專利名稱：一種雙膜結構移植材料的制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于組織工程和生物材料領域，涉及一種雙膜結構移植材料，特別涉及一種干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜雙膜結構移植材料的制備方法及用途。
背景技術：
目前，利用干細胞技術進行組 織缺損修復通常采用干細胞懸液和外源性支架材料復合的方法，主要形式有三種:單純細胞懸液局部移植；細胞懸液接種于外源性支架材料；細胞懸液接種于支架材料后體外行三維培養。然而，上述移植方法存在諸多不足:首先，細胞在用胰酶消化獲得懸液的過程中，細胞間信號分子和細胞外基質的結構遭到破壞，細胞本身的活性也受到了影響；其次，細胞移植的量難以控制，細胞量太少，細胞難以迅速定植于移植局部，細胞量太多，又會造成局部細胞堆積，不利于細胞伸展和營養供應；最后，支架材料的移植和降解可能造成宿主毒性反應和免疫反應，而未降解的支架材料會造成纖維包裹，影響血供和組織結構重建。因此，需要尋找一種制備干細胞復合支架材料的新方法，減少干細胞的流失，提高其生物學活性，減少支架材料的吸收和宿主的免疫反應，提高組織缺損修復的效果。
發明內容
為了克服上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種CSF復合PRF的雙膜結構的移植材料及其制備方法和用途，CSF (cell sheet fragment)即細胞膜片片段，PRF(platelet-rich fibrin)為富血小板纖維蛋白，本發明的移植材料能夠應用于如軟骨、軟組織缺損的修復及牙髓、牙周膜組織的再生，有效提高組織修復的效果。為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是:一種雙膜結構移植材料，其特征在于:由干細胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜顆粒組成。優選的，所述干細胞選自骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞、牙髓干細胞或牙周膜干細胞。優選的，所述富血小板纖維蛋白膜片顆粒經由血液離心后獲得。優選的，細胞膜片采用六孔板進行制備，細胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜的比例如下:每張六孔板細胞膜片數量:用于離心獲得富血小板纖維蛋白膜片的血液毫升數=I: 3.5 4.0。優選的，所述干細胞和富血小板纖維蛋白均來源于同一個體。優選的，干細胞必須制備成細胞膜片片段的形式。一種移植材料的制備方法，其特征在于其制備過程包括以下步驟:第一步，干細胞膜片的培養:原代干細胞經擴大培養后接種于六孔板，待生長融合至80%時以膜片誘導液予以培養，3天換液一次，待細胞膜片周圍出現卷曲時認為細胞膜片成熟；
第二步，制備干細胞膜片片段:用機械剝離的方法將細胞膜片從培養皿中剝離，用無菌眼科剪將其剪碎，制備成細胞膜片片段(大小約0.5mmX 0.5mm)；第三步，提取富血小板纖維蛋白膜片顆粒:根據所需比例，以IOml為單位，將血液(不加任何抗凝劑)置于無菌玻璃離心管或塑料套管的玻璃離心管中，立即以3000rpm/min的速度離心10分鐘，靜置5分鐘后，無菌鑷鉗夾取出離心管中間部分的富血小板纖維蛋白凝膠，將其底部紅細胞端于無菌紗布上輕蘸以去除多余紅細胞，保留完整的淡黃色凝膠部分及底部少量粘附牢固的紅細胞，將后者平鋪置于無菌紗布之間，輕壓擠出其中液體成分，制備成一淡黃色堅韌膜狀結構，用無菌眼科剪將其剪碎，制備成大小約0.5mmX 0.5mmX 0.5mm的富血小板纖維蛋白膜片顆粒；第四步，將制備的細胞膜片片 段和富血小板纖維蛋白膜片顆粒置于無菌培養皿中，按照比例手動將其混勻，保證二者充分混合，即可得到干細胞膜片片段與富血小板纖維蛋白膜復合后形成的雙膜結構移植材料。優選的，細胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜的比例如下:每張六孔板細胞膜片數量:用于離心獲得富血小板纖維蛋白膜片的血液毫升數=I: 3.5 4.0。本發明的移植材料在口腔頜面部或全身中小范圍組織缺損修復中的應用。本發明的移植材料在制備口腔頜面部或全身中小范圍組織缺損修復用移植材料中的用途。本發明的移植材料與其他生物材料組成的復合材料在制備組織缺損修復用移植材料中的用途。一種干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜的雙膜結構移植材料，由干細胞膜片片段、富血小板纖維蛋白膜顆粒組成。干細胞形式根據修復組織的類型可不同，包括骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞、牙髓干細胞及牙周膜干細胞等，富血小板纖維蛋白膜為血液經離心后制備獲得。體外進行二者配比的篩選，以干細胞的增殖、分化作為評價指標，確定二者最佳體積比為:六孔板獲得細胞膜片:用于離心獲得富血小板纖維蛋白膜片的血液=I: 3.5 4.0。按照該配比進行移植物的制備，再將其移植至實驗動物體內，進行體內實驗的驗證，結果證明，該配比下的雙膜結構移植物具有良好的組織修復與組織再生作用。移植材料兩組分混合的方式是:將干細胞制備成膜片片段形式，富血小板纖維蛋白膜制備成顆粒狀(大小約0.5mmX0.5mmX0.5mm), 二者于無菌培養皿中手動機械混勻，使二組分充分混合。本發明還提供了所述干細胞膜片片段及富血小板纖維蛋白膜顆粒的制備方法，包括以下步驟:第一步，干細胞膜片的培養:原代干細胞經擴大培養后接種于六孔板，待生長融合至80%時以膜片誘導液予以培養，3天換液一次，待細胞膜片周圍出現卷曲時認為細胞膜片成熟;第二步，制備干細胞膜片片段:用機械剝離的方法將細胞膜片從培養皿中剝離，用無菌眼科剪將其剪碎，制備成細胞膜片片段(大小約0.5mmX 0.5mm)；第三步，提取富血小板纖維蛋白膜片顆粒:根據所需比例，以IOml為單位，將血液(不加任何抗凝劑)置于無菌玻璃離心管或塑料套管的玻璃離心管中，立即以3000rpm/min的速度離心10分鐘，靜置5分鐘后，無菌鑷鉗夾取出離心管中間部分的富血小板纖維蛋白凝膠，將其底部紅細胞端于無菌紗布上輕蘸以去除多余紅細胞，保留完整的淡黃色凝膠部分及底部少量粘附牢固的紅細胞，將后者平鋪置于無菌紗布之間，輕壓擠出其中液體成分，制備成一淡黃色堅韌膜狀結構，用無菌眼科剪將其剪碎，制備成大小約0.5mmX 0.5mmX 0.5mm的富血小板纖維蛋白膜片顆粒；第四步，將制備的細胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜片顆粒置于無菌培養皿中，按照比例手動將其混勻，保證二者充分混合，即可得到干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜雙膜結構移植材料。所述的干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜顆粒的雙膜結構移植材料可用于中小范圍的軟骨及軟組織缺損的修復，對于操作視野較好部位可直接將復合物置于缺損處，對于操作視野不佳或無法完全暴露缺損區的病例，亦可將移植材料置于注射器或采用內窺鏡方法將其注射于缺損處。本發明與現有技術相比具 有以下優點:現有組織工程技術使用的支架材料幾乎全部是外源性材料，而種子細胞則以細胞懸液的形式接種于外源性材料上，再添加一種或幾種外源性生長因子，這種方法的不足之處在于:外源性的支架材料降解需要一定時間，且存在降解不充分的可能；而種子細胞以懸液形式接種并移植到組織局部后，極易流失，使得能夠局部定植穩定發揮作用的細胞量明顯變少；而且，外源性添加的生長因子種類較少，與生理狀況下多種生長因子比例協調、協同發揮作用的模式完全不同，這些都會影響組織工程技術臨床應用的效果。本發明最突出的特點是從根本上解決了上述現有技術的缺點，具體表現在以下幾點:I)低排斥。本法制備的復合移植材料中的兩種成分，即干細胞膜片片段(CSF)和富血小板纖維蛋白膜(PRF)來源充足，具有極佳的生物學活性，幾乎不存在免疫排斥反應及毒性反應。2)配比佳。本發明的重要特點之一是篩選出了干細胞數量和富血小板纖維蛋白膜的最佳配比。該配比條件下，細胞具有良好的增殖和分化能力，有利于組織修復和再生，且該配比以六孔板獲得細胞膜片數量和血液的毫升數作為配比的基本單位，容易準確掌握，便于操作。3)高效率。富血小板纖維蛋白膜來自于血液，操作簡單，極易獲得；其本身含有大量的生長因子，包括轉化生長因子β-1 (TGF β-1)、血小板源性生長因子(TOGF)、胰島素樣生長因子(IGF)，上述三種生長因子可以促進細胞遷移、增殖，誘導纖維蛋白基質進行重塑，并促進膠原基質的分泌，在最初的組織愈合中起到了重要的作用；除此而外，PRF還含有表皮生長因子(EGF)和血管內皮生長因子(VEGF)等與創傷愈合和骨再生相關的生長因子。PRF本身就是纖維蛋白網狀交聯形成的三維支架結構，這種結構可以使得其中的生長因子緩慢釋放。所以，PRF的組織修復和組織再生作用主要通過兩方面實現，即生長因子的調節作用和纖維蛋白支架作用。4)易操作。細胞膜片片段(CSF)的細胞類型可以根據修復缺損的區域及組織類型的不同而不同，包括骨髓間充質干細胞(BMSCs)、脂肪干細胞(ASCs)、牙髓干細胞(DPSCs)、牙周膜干細胞(PDLSCs)等，上述細胞均已被證實有良好的組織再生能力，且獲得相對容易，易于體外短時間內擴大培養；細胞膜片技術本身由于保留了細胞外基質和細胞活性而較懸浮細胞具有更強的組織再生潛能；同時，膜片片段技術又改變了傳統的膜片移植模式，將膜片制備成一定大小的片段，一方面可使細胞片段與支架材料充分混合，細胞快速定植于支架材料表面并伸出突觸延伸至支架間隙內部，二者形成一個整體(圖7)，另一方面可將細胞注射至難以完全暴露操作視野的區域。5)抗感染。PRF的紅端濃縮了大量的白細胞，這些白細胞一方面在局部發揮良好的抗炎作用，另一方面調動機體的免疫功能；同時，PRF在制備過程中還網羅了血液中大量免疫調節因子，如IL-1 β，IL-4，IL-6及TNF-α，共同發揮抗感染的作用，利于組織愈合。因此，本發明方法制備的復合移植材料具有來源豐富、適應癥廣泛、制備簡單、無免疫排斥反應及毒性反應、無倫理爭議、安全有效等優點。該方法具有普遍意義，適用于每位患者。
圖1為細胞膜片培養成熟后大體觀(以牙髓干細胞為例)。圖2為細胞膜片顯微結構的HE染 色(以牙髓干細胞為例)。圖3為細胞膜片掃描電鏡結構(以牙髓干細胞為例)。圖4為富血小板纖維蛋白大體觀，其中A為離心后靜置5分鐘大體觀；B為PRF凝膠；C為PRF膜；D為PRF顆粒。圖5為富血小板纖維蛋白膜顯微結構的HE染色，其中A為40倍放大，B為100倍放大。圖6為富血小板纖維蛋白膜掃描電鏡結構，其中A為其上端，為纖維蛋白三維網狀結構出為其下端，可見大量血小板、白細胞聚集。圖7為牙髓干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜顆粒后形成的雙膜結構移植物的掃描電鏡，可見細胞牢固粘附于PRF表面，并伸出細胞突觸至PRF三維網狀結構的空隙中，二者牢固結合，形成整體。圖8為不同配比條件下細胞增殖情況，其中A為PRF對牙髓干細胞增殖的影響，B為PRF對牙周膜干細胞增殖的影響。圖9為不同配比條件下牙髓干細胞向成牙本質細胞分化時DMPl的表達水平。圖10為不同配比條件下牙周膜干細胞向牙周膜細胞分化時CP23的表達水平。圖11為分別采用單純骨髓間充質干細胞膜片片段、單純PRF顆粒、骨髓間充質干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜顆粒的雙膜結構修復兔髁突軟骨缺損的體內實驗結果，該圖為實驗2、4、8周后髁突組織大體觀察結果。圖12為圖11組織行HE染色結果。圖13為圖11組織行甲苯胺藍染色結果。圖14為圖13中新生軟骨區甲苯胺藍異染著色強度分析的統計圖，橫坐標代表組別及時間，縱坐標代表異染區著色強度的平均光密度值。圖15為分別采用單純PRF顆粒、單純牙髓干細胞膜片片段、牙髓干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜顆粒雙膜結構行犬牙髓再生的體內實驗結果，該圖為I月、2月后HE染色結果。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明進行更加詳盡的說明。干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜的雙膜結構移植材料的制備方法，包括體外配比篩選和體內驗證兩部分。第一部分:體外配比篩選1.材料與設備1.1主要試劑a-MEM培養基(Hyclone公司，美國);0.25%胰酶(Hyclone公司，美國);胎牛血清(四季青，浙江天杭生物科技有限公司)。1.2儀器設備多管架自動平衡離心機(TD25-WS，湖南湘儀 實驗室儀器開發有限公司);細胞培養箱(Heraeuc Hearcell, Thermo公司，中國);六孔板(Nunc公司，美國);超凈工作臺(B10BASE，美國)。2.操作步驟2.1干細胞的培養:I)將原代干細胞經擴大培養后，按照1: 2 1: 3比例進行傳代；2)取第三代干細胞接種于六孔板中，常規培養(10% FBS的a -MEM培養液)至細胞融合80%。2.2富血小板纖維蛋白制備:I)將根據所需比例，以IOml為單位，將血液(不加任何抗凝劑)置于無菌玻璃離心管或塑料套管的玻璃離心管中，立即以3000rpm/min的速度離心10分鐘，靜置5分鐘；2)無菌鑷鉗夾取出離心管中間部分的富血小板纖維蛋白凝膠，將其底部紅細胞端于無菌紗布上輕蘸以去除多余紅細胞，保留完整的淡黃色凝膠部分及底部少量粘附牢固的紅細胞，將后者平鋪置于無菌紗布之間，輕壓擠出其中液體成分，制備成一長方形淡黃色堅朝月吳狀結構；3)將其平鋪于無菌紗布上，無菌剪刀沿其長軸剪開，將其制備成1/8和1/4的PRF,置于培養液中備用。2.3干細胞與富血小板纖維蛋白膜共培養:I)按照1/8、1/4、3/8、1/2張PRF的比例，將剪好的PRF置于第三代干細胞的六孔板培養皿中，常規培養7日，3天換液一次；2) 二者共培養7天后去掉PRF，干細胞則繼續正常培養，3天換液一次；2.4干細胞增殖、分化的檢測:I)分別于二者共培養前和共培養后的I 7天進行干細胞數量的檢測，觀察PRF對細胞增殖的影響；2) 二者共培養后的7、14、21天行干細胞相關基因表達的Real-time PCR檢測，觀察PRF對細胞分化的影響。3.實驗結果3.1干細胞增殖PRF對牙髓干細胞和牙周膜干細胞的增殖具有明顯的促進作用，且呈一定的時間依賴性。兩種干細胞共同的特點是:PRF濃度從1/8 3/8，其對細胞增殖的影響呈現出明顯的濃度依賴性，且以3/8PRF對細胞增殖的促進作用最為明顯，1/2PRF對細胞增殖的雖有一定促進作用，但不及3/8PRF作用明顯(如圖8所示)。3.2干細胞分化二者共培養21天后，PRF對牙髓干細胞 向成牙本質細胞方向分化的特異性蛋白DMPl的表達具有明顯的上調作用，且呈明顯的濃度依賴性，以1/2PRF最好，但其與3/8PRF之間的差別無統計學意義(圖9) ;PRF對牙周膜干細胞特異性蛋白CP23的表達也具有明顯的上調，以3/8PRF的濃度最好(如圖10所示)。綜合PRF對兩種不同類型的干細胞增殖分化的影響的結果，我們認為3/8PRF對干細胞的增殖和分化均有明顯的促進作用，故選擇該濃度作為最佳濃度。由于每張PRF膜所需血液為10mL，故最終確定二者配比關系為:每張六孔板細胞膜片數量:血液毫升數=I: 3.75，為了簡化操作，我們認為1: 3.5 4.0均可。為了驗證該配比條件下的移植物的體內移植效果，我們進行體內部分實驗。第二部分:移植物體內驗證第一步，干細胞膜片的培養:原代干細胞經擴大培養后接種于六孔板，待生長融合至80%時以膜片誘導液予以培養，3天換液一次，待細胞膜片周圍出現卷曲時認為細胞膜片成熟;第二步，制備干細胞膜片片段:用機械剝離的方法將細胞膜片從培養皿中剝離，用無菌眼科剪將其剪碎，制備成細胞膜片片段(大小約0.5mmX 0.5mm)；第三步，提取富血小板纖維蛋白膜片顆粒:具體方法同體外實驗部分，將制備所得的PRF膜用無菌眼科剪將其剪碎，制備成大小約0.5mmX 0.5mmX 0.5mm的富血小板纖維蛋白膜片顆粒；第四步，將制備的細胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜片顆粒置于無菌培養皿中，按照比例手動將其混勻，保證二者充分混合，即可得到干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜雙膜結構移植材料。對于操作視野較好的部位，使用時可將制備好的雙膜結構移植材料直接置于缺損處，對于操作視野不佳或無法完全暴露缺損區的病例，亦可將移植材料置于注射器或采用內窺鏡方法將其注射于缺損處。為了驗證本發明所述干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜的雙膜結構移植材料的功效，我們分別進行了不同種類干細胞細胞膜片復合富血小板纖維蛋白膜雙膜結構進行組織缺損修復的實驗，現分別以“兔骨髓間充質干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜雙膜結構修復兔髁突軟骨缺損”和“犬牙髓干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜雙膜結構用于牙髓再生治療”為例，進行如下試驗:實驗一:兔骨髓間充質干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜雙膜結構修復兔髁突軟骨缺損1.材料與設備1.1主要試劑a-MEM培養基(Hyclone公司，美國);0.25%胰酶(Hyclone公司，美國)；胎牛血清(四季青，浙江天杭生物科技有限公司)；維生素C(Sigma公司，美國)；戊巴比妥鈉(德國，科昊生物工程有限責任公司分裝)。
1.2儀器設備多管架自動平衡離心機(TD25-WS，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；細胞培養箱(Heraeuc Hearcell, Thermo公司，中國);六孔板(Nunc公司，美國);超凈工作臺(B10BASE，美國)；尼康顯微鏡成像系統(XTJ30，日本)，分析電子天平(FA1004，中國)，掃描電鏡(日立S-4800,日本)。2.操作步驟2.1兔骨髓間充質干細胞(BMSCs)的培養兔原代骨髓間充質干細胞采用含10%胎 牛血清的a -MEM培養基常規培養，待細胞融合至80%時按照1: 2 1: 3的比例進行擴大培養，每2 3天換液一次；2.2BMSCs膜片的制備DBMSCs培養至第三代時，傳代至6孔板；更換膜片培養液(含10%胎牛血清、20mg/ml維生素C的a -MEM培養基)，常規繼續培養兩周，膜片培養液每2 3天更換一次，換液時注意避光；2)待細胞膜片生長至周邊細胞膜片稍卷曲時，即認為細胞膜片已成熟，將成熟的細胞膜片用眼科鑷自一端剝離(如圖1，圖2，圖3所示)，置于無菌培養皿中，采用無菌眼科剪將其剪成大小約0.5mmX 0.5mm的片段，備用。2.3PRF 的制備I)根據所需比例，以IOml為單位，將兔血液(不加任何抗凝劑)置于無菌玻璃離心管或塑料套管的玻璃離心管中，立即以3000rpm/min的速度離心10分鐘，靜置5分鐘；2)此時可見離心管中血液分為三層:下層為紅細胞層，上層為極少量的淡黃色清液，中間層為淡黃色半透明富血小板纖維蛋白凝膠(如圖4A所示)；3)用無菌眼科鑷將中間部分凝膠完整取出，將其底部紅細胞端于無菌紗布上輕蘸以去除多余紅細胞，保留完整的淡黃色凝膠部分及底部少量粘附牢固的紅細胞(如圖4B所示)，將后者平鋪置于無菌紗布之間，輕壓擠出其中液體成分，制備成一淡黃色堅韌膜狀結構，即為富血小板纖維蛋白膜，即PRF膜(如圖4C，圖5，圖6所示)；4)用無菌眼科剪將其剪碎,制備成大小約0.5mmX 0.5mmX 0.5mm的富血小板纖維蛋白膜片顆粒，備用(如圖4D所示)。2.4BMSCs/PRF雙膜結構的制備將制備的BMSCs細胞膜片片段和PRF膜片顆粒置于無菌培養皿中，按照六孔板獲得細胞膜片:用于離心獲得富血小板纖維蛋白膜片的血液=I: 3.5 4.0的比例，手動將其混勻，保證二者充分混合，即可得到干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜顆粒的雙膜結構移植材料，備用(如圖7所示)。2.5兔顳下頜關節軟骨缺損模型的建立I)麻醉:無菌條件下，3%戊巴比妥鈉(lmL/kg)耳緣靜脈麻醉，另用I %利多卡因于建模側施以局麻；2)術前準備:術側顳下頜關節術區備皮，碘伏消毒，鋪巾；3)于外目此外側5mm處至外耳道方向作約2cm長的皮膚切口 ；4)分離皮下組織，切開關節囊；5)暴露髁突關節，用電動鉆于髁突前斜面中央鉆取I個直徑約3mm的孔；
6)行關節復位，縫合關節囊，縫合皮膚層。2.6實驗分組根據實驗設計，將待植入髁突軟骨缺損處的移植物分為4組:①空白對照組:髁突軟骨缺損處不植入移植物；②單純PRF顆粒組；③單純BMSCs細胞膜片片段組；@ BMSCs/PRF雙膜結構組。3.實驗結果分別于各組植入后的2w、4w、8w時使用 戊巴比妥鈉麻醉后取材，4 %多聚甲醛固定。15% EDTA脫鈣后進行大體觀察，以及HE、甲苯胺藍染色后組織顯微結構的觀察，結果如下:I)大體觀察可見:BMSCs/PRF雙膜結構組修復情況要好于同時間點的其它組(如圖11所示)；2)HE染色結果:空白對照組在各時間點缺損區凹陷，均未見有軟骨樣物質充填；單獨PRF組與單獨細胞膜片組隨著時間的延長缺損修復區逐漸有新生軟骨生成，但軟骨層次排列紊亂；雙膜結構組，第8周時損傷區基本齊平，修復軟骨層較薄、層次較清晰，與鄰近正常軟骨各層較連續(如圖12所示)；3)甲苯胺藍染色結果:各組新生軟骨區域呈異染現象(如圖13所示)，采用IPP
6.0軟件對各組甲苯胺藍染色圖片進行著色強度分析，計算平均光密度值。結果得出:除空白對照組外，其余3組在術后2、4、8周平均OD值呈逐漸增加趨勢(P < 0.05)，并顯著高于同時間點的空白對照組(P < 0.05);單獨PRF組與單獨細胞膜片組在各個時間點平均OD值均無顯著性差異。雙膜結構組4、8周平均OD值顯著高于同時間點的其它組(P < 0.05)(如圖14所示)。實驗二:犬牙髓干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜雙膜結構用于牙髓再生治療1.材料與設備1.1主要試劑a-MEM培養基(Hyclone公司，美國)；1型膠原酶(GIBC0公司，美國)；0.25%胰酶(Hyclone公司，美國)；胎牛血清(四季青，浙江天杭生物科技有限公司)；維生素C(Sigma公司，美國)；戊巴比妥鈉(德國，科昊生物工程有限責任公司分裝)。1.2儀器設備多管架自動平衡離心機(TD25-WS，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；細胞培養箱(Heraeuc Hearcell, Thermo公司，中國);六孔板(Nunc公司，美國);超凈工作臺(B10BASE，美國)；尼康顯微鏡成像系統(XTJ30，日本)，分析電子天平(FA1004，中國)，掃描電鏡(日立S-4800,日本)。2.操作步驟2.1犬牙髓干細胞(DPSCs)的分離與培養犬原代牙髓干細胞采用含10% FBS的a-MEM常規培養，培養3 5天后的出現多個克隆細胞團，待克隆團內部細胞生長至80%時，以1: 2 1: 3的比例進行擴大培養，每2 3天換液一次；2.2DPSCs膜片的制備
同實驗一。2.3PRF 的制備同實驗一。2.4犬牙髓干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜雙膜結構移植材料的制備同實驗一。2.5犬牙髓再生模型的建立I)犬(約6月齡)常規麻醉，方法同 前；2)術前準備:犬口內所有前磨牙采用牙周刮治器械行齦上下手動刮治，去除牙石及軟垢，口腔內外碘伏嚴格消毒，鋪巾；3)經隨機化分組后，上下頜前磨牙(除第一前磨牙)開髓，揭髓頂，暴露牙髓組織，拔髓針完整拔除牙髓后，采用30#K確定根尖孔開放后，擴大根尖孔至70#Κ銼，使根尖開放區直徑達0.7mm ；4) 一次性注射器吸取大量無菌生理鹽水進行根管沖洗，確定根管內無牙髓組織及牙體組織碎屑殘留；5)依照2.6中分組，將移植物置于根管中，采用螺旋輸送器將移植物送至整個根管中，達根管口處；移植物上端輕置氫氧化鈣(Dycal，登士柏公司)，厚度約1mm，待氫氧化鈣結固后，修整洞壁，采用玻璃離子墊底，厚度約1mm，缺損處采用光固化樹脂充填；2.6實驗分組根據實驗設計，將待植入髓腔的移植物分為4組:①空白對照組:髓腔內不植入任何移植物；②單純PRF顆粒組；③單純DPSCs細胞膜片片段組；@ DPSCs/PRF雙膜結構組。3.實驗結果HE染色結果:正常對照組可見牙髓組織、成牙本質細胞、前期牙本質及成熟牙本質有序排列，成牙本質細胞呈高柱狀有序排列；各實驗組均可見血管及染色較淺的前期牙本質形成，但血管數量、牙本質厚薄及細胞排列情況各組間存在差異:DPSCs/PRF雙膜結構組細胞呈疏松的星網狀復層排列，且細胞形態由遠離牙本質的平行生長逐漸向靠近牙本質的垂直極性生長轉變，形態類似成牙本質細胞，髓腔內見較多新生血管形成；單純DPSCs細胞膜片組牙髓細胞較雙膜結構組排列疏松、無序，且牙本質層較薄，但髓腔內亦可見較多的血管形成；單純PRF顆粒組細胞大多呈圓形，無明顯伸展，排列無序且牙本質壁薄，但髓腔內亦可見少量血管形成(如圖15所示)。4.機理分析4.1干細胞膜片片段(CSF)的作用干細胞(stem cells, SC)是一類具有自我復制能力和多向分化能力的細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，故目前作為種子細胞被廣泛應用于組織工程中。細胞膜片技術是通過體外誘導的方式促使種子細胞在短時間內產生大量細胞外基質(extracellular matrix, ECM)，將細胞緊密連結成為一種片狀結構。ECM不僅為細胞和組織提供連接、營養供應以及力學性能的支持，更為重要的是能調節細胞間的溝通，對細胞的基本生命活動發揮全方位的動態調節作用。ECM具有結構和功能的多樣性，其結構和成分的變化將影響細胞骨架的構建，從而決定細胞的形狀和活性，影響細胞的生存，參與和控制細胞的分化與遷移，在組織器官的發生、發育、再生及維持組織器官的結構和功能的生理活動中均具有極其關鍵的作用。細胞膜片技術這種能夠保存細胞間自分泌信號分子性能的獨特優勢，可以減少無效移植細胞的數量，有利于組織的重建或再生。而膜片片段技術改變了傳統的膜片移植模式，將完整的細胞膜片制備為一定大小的片段，一方面保存了種子細胞的活性，并且最大程度保存了 ECM及細胞間自分泌信號分子的性能，另一方面使細胞能最大程度地與支架均勻混合，便于細胞迅速定植于支架表面，使二者形成的移植物成為具有良好生物功能的整體。4.2富血小板纖維蛋白膜(PRF)的作用富血小板纖維蛋白(PRF)是全血經一次快 速離心后形成的纖維網狀結構。PRF的主要特點在于富含大量比例接近生理狀況的生長因子，如轉化生長因子(transforminggrowth factor β , TGF β )、血小板源性生長因子(platelet-derivedgrowth factors,F1DGF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors, IGF),上述三種生長因子在最初的組織愈合中起到了重要的作用，它們可以促進細胞遷移和增殖，誘導纖維蛋白基質進行重塑，并且促進膠原基質的分泌；除此而外，PRF中還含有與創傷愈合和骨再生相關的多種生長因子，包括表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growthfactor, VEGF)等。作為血小板濃縮物的第二代產品，與第一代產品富血小板血漿(plateIet-richpIasma, PRP)相比，PRF 具有以下特點:I)制備簡單。PRP的制備需要添加抗凝劑，以防止血液凝固；其制備需要兩次離心，需要將離心后的上清進行轉移，操作繁瑣，且目前尚無標準的離心速度和時間，不同學者對其制備的方法持有不同觀點。PRF的制備則很簡單，抽取全血后立即以3000rprm/min的速度離心10分鐘，靜置5分鐘，即可得到PRF凝膠。2)安全性好。PRP在制備時首先需要加入抗凝劑，其次在兩次離心結束后需要添加牛凝血酶及氯化鈣加以激活，才可形成凝膠狀以便體內移植，而且PRP只有在激活以后才能使得其中的血小板α鏈脫顆粒釋放生長因子；然而，添加外源性物質有可能引起宿主的免疫反應，且過多的操作步驟也增加了污染的幾率。PRF的制備不需要添加任何外源性物質,且一步操作完成,安全性好。3)生長因子緩釋。PRP是通過加入較多的凝血酶進行人為激活后迅速形成凝膠狀的。大量的外源性的凝血酶使得纖維蛋白迅速聚合，形成雙向致密連接結構，這就使得血小板釋放出來的生長因子不能被網羅其中，而是存留在纖維網狀結構之外的懸液中，從而呈現出快速、大量釋放的特點。而PRF是在自身凝血酶作用下產生的緩慢的聚合方式，這種漸進性的聚合方式更大程度上將外周血中游離的生長因子網羅至PRF的三維網狀結構中。游離生長因子和血小板中的生長因子在這種三維結構中的分布必然會導致其緩釋效應，因為它們只會在其所在纖維結構發生改建時才得以釋放，而且PRF中的纖絲和纖維蛋白形成四方形的連接方式，這種彈性基質結構也更有利于細胞遷移和可溶性分子保留。4)三維網狀結構可作為支架材料。PRP中的纖維蛋白形成的是雙向的致密連接結構，這種結構不利于細胞和生長因子的遷移。PRF中的纖維蛋白則形成三維網狀結構，這種結構不但利于細胞和生長因子的遷移，還為組織修復相關細胞提供了增殖分化的場所，發揮了重要的支架作用。
5)含有大量的白細胞。PRF經由全血離心得到，在離心過程中，血液中絕大多數白細胞均分布于PRF下端，即紅端(如圖6中B圖所示)；因此，在雙膜結構移植至體內時，一方面濃縮的白細胞于局部發揮良好的抗炎作用，另一方面調動機體的免疫系統，發揮良好的抗炎功能和免疫調節功能；同時，PRF在制備過程中還網羅了血液中大量免疫調節因子，如IL-Ιβ，IL-4，IL-6及TNF-α等，這些因素在組織缺損修復后防止感染、促進愈合等方面均發揮著重要作用。4.3干細胞膜片片段復 合富血小板纖維蛋白膜的雙膜結構動物移植效果的分析本發明的第一部分應用體外實驗對干細胞細胞膜片與富血小板纖維蛋白膜的配比關系進行了研究，得到了二者之間最佳配比關系。第二部分，按照該配比關系制備雙膜結構移植物，將其植入實驗動物體內，探究雙膜結構移植物對組織修復的影響。4.3.1實驗一中，富血小板纖維蛋白膜PRF顆粒作為細胞支架及生長因子供體，與骨髓間充質干細胞膜片片段進行復合，將其按照一定比例混合后置于組織缺損處，進行軟骨缺損的修復。PRF膜片極具韌性，剪碎成為顆粒狀后極易操作，可將其置于任何形狀的組織缺損中；骨髓間充質干細胞制作成膜片形式后，由于存在細胞外基質的連接，避免了以往的懸浮細胞易流失的缺點。我們的實驗結果表明，與自然恢復組、單純的PRF以及單純的細胞膜片組相比，雙膜結構組修復軟骨缺損的效果最好，在第8周時損傷區基本齊平，修復軟骨層較薄、層次較清晰，與鄰近正常軟骨各層較連續。這就證明了我們的猜想，即:骨髓間充質干細胞在局部發揮了種子細胞的作用，在局部微環境中能夠增殖分化成特定的細胞類型，而PRF膜片顆粒一方面提供了大量的膠原基質成分，為細胞提供了支架結構，另一方面其中含有的血小板隨著基質成分的改建而不斷被激活，釋放出大量比例接近生理狀況的生長因子，為干細胞的增殖和分化及組織的修復提供營養支持。4.3.2實驗二中，以PRF膜片作為細胞支架及生長因子供體，與牙髓干細胞膜片片段進行復合，將其按照一定比例混合后置于牙髓缺如的根管腔內，進行牙髓再生的研究。結果發現，雙膜結構組較單純細胞膜片及單純PRF組再生效果好。正常對照組犬牙縱切面HE染色觀察可見牙髓、成牙本質細胞、前期牙本質及成熟牙本質有序排列，牙本質經脫礦處理后呈紅色的嗜伊紅膠原基質染色，靠近髓腔的前期牙本質部分染色較淺，沿牙本質層排列，單層成牙本質細胞緊接前期牙本質呈高柱狀排列。DPSCs/PRF雙膜結構組HE染色發現，細胞呈疏松星網狀復層排列，且細胞形態由遠離牙本質的平行生長逐漸向靠近牙本質的垂直極性生長轉變，形態類似成牙本質細胞，髓腔內見較多血管形成。單純細胞膜片組細胞呈疏松星網狀復層排列，但較雙膜結構組排列疏松、無序，未表現出明顯的近牙本質垂直極性生長轉變的特點，且牙本質層較薄，但細胞形態伸展明顯，髓腔內亦可見較多的血管形成。單純PRF顆粒組細胞大多呈圓形，無明顯伸展，排列無序，無明顯垂直極性生長轉變，牙本質壁薄，但髓腔內亦可見少量血管形成。上述結果說明，在牙髓再生過程中，牙髓干細胞是理想的種子細胞，將其制成細胞膜片片段的形式，一方面最大程度上保留了細胞外基質，使得細胞間相關信號分子得以完整保存，另一方面，擺脫了細胞懸液的束縛，膜片的形式更加便于操作，保證牙髓腔局部有足夠量的且不易流失的種子細胞。根尖孔開放后，保證了髓腔內有足夠血運，使得種子細胞有一定的營養支持，這樣，即使沒有PRF提供大量的生長因子和支架作用，髓腔中也有牙髓組織再生。另一方面，根尖孔開放后，血液會充滿髓腔，而循環血中本身存在未分化的間充質干細胞，干細胞歸巢至牙髓腔中，在PRF顆粒釋放的大量的生長因子的作用和髓腔局部微環境的雙重作用下，歸巢的干細胞在髓腔局部得以增殖、分化，達到牙髓再生的目的，這可能也就是在單純PRF顆粒組也能見到排列較好的再生牙髓的原因。而髓腔中缺少了 PRF提供生長因子和膠原支架，即使有歸巢的干細胞，也未必能形成較好的牙髓組織。而將牙髓干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜顆粒雙膜結構的移植材料置于髓腔中，即同時滿足了種子細胞、三維支架以及生長因子的要求，因此可以得到較為理想的牙髓再生，這與本實驗結果相符。綜上所述，實驗結果證實機理分析，本發明 所示的干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜片的新型生物材料，能夠顯著促進組織缺損的修復及組織再生效果。本發明方法制備的生物移植材料配比合適，來源豐富，具有普遍的適用性，適用于每位患者個體。通過該方法制備的生物移植材料，可廣泛用于不同類型組織缺損的修復，還具有良好的組織再生效果，為組織工程相關實驗的展開和臨床修復組織缺損及組織再生提供了新思路。
權利要求
1.一種雙膜結構移植材料，其特征在于:由干細胞細胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜顆粒組成。
2.如權利要求1所述的移植材料，其特征在于:所述干細胞選自骨髓間充質干細胞、月旨肪干細胞、牙髓干細胞或牙周膜干細胞。
3.如權利要求1所述的移植材料，其特征在于:所述富血小板纖維蛋白膜片顆粒經由血液離心后獲得。
4.如權利要求1所述的移植材料，其特征在于:細胞膜片采用六孔板進行制備，細胞細胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜的比例如下:每張六孔板細胞膜片數量:用于離心獲得富血小板纖維蛋白膜片的血液毫升數=I: 3.5 4.0。
5.如權利要求1所述的移植材料，其特征在于:所述干細胞和富血小板纖維蛋白均來源于同一個體。
6.如權利要求1所述的移植材料，其特征在于:干細胞必須制備成細胞膜片片段的形式。
7.權利要求1所述移植材料的制備方法，其特征在于其制備過程包括以下步驟: 第一步，干細胞膜片的培養:原代干細胞經擴大培養后接種于六孔板，待生長融合至80%時以膜片誘導液予以培養，3天換液一次，待細胞膜片周圍出現卷曲時認為細胞膜片成熟； 第二步，制備干細胞膜片片段:用機械剝離的方法將細胞膜片從培養皿中剝離，用無菌眼科剪將其剪碎，制備成細胞膜片片段(大小約0.5mmX 0.5mm)；` 第三步，提取富血小板纖維蛋白膜片顆粒:根據所需比例，以IOml為單位，將血液(不加任何抗凝劑)置于無菌玻璃離心管或塑料套管的玻璃離心管中，立即以3000rpm/min的速度離心10分鐘，靜置5分鐘后，無菌鑷鉗夾取出離心管中間部分的富血小板纖維蛋白凝膠，將其底部紅細胞端于無菌紗布上輕蘸以去除多余紅細胞，保留完整的淡黃色凝膠部分及底部少量粘附牢固的紅細胞，將后者平鋪于無菌紗布之間，輕壓擠出其中液體成分，制備成一淡黃色堅韌膜狀結構，用無菌眼科剪將其剪碎，制備成大小約0.5mmX0.5mmX0.5mm的富血小板纖維蛋白膜片顆粒； 第四步，將制備的細胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜片顆粒置于無菌培養皿中，按照比例手動將其混勻，保證二者充分混合，即可得到干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜雙膜結構移植材料。
8.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于:細胞細胞膜片片段和富血小板纖維蛋白膜的比例如下:每張六孔板細胞膜片數量:用于離心獲得富血小板纖維蛋白膜片的血液毫升數=1: 3.5 4.0。
9.權利要求1-5任一項所述的移植材料在口腔頜面部或全身中小范圍組織缺損修復中的應用。
10.權利要求1-5任一項所述的移植材料在制備口腔頜面部或全身中小范圍組織缺損修復用移植材料中的用途。
11.權利要求1-5任一項所述的移植材料與其他生物材料組成的復合材料在制備組織缺損修復用移植材料中的用途。
全文摘要
本發明屬于組織工程和生物材料領域，為一種雙膜結構移植材料的制備方法及用途，移植材料由干細胞膜片片段、富血小板纖維蛋白膜顆粒組成，干細胞經擴大培養后采用膜片誘導液誘導培養得到干細胞膜片，剪碎后制備成細胞膜片片段；富血小板纖維蛋白凝膠擠壓后去除其中液體成分，即可得富血小板纖維蛋白膜，后者剪碎成為顆粒形式；將細胞膜片片段與富血小板纖維蛋白膜顆粒按照體外篩選的最佳配比關系進行混合后，即制得所需移植材料。本材料可廣泛用于口腔及全身其他部位中小范圍缺損的組織修復及再生，提高了組織修復的效果。
文檔編號A61L27/22GK103100112SQ20121052509
公開日2013年5月15日 申請日期2012年12月7日 優先權日2012年12月7日
發明者張旻, 陳永進, 趙寅華, 李軼杰, 劉南霞, 程百祥, 杜靜, 陳慧, 李強 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學