專利名稱：b型流感嗜血桿菌結合疫苗及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及流感嗜血桿菌疫苗，尤其涉及b型流感嗜血桿菌結合疫苗及其應用。
背景技術：
流感嗜血桿菌根據莢膜的性質分為a，b，c，d，e, f型及不可分型，其中b型流感嗜血桿菌的侵襲力最強。由b型流感嗜血桿菌(Hib)引起的化膿性腦膜炎、肺炎、關節炎、會厭炎等疾病，已成為全球一個重要的公共衛生問題。而研制成功的Hib多糖疫苗及Hib結合疫苗，可有效預防由b型流感嗜血桿菌引起的感染。對于5對以下兒童，尤其是2周歲以下的嬰幼兒，Hib多糖疫苗的保護效果不佳。
優良方法。蛋白載體具有T細胞依賴的特性，在莢膜多糖特異性抗原上加上蛋白載體可將非T細胞依賴性的多糖抗原轉變為T細胞依賴性抗原，激發機體的T輔助細胞產生的一系列的免疫增強效應。對于免疫系統尚未發育成熟的嬰幼兒，尤其是2周歲以下的嬰幼兒而言，結合疫苗大大增強了其免疫效果。現有技術廣泛采用溴化氰活化，己二酰肼衍生，并在碳二亞胺存在下，與蛋白載體例如破傷風類毒素進行結合制備Hib結合疫苗，獲得多糖蛋白結合物。多糖蛋白結合物溶液是一個十分復雜的混合物體系，結合物中殘留未結合的多糖和載體蛋白質等。在對多糖蛋白結合物進行純化的過程中，多采用O. 2mol/L的氯化鈉溶液作為流動相。但是，采用O. 2mol/L的氯化鈉溶液作為流動相，多糖蛋白結合物回收率低。而且多糖蛋白結合物的純化采用O. 2mol/L的氯化鈉溶液，不利于后續工序包括分裝后產品的穩定性。
發明內容
本發明的目的是提供b型流感嗜血桿菌結合疫苗，用于提高多糖蛋白結合物的穩定性。本發明另一目的是提供b型流感嗜血桿菌結合疫苗的劑型。本發明再一目的是提供疫苗在制備預防由b型流感嗜血桿菌感染導致的腦膜炎、肺炎、敗血癥、蜂窩組織炎、關節炎、會厭炎感染性疾病的藥物中的應用。本發明所述b型流感嗜血桿菌結合疫苗，包括如下組分和含量b型流感嗜血桿菌多糖 20-30 μ g/ml ；破傷風類毒素40-100 μ g/ml;pH 7.2-7. 5。所述的b型流感嗜血桿菌結合疫苗，其制備方法包括以下步驟I)制備b型流感嗜血桿菌多糖；2)制備b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風類毒素結合物混合液；3)純化以TRIS-HCl緩沖液作為流動相，用層析法純化步驟2)中的混合液，得到b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液。其中，所述TRIS-HCl緩沖液，濃度為20-100mmol/L，pH值為7. 2-7. 5，優選所述TRIS-HCl 緩沖液濃度為 20-50mmol/L。具體地，步驟如下I)發酵培養b型流感嗜血桿菌采用b型流感嗜血桿菌生產用菌株，菌株復壯、培養、發酵，發酵液通過甲醛殺菌后收獲培養物；2)制備b型流感嗜血桿菌多糖收集的培養物經過離心去除菌體,加入沉淀劑沉淀上清液中的多糖，經過研磨、乙醇沉淀去除核酸，并經過冷酚溶液抽提去除雜蛋白，并通過超濾方法去除殘留小分子物質，通過乙醇沉淀制備精制多糖；3)制備b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風類毒素結合物精制多糖經過溴化氰活化、己二酰肼衍生、在碳二亞胺作用下與破傷風類毒素結合； 4)以TRIS-HCl緩沖液作為流動相，用層析法純化制備b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液。本發明所述疫苗還包括賦形劑，所述賦形劑為TRIS-HCl緩沖液和氯化鈉或TRIS-HCl緩沖液和乳糖。其中，所述TRIS-HCl緩沖液濃度為8-12mmol/L、氯化鈉7. 5-9. 5mg/ml、乳糖20_30mg/ml。本發明還提供含有上述b型流感嗜血桿菌結合疫苗的制劑，包括液體劑和凍干制劑。本發明所述b型流感嗜血桿菌結合疫苗的液體劑的組分為b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風類毒素結合物、TRIS-HCl緩沖液和氯化鈉組成，其中，各組分的濃度為b型流感嗜血桿菌多糖 20-30 μ g/ml ；破傷風類毒素40-100 μ g/ml ；TRIS-HCl 緩沖液8_12mmol/L ；氯化鈉7. 5-9. 5mg/ml。上述b型流感嗜血桿菌結合疫苗液體劑的制備方法，包括如下步驟I)制備b型流感嗜血桿菌結合疫苗；2)半成品配制及分裝步驟I)中加入TRIS-HCl緩沖液，氯化鈉溶液稀釋，余量為注射用水，進行分裝。本發明所述b型流感嗜血桿菌結合疫苗的凍干制劑的組分為b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風類毒素結合物、TRIS-HCl緩沖液和乳糖，其中，各組分的濃度為b型流感嗜血桿菌多糖 20-30 μ g/ml ；破傷風類毒素40-100 μ g/ml ；TRIS-HCl 緩沖液8_12mmol/L ；乳糖20_30mg/ml。上述b型流感嗜血桿菌結合疫苗的凍干劑型的制備方法，包括如下步驟I)制備b型流感嗜血桿菌結合疫苗；2)半成品配制及分裝步驟I)中加入TRIS-HCl緩沖液，氯化鈉溶液稀釋，余量為注射用水，進行分裝；
3)凍干-50'40 V預凍3_4h，然后在真空度5 15Pa下，溫度緩慢升溫至-20°C ±2°C，溫度維持5 7h，再階梯式升溫至30°C，溫度維持6 8h，凍干結束。所述b型流感嗜血桿菌結合疫苗可預防由b型流感嗜血桿菌感染導致的腦膜炎、肺炎、敗血癥、蜂窩組織炎、關節炎、會厭炎等感染性疾病。本發明有益效果在多糖蛋白結合物進行純化的過程中采用緩沖液體系TRIS-HCl緩沖液體系，不僅能夠顯著地提高多糖蛋白結合物純化過程的回收率，而且可增加后續工序產品的穩定性，維持產品的pH值在中性范圍內，避免因為pH值的變化導致產品的質量的潛在變化。 概念的闡釋多糖含量b型流感嗜血桿菌結合疫苗的抗原為b型流感嗜血桿菌的莢膜多糖，抗原含量以多糖的含量進行表征，無論是在原液制備還是在半成品配制過程中。多糖蛋白結合物混合液指在進行多糖與蛋白結合試驗后尚未經過柱層析進行分離，包含有多糖與蛋白結合物大分子及未結合的多糖、蛋白小分子物質。多糖回收率本專利中多糖回收率指的是在進行多糖與蛋白結合后回收的符合《中華人民共和國藥典》三部(2010年版)“b型流感嗜血桿菌結合疫苗”規程規定的原液質量的Hib結合物原液中多糖質量與多糖投料量的比值。高分子結合物多糖蛋白結合物的混合物已經過柱層析純化收集的大分子物質。高分子結合物含量是在經過柱層析純化后收集的大分子物質中，按照《中華人民共和國藥典》三部(2010年版)中高分子結合物含量測定方法測得的以百分數表示的大分子含量。Kd < O. 2的回收率指采用排阻色譜進行測定結合物分子的分配系數時，以Kd< O. 2峰面積與總峰面積的比值。效力試驗用以表征Hib結合疫苗在動物體內產生抗體的水平。按照《中華人民共和國藥典》三部(2010年版)中效力試驗方法檢測.以高于陰性對照組小鼠血清的Cutoff值的百分比表示。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1b型流感嗜血桿菌結合疫苗原液的制備I)采用《中華人民共和國藥典》三部(2010年版)中“b型流感嗜血桿菌結合疫苗”規程規定的菌種培養、發酵及精制多糖制備工藝步驟，制備b型流感嗜血桿菌精制多糖。采用b型流感嗜血桿菌生產用菌株(MH200201，北京民海生物科技有限公司自主分離)，菌株復壯、培養、發酵，發酵液通過甲醛殺菌后收獲培養物；2)收集的培養物經過離心去除菌體，加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)沉淀上清液中的多糖，離心收集多糖，經過研磨、乙醇沉淀去除核酸，并經過冷酚溶液抽提去除雜蛋白，并通過超濾方法去除殘留小分子物質，通過乙醇沉淀制備精制多糖；3)精制多糖經過溴化氰活化、己二酰肼衍生、在碳二亞胺作用下與破傷風類毒素結合，多糖與破傷風類毒素的質量比為1: 1，制得b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風類毒素結合物混合液；參考楊耀、黃鎮等人發表的《b型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗的研制》(中國生物制品學雜志，2002，Vol. 15, No. 3)；4)混合液分別用 O. 02mol/L 的 TRIS-HC1 緩沖液、pH7. 2-7. 5,0. 2mol/L 的氯化鈉溶液作為流動相，按不高于層析柱體積10%的上樣量上樣，兩種介質的上樣量相同。收集V。附近的洗脫液，除菌過濾。表I同一批結合物不同純化介質的檢定結果
權利要求
1.一種b型流感嗜血桿菌結合疫苗，其特征在于，包括如下組分和含量 b型流感嗜血桿菌多糖 20-30 u g/ml ； 破傷風類毒素40-100 u g/ml ；pH 值 7. 2-7. 5。
2.根據權利要求1所述的b型流感嗜血桿菌結合疫苗，其特征在于，其制備方法包括以下步驟 1)制備b型流感嗜血桿菌多糖； 2)制備b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風類毒素結合物混合液； 3)純化以TRIS-HCl緩沖液作為流動相，用層析法純化步驟2)中的混合液，得到b型流感嗜血桿菌結合疫苗。
3.根據權利要求2所述的b型流感嗜血桿菌結合疫苗，其特征在于，所述TRIS-HCl緩沖液，濃度為 20-100mmol/L，pH 值為1. 2-7. 5。
4.根據權利要求3所述的b型流感嗜血桿菌結合疫苗，其特征在于，所述TRIS-HCl緩沖液濃度為20_50mmol/L。
5.根據權利要求1所述的b型流感嗜血桿菌結合疫苗，其特征在于，還包括賦形劑。
6.根據權利要求5所述的b型流感嗜血桿菌結合疫苗，其特征在于，所述賦形劑為TRIS-HCl緩沖液和氯化鈉； 或TRIS-HCl緩沖液和乳糖。
7.根據權利要求6所述的結合疫苗，其特征在于，所述TRIS-HCl緩沖液濃度為8_12mmol/L、氯化鈉濃度為 7. 5-9. 5mg/ml、乳糖濃度為 20-30mg/ml。
8.根據權利要求1-7任一項所述的結合疫苗，其特征在于，所述結合疫苗進一步制備得到百白破b型流感嗜血桿菌聯合疫苗。
9.權利要求1-8任一項所述b型流感嗜血桿菌結合疫苗在制備用于預防由b型流感嗜血桿菌感染導致的腦膜炎、肺炎、敗血癥、蜂窩組織炎、關節炎、會厭炎感染性疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種b型流感嗜血桿菌結合疫苗及其應用。所述b型流感嗜血桿菌結合疫苗包括b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風類毒素結合物，pH 7.2-7.5。本發明在b型流感嗜血桿菌多糖蛋白結合物進行純化的過程中采用TRIS-HCl緩沖液體系，不僅能夠顯著地提高多糖蛋白結合物純化過程的回收率，而且可增加后續工序產品的穩定性，維持產品的pH值在中性范圍內，避免因為pH值的變化導致產品的質量的潛在變化。
文檔編號A61K39/102GK103007264SQ20121054627
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月14日 優先權日2012年12月14日
發明者孫曉東, 劉建凱 申請人:北京民海生物科技有限公司