包含c-met拮抗劑和b-raf拮抗劑的組合治療的制作方法

包含c-met拮抗劑和b-raf拮抗劑的組合治療的制作方法
【專利摘要】一般地，本發明涉及分子生物學和生長因子調節領域。更具體地，本發明涉及用于治療病理狀況(諸如癌癥)的療法。
【專利說明】包含C-MET拮抗劑和B-RAF拮抗劑的組合治療
[0001]對相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年9月19日提交的美國專利申請號61/536，436、2011年10月25日提交的美國專利申請號61/551，328、2012年2月14日提交的美國專利申請號61/598，783、和2012年5月I日提交的美國專利申請號61/641，139的優先權，通過述及將其內容完整收入本文。
[0003]序列表
[0004]本申請含有序列表，已經以ASCII格式經EFS-Web提交且通過述及完整收入本文。2012年8月28日創建的所述ASCII拷貝命名為P47361W0.txt，并且大小為16，669個字節。
發明領域
[0005]一般地，本發明涉及分子生物學和生長因子調節領域。更具體地，本發明涉及用于治療病理狀況(諸如癌癥)的療法。
[0006]發明背景
[0007]癌癥仍然是對人類健康的最致命威脅之一。在美國，癌癥每年影響近130萬新患者，而且是位于心臟病之后的第二位死因，占4例死亡中的大約I例。例如，乳腺癌是癌癥的第二位最常見形式，而且是美國女性中的第二位癌癥殺手。還預測癌癥可能在5年內超越心血管疾病成為第一位死因。實體瘤對大多數上述死亡負有責任。雖然某些癌癥的醫學治療中已經取得了重大進步，但是所有癌癥的總體5年存活率在最近20年里只改進了約10%。癌癥(或稱作惡性腫瘤)以不受控制的方式快速生長和轉移，使得及時檢測和治療極端困難。
[0008]盡管癌癥治療獲得了重大進展，但是仍然在尋找改良的療法。
[0009]通過述及而完整收錄本文中引用的所有參考文獻(包括專利申請和出版物)。
[0010]發明概述
[0011]提供了 c-met拮抗劑用于有效治療癌癥患者的用途。本申請還提供了用于診斷疾病的更好方法，以用于任選用c-met拮抗劑與B-raf拮抗劑組合治療該疾病。特別地，記載的結果證明了使用B-raf拮抗劑vemurafenib (PLX-4032)和c-met拮抗劑的組合治療導致與單獨用vemurafenib治療相比腫瘤消退的統計學顯著改善,包括部分響應的驚人改善。c-met表達與對vemurafenib治療的敏感性負相關。另外，相對于用B_raf拮抗劑治療的具有更低循環HGF水平的患者，具有更高水平的循環肝細胞生長因子(HGF)的具有B-raf突變體黑素瘤的患者在用B-raf拮抗劑治療時顯示出實質性縮短的無進展存活和總體存活。
[0012]本發明提供了用于治療諸如癌癥等病理狀況的組合療法，其中c-met拮抗劑與B-raf拮抗劑組合，由此提供顯著的抗腫瘤活性。
[0013]一方面，提供了用于治療形成對B-raf拮抗劑的抗性的可能性升高的癌癥患者的方法，其包括施用有效量(組合地)的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
[0014]一方面，提供了用于提高和/或恢復對B-raf拮抗劑的敏感性的方法，其包括對癌癥患者施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。[0015]一方面，提供了用于延長B-raf拮抗劑敏感性時段的方法，其包括對癌癥患者施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
[0016]一方面，提供了用于治療具有B-raf抗性(B_raf拮抗劑抗性)癌癥的患者的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
[0017]一方面，提供了用于延長B-raf拮抗劑響應持續時間的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
[0018]一方面，提供了用于延遲或阻止形成HGF介導的B-raf抗性癌癥的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
[0019]一方面，提供了用于測定c-met生物標志物表達的方法，其包括測定患者的癌癥是否表達c-met生物標志物的步驟,其中c-met生物標志物表達指示該患者很可能具有B-raf拮抗劑抗性癌癥。在一些實施方案中，該患者的癌癥已顯示表達B-raf生物標志物。在一些實施方案中，c-met生物標志物表達為蛋白質表達且使用IHC在來自該患者的樣品中測定。在一些實 施方案中，大量的c-met生物標志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF檢測測定的)指示該患者很可能具有B_raf拮抗劑抗性癌癥。如本文中使用的，“升高的”或“高的” c-met指與患者對治療的響應性有關的c-met量。在一些實施方案中，小量的c-met生物標志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF檢測測定的)指示該患者不太可能具有B-raf拮抗劑抗性癌癥。在一些實施方案中，高c-met為低的，中等的或高的測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，Hl 155，和HEK-293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中，高c-met為中等的或高的測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，Hl 155，和HEK-293的c-met染色強度而言。如本文中使用的，“小”量的c-met指與缺乏對治療的響應有關的c-met量，或者在一些實施方案中為與對治療的響應較差(例如與無治療相比臨床受益減少)有關的c-met量。在一些實施方案中，“低” c-met為低的或無測定c_met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c_met染色強度而言。在一些實施方案中，“低”c-met表達為無測定c-met表達,例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c_met染色強度而言。
[0020]一方面，提供了用于測定c-met生物標志物表達的方法，其包括測定患者的癌癥是否表達c-met生物標志物的步驟,其中c-met生物標志物表達指示該患者很可能形成B-raf抗性癌癥。在一些實施方案中，該患者的癌癥已顯示表達B-raf生物標志物。在一些實施方案中，c-met生物標志物表達為蛋白質表達且使用IHC在來自該患者的樣品中測定。在一些實施方案中，用B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑治療該患者。在一些實施方案中，大量的c-met生物標志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF檢測測定的)指示該患者很可能具有B-raf拮抗劑抗性癌癥。在一些實施方案中，高c-met為低的，中等的或高的測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441,H1155，和HEK-293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中，高c-met為中等的或高的測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，Hl 155，和HEK-293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中，“低”c-met為低的或無測定c_met表達,例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c_met染色強度而言。在一些實施方案中，“低”c-met表達為無測定c-met表達,例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c_met染色強度而言。
[0021]一方面，提供了用于測定c-met生物標志物表達的方法，其包括測定患者的癌癥是否表達c-met生物標志物的步驟,其中c-met生物標志物表達指示該患者是用c_met拮抗劑和B-raf拮抗劑治療的候選:提高該患者的癌癥對B-raf拮抗劑的敏感性,恢復該患者的癌癥對B-raf拮抗劑的敏感性，延長該患者的癌癥對B-raf拮抗劑的敏感性的時段，和/或阻止該患者的癌癥形成HGF介導的B-raf拮抗劑抗性。在一些實施方案中，該患者的癌癥已顯示表達B-raf生物標志物。在一些實施方案中，c-met生物標志物表達為蛋白質表達且使用IHC在來自該患者的樣品中測定。在一些實施方案中，用B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑治療該患者。在一些實施方案中，大量的c-met生物標志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF檢測測定的)指示該患者很可能具有B_raf拮抗劑抗性癌癥。在一些實施方案中，高c-met為低的，中等的或高的測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c_met染色強度而言。在一些實施方案中，高c-met為中等的或高的測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，Hl 155，和HEK-293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中，“低” c-met為低的或無測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中，“低” c-met表達為無測定c_met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c_met染色強度而言。
[0022]一方面，提供了用于為具有已顯示表達B-raf生物標志物的癌癥的患者選擇療法的方法，其包括在來自該患者的樣品中測定c-met生物標志物的表達,并基于該生物標志物的表達水平選擇癌癥藥物。在一些實施方案中，如果癌癥樣品表達c-met生物標志物的話，選擇該患者用c-met拮 抗劑與B-raf拮抗劑組合治療。在一些實施方案中，使用治療有效量的c-met拮抗劑和B-raf拮抗劑對該患者治療癌癥。在一些實施方案中，如果癌癥樣品表達基本上檢測不到水平的c-met生物標志物的話，選擇該患者用除c-met拮抗劑以外的癌癥藥物治療。在一些實施方案中，大量的c-met生物標志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF檢測測定的)指示該患者很可能具有B_raf拮抗劑抗性癌癥。在一些實施方案中，高c-met為低的，中等的或高的測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c_met染色強度而言。在一些實施方案中，高c-met為中等的或高的測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團SA549，H441，H1155jPHEK-293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中，“低” c_met為低的或無測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中，“低” c-met表達為無測定c_met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c_met染色強度而言。
[0023]一方面，提供了用于將患者鑒定為用B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑治療的候選的方法，其包括測定該患者的癌癥表達c-met生物標志物。在一些實施方案中，大量的c-met生物標志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF檢測測定的)指示該患者很可能具有B-raf拮抗劑抗性癌癥。在一些實施方案中，高c-met為低的，中等的或高的測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，Hl 155，和HEK-293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中，高c-met為中等的或高的測定c_met表達,例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中，“低”c-met為低的或無測定c-met表達,例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中，“低” c-met表達為無測定c-met表達,例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549,H441, Hl 155，和HEK-293的c-met染色強度而言。
[0024]一方面，提供了用于將患者鑒定為有風險形成對B-raf拮抗劑的抗性的方法，其包括測定該患者的癌癥表達c-met生物標志物。
[0025]一方面，提供了測定B-raf拮抗劑治療患者中癌癥的治療功效的方法，其包括通過免疫測定法，ELISA，雜交測定法，PCR，5’核酸酶測定法，IHCjP /或RT-PCR測定自所述患者獲得的樣品中c-met生物標志物和/或B-raf生物標志物的存在情況，其中存在c_met生物標志物指示B-raf拮抗劑在治療上有效治療所述受試者中的癌癥。在一些實施方案中，該患者的癌癥已顯示表達B-raf生物標志物。在一些實施方案中，B-raf生物標志物為突變型B-raf。在一些實施方案中，突變型B-raf為組成性活化的B_raf。在一些實施方案中，突變型B-raf為B-raf V600。在一些實施方案中，B_raf V600為B_raf V600E。在一些實施方案中，突變型 B-raf 為 B-raf V600K (GTG)AAG)，V600R (GTG)AGG)，V600E (GTG)GAA)和/或V600D(GTG>GAT)中的一項或多項。在一些實施方案中，使用包括下述各項的方法測定突變型B-raf生物標志物表達:(a)對樣品(諸如患者癌癥樣品)實施基因表達序型分析，PCR (諸如rtPCR或等位基因特異性PCR)，RNA-seq,微陣列分析，SAGE, MassARRAY技術，或FISH中的一項或多項；并(b)測定樣品中突變型B-raf生物標志物的表達。在一些實施方案中，使用包括下述各項的方法測定突變型B-raf生物標志物表達:(a)對自患者癌癥樣品(諸如FFPE固定的患者癌癥樣品)提取的核酸實施PCR ;并(b)測定樣品中突變型B-raf生物標志物的表達。在一些實施方案中，該患者的癌癥已顯示表達c-met生物標志物。在一些實施方案中，使用免疫組織化學(IHC)測定c-met生物標志物表達。在一些實施方案中，相對于對照細胞團粒的c-met染色強度測定c-met表達,而且高c_met表達為低的，中等的和強的測定 c-met表達，相對于細胞系HEK-293，A549和細胞系H441而言。在一些實施方案中，相對于對照細胞團粒的c-met染色強度測定c-met表達,而且高c_met表達為中等的和強的測定c-met表達，相對于細胞系A549和細胞系H441而言。在一些實施方案中，c-met表達為低的c-met表達。在一些實施方案中，相對于對照細胞團粒的c_met染色強度測定c-met表達,而且低c-met表達為無或低的測定c_met表達,相對于細胞系H1155和細胞系HEK-293而言。在一些實施方案中，相對于對照細胞團粒的c-met染色強度測定c-met表達，而且低c-met表達為無測定c_met表達，相對于細胞系H1155而言。在一些實施方案中，c-met生物標志物表達為核酸表達，而且使用PCR，RNA-seq，微陣列分析，SAGE,MassARRAY技術，或FISH在來自該患者的樣品中測定。在一些實施方案中，使用磷酸-ELISA測定c-met生物標志物表達。在一些實施方案中，c-met生物標志物表達為磷酸-met表達。在一些實施方案中，通過測定肝細胞生長因子(HGF)的表達(例如使用ELISA)來測定c-met生物標志物表達。在一些實施方案中，HGF表達為自分泌。在一些實施方案中，HGF在腫瘤或腫瘤基質中表達(例如使用IHC測定)。在一些實施方案中，在患者的血清中測定表達(例如使用ELISA測定)。在一些實施方案中，癌癥為黑素瘤，結腸直腸癌，乳腺癌，卵巢癌或甲狀腺癌。在一些實施方案中，癌癥為黑素瘤。在一些實施方案中，該癌癥為乳頭狀甲狀腺癌。
[0026]一方面，本發明提供了用于確定黑素瘤患者預后的方法，其包括在來自該患者的樣品中測定c-met生物標志物的表達情況，其中c-met生物標志物為HGF且HGF表達預示該受試者中的癌癥。在一些實施方案中，HGF表達升高預示例如用B-raf抑制劑(例如vemurafenib)治療患者時無進展存活縮短和/或總體存活縮短。在一些實施方案中，在患者血清中測定HGF表達，例如使用ELISA。在一些實施方案中，患者血清中的HGF表達超出中值HGF表達水平(諸如群體中的中值HGF表達水平)。在一些實施方案中，患者血清中的HGF表達超出例如約330ng/ml。在一些實施方案中，患者血清中的HGF表達超出約300ng/ml, 310ng/ml,320ng/ml,330ng/ml,340ng/ml,350ng/ml,360ng/ml,370ng/ml,380ng/ml,390ng/ml, 400ng/ml, 420ng/ml, 440ng/ml, 460ng/ml, 480ng/ml, 500ng/ml,或更高。在一些實施方案中，選擇該患者用有效量的c-met拮抗劑和B-raf拮抗劑治療。在一些實施方案中，用有效量的c-met拮抗劑和B-raf拮抗劑治療該患者。在一些實施方案中，黑素瘤表達(已顯示表達)B-raf V600。
[0027]在一些實施方案中，該患者的癌癥已顯示表達B-raf生物標志物。B_raf生物標志物可以是突變型B-raf。突變型B-raf為組成性活化的B-raf。在一些實施方案中，突變型 B-raf為 B-raf V600。B-raf V600 可以是 B_raf V600E。突變型 B_raf的一個非限制性例示性列表為:B-raf V600K (GTG>AAG), V600R(GTG>AGG), V600E (GTG)GAA)和 / 或V600D(GTG>GAT)。在一些實施方案中，檢測突變型B_raf多肽。在一些實施方案中，檢測突變型B-raf核酸。“V600E”指BRAF第1799位核苷酸處導致谷氨酰胺替代B_raf第600位氨基酸處纈氨酸的突變(T>A)。“V600E”在先前的編號系統(Kumar et al.，Clin.CancerRes.9:3362-3368, 2003)下也稱作 “V599E” (1796T>A)。
[0028]在一些實施方案中，使用包括下述各項的方法測定突變型B-raf生物標志物表達:(a)對樣品(諸如患者癌癥樣品)實施基因表達序型分析，PCR(諸如rtPCR或等位基因特異性PCR)，RNA-seq，5’核酸酶測定法(例如TaqMan)，微陣列分析，SAGE, MassARRAY技術，或FISH中的一項或多項；并(b)在樣品中測定突變型B-raf生物標志物的表達。在一些實施方案中，使用包括下述各項的方法測定突變型B-raf生物標志物表達:(a)對自患者癌癥樣品(諸如FFPE固定的患者癌癥樣品)提取的核酸實施RT-PCR ;并(b)在樣品中測定突變型B-raf生物標志物的表達。在一些實施方案中，使用包括下述各項的方法測定突變型B-raf生物標志物表達:(a)對自患者癌癥樣品(諸如FFPE固定的患者癌癥樣品)提取的核酸實施PCR;并(b)在樣品中測定突變型B-raf生物標志物的表達。在一些實施方案中，使用包括下述各項的方法測定突變型B-raf生物標志物表達:(a)使第一和第二寡核苷酸雜交至B-raf靶序列的至少一種變體；其中所述第一寡核苷酸至少與靶序列的一種或多種變體部分互補且所述第二寡核苷酸至少與靶序列的一種或多種變體部分互補且具有至少一個與靶序列的僅一種變體互補的內部選擇性核苷酸；(b)用核酸聚合酶延伸第二寡核苷酸；其中當所述選擇性核苷酸與靶形成堿基對時，所述聚合酶能夠優先延伸所述第二寡核苷酸，且當所述選擇性核苷酸與靶不形成堿基對時，實質性較少；并(C)檢測所述寡核苷酸延伸的產物，其中延伸表示存在寡核苷酸對其具有互補選擇性核苷酸的靶序列變體。在一些實施方案中，B-raf靶序列的一種或多種變體為野生型B-raf和V600E B_raf。[0029]在一些實施方案中，該患者的癌癥已顯示表達c-met生物標志物。c_met生物標志物可以是c-met多肽。在一些實施方案中，使用免疫組織化學(IHC)測定c-met生物標志物表達。在一些實施方案中，大量的c-met生物標志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF檢測測定的)指示該患者很可能具有B_raf拮抗劑抗性癌癥。在一些實施方案中，高c-met為低的，中等的或高的測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c_met染色強度而言。在一些實施方案中，高c-met為中等的或高的測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155JPHEK_293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中，“低” c-met為低的或無測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中低”c_met表達為無測定c_met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c_met染色強度而言。在一些實施方案中，IHC得分為2。在一些實施方案中，IHC得分為3。在一些實施方案中，IHC得分為I。在一些實施方案中，IHC得分為O。在一些實施方案中，高c-met生物標志物表達為50%或更多的腫瘤細胞具有中等c-met染色強度，組合的中等/高c_met染色強度或高c-met染色強度。在一些實施方案中，使用磷酸-ELISA測定c-met生物標志物表達。在一些實施方案中，c-met生物標志物表達為磷酸-met表達,而且在一些實施方案中，使用抗磷酸-c-met抗體檢測。
[0030]c-met生物標志物表達可以是核酸表達。在一些實施方案中，使用PCR (諸如rtPCR或等位基因特異性PC R)，RNA-seq,微陣列分析，SAGE, MassARRAY技術，或FISH在來自該患者的樣品中測定c-met生物標志物。
[0031]可以通過測定肝細胞生長因子(HGF)的表達來測定c-met生物標志物。如此，在一些實施方案中，c-met生物標志物為HGF表達，而且例如在血清中(例如使用ELISA)或通過IHC(例如腫瘤或腫瘤基質)檢測HGF表達。HGF表達可以是自分泌。HGF可以在腫瘤基質中表達。在一些實施方案中，在患者的血清中測定HGF表達。在一些實施方案中，HGF表達水平超出中值HGF表達水平。在一些實施方案中，中值HGF表達水平為約330pg/mL。在一些實施方案中，血清中的HGF表達大于中值HGF表達水平。在一些實施方案中，血清中的HGF表達大于約330pg/ml。在一些實施方案中，患者血清中的HGF表達超出約300ng/ml,310ng/ml,320ng/ml,330ng/ml,340ng/ml,350ng/ml,360ng/ml,370ng/ml,380ng/ml,390ng/ml, 400ng/ml, 420ng/ml, 440ng/ml, 460ng/ml, 480ng/ml, 500ng/ml,或更多。
[0032]c-met拮抗劑可以是拮抗性抗c-met抗體。在一些實施方案中，抗c_met抗體包含:(a)HVRl-HC，其包含SEQ ID NO:1中所示序列；(b)HVR2-HC，其包含SEQ ID NO: 2中所示序列；(c)HVR3-HC，其包含SEQ ID NO: 3中所示序列；(d) HVR1-LC，其包含SEQ ID NO: 4中所示序列;(e)HVR2-LC，其包含SEQ ID NO:5中所示序列；和(f)HVR3-LC，其包含SEQ IDNO:6中所示序列。在一些實施方案中，抗c-met抗體是單價的且包含:(a)第一多肽,其包含重鏈，所述多肽包含SEQ ID N0:11中所示序列；(b)第二多肽，其包含輕鏈，該多肽包含SEQ ID N0:12中所示序列；和第三多肽，其包含Fe序列，該多肽包含SEQ ID N0:13中所示序列，其中重鏈可變域和輕鏈可變域作為復合物存在且形成單一抗原結合臂，其中第一和第二 Fe多肽存在于復合物中且形成與包含所述抗原結合臂的Fab分子相比提高所述抗體片段穩定性的Fe區。[0033]在一些實施方案中，c-met拮抗劑為 crizotinib, tivantinib, carbozantinib,MGCD-265, ficlatuzumab,人源化 TAK-701, rilotumumab, foretinib, h224Gll, DN-30,MK-2461, E7050, MK-8033, PF-4217903, AMG208, JNJ-38877605, EMD1204831, INC-280,LY-2801653, SGX-126, RP1040, LY2801653, BAY-853474, GDC-0712，和 / 或 LA480 中的一項或多項。在一些實施方案中，c-met拮抗劑為crizotinib。在一些實施方案中，c_met拮抗劑為tivantinib。在一些實施方案中，c-met拮抗劑為⑶C-0712。
[0034]在一些實施方案中，B-raf拮抗劑為 sorafenib，PLX4720, PLX-3603, GSK2118436,⑶C-0879，N- (3- (5- (4-氯苯基)-1H-吡咯并[2，3_b]吡啶-3-羰基)-2，4- 二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺，vemurafenib, GSK2118436，RAF265 (Novartis)，XL281, ARQ736, BAY73-4506中的一項或多項。在又一些實施方案中，B-raf拮抗劑為vemurafenib。在又一些實施方案中，B-raf拮抗劑為GSK2118436。Β-raf拮抗劑可以是對B_raf V600E選擇性的。
[0035]B-raf拮抗劑和c_met拮抗劑可以同時施用。B_raf拮抗劑和c_met拮抗劑可以序貫施用。在一些實施方案中，在c-met拮抗劑之前施用B-raf拮抗劑。在一些實施方案中，在B-raf拮抗劑之前施用c-met拮抗劑。
[0036]一方面，提供了包括對所述受試者施用至少一種別的治療(諸如癌癥藥物)的方法。
[0037]癌癥可以是黑素瘤，結腸直腸癌，卵巢癌，乳腺癌或乳頭狀甲狀腺癌。本文中描述了其它癌癥。在一些實施方案中，癌癥為黑素瘤。在一些實施方案中，癌癥對B-raf拮抗劑有抗性。在一些實施方案中，患者先前用B-raf拮抗劑治療過。在一些實施方案中，患者先前沒有用B-raf拮抗劑 治療過。在一些實施方案中，患者對B-raf拮抗劑不應。
[0038]此外，本發明涉及為癌癥藥物(例如c-met拮抗劑)登廣告的方法，包括對目標受眾宣傳該癌癥藥物用于基于c-met生物標志物的表達(而且，在一些實施方案中，進一步基于B-raf生物標志物(例如突變型B-raf生物標志物)的表達)來治療癌癥患者的用途。宣傳可以通過任何可得手段來進行。在一些實施方案中，該宣傳是通過伴隨c-met拮抗劑(諸如抗c-met抗體)的商業性配制劑的包裝插頁進行的。該宣傳也可以通過伴隨第二藥物的商業性配制劑的包裝插頁來進行(在治療為使用c-met拮抗劑和第二藥物(例如B-raf拮抗劑,諸如vemurafenib)的組合療法時)。宣傳可以通過書面或口頭告知內科醫師或健康護理提供者來進行。在一些實施方案中，宣傳通過包裝插頁來進行，其中包裝插頁提供說明書來接受c-met拮抗劑,和在一些實施方案中，與第二藥物,諸如B-raf拮抗劑(諸如vemurafenib)組合治療。在一些實施方案中，宣傳之后是在有或無第二藥物(例如vemurafenib)的情況中用c_met拮抗劑治療患者。在一些實施方案中，宣傳之后是在有或無c-met拮抗劑治療的情況中用第二藥物治療患者。在一些實施方案中,包裝插頁指示在患者的癌癥樣品表達高c-met生物標志物的情況中使用c-met拮抗劑來治療患者。在一些實施方案中，包裝插頁指示在患者的癌癥樣品表達低c-met生物標志物的情況中不使用c-met拮抗劑來治療患者。
[0039]在一些方面，本發明的特征在于指導表達c-met生物標志物的癌癥(諸如黑素瘤)患者的方法，其通過提供接受抗c-met抗體(例如抗c-met抗體)治療，和在一些實施方案中，第二藥物(諸如B-raf拮抗劑,例如vemurafenib)治療以例如延長患者的存活、降低患者的癌癥復發風險和/或提高患者的存活可能性的說明書來進行。在一些實施方案中，該治療包括對黑素瘤患者組合施用抗c-met抗體(例如MetMAb)和B_raf拮抗劑(諸如vemurafenib)。在一些實施方案中，該方法進一步提供說明書來接受至少一種化療劑治療。在某些實施方案中，依照該指導方法的指導來治療患者。
[0040]本發明還提供了商業方法,包括銷售c-met拮抗劑(例如抗c_met抗體)，用于在人患者中治療癌癥(例如黑素瘤)，例如用于延長存活、降低患者的癌癥復發可能性、和/或提聞患者的存活可能性，其中患者的癌癥表達聞(升聞的)c-met生物標志物表達。在一些實施方案中，該治療包括對癌癥患者施用抗c-met抗體(例如onartuzumab (MetMAb)),和在一些實施方案中，施用第二藥物(例如B-raf拮抗劑,諸如vemurafenib)。
[0041]一方面，本發明提供了診斷試劑盒，其包含一種或多種用于測定來自癌癥(例如黑素瘤)患者的樣品中c-met生物標志物的表達的試劑。該診斷試劑盒適合與本文中描述的任何方法一起使用。在一些實施方案中，該試劑盒進一步包含使用該試劑盒來選擇c-met藥物以治療黑素瘤患者的說明書。在一些實施方案中，該治療包括對癌癥患者施用抗c-met抗體(例如onartuumab (MetMAb)),和在一些實施方案中，第二藥物(例如B_raf拮抗劑,諸如 vemurafenib)。
[0042]本發明還涉及制品,其包含包裝在一起的c-met拮抗劑和包裝插頁,該c-met拮抗劑在藥學可接受載體中，該包裝插頁指示該c-met拮抗劑用于基于c-met生物標志物的表達治療癌癥患者。治療方法包括本文中公開的任何治療方法。
[0043]附圖簡述
[0044]圖1:在癌基因成癒的癌細胞系(oncogene addicted cancer cell line)中 RTK配體減弱激酶抑制。a,描繪來自RTK配體矩陣篩選(matrix screen)的結果的圖。在存在或缺失RTK配體(50ng/mL)的情況中用漸增濃度范圍的適宜激酶抑制劑處理激酶成癮的癌細胞系。b，來自用有效激酶抑制劑和六種獨特的RTK配體中每一種處理的41種激酶成癮的癌細胞系的矩陣篩選結果的匯總。NR代表無挽救，P代表部分挽救，而R代表完全挽救。c，細胞存活力測定法，其證明了 RTK配體的藥物處理的癌細胞系(72h)的影響的多樣性。如指示的，用50ng/mL RTK配體共處理細胞，其中觀察到三種不同結果-無挽救，部分挽救或完全挽救。誤差棒代表均值+/-s.e.m。
[0045]圖2:促存活途徑再活化與RTK配體挽救有關。a，免疫印跡，其顯示了激酶抑制(I μ M，2h)后急性RTK配體處理(50ng/mL)對sAKT和ERK磷酸化的影響。指示了 RTK配體挽救，灰色方形指示完全挽救，而黑色方形指示部分挽救，如通過初始篩選測定的(圖lb)。b，細胞存活力測定法，其證明了藥物處理(72h)后三種激酶成癮的癌細胞系中對細胞增殖的阻抑。如指示的，在存在適宜第二激酶抑制劑(0.5μΜ)的情況中用50ng/mL RTK配體共處理細胞。PD:PD173074, Lap:lapatinib, Criz:crizotinib。誤差棒代表均值+/-s.e.m。c，免疫印跡，其顯示了在存在和缺失RTK配體(50ng/mL，2h)的情況中急性激酶抑制(I μ Μ)對AKT和ERK磷酸磷酸化的影響。在適宜時用第二激酶抑制劑(0.5 μ Μ)共處理細胞細胞。Sun:sunitinib, PD:PD173074, PLX:PLX4032, Lap:lapatinib, Erl:erlotinib,Criz:crizotinib。
[0046] 圖3:在HER2擴增的細胞系中HGF促進lapatinib抗性。a，免疫印跡，其顯示了如指不的，用 lapatinib (Lap, I μ M)，HGF (50ng/mL)和 crizotinib (Criz, 0.5 μ M)處理后AU565HER2擴增的乳腺癌細胞中對凋亡(遭到切割的PAPR)的阻抑。b，免疫印跡，其顯示了一組HER2擴增的乳腺癌細胞系中的pMET和MET表達。指示了 HGF挽救，黑色方形指示部分挽救，如通過初始篩選測定的(圖1b)。c,如指示的,用lapatinib (Lap, I μ M), HGF (50ng/mL)或crizotinib (Criz，(λ 5 μ M)任一處理的AU565HER2擴增的乳腺癌細胞的Syto60染色。每三天處理細胞，持續指示的數據。突變代表3項獨立實驗，而且數值指示均值+/-s.d。d，免疫印跡，其顯示了兩種MET陽性(AU565，HCC1954)和一種MET陰性(BT474)HER2擴增的細胞系中pAKT和pERK的再活化。如指示的，用lapatinib (Lap, I μ Μ), HGF (50ng/mL)或crizotinib (Criz，0.5 μ Μ)任一處理細胞(2h)。e，代表性載玻片，其顯示了 HER2陽性(3+)乳腺癌組織中的MET表達。f，用Iapatinib(IyM)和HGF (50ng/mL)處理3次后對MET表達更高的AU565細胞的選擇。g，如指示的，用lapatinib (5 μ M)和crizotinib (I μ Μ)任一處理的HCC1954HER2擴增的乳腺癌細胞的Syto60染色。每周兩次處理細胞，持續指示的時間。圖像代表3項獨立實驗，而且數值指示均值+/-s.d。
[0047]圖4:在BRAF突變體黑素瘤細胞系中HGF促進PLX4032抗性。a，左邊，免疫印跡，其顯示了一組BRAF突變體黑素瘤細胞系中的pMET和MET表達。顯示了 HGF挽救，灰色方形代表完全挽救，黑色方形代表部分挽救，而白色方形代表無挽救。右邊，在存在HGF (72h)的情況中PLX4032 (I μ Μ)處理的BRAF突變體黑素瘤系中如通過密度測定術測定的MET表達和百分比挽救之間的關聯。b，免疫印跡，其顯示了三種MET陽性(NAE，624MEL，A375)和兩種MET陰性(M14，Hs693T)BRAF突變體細胞系中pERK的再活化。如指示的，用PLX4032 (PLX，I μ M)，HGF (50ng/mL)或 crizotinib (Criz，0.5 μ Μ)處理細胞(2h)。c，如指示的,用PLX4032(5yM)和/或crizotinib (I μ Μ)任一處理的624MEL BRAF突變體黑素瘤細胞的Syto60染色 。每周兩次處理細胞，持續指示的時間。圖像代表3項獨立實驗，而且數值指示均值+/-s.d。d，腫瘤生長測定法，其顯示了使用3D6MET激動性抗體活化MET受體對PLX4032處理在928MEL異種移植物中的效果的影響。如指示的，用對照抗體(抗gpl20)，3D6 (抗MET激動性抗體)，RG7204 (PLX4032)或⑶C-0712 (MET小分子抑制劑)任一處理小鼠，每組10只,持續4周。誤差棒代表均值+/-s.e.m。
[0048]圖5:a，免疫印跡，其顯示了用TOGF刺激(50ng/mL，30min)后TOGFR的活化。b，來自用順鉬和六種獨特的RTK配體共處理的六種激酶成癮的癌細胞系的篩選結果的匯總。NR代表無挽救。c，細胞存活力測定法，其證明了藥物治療(72h)后三種激酶成癮的癌細胞系中對細胞增殖的阻抑。如指示的，在存在適宜第二激酶抑制劑(0.5μΜ)的情況中用50ng/mL RTK 配體共處理細胞。PD:PD173074, Lap:lapatinib, Criz:crizotinib0 誤差棒代表均值+/-s.e.m。d，免疫印跡，其顯示了在存在或缺失RTK配體(50ng/mL，2h)的情況中急性激酶抑制(ΙμΜ)對AKT和ERK磷酸化的影響。在適宜時用第二激酶抑制劑(0.5μΜ)共處理細胞。Criz:crizotinib, PD:PD173074, Lap:lapatinib。
[0049]圖6:a，免疫印跡，其顯示來自矩陣篩選的一組41種激酶成癮的癌細胞系中MET，PDGFR a，IGFlRP , EGFR, HER2, HER3, FGFRl, FGFR2 和 FGFR3 的表達。指示了 RTK 配體挽救；灰色方形代表完全挽救，黑色方形代表部分挽救，白色方形代表無挽救，而陰影線方形代表配體相關激酶。X代表移除的樣品，amp代表擴增的，而mut代表突變的。使用β -微管蛋白測定相等加載。b，關聯RTK表達與RTK配體挽救激酶成癮的細胞免于激酶抑制的能力的表。使用2x2列聯表確定統計學顯著性。給出了 P值。
[0050]圖7:a，免疫印跡，其證明了在受體表達、非RTK配體挽救的細胞中在不偶聯下游存活信號的情況中受體的活化。PLX:PLX4032，Lap:lapatinib。b，免疫印跡，其證明了在受體表達、非RTK配體挽救的細胞中在偶聯至少一種下游存活信號的情況中受體的活化。PLX:PLX4032, TAE:TAE684, Erl:erlotinib。c，免疫印跡，其證明了在受體表達、非 RTK配體挽救的細胞中RTK配體未能活化適宜受體和相應下游存活信號。PLX:PLX4032, TAE:TAE684, Erl:erlotinib。
[0051]圖8:a，細胞存活力測定法，其證明了用TAE684或crizotinib處理(72h)處理后在H3122EML4-ALK易位的NSCLC癌細胞系中對細胞增殖的阻抑。用50ng/mL HGF共處理細胞。誤差棒代表均值+/-s.e.m。b，免疫印跡，其顯示了在存在或缺失HGF(50ng/mL，2h)的情況中急性TAE684或crizotinib (I μ Μ)處理對AKT和ERK磷酸化的影響。C，如指示的，在存在或缺失HGF (50ng/mL)的情況中用TAE684 (2 μ Μ)處理的H2228EML4-ALK易位的NSCLC細胞的Syto60染色。每3天處理細胞,持續9天。d,如指示的,在存在和缺失HGF(50ng/mL)的情況中用Erlotinib (5 μ Μ)處理的H358EGF樣配體驅動的NSCLC細胞的Syto60染色。每3天處理細胞，持續9天。圖像代表3項獨立實驗，而且數值指示均值+/-s.d。
[0052]圖9顯示a，細胞存活力測定法，其證明了在用PLX4032 (72h)處理后在兩種BRAF突變體細胞系中對細胞增殖的阻抑。如指示的，用50ng/mL RTK配體和crizotinib (Criz, 0.5 μ M)共處理細胞。誤差棒代表均值+/_s.e.m。b,時間過程,其顯示了用Iapatinib(IyM)處理的AU565HER2擴增的乳腺癌細胞中HGF(50ng/mL)刺激后持續的存活信號(PAKT和pERK)。
[0053]圖10:具有BRAF V600F的細胞中各種RTK配體的挽救結果。
[0054]圖1 1:如指不的，用 lapatinib (5 μ M)和 crizotinib (I μ Μ)任一處理的HCC1954HER2擴增的乳腺癌細胞的Syto60細胞染色。每周兩次處理細胞，持續指示的時間。圖像代表3項獨立實驗，而且數值指示均值+/-s.d。
[0055]圖12:a,免疫印跡，其顯示了 MET 陽性(NAE,624MEL,928MEL, Α375)和 MET 陰性(Μ14，Hs693T)BRAF突變體細胞系中ERK的再活化。如指示的，用PLX4032 (PLX，I μ M)，HGF (50ng/mL)或crizotinib (Criz, 0.5 μ Μ)處理細胞(2h)。b,腫瘤生長測定法，其顯示了在928MEL和624MEL異種移植物中使用3D6MET激動性抗體活化MET對PLX4032的生長抑制活性的影響。如指示的，用對照抗體(抗gpl20)，3D6(抗MET激動性抗體)，RG7204 (PLX4032)或⑶C-0712 (MET小分子抑制劑)任一處理小鼠(每組10只)，持續4周，并在制定時間測量腫瘤體積。誤差棒代表均值+/-s.e.m。使用雙向ANOVA確定2組之間的差異(* = 0.0008)。
[0056]圖13:用PLX4032治療的患者的轉移性黑素瘤中的無進展存活和總體存活。將患者基于他們的血漿HGF水平分層成兩組(綠色〈中值HGF ;紅色〉中值HGF)。
[0057]圖14:a，細胞存活力測定法，其通過活化PI3K和MAPK途徑二者(72h)，證明了來自激酶抑制的疊加挽救。用Iapatinib(IyM)與10ng/mL NRGl或FGF組合共處理AU565細胞。b，細胞存活力測定法，其證明了抑制PI3K途徑在逆轉配體誘導的挽救方面比MAPK途徑更加有力。在存在HGF(50ng/mL)的情況中用適宜的激酶抑制劑處理細胞。然后用IOOnMPI3K抑制劑(BEZ235)或MAPK抑制劑(AZD6244)任一處理細胞。誤差棒代表均值+/_s.e.m0
[0058]圖15:免疫印跡，其顯示了來自矩陣篩選的一組41種激酶成癮的癌細胞系中MET，PDGFR α，IGFlRP，EGFR, HER2, HER3, FGFRl，FGFR2 和 FGFR3 的表達。指示了 RTK 配體；灰色方形代表完全挽救，深灰色方形代表部分挽救，白色方形代表無挽救，而黑色方形代表配體相關激酶。X代表移除的樣品，amp代表擴增的，而mut代表突變的。使用β-微管蛋白測定相等加載。
[0059]圖16:如指示的，在存在或缺失HGF(50ng/mL)的情況中用ΤΑΕ684(2μΜ)處理的H2228EML4-ALK易位的NSCLC細胞的Syto60染色。每3天處理細胞，持續9天。圖像代表3項獨立實驗，而且數值指示均值+/-s.d。
[0060]圖17:a,描繪在SK-MEL-28細胞中對446種測試分泌因子分析PLX4032敏感性的圖。b，來自在存在5 μ M PLX4032 (72h)的情況中在存在50ng/mL配體的情況中在SK-MEL-28細胞上分析446種測試分泌因子的結果的匯總。圖呈現了形成初始分析的配體和挽救SK-MEL-28細胞免于PLX4032敏感性的新鑒定的可溶性因子。誤差棒代表均值+/_s.e.m。
[0061]圖18:如指示的，用 PLX4032(5yM)和 / 或 crizotinib (I μ Μ)任一處理的 Α375 和928MEL BRAF突變體黑素瘤細胞系的Syto60細胞染色。每周兩次處理細胞，持續指示的時間。圖像代表3項獨立實驗，而且數值指示均值+/-s.d。
[0062]圖19A和19B:匯總來自928MEL和624MEL異種移植物研究的結果的表。
[0063]圖20顯示來自1 26名轉移性黑素瘤患者(服藥循環I前)的血漿中的HGF蛋白水平的ELISA結果的匯總。
[0064]圖21:培養的BRAF突變體黑素瘤癌細胞中MET的IHC染色。
[0065]圖22:細胞存活力測定法，其證明了用crizotinib處理后對HCC1954和AU565中細胞增殖的阻抑(72h syto60測定法)。在存在crizotinib (0.5 μ M) (MET TKI)和lapatinib (EGFR/HER2TKI)的情況中用 50ng/mL HGF 共處理細胞。
[0066]圖23:顯示 lapatinib(l μ Μ)在存在 NRGl (50ng/mL, 2h)的情況中對 AKT 和 ERK 磷酸化的影響的免疫印跡。用erlotinib (0.5 μ M)共處理細胞,如指示的。Lap:lapatinib,Erl:erlotinib。
[0067]圖24:a，柱狀圖(帶陰影線)，其顯示了來自參加BRM2試驗，服藥循環I前的126名轉移性黑素瘤患者的1g(HGF)水平的頻率分布，疊加經驗密度(黑色)(偏離常態的Kolmogorov-Smirnoff P值為0.18)。b，用PLX4032治療的轉移性黑素瘤患者中的無進展存活(PFS)和總體存活(OS)。將患者基于他們的血漿HGF水平分層成三組。顯示了每個組的事件數目患者和中等的距事件的時間。使用結果在連續結果上的cox-比例模型來計算危害比和相應的P值。
[0068]圖25:a，⑶C-0712的結構。b，cMet和選定激酶的酶IC50。使用活化的cMet激酶域所致poly (Glu，Tyr)磷酸化測定cMet效力，通過ELISA檢測。數據為多重測定的幾何均值(η = 5)。使用Invitrogen選定篩選服務依照Invitrogen標準方案進行了其它激酶測定法。測定所有IC50，[ΑΤΡ]在對Km而言的適宜數值。C，在基于細胞的測定法中⑶C-0712針對選定RTK的效力和選擇性。所有測定法測量在存在10% FBS的情況中與化合物一起溫育2小時后，表中限定的細胞系中的RTK自體磷酸化。d，激酶選擇性序型分析數據。使用Invitrogen選定篩選服務在0.1 μ M針對一組210種激酶測定⑶C-0712。列出了具有>50%抑制的所有激酶。e，⑶C-0712激酶選擇性的圖示。特定激酶在0.1 μ M化合物的百分比抑制通過在人kinome上覆蓋的圓圈的大小和顏色來表示。[0069]圖26:依照國際專利申請W02007103308A2中概述的規程制備⑶C-0712。試劑和條件:(a) (EtO) 3CH, Meldrum 氏酸，80°C, 76 % ； (b) Dowtherm, 220°C, 45 % ； (c) 3, 4- 二氟硝基苯，Cs2CO3, DMF，100O，88% ； (d)TFA, 70°C,99% ;(e)I2，K0H，DMF, 50°C,88% ； (f)PMBCl,K2CO3, DMF，rt,61% ； (g) SnCl2_2H20，EtOH, 65°C ； (h) CuI，吲哚-2-羧酸，DMSO, K2CO3,115。。，56% ; (i) EDCI，HOBt，ipr2EtNH, DMF,92% ； (j) TFA, CH2Cl2, rt ； (k) CH3CHO, NaHB (OAc) 3, 77%(通過兩個步驟)；(1)TFA，70°C，73%。
[0070]發明詳述
[0071]1.定義
[0072] 在本文中，“患者”為人患者。患者可以是“癌癥患者”，即患有或有風險患上一種或多種癌癥癥狀的患者。此外，患者可以是先前治療過的癌癥患者。患者可以是“黑素瘤癌癥患者”，即患有或有風險患上一種或多種黑素瘤癥狀的患者。此外，患者可以是先前治療過的黑素瘤患者。
[0073]如本文中使用的，除非另外指明，術語“c-met”或“Met”指任何天然或變異(無論天然的或合成的)c_met多肽。術語“野生型c-met” 一般指包含天然發生c_met蛋白的氨基酸序列的多肽。
[0074]如本文中使用的，術語“c-met變體”指在天然c_met序列中包括一處或多處氨基酸突變的c-met多肽。任選地，該一處或多處氨基酸突變包括氨基酸替代。
[0075]“抗c-met抗體”指以足夠親和力和特異性結合c_met的抗體。所選擇的抗體正常情況下會具有足夠強的對c-met的結合親和力，例如抗體可以以介于IOOnM-1pM之間的Kd值結合人c-met。抗體親和力可通過例如基于表面等離振子共振的測定法(諸如BIAcore測定法，如PCT申請公開文本N0.W02005/012359中所記載的)；酶聯免疫吸附測定法(ELISA);和競爭測定法(例如RIA)來測定。在某些實施方案中，抗c-met抗體能在靶向和干擾涉及c-met活性的疾病或狀況中用作治療劑。還有，所述抗體可以進行其它生物學活性測定法，例如為了評估它作為治療劑的效力。此類測定法是本領域已知的，而且取決于抗體的靶抗原和預定用途。
[0076]“c-met拮抗劑”(可互換地稱作“c_met抑制劑”)指干擾c_met活化或功能的藥劑。在一個具體的實施方案中，C-met抑制劑具有約1，OOOnM或更低的對c-met的結合親和力(解離常數)。在另一個實施方案中，c-met抑制劑具有約IOOnM或更低的對c-met的結合親和力。在另一個實施方案中，c-met抑制劑具有約50nM或更低的對c-met的結合親和力。在另一個實施方案中，c-met抑制劑具有約IOnM或更低的對c-met的結合親和力。在另一個實施方案中，c-met抑制劑具有約InM或更低的對c_met的結合親和力。在一個具體的實施方案中，c-met抑制劑共價結合c-met。在一個具體的實施方案中，c_met抑制劑以1，OOOnM或更低的IC50抑制c-met信號傳導。在另一個實施方案中，c-met抑制劑以500nM或更低的IC50抑制c-met信號傳導。在另一個實施方案中，c-met抑制劑以50nM或更低的IC50抑制c-met信號傳導。在另一個實施方案中，c-met抑制劑以IOnM或更低的IC50抑制c-met信號傳導。在另一個實施方案中，c-met抑制劑以InM或更低的IC50抑制c-met信號傳導。
[0077]“c-met活化”指c_met受體的活化或磷酸化。一般而言，c-met活化導致信號轉導(例如由c-met受體的細胞內激酶結構域引起的，磷酸化c-met或底物多肽中的酪氨酸殘基)。c-met活化可以由c-met配體(HGF)結合感興趣c-met受體來介導。HGF對c_met的結合可活化c-met的激酶結構域并由此導致c-met中酪氨酸殘基的磷酸化和/或其它的底物多肽中酪氨酸殘基的磷酸化。
[0078]“B-raf活化”指B_raf激酶的活化或磷酸化。一般而言，B-raf活化導致信號轉導。
[0079]如本文中使用的，除非另外指明，術語“B-raf”指任何天然或變異(無論天然的或合成的)B-raf多肽。術語“野生型B-raf” 一般指包含天然發生B-raf蛋白的氨基酸序列的多肽。
[0080]如本文中使用的，術語“B-raf變體”指在天然B_raf序列中包括一處或多處氨基酸突變的B-raf多肽。任選地，該一處或多處氨基酸突變包括氨基酸替代。
[0081]“B-raf拮抗劑”(可互換地稱作“B_raf抑制劑”)指干擾B_raf活化或功能的藥劑。在一個具體的實施方案中，B-raf抑制劑具有約1，OOOnM或更低的對B-raf的結合親和力(解離常數)。在另一個實施方案中，B-raf抑制劑具有約IOOnM或更低的對B-raf的結合親和力。在另一個實施方案中，B-raf抑制劑具有約50nM或更低的對B-raf的結合親和力。在另一個實施方案中，B-raf抑制劑具有約IOnM或更低的對B-raf的結合親和力。在另一個實施方案中，B-raf抑制劑具有約InM或更低的對B-raf的結合親和力。在一個具體的實施方案中 ，B-raf抑制劑以1，OOOnM或更低的IC50抑制B_raf信號傳導。在另一個實施方案中，B-raf抑制劑以500nM或更低的IC50抑制B_raf信號傳導。在另一個實施方案中，B-raf抑制劑以50nM或更低的IC50抑制B_raf信號傳導。在另一個實施方案中，B-raf抑制劑以IOnM或更低的IC50抑制B-raf信號傳導。在另一個實施方案中，B_raf?抑制劑以InM或更低的IC50抑制B-raf信號傳導。
[0082]“V600E”指BRAF基因中導致谷氨酰胺替代B-Raf氨基酸位置600處纈氨酸的突變。“V600E”在先前的編號系統下也稱作“V599E”(Kumar et al.,Clin.CancerRes.9:3362-3368，2003)。
[0083]“親和力”指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有指示，如本文中使用的，“結合親和力”指反映結合對的成員(例如抗體和抗原)之間1:1相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通常可以用解離常數(Kd)來表述。親和力可以通過本領域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于測量結合親和力的具體的說明性和例示性的實施方案。
[0084]“選擇性”或“更大親和力”意圖指拮抗劑對突變型蛋白質的結合比對野生型蛋白質的結合更加緊密(解離常數更低)。在一些實施方案中，更大親和力或選擇性為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、200、300、400、500或更多倍數的更大結合。如本文中使用的，術語“B-raf靶向藥物”指結合B-raf且抑制B_raf活化的治療劑。
[0085]如本文中所使用的，術語“c-met祀向藥物”指結合c_met并抑制c_met活化的治療劑。
[0086]如本文中所使用的，如例如應用于受體激酶活性，術語“組成性”指受體不依賴配體或其它活化性分子的存在的持續信號傳導活性。根據受體的性質，所有活性可以是組成性的，或者受體的活性可以通過其它分子(例如配體)的結合而進一步活化。導致受體活化的細胞事件是本領域普通技術人員公知的。例如，活化可包括寡聚化(例如二聚化，三聚化，等)成高級受體復合物。復合物可包含單一種類的蛋白質，即同聚復合物。或者，復合物可包含至少兩種不同蛋白質種類，即異聚復合物。可以通過例如受體的正常或突變體形式在細胞表面上的過表達來引起復合物形成。也可以通過受體中的特定突變來引起復合物形成。
[0087]短語“基因擴增”指在特定細胞或細胞系中形成多拷貝的基因或基因片段的過程。復制區(擴增的DNA的區段)常常稱作“擴增子”。通常，所產生的信使RNA(mRNA)的量，SP基因表達的水平，也按由所表達特定基因形成的拷貝數的比例增加。
[0088]“酪氨酸激酶抑制劑”為一定程度抑制酪氨酸激酶(諸如c-met受體或B-raf)的酪氨酸激酶活性的分子。
[0089]“展示出c-met和/或B_raf表達、擴增、或活化”的癌或生物學樣品指在診斷測試中表達(包括過表達)c-met和/或B-raf,擴增了 c-met和/或B_raf基因,和/或以其它方式表明c-met和/或B-raf活化或磷酸化的癌或生物學樣品。
[0090]“不展示c-met和/或B_raf表達、擴增、或活化”的癌或生物學樣品指在診斷測試中沒有表達(包括過表達)c-met和/或B-raf，沒有擴增c-met和/或B_raf基因，和/或沒有以其它方式表明c-met和/或B-raf活化或磷酸化的癌或生物學樣品。
[0091]“展示出c-met和/或B_raf活化”的癌或生物學樣品指在診斷測試中展現出C-met和/或B-raf活化或磷酸化的癌或生物學樣品。此類活化可直接(例如通過ELISA或IHC來測量C-met和/或B_raf磷酸化)或間接測定。
[0092]“不展示c-met和/或B_raf活化”的癌或生物學樣品指在診斷測試中不展現出c-met和/或B-raf活化或磷酸化的癌或生物學樣品。此類活化可直接(例如通過ELISA或IHC來測量C-met和/或B_raf磷酸化)或間接測定。
[0093]“展示出組成性c-met和/或B_raf活化”的癌或生物學樣品指在診斷測試中展現出組成性c-met和/或B-raf活化或磷酸化的癌或生物學樣品。此類活化可直接(例如通過ELISA來測量c-met和/或B_raf磷酸化)或間接測定。
[0094]“不展示c-met擴增”的癌或生物學樣品指在診斷測試中不具有擴增的cnet基因的癌或生物學樣品。
[0095]“展示出c-met”的癌或生物學樣品指在診斷測試中具有擴增的c_met基因的癌或生物學樣品。
[0096]“不展示組成性c-met和/或B_raf活化”的癌或生物學樣品指在診斷測試中不展現組成性c-met和/或B-raf活化或磷酸化的癌或生物學樣品。此類活化可直接(例如通過ELISA來測量c-met和/或B_raf磷酸化)或間接測定。
[0097]“磷酸化”指對蛋白質，諸如B-raf和/或c_met，或其底物添加一個或多個磷酸根基團。
[0098]“磷酸-ELISA測定法” (phosho-ELISA assay)在本文中指在酶聯免疫吸附測定法(ELISA)中評估一種或多種c-met和/或B_raf的磷酸化的測定法，其中使用檢測磷酸化的c-met和/或B-raf、底物或下游信號分子的試劑(通常是抗體)。優選的是，使用檢測磷酸化c-met和/或B-raf的抗體。該測定法可以對細胞溶胞物，優選來自新鮮的或冷凍的生物學樣品的細胞溶胞物進行。[0099]“c-met過表達或擴增”的癌細胞指與同一組織類型的非癌性細胞相比，具有顯著更高水平的c-met蛋白質或基因的癌細胞。此類過表達可以是由基因擴增或者轉錄或翻譯增加引起的。可在診斷或預后測定法中通過評估細胞表面上存在的c-met蛋白質水平的升高(例如通過免疫組化測定法；IHC)來測定c-met過表達或擴增。或者/另外，可測量細胞中編碼c-met的核酸的水平，例如通過熒光原位雜交(FISH ;參見1998年10月公布的W098/45479)、Southern印跡或聚合酶鏈式反應(PCR)技術，諸如定量實時PCR(qRT-PCR)。在上述測定法之外，熟練從業人員還可利用多種體內測定法。例如，可將患者身體內的細胞暴露于任選用可檢測標記物例如放射性同位素標記的抗體，并且可評估該抗體對患者身體內細胞的結合，例如通過外部掃描放射性或通過分析取自事先已暴露于所述抗體的患者的活檢。
[0100]“不過表達或擴增C-met”的癌細胞指與同一組織類型的非癌性細胞相比，不具有高于正常的c-met蛋白質或基因水平的癌細胞。
[0101]術語“突變”在用于本文時指特定蛋白質或核酸(基因，RNA)分別相對于野生型蛋白質或核酸的氨基酸或核酸序列的差異。突變的蛋白質或核酸可以由基因的一個等位基因(雜合的)或兩個等位基因(純合的)表達或者在其中找到，而且它可以是體細胞的或種系的。在本發明中，突變一般是體細胞的。突變包括序列重排，諸如插入、刪除、和點突變(包括單核苷酸/氨基酸多態性)。
[0102]“抑制”指與參照相比減小或降低活性、功能、和/或量。
[0103]蛋白質“表達”指基因中編碼的信息轉換成信使RNA(mRNA)，然后轉換成蛋白質。 [0104]在本文中，“表達”感興趣蛋白質(諸如c-met受體)的樣品或細胞指其中測定出存在編碼該蛋白質的mRNA或蛋白質(包括其片段)的樣品或細胞。
[0105]“阻斷性”抗體或抗體“拮抗劑”指抑制或降低其所結合的抗原的生物學活性的抗體。優選的阻斷性抗體或拮抗性抗體完全抑制抗原的生物學活性。
[0106]患者“群體”指一組癌癥患者，諸如臨床試驗中的，或對特定適應證諸如黑素瘤癌癥療法FDA批準之后腫瘤學家看到的。
[0107]對于本發明的方法，術語“指導”患者意味著通過任何手段，但是優選書面地，諸如以包裝插頁或其它書面推廣材料的形式提供關于可應用療法、藥療、處理、處理方案、等等的指導。
[0108]對于本發明的方法，術語“宣傳(promoting) ”意味著通過任何手段，包括書面地，諸如以包裝插頁的形式提供、登廣告、出售、或描述特定藥物、藥物組合、或治療模態。宣傳在本文中指治療劑，諸如抗c-met抗體和/或B-raf拮抗劑用于適應證,諸如黑素瘤治療的宣傳，其中此類宣傳得到食品和藥品管理局(FDA)批準，認為已證明與受試者群體中統計上顯著的治療功效和可接受的安全性有關。
[0109]術語“銷售”在本文中用于描述產品(例如藥物)的宣傳、出售或分發。銷售具體包括目的在于包裝、登廣告、和任何使產品商業化的商業活動。
[0110]為了本文中的目的，“先前治療過的”癌癥患者已經接受過在先癌癥療法。
[0111]即使對癌癥患者施用抗腫瘤劑，諸如化療劑，“頑固性”或“不應性”(refractory)癌癥仍然發生進展。
[0112]“癌癥藥物”指有效治療癌癥的藥物。癌癥藥物的例子包括下文所述化療劑和化療方案；c-met拮抗劑,包括抗c-met抗體,諸如MetMAb ；B-raf拮抗劑。
[0113]如本文中所使用的，術語“生物標志物”或“標志物” 一般指其在哺乳動物組織或細胞中或上的表達或分泌可以通過已知方法(或本文中所公開的方法)來檢測且預示或可用于預測(或幫助預測)細胞、組織或患者對治療方案的響應性的分子，包括基因、mRNA、蛋白質、碳水化合物結構、或糖脂。
[0114]與癌癥(例如黑素瘤)患者的臨床好處減少有關的生物標志物的“量”或“水平”指生物學樣品中沒有可檢測的生物標志物或有低可檢測水平，其中生物標志物的水平與患者臨床好處減少有關。這些可以通過本領域技術專家知道及本發明也公開的方法來測量。評估的生物標志物的表達水平或量可用于測定對治療的響應。在一些實施方案中，生物標志物的量或水平使用IHC(例如患者腫瘤樣品的)和/或ELISA和/或5’核酸酶測定法和/或PCR(例如等位基因特異性PCR)來測定。
[0115]術語“表達的水平”或“表達水平”一般可互換使用，而且一般指生物學樣品中多核苷酸、mRNA、或氨基酸產物或蛋白質的量。“表達”一般指基因所編碼的信息轉換成細胞中存在的和運行的結構的過程。因此，依照本發明，基因的“表達”可以指轉錄成多核苷酸、翻譯成蛋白質、或甚至蛋白質的翻譯后修飾。轉錄得到的多核苷酸的、翻譯得到的蛋白質的、或翻譯后修飾得到的蛋白質的片段也應視為表達的，無論它們是源自通過可變剪接生成的轉錄物或經過降解的轉錄物，或者是源自蛋白質的翻譯后加工(例如通過蛋白水解)。在一些實施方案中，“表達的水平”指生物學樣品中蛋白質的量，如使用IHC測定的。
[0116]“患者樣品”指從癌癥患者得到的相似細胞的集合。組織或細胞樣品的來源可以是實體組織，像來自新鮮 的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活檢樣品或穿刺樣品；血液或任何血液組分；體液，諸如腦脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或間隙液；來自受試者的妊娠或發育任何時間的細胞。組織樣品可能包含在自然界中天然不與組織混雜的化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩沖劑、固定劑、營養物、抗生素、等等。腫瘤樣品的例子在本文中包括但不限于腫瘤活檢、循環中的腫瘤細胞、血清或血漿、循環中的血漿蛋白質、腹水、衍生自腫瘤或展現出腫瘤樣特性的原代細胞培養物或細胞系，以及保存的腫瘤樣品，諸如福爾馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤樣品或冷凍的腫瘤樣品。在一個實施方案中，所述樣品包含黑素瘤腫瘤樣品。
[0117]患者對藥物治療的“有效響應”或“響應性”及類似用語指在施用癌癥藥物后對處于癌癥(例如黑素瘤)風險或患有癌癥(例如黑素瘤)的患者給予的臨床或治療好處。此類好處包括如下任何一項或多項:延長存活(包括總體存活和無進展存活)；導致客觀響應(包括完全響應或部分響應)；或改善癌癥體征或癥狀，等。在一個實施方案中，使用生物標志物來鑒定預期在用藥物(例如抗c-met抗體)治療時相對于不以相同水平表達該生物標志物的患者具有更大無進展存活(PFS)的患者。
[0118]“存活”(survival)指患者保持存活,而且包括總體存活(overall survival)和無進展存活(progress free survival)。
[0119]“總體存活”指保持一定時期諸如I年、5年等存活的患者，自診斷或治療時起計
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[0120]“無進展存活”指保持存活且癌癥沒有進展或惡化的患者。
[0121]“延長存活”意味著使接受治療的患者的總體存活或無進展存活相對于未接受治療的患者(即相對于未用藥物治療的患者)，或相對于不以指定水平表達生物標志物的患者，和/或相對于用已獲批準的抗腫瘤劑(諸如厄洛替尼的化療方案)治療的患者有延長。
[0122]“客觀響應”(objective response)指可測量的響應，包括完全響應(CR)或部分響應(PR)。
[0123]“完全響應"(complete response)或“CR”指癌癥的所有體征響應治療而消失。這并不總是意味著癌癥已經治愈。
[0124]“部分響應”(partial response)或“PR”指一處或多處腫瘤或損害的大小或體內癌癥的程度響應治療而減小。
[0125]“處理”和“治療”(treatment)指治療性處理和預防性或防范性措施二者。需要治療的包括那些早就患有良性、癌前、或非轉移性腫瘤的以及要預防癌癥發生或復發的。
[0126]術語“治療有效量”指治療劑在哺乳動物中治療或預防疾病或病癥的量。在癌癥的情況中，治療有效量的治療劑可減少癌細胞的數目；縮小原發性腫瘤的尺寸；抑制(即一定程度的減緩，優選阻止)癌細胞浸潤入周圍器官；抑制(即一定程度的減緩，優選阻止)腫瘤轉移；一定程度的抑制腫瘤生長；和/或一定程度的減輕一種或多種與病癥有關的癥狀。根據藥物可阻止現有癌細胞生長和/或殺死現有癌細胞的程度，它可以是細胞抑制性的和/或細胞毒性的。對于癌癥療法，體內功效可以通過例如評估存活持續時間、距疾病進展的時間(TTP)、響應率(RR)、響應持續時間、和/或生活質量來測量。
[0127]術語“癌(癥)”和“癌(性)的”指向或描述哺乳動物中典型的以不受調節的細胞生長為特征的生理 疾患。此定義中包括良性和惡性癌癥。“早期癌癥”或“早期腫瘤”指非侵入性的或轉移性的，或者歸為O期、I期、或II期癌癥的癌癥。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤(包括髓母細胞瘤和視網膜母細胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜細胞肉瘤)、神經內分泌腫瘤(包括類癌瘤、胃泌素瘤和胰島細胞癌)、間皮瘤、施旺氏細胞瘤(包括聽神經瘤)、腦膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括黑素瘤、結腸直腸癌、甲狀腺癌(例如乳頭狀甲狀腺癌)、非小細胞肺癌(NSCLC)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastric或stomach cancer)包括胃腸癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer或hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌(包括轉移性乳腺癌)、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney或renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肛門癌、陰莖癌、睪丸癌、食管癌、膽管腫瘤、及頭和頸癌。在一些實施方案中，癌癥是黑素瘤；結腸直腸癌；甲狀腺癌，例如乳頭狀甲狀腺癌；或卵巢癌。
[0128]術語“多核苷酸”在以單數或復數使用時一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸，可以是未經修飾的RNA或DNA或者是經過修飾的RNA或DNA。如此，例如，本文中所定義的多核苷酸包括但不限于單鏈和雙鏈DNA、包含單鏈區和雙鏈區的DNA、單鏈和雙鏈RNA、及包含單鏈區和雙鏈區的RNA，包含DNA和RNA的雜合分子，它可以是單鏈的，或者更典型的是雙鏈的，或者包含單鏈區和雙鏈區。另外，術語“多核苷酸”在用于本文時指包含RNA或DNA或RNA和DNA 二者的三鏈區。此類區中的鏈可來自相同分子或來自不同分子。所述區可包含一種或多種分子的整個，但是更典型的是只包含有些分子的一個區。三股螺旋區的分子之一常常是寡核苷酸。術語“多核苷酸”明確包括cDNA。該術語包括包含一種或多種經修飾堿基的DNA (包括cDNA)和RNA。如此，主鏈為穩定性或其它原因而修飾的DNA或RNA也是“多核苷酸”該術語在本文中的意圖所在。此外，包含罕見堿基諸如肌苷或經修飾堿基諸如氣化堿基的DNA或RNA也包括在本文中所定義的術語“多核苷酸”內。一般而言，術語“多核苷酸”涵蓋未修飾多核苷酸的所有化學、酶學和/或代謝修飾形式，以及病毒和細胞，包括簡單和復雜細胞的特征性的DNA和RNA的化學形式。
[0129] “化療劑”指可用于治療癌癥的化學化合物。化療劑的實例包括烷化劑類(alkylating agents)，諸如塞替派(thiotepa)和環憐酉先胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN? );磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates)，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙卩定類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(uredepa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylameIamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietyIenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethiyIenethiophosphoramide)和三輕甲蜜胺(trimethylolomelamine);番蒸枝內酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bulIatacin)和布拉他辛酮(bulIatacinone)) ； δ -9-四氫大麻酷(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酌.(dronabinol)，MARINOL? ) ; β -拉帕醌(Iapachone);拉帕醇(Iapachol);秋水仙素類(colchicines);白禪脂酸(betulinicacid);喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan) ( HYCAMTIN?)、CPT-1K伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR? )、乙酰喜樹堿、東莨菪亭(scopoletin)和 9_ 氨基喜樹減)；苔蘚抑素(bryostatin) ;callystatin ;CC_1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinic acid);替尼泊苷(teniposide);隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素I和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin) ;duocarmycin (包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1);艾植塞洛素(eleutherobin) ；pancratistatin ；sarcodictyin ;海綿抑素(spongistatin);氮芥類(nitrogen mustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾酉享(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲憐胺(trofosfamide)、尿啼唳氮芥(uracil mustard)；亞硝脲類(nitrosureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(1mustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素Y II和加利車霉素ω Il (參見例如Nicolaou等人.，Angew.Chem Intl.Ed.Engl.，33:183-186 (1994)) ;CDP323，一種口服 α-4 整聯蛋白抑制劑；蒽環類抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A ;埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)發色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素發色團)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素 C (cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放線菌素 D (dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6- 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRIAMYC1N?、嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、鹽酸多柔比星脂質體注射劑(DOXIL? )、脂質體多柔比星TLC D-99 ( MYOCET? )、PEG化脂質體多柔比星(CAELYX? )、和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcel1mycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素 C、霉酷酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤、吉西他濱(gemcitabine) ( GE_MZAR? )、替加氟(tegafur) ( UFTORAL?
)、卡培他濱(capecitabine) ( XELODA? )、埃坡霉素(epothilone)和 5_ 氟尿啼P定(5-FU);葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate) ; 票呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-疏基票呤(mercaptopurine)、硫咪票呤(thiamiprine)、硫鳥 P票呤(thioguanine)；啼卩定類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifIuridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(f1xuridine);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinic acid);醋葡醒內酯(aceglatone);醒磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid);恩尿啼唳(eniluracil);安口丫P定(amsacrine) ；bes trabucil ;比生群(bisantrene);依達曲沙(edatraxate);地憐酉先胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地口丫酉昆(diaziquone) ;elfornithine ;依利醋銨(elliptinium acetate);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；輕脲(hydroxyurea)；香燕多糖(Ientinan);氯尼達明(1nidamine);美登木素生物堿類(maytansinoids),諸如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌達醇(mopidamol) ； 二胺硝口丫 P定(nitracrine)；噴司他丁 (pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(1soxantrone) ;2_ 乙基酉先餅(ethylhydrazide);丙卡巴餅(procarbazine) ； PSK? 多糖復合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran);螺旋錯(spirogermanium);細交鏈抱菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone) ;2，2’，2’’ -三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、撫孢菌素(verrucarin) A、桿孢菌素(roridin) A和蛇行菌素(anguidin))；烏拉坦(urethan);達卡巴曝(dacarbazine);甘露醇氣芥(mannomustine) ;二漠甘露醇(mitobronitol) ; 二溴衛矛醇(mitolactol);哌泊溴焼(pipobroman) ;gacytosine ;阿糖胞苷(arabinoside) ( “Ara_C”)；塞替派(thiotepa);類紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel) ( TAXOL? )、清蛋白改造的納米顆粒劑型帕利他塞(ABRAXANE?)和多西他塞(doxetaxc'l) ( TAXOTERE? );苯丁酸氣芥(chlorambucil) ;6_ 硫鳥嘌呤(thioguanine);疏基嘌呤(mercaptopurine);甲氨蝶呤(methotrexate);鉬類似物，諸如順鉬(cisplatin)、奧沙利鉬(oxaliplatin)和卡鉬(carboplatin);長春藥類(vincas),其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括長春堿(vinblastine) ( VELBAN?)、長春新喊(vincristine) ( ONCOVIN? )、長春地辛(vindesine) ( ELDISINE?
，FILDESIN?)、和長春瑞濱(Vinorelbine) (NAVELB丨NE?);依托泊苷(etoposide)(VP-16);異環磷酰胺(ifosfamide);米托蒽酉昆(mitoxantrone);亞葉酸(Ieucovovin)；能滅瘤(novantrone);依達曲沙(edatrexate);道諾霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);伊本膦酸鹽(ibandronate);拓撲異構酶抑制劑RFS2000 ;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);類維 A 酸(retinoids),諸如維 A 酸(retinoic acid),包括貝沙羅汀(bexarotene)
(TARGRETIN? ) ;二膦酸鹽類(bisphosphonates),諸如氯膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS?或OSTAC? )、依替膦酸鈉(etidronate) ( DIDROCAL? )、NE-58095、唑來膦酸/唑來膦酸鹽(zoledronic acid/zoledronate) ( ZOMETA? )、阿倫膦酸鹽(alendronate) ( FOSAMAX? )、帕米膦酸鹽(pamidronate) ( AREDIA? )、替魯膦酸鹽(tiludronate) ( SKELID? )或利塞膦酸鹽(risedronate) ( ACTONEL?);以及曲沙他濱(troxacitabine) (1，3-二氧戍環核苷胞喃唳類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制牽涉異常細胞增殖的信號途經中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗，諸如THERATOPE?疫苗
和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN?疫苗、LEUVECTIN?疫苗和VAXID?疫
苗；拓撲異構酶I抑制劑(例如LURTOTECAN? ) ;rmRH (例如ABAREUX? );BAY439006 (sorafenib ；Bayer) ；SU-11248 (Pfizer);哌立福辛(perifosine), C0X-2 抑制劑(如塞來考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib)),蛋白體抑制劑(例如PS341)；bortezomib ( VELCADE? ) ;CCI_779 ;tipifarnib (R11577) ；orafenib, ABT510 ；Bcl-2抑制劑，諸如 oblimersen sodium( GENASENSE? ) ;pixantrone ;EGFR 抑制劑(見下文
定義)；酪氨酸激酶抑制劑(見下文定義)；及任何上述各項的藥學可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或更多種上述各項的組合，諸如CHOP(環磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍聯合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉬(EL0XATIN?)聯合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。
[0130] 在本文中，化療劑包括起調節、降低、阻斷或抑制可促進癌生長的激素效果作用的“抗激素劑”或“內分泌治療劑”類。它們自身可以是激素，包括但不限于:具有混合的激動劑/拮抗劑特性的抗雌激素類，包括他莫昔芬(tamoxifen) (NOLVADEX)、4_羥基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene) ( FARESTON? )、艾多昔芬(idoxifene)、屈洛
昔芬(dro1xifene)、雷洛昔芬(raloxifene) ( EVISTA? )、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)，和選擇性雌激素受體調節劑類(SERM)，諸如SERM3 ;沒有激動劑特性的純的抗雌激素類，諸如氟維司群(fulvestrant) ( FASLODEX(R))和EM800 (此
類藥劑可阻斷雌激素受體(ER) 二聚化、抑制DNA結合、提高ER周轉、和/或遏制ER水平)；芳香酶抑制劑類，包括類固醇芳香酶抑制劑類，諸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane) ( AROMASIN? )，和非類固醇芳香酶抑制劑類，諸如阿那曲唑(anastrozole) ( ARI1VIIDEX? )、來曲唑(Ietrozole) ( FEMARA? )和氨魯米特(aminoglutethimide),和其它芳香酶抑制劑類,包括伏氯唑(vorozole) ( RJVISOR? )、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate) ( MEGASE?^ )、法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；促黃體生成激素釋放激素激動劑類，包括亮丙瑞林(leuprolide) (LUPRON?和ELIGARD? )、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(triptorelin);性類固醇類(sex steroids),包括妊娠素類(progestine),諸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲輕孕酮(medroxyprogesterone acetate),雌激素類,諸如二乙基己烯雌酹(diethylstiIbestrol)和普雷馬林(premarin),和雄激素類/類視黃酸類,諸如氟甲睪酮(fluoxymesterone)、所有反式視黃酸(transretionic acid)和芬維 A 胺(fenretinide)；奧那司酮(onapristone);抗孕酮類；雌激素受體下調劑類(ERD);抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及任何上述物質的藥劑學可接受的鹽、酸或衍生物；以及兩種或多種上述物質的組合。
[0131]本文中化療劑或化療方案的具體例子包括:烷化劑類(例如苯丁酸氮芥、苯達莫司汀(bendamustine)、或環磷酰胺)；核苷類似物或抗代謝物(例如氟達拉濱)、氟達拉濱和環磷酰胺(FC);潑尼松或潑尼松龍(prednisolone);含烷化劑的組合療法，包括環磷酰胺、長春新堿、潑尼松龍(CHOP)，或環磷酰胺、長春新堿、潑尼松龍(CVP)，等。 [0132]“目標受眾(target audience) ”指接受如通過推銷或做廣告(尤其為了特定用途、治療、或適應癥)進行的特定藥物宣傳或意圖進行的特定藥物宣傳的人群或機構，諸如患者個體，患者群體，報紙、醫學文獻、和雜志讀者，電視或因特網觀眾，無線電或因特網聽眾，內科醫生，藥品公司，等。
[0133]術語“包裝插頁”用于指治療產品的商業包裝中通常包含的用法說明書，其含有關于涉及此類治療產品應用的適應癥、用法、劑量、施用、禁忌癥、要與包裝的產品組合的其它治療產品、和/或警告等的信息。
[0134]本文中的術語“抗體”以最廣義使用，并且涵蓋各種抗體結構，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現出期望的抗原結合活性。
[0135]“抗體片段”指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體中結合完整抗體結合的抗原的部分。抗體片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’ )2 ;雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv);和由抗體片段形成的多特異性抗體。
[0136]“親和力成熟的”抗體指在一個或多個高變區(HVR)中具有一處或多處改變的抗體，與不擁有此類改變的親本抗體相比，此類改變導致該抗體對抗原的親和力改善。
[0137]與參照抗體“結合相同表位的抗體”指在競爭測定法中將參照抗體對其抗原的結合阻斷50%或更多的抗體，且相反，參照抗體在競爭測定法中將該抗體對其抗原的結合阻斷50%或更多。
[0138]術語“嵌合”抗體指其中的重和/或輕鏈的一部分自特定的來源或物種衍生，而重和/或輕鏈的剩余部分自不同來源或物種衍生的抗體。
[0139]抗體的“類”指其重鏈擁有的恒定域或恒定區的類型。抗體有5大類:IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且這些中的幾種可以進一步分成亞類(同種型)，例如，IgG1UgG2UgGyIgG4 JgA1、和IgA2。與不同類免疫球蛋白對應的重鏈恒定域分別稱作α、δ、ε、Y、和μ。
[0140]在用于本文時，術語“細胞毒劑”指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒劑包括但不限于:放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、長春花生物喊類(vinca alkaloids)(長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素(mitomycin) C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體；及下文公開的各種抗腫瘤或抗癌劑。
[0141]“效應器功能”指那些可歸于抗體Fe區且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應器功能的例子包括:Clq結合和補體依賴性細胞毒性(CDC) ；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒 性(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調jPB細胞活化。
[0142]本文中的術語“Fe區”用于定義免疫球蛋白重鏈中至少含有恒定區一部分的C端區。該術語包括天然序列Fe區和變體Fe區。在一個實施方案中，人IgG重鏈Fe區自Cys226，或自Pro230延伸至重鏈的羧基端。然而，Fe區的C端賴氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有規定，Fe區或恒定區中的氨基酸殘基的編號方式依照EU編號系統，又稱作EU 索弓 I,如記載于 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。
[0143]“框架”或“FR”指除高變區(HVR)殘基外的可變域殘基。一般地，可變域的FR由4個？1?域組成疋1?1、？1?2、？1?3、和？1?4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的順序出現:FR1-H1 (LI) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。
[0144]術語“全長抗體”、“完整抗體”、和“全抗體”在本文中可互換使用，指與天然抗體結構具有基本上類似的結構或者具有含有如本文中所限定的Fe區的重鏈的抗體。
[0145]“人抗體”指擁有與由人或人細胞生成的或利用人抗體全集或其它人抗體編碼序列自非人來源衍生的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序列的抗體。人抗體的此定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
[0146]“人源化”抗體指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施方案中，人源化抗體會包含至少一個，通常兩個基本上整個可變域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)對應于非人抗體的那些，且所有或基本上所有FR對應于人抗體的那些。任選地，人源化抗體可以至少包含自人抗體衍生的抗體恒定區的一部分。抗體，例如非人抗體的“人源化形式”指已經經歷人源化的抗體。[0147]在用于本文時，術語“高變區”或“HVR”指抗體可變域中在序列上高變的和/或形成結構上限定的環(“高變環”)的每個區。一般地，天然的4鏈抗體包含6個HVR;三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。HVR —般包含來自高變環和/或來自“互補決定區”(CDR)的氨基酸殘基，后一種是最高序列變異性的和/或牽涉抗原識別。例示性的高變環存在于氨基酸殘基 26-32 (LI) ,50-52 (L2) ,91-96 (L3) ,26-32 (Hl) ,53-55 (H2)、和96-101 (H3) ο (Chothia 和 Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性的 CDR(CDR_L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-Hl、CDR-H2、和 CDR-H3)存在于 LI 的氨基酸殘基 24-34、L2 的 50-56、L3 的 89-97,Hl 的 31_35B、H2 的 50-65、和 H3 的 95-102 (Kabat 等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, National Institutesof Health, Bethesda, MD (1991))。除了 VH中的CDRl外，CDR—般包含形成高變環的氨基酸殘基。⑶R還包含“特異性決定殘基”，或“SDR”，其是接觸抗原的殘基。SDR包含在稱作縮短的-⑶R，或 a-CDR 的 CDR 區內。例示性的 a_CDR (a-CDR-Ll、a_CDR_L2、a_CDR_L3、a-CDR-Hl、a-CDR-H2、和 a_CDR-H3)存在于 LI 的氨基酸殘基 31-34、L2 的 50-55、L3 的89-96,Hl 的 31-35B、H2 的 50-58、和 H3 的 95-102 (見 Almagro 和 Fransson, Front.Biosci。13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可變域中的HVR殘基和其它殘基(例如，FR殘基)在本文中依照Kabat等，見上文編號。在一個實施方案中，本文中的c-met抗體包含SEQ IDNO:1-6 的 HVR0
[0148]“親和力”指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有指示，如本文中使用的，“結合親和力”指反映結合對的成員(例如抗體和抗原)之間1:1相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通常可以用解離常數(Kd)來表述。親和力可以通過本領域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于測量結合親和力的具體的說明性和例示性的實施方案。
[0149]“免疫綴合物”指與一種或多種異源分子，包括但不限于細胞毒劑綴合的抗體。
[0150]在用于本文時，術語“單克隆抗體”指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體是相同的和/或結合相同表位，除了例如含有天然存在的突變或在單克隆抗體制備物的生成期間發生的可能的變體抗體外，此類變體一般以極小量存在。與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。如此，修飾語“單克隆”指示抗體自一群基本上同質的抗體獲得的特性，而不應解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，可以通過多種技術來生成要依照本發明使用的單克隆抗體，包括但不限于雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法，本文中描述了用于生成單克隆抗體的此類方法和其它例示性方法。
[0151]“裸抗體”指未與異源模塊(例如細胞毒性模塊)或放射性標記物綴合的抗體。裸抗體可以存在于藥物配制劑中。
[0152]“天然抗體”指具有不同結構的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是約150，000道爾頓的異四聚糖蛋白，由二硫化物鍵合的兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構成。從N至C端，每條重鏈具有一個可變區(VH)，又稱作可變重域或重鏈可變域，接著是三個恒定域(CHl、CH2jPCH3)。類似地，從N至C端，每條輕鏈具有一個可變區(VL)，又稱作可變輕域或輕鏈可變域，接著是一個恒定輕(CL)域。根據其恒定域氨基酸序列，抗體輕鏈可歸入兩種類型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(λ)。
[0153]術語“藥物配制劑”指其形式容許藥物的生物學活性是有效的，且不含對會施用該配制劑的受試者產生不可接受的毒性的別的成分的無菌制備物。
[0154]“無菌”配制劑是無菌的或不含所有活的微生物及其孢子。
[0155]“試劑盒”指包含至少一種試劑(例如用于治療癌癥(例如黑素瘤、結腸直腸癌)的藥物，或用于特異性檢測生物標志物基因或蛋白的試劑(例如抗體))的任何制品(例如包裝或容器)。所述制品優選以用于實施本發明方法的單位來宣傳、分發、或銷售。
[0156]“藥學可接受載體”指藥物配制劑中與活性成分不同的，且對受試者無毒的成分。藥學可接受載體包括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩定劑、或防腐劑。
[0157]關于參照多肽序列的“百分比)氨基酸序列同一性”定義為比對序列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術范圍內的多種方式進行，例如使用公眾可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可以決定用于比對序列的合適參數，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然而，為了本發明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比較計算機程序ALIGN-2產生的。ALIGN-2序列比較計算機程序由Genentech, Inc.編寫，并且源代碼已經連同用戶文檔一起提交給美國版權局(US Copyright Office, WashingtonD.C.，20559)，其中其以美國版權注冊號TXU510087注冊。公眾自Genentech, Inc.，SouthSan Francisco, California可獲得ALIGN-2程序,或者可以從源代碼編譯。ALIGN2程序應當編譯成在UNIX操作系統，包括數碼UNIX V4.0D上使用。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定且不變。
[0158]在采用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列A相對于(to)、與(with)、或針對(against)給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對于、與、或針對給定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算:
[0159]分數X/Y 乘 100
[0160]其中X是由序列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對中評分為相同匹配的氨基酸殘基數，且其中Y是B中的氨基酸殘基總數。應當領會，若氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等，則A相對于B的％氨基酸序列同一性將不等于B相對于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2計算機程序獲得的。
[0161]I1.癌癥藥物
[0162]一方面，本發明特征在于c-met拮抗劑和B_raf拮抗劑在治療受試者中病理狀況(諸如癌癥)的組合療法中的用途。另一方面，本發明涉及基于一種或多種本文中公開的生物標志物的表達來選擇能用癌癥藥物治療的患者。癌癥藥物的例子包括但不限于:
[0163] -c-met拮抗劑,包括抗c_met抗體；
[0164]-B-raf 拮抗劑；[0165]-化療劑和化療方案；
[0166]-用于治療癌癥(例如黑素瘤)的開發中的或已批準的其它藥物或其組合。
[0167]c-met拮抗劑的例子包括但不限于可溶性c_met受體、可溶性HGF變體、結合c-met或HGF的適體(apatmer)或肽體(peptibody) >c-met小分子、抗cnet抗體和抗HGF抗體。
[0168]在一個實施方案中，c-met拮抗劑是抗體，例如針對或結合c-met的抗體。本文中的抗體包括:單克隆抗體，包括嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在一個實施方案中，抗體是抗體片段，例如？￥、？813、？313’、單臂抗體、80?￥、雙抗體、或？(313’)2片段。在另一個實施方案中，抗體是全長抗體，例如完整IgGl抗體或其它抗體類或同種型，如本文中定義的。在一個實施方案中，抗體是單價的。在另一個實施方案中，抗體是包含Fe區的單臂抗體(即重鏈可變域和輕鏈可變域形成單一抗原結合臂)，其中Fe區包含第一和第二 Fe多肽，其中第一和第二 Fe多肽以復合物存在且形成Fe區，與包含所述抗原結合臂的Fab分子相比，該Fe區提高所述抗體片段的穩定性。單臂抗體可以是單價的。
[0169]在另一個實施方案中，抗c-met抗體是MetMAb(onartuzumab)或其生物相似形式。MetMAb 公開于例如 W02006/015371 Jin et al, Cancer Res (2008) 68:4360。在另一個實施方案中，抗c-met抗體包含重鏈可變域，其包含下述一項或多項:(a) HVR1-HC，其包含序列 GYTFTSYWLH(SEQ ID NO:1) ； (b) HVR2-HC，其包含序列 GMIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQID N0:2);和 / 或(c)HVR3-HC，其包含序列 ATYRSYVTPLDY(SEQ ID NO:3)。在一些實施方案中，抗體包含輕鏈可變域，其包含下述一項或多項:(a)HVRl-LC，其包含序列KSSQSLLYTSSQKNY LA(SEQ ID NO:4) ;HVR2_LC，其包含序列 WASTRES(SEQ ID NO:5);和 / 或(c)HVR3-LC，其包含序列QQYYAYPWT(SEQ ID NO:6)。在一些實施方案中，抗c-met抗體包含重鏈可變域和輕鏈可變域，該重鏈可變域包含:(a) HVR1-HC，其包含序列GYTFTSYWLH (SEQID NO:1) ; (b)HVR2-HC，其包含序列 GMIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO: 2);和(c)HVR3_HC，其包含序列ATYRSYVTPLDY(SEQ ID NO: 3)，該輕鏈可變域包含:(a)HVR1-LC，其包含序列KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO:4) ;HVR2_LC，其包含序列 WASTRES (SEQ ID NO:5);和(c)HVR3-LC，其包含序列 QQYYAYPWT(SEQ ID NO:6)。
[0170]在任何上述實施方案中，例如，抗c-met抗體可以是人源化的。在一個實施方案中，抗c-met抗體包含任何上述實施方案中的HVR，且進一步包含受體人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
[0171]另一方面，抗c-met抗體包含與SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%序列同一性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的VH序列相對于參照序列含有替代(例如保守替代)、插入、或刪除，但是包含該序列的抗c-met抗體保留結合人c-met的能力。在某些實施方案中，在SEQ ID N0:7中替代、改變插入和/或刪除了總共I到10個氨基酸。在某些實施方案中，替代、插入、或刪除存在于HVR以外的區域(即在FR中)。任選地，抗c-met抗體包含SEQ ID NO: 7中的VH序列，包括該序列的翻譯后修飾。
[0172]另一方面，提供抗c-met抗體，其中該抗體包含與SEQ ID N0:8的氨基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%序列同一性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的VL序列相對于參照序列含有替代(例如保守替代)、插入、或刪除，但是包含該序列的抗c-met抗體保留結合c-met的能力。在某些實施方案中，在SEQID N0:8中替代、插入和/或刪除了總共I到10個氨基酸。在某些實施方案中，替代、插入、或刪除存在于HVR以外的區域(即在FR中)。任選地，抗c-met抗體包含SEQ ID NO:8中的VL序列，包括該序列的翻譯后修飾。
[0173]在還有另一個實施方案中，抗c-met抗體包含與SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%序列同一性的 VL區和與SEQ ID N0:7 的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的VH區。在還有又一個實施方案中，抗c-met抗體包含:HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1 ;HVR_L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2 ；HVR-L3,其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3 ;HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4 ;HVR_H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:5 ;和HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:6。
[0174]另一方面，提供抗c-met抗體，其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。
[0175]又一方面，本發明提供與本文中提供的抗c-met抗體結合相同表位的抗體。例如，在某些實施方案中，提供與下述抗c-met抗體結合相同表位或能被下述抗c-met抗體競爭性抑制的抗體，該抗c-met抗體包含VH序列SEQ ID NO: 7和VL序列SEQ ID NO: 8。
[0176]在本發明的又一個方面，依照任何上述實施方案的抗c-met抗體可以是單克隆抗體，包括單價抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在一個實施方案中，抗c-met抗體是抗體片段，例如單臂、Fv 、Fab、Fab’、SCFv、雙抗體、或F(ab’)2片段。在另一個實施方案中，抗體是全長抗體，例如完整IgGl或IgG4抗體或其它抗體類或同種型，如本文中定義的。依照另一個實施方案中，抗體是雙特異性抗體。在一個實施方案中，雙特異性抗體包含上文所述HVR或包含上文所述VH和VL區。
[0177]在一些實施方案中，抗c-met抗體是單價的，而且包含下述各項(或由下述各項組成或基本上由下述各項組成):(a)第一多肽，其包含重鏈可變域(其具有序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7))、CHl 序列、和第一 Fe 多肽；(b)第二多肽，其包含輕鏈可變域(其具有序列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKR(SEQID NO:8))、和CLl序列；和(c)第三多肽,其包含第二 Fe多肽，其中重鏈可變域和輕鏈可變域作為復合物存在且形成單一抗原結合臂，其中第一和第二 Fe多肽在復合物中存在且形成Fe區，與包含所述抗原結合臂的Fab分子相比，該Fe區提高所述抗體片段的穩定性。在一些實施方案中，第一多肽包含 Fe 序列 CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 9)，而第二多肽包含 Fe 序列 CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:10)。
[0178]在另一些實施方案中，抗c-met抗體是單價的，而且包含:(a)第一多肽，其包含重鏈，所述多肽包含序列:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 11) ； (b)第二多肽，其包含輕鏈，所述多肽包含序列DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 12);和第三多肽，其包含 Fe 序列，所述多肽包含序列 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 13)，其中重鏈可變域和輕鏈可變域作為復合物存在且形成單一抗原結合臂。
[0179]本文中描述了且本領域知道適合用于本發明方法的其它抗c-met抗體。例如，W005/016382中公開的抗c-met抗體(包括但不限于抗體13.3.2,9.1.2,8.70.2,8.90.3)；由以ICLC編號PD03001保藏于CBA(Genoa)的雜交瘤細胞系生成或識別HGF受體β鏈胞外域上表位(所述表位與該單克隆抗體識別的表位相同)的抗c-met抗體；W02007/126799中公開的抗 c-met 抗體(包括但不限于 04536、05087、05088、05091、05092、04687、05097、05098、05100、05101、04541、05093、05094、04537、05102、05105、04696、04682)；W02009/007427中公開的抗c-met抗體(包括但不限于于2007年3月14日以編號1-3731、于2007年3月14日以編號1-3732、于2007年7月6日以編號1-3786、于2007年3月14日以編號 1_3724 保藏于 CNCM(Institut Pasteur, Paris, France)的抗體)；201101294S1中公開的抗c-met抗體；US20110104176中公開的抗c-met抗體；W02009/134776中公開的抗c-met抗體；W02010/059654中公開的抗c-met抗體；W02011020925中公開的抗c-met抗體(包括但不限于自于2008年3月12日以編號1-3949保藏于CNCM(InstitutPasteur, Paris, France)的雜交瘤和于2010年I月14日以編號1-4273保藏的雜交瘤分泌的抗體)。
[0180]一方面，抗c-met抗體包含促進抗體片段內Fe序列的異二聚化，同時將同二聚化降至最低的至少一項特征。此類特征改善免疫球蛋白群體的產量和/或純度和/或同質性。在一個實施方案中，抗體包含構成“結”和“穴”的Fe突變，如W02005/063816中描述的。例如，穴突變可以是Fe多肽中的T366A、L368A和/或Y407V中的一項或多項，而空穴突變可以是T366W。
[0181]在一些實施方案中，c-met拮抗劑是抗肝細胞生長因子(HGF)抗體，例如人源化抗HGF 抗體 TAK701、rilotumumab、Ficlatuzumab、和 / 或 W02007/143090 中描述的人源化抗體2B8。在一些實施方案中，抗HGF抗體是US7718174B2中描述的抗HGF抗體。[0182]在一些實施方案中，c-met拮抗劑是c-met小分子抑制劑。小分子抑制劑優選是除本文中定義的結合多肽或抗體以外的，結合(優選特異性結合c-met的有機分子。在一些實施方案中，c-met小分子抑制劑是選擇性c-met小分子抑制劑。在一些實施方案中，c_met拮抗劑是激酶抑制劑。
[0183]特異性結合HGF的c-met受體分子或其片段能在本發明的方法中使用，例如用于結合和隔絕HGF蛋白質，由此阻止其信號傳導。優選地，c-met受體分子或其HGF結合片段是可溶性形式。在一些實施方案中，所述受體的可溶性形式通過結合HGF，由此阻止它結合其在靶細胞表面上存在的天然受體而對c-met蛋白質的生物學活性發揮抑制效果。還包括c-met受體融合蛋白，下文描述了它的例子。
[0184]本發明的可溶性c-met受體蛋白質或嵌合cnet受體蛋白質包括沒有經跨膜結構域固定至細胞表面的c-met受體蛋白質。因此，c-met受體的可溶性形式(包括嵌合受體蛋白質)在能夠結合和滅活HGF的同時不包含跨膜結構域且如此一般不變成與表達該分子的細胞的細胞膜結合。參見例如 Kong-Beltran, M et al Cancer Cell (2004) 6 (I): 75-84。
[0185]特異性結合c-met并阻斷或降低cnet活化，由此阻止它發信號的HGF分子或其片段能在本發明的方法中使用。
[0186]適體是形成特異性結合靶分子(諸如HGF或c-met多肽)的三級結構的核酸分子。適體的生成和治療用途是本領域已完善建立的。參見例如美國專利N0.5，475，096。HGF適體是PEG化的修飾的寡核苷酸，其采取使之能夠結合細胞外HGF的三維構象。關于適體的別的信息可見于美國專利申請公開文本N0.20060148748。
[0187]肽體是與編碼免疫球蛋白分子的片段或部分的氨基酸序列相連接的肽序列。多肽可衍生自隨機化序列，通過任何方法來選擇特異性結合，包括但不限于噬菌體展示技術。在一個優選的實施方案中，可以將所選擇的多肽連接至編碼免疫球蛋白Fe區的氨基酸序列。特異性結合并拮抗HGF或c-met的肽體在本發明的方法中也是有用的。
[0188]在一個實施方案中，c-met拮抗劑結合c-met胞外域。在一些實施方案中，c_met拮抗劑結合c-met激酶域。在一些實施方案中，c-met拮抗劑與肝細胞生長因子(HGF)競爭c-met結合。在一些實施方案中，c-met拮抗劑結合HGF。
[0189] 在某些實施方案中，c-met拮抗劑是下述任一:⑶C-0712，SGX-523，Crizotinib (PF-02341066 ;3_ [ (IR)-1-(2，6- 二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺；CAS n0.877399-52-5) ； JNJ-38877605 (CAS n0.943540-75-8)，BMS-698769, PHA-665752(Pfizer)， SU5416, INC-280(Incyte ;SUl1274(Sugen ；[(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-({3，5- 二甲基-4-[(4-甲基哌嗪_1_基)羰基]_1Η_吡咯-2-基}亞甲基)-N-甲基-2-氧二氫吲哚-5-磺酰胺；CAS n0.658084-23-2])，Foretinib (GSK1363089)，XL880 (CAS n0.849217-64-7 ；XL880 是 met 和 VEGFR2 和 KDR 的抑制劑);MGCD-265 (MethylGene ;MGCD_265 靶向 c_MET、VEGFRl、VEGFR2、VEGFR3、Ron 和 Tie_2受體；CAS n0.875337-44-3)，Tivantinib (ARQ197 ； (-) - (3R, 4R) -3-(5, 6_ 二氫-4H-吡咯[3,2，1-1j]喹啉-1-基)-4-(lH-吲哚-3-基)吡咯烷 _2，5-二酮;參見 Munchi etal，Mol Cancer Ther June20109 ; 1544 ;CAS n0.905854-02-6)，LY-2801653(Lilly)，LY2875358 (Lilly) ,MP-470, Rilotumumab (AMG102，抗 HGF 單克隆抗體)，抗體 223C4 或人源化抗體223C4 (W02009/007427)，人源化L2G7 (人源化TAK701 ;人源化抗HGF單克隆抗體)；EMD1214063(Merck Sorono)，EMD1204831(Merck Serono)，NK4,Cabozantinib(XL-184,CASn0.849217-68-1 ;carbozantinib 是 met 和 VEGFR2 的一種雙重抑制劑),MP-470 (SuperGen ；是 c-KIT、MET、PDGFR、Flt3、和 AXL 的一種新型抑制劑)，Comp-1, Ficlatuzumab (AV-299 ；抗 HGF 單克隆抗體)，E7050 (Cas n0.1196681-49-8 ；E7050 是一種雙重 c_met 和 VEGFR2 抑制劑(Esai) ；MK-2461(Merck ;N_((2R)-1，4-二惡烷-2-基甲基)-N-甲基-N’-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-氧-5H-苯并[4，5]環庚[1，2_b]吡啶-7-基]磺酰胺；CASn0.917879-39-1) ；MK8066(Merck), PF4217903(Pfizer)， AMG208(Amgen)， SGX-126，RP1040, LY2801653, AMG458, EMD637830, BAY-853474, DP-3590。在某些實施方案中，c-met 拮抗劑是 crizotinib、tivantinib、carbozantinib、MGCD-265、ficlatuzumab、人源化 TAK-701、rilotumumab, foretinib、h224Gll、DN-30、MK-2461、E7050、MK-8033、PF-4217903、AMG208、JNJ-38877605、EMD1204831、INC-280、LY-2801653、SGX-126、RP1040、LY2801653、BAY-853474,和/或LA480中任一種或多種。在某些實施方案中，c_met拮抗劑是 crizotinib、tivantinib、carbozantinib、MGCD-265、ficlatuzumab、人源化 TAK-701、rilotumumab、和/或foretinib中任一種或多種。在一些實施方案中，c-met拮抗劑是⑶C-0712。
[0190]B-raf拮抗劑是本領域已知的且包括例如sorafenib、PLX4720、PLX-3603、GSK2118436、⑶C-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)_1Η_ 吡咯并[2，3_b]吡啶-3-羰基)-2，4- 二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺、及 W02007/002325、W02007/002433、W02009111278、W02009111279、W02009111277、W02009111280 和美國專利 N0.7，491，829 中記載的那些。其它 B-raf 拮抗劑 包括 vemurafenib (也稱作 Zelobraf(S)和 PLX-4032)、GSK2118436、RAF265 (Novartis)、XL281、ARQ736、BAY73-4506。在一些實施方案中，B_raf 拮抗劑是選擇性B-raf拮抗劑。在一些實施方案中,B-raf拮抗劑是B-raf V600的選擇性拮抗劑。在一些實施方案中，B-raf拮抗劑是B-raf V600E的選擇性拮抗劑。在一些實施方案中，B-rafV600 是B-raf V600E,B-raf V600K、和 / 或 V600D。在一些實施方案中，B_raf V600 是B_rafV600R。
[0191]B-raf拮抗劑可以是小分子抑制劑。小分子抑制劑優選是除本文中限定的結合(優選特異性地)B-raf的多肽或抗體以外的有機分子。在一些實施方案中，B-raf拮抗劑是激酶抑制劑。在一些實施方案中，B-raf拮抗劑是抗體、肽、肽模擬物、適體(aptomer)或多核苷酸。
[0192]在一個實施方案中，抗體(例如本文方法中使用的抗體)可摻入任何單一或組合特征，如下文1-6節描述的。
[0193]1.抗體片段
[0194]在某些實施方案中，本文中提供的抗體是抗體片段。抗體片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，單臂抗體，及下文所描述的其它片段。關于某些抗體片段的綜述，見Hudson等Nat.Med.9:129-134 (2003)。關于scFv片段的綜述，見例如Pluckthiin,于 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113卷，Rosenburg和Moore 編，(Springer-Verlag, New York),第 269-315 頁(1994);還可見 W093/16185 ;及美國專利N0.5，571，894和5，587，458。關于包含補救受體結合表位殘基，并且具有延長的體內半衰期的Fab和F(ab’)2片段的討論，見美國專利N0.5，869，046。[0195]雙抗體是具有兩個抗原結合位點的抗體片段，其可以是二價的或雙特異性的。見例如 EP404, 097 ；W01993/01161 ；Hudson 等，Nat.Med.9:129-134(2003)；及 Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993)。三抗體和四抗體也記載于 Hudson等，Nat.Med.9:129-134 (2003)。
[0196]單域抗體是包含抗體的整個或部分重鏈可變域或整個或部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施方案中，單域抗體是人單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA ;見例如美國專利 N0.6，248，516B1)。
[0197]單臂抗體(即重鏈可變域和輕鏈可變域形成單一抗原結合臂)公開于例如W02005/063816 ；Martens et al, Clin Cancer Res (2006)，12:6144。對于需要拮抗功能且抗體二價性導致不想要的激動效應的病理狀況治療，單臂抗體(即包含單一抗原結合臂的抗體)的單價性狀導致和/或確保抗體結合靶分子時的拮抗功能。另外，包含Fe區的單臂抗體的特征在于與具有相似/基本上相同的抗原結合特征的Fab形式相比卓越的藥動學屬性(諸如體內降低的清除速率和/或延長的半衰期)，如此克服使用常規單價Fab抗體的主要缺點。用于制備單臂抗體的技術包括但不限于“結入穴”工程(參見例如美國專利N0.5，731，168)。MetMAb是單臂抗體的一個例子。
[0198]可以通過多種技術，包括但不限于對完整抗體的蛋白水解消化及重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)的生成來生成抗體片段，如本文中所描述的。
[0199]2.嵌合的和人源化的抗體
[0200]在某些實施方 案中，本文中提供的抗體是嵌合抗體。某些嵌合抗體記載于例如美國專利 N0.4，816，567 ;及 Morrison 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 81:6851-6855 (1984))。在一個例子中，嵌合抗體包含非人可變區(例如，自小鼠、大鼠、倉鼠、家兔、或非人靈長類，諸如猴衍生的可變區)和人恒定區。在又一個例子中，嵌合抗體是“類轉換的”抗體，其中類或亞類已經自親本抗體的類或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
[0201]在某些實施方案中，嵌合抗體是人源化抗體。通常，將非人抗體人源化以降低對人的免疫原性，同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。一般地，人源化抗體包含一個或多個可變域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗體衍生，而FR(或其部分)自人抗體序列衍生。任選地，人源化抗體還會至少包含人恒定區的一部分。在一些實施方案中，將人源化抗體中的一些FR殘基用來自非人抗體(例如衍生HVR殘基的抗體)的相應殘基替代，例如以恢復或改善抗體特異性或親和力。
[0202]人源化抗體及其生成方法綜述于例如Almagro和Fransson, Front.Biosc1.13:1619-1633 (2008),并且進一步記載于例如 Riechmann等，Nature332:323 - 329 (I 988) ； Qu e e η 等，Proc.Nat’ I Acad.Sc1.USA86:10029-10033(1989)；美國專利 N0.5，821，337，7，527，791，6，982，321 和7, 087, 409 ；Kashmiri 等，Methods36:25-34(2005)(描述了 SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan, Mol.1mmunol.28:489-498 (1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等，Methods36:43-60 (2005)(描述了“FR 改組”)；及 Osbourn 等，Methods36:61-68 (2005)和 Klimka 等，Br.J.Cancer, 83:252-260 (2000)(描述了 FR 改組的“引導選擇”方法)。
[0203]可以用于人源化的人框架區包括但不限于:使用“最佳擬合(best-fit)”方法選擇的框架區(見例如Sims等J.1mmunol.151:2296 (1993))；自輕或重鏈可變區的特定亞組的人抗體的共有序列衍生的框架區(見例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 89:4285(1992)；及 Presta 等 J.1mmunol.，151:2623(1993));人成熟的(體細胞突變的)框架區或人種系框架區(見例如Almagro和Fransson, Front.Biosc1.13:1619-1633(2008));和通過篩選FR文庫衍生的框架區(見例如Baca等，J.Biol.Chem.272:10678-10684 (1997)及 Rosok 等，J.Biol.Chem.271:22611-22618 (1996))。
[0204]3.人抗體
[0205]在某些實施方案中，本文中提供的抗體是人抗體。可以使用本領域中已知的多種技術來生成人抗體。一般地，人抗體記載于van Dijk和van de ffinkel, Curr.0pin.Pharmacol.5:368-74(2001)及 Lonberg, Curr.0pin.1mmunol.20:450-459(2008)。
[0206]可以通過對轉基因動物施用免疫原來制備人抗體，所述轉基因動物已經修飾為響應抗原性攻擊而生成完整人抗體或具有人可變區的完整抗體。此類動物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替換內源免疫球蛋白基因座，或者其在染色體外存在或隨機整合入動物的染色體中。在此類轉基因小鼠中，一般已經將內源免疫球蛋白基因座滅活。關于自轉基因動物獲得人抗體的方法的綜述，見Lonberg, Nat.Biotech.23:1117-1125 (2005)。還可見例如美國專利N0.6，075，181和6，150，584，其描述了 XEN0M0USE?技術；美國專利N0.5，770，429，其描述了 HUMAB?技術；美國專利N0.7，041, 870，其描述了 K-M MOUSE?技術，和美國專利申請公開文本N0.US2007/0061900,其描述了VFI OCIMOUSE?技術)。可以例如通過與不同人恒定區組合進一步修飾來自由此類動物生成的完整抗體 的人可變區。
[0207]也可以通過基于雜交瘤的方法生成人抗體。已經描述了用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異骨髓瘤細胞系(見例如Kozbor J.1mmunol., 133:3001 (1984)；Brodeur 等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第 51-63 頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及 Boerner 等，J.1mmunol., 147:86 (1991))。經由人B細胞雜交瘤技術生成的人抗體也記載于Li等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 103:3557-3562 (2006)。其它方法包括那些例如記載于美國專利N0.7，189，826 (其描述了自雜交瘤細胞系生成單克隆人IgM抗體)和Ni，XiandaiMianyixue, 26 (4): 265-268 (2006)(其描述了人-人雜交瘤)的。人雜交瘤技術(Trioma技術)也記載于 Vollmers 和 Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3): 927-937 (2005)及 Vollmers和 Brandlein, Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology, 27(3):185-91 (2005)。
[0208]也可以通過分離自人衍生的噬菌體展示文庫選擇的Fv克隆可變域序列生成人抗體。然后，可以將此類可變域序列與期望的人恒定域組合。下文描述了自抗體文庫選擇人抗體的技術。
[0209]4.文庫衍生的抗體
[0210]可以通過對組合文庫篩選具有期望的一種或多種活性的抗體來分離本發明的抗體。例如，用于生成噬菌體展示文庫并對此類文庫篩選擁有期望結合特征的抗體的多種方法是本領域中已知的。此類方法綜述于例如Hoogenboom等于Methods in MolecularBiologyl78:1-37 (0，Brien 等編,Human Press, Totowa, NJ, 2001)，并且進一步記載于例如 McCafferty 等，Nature348:552-554 ;Clackson 等，Nature352:624-628(1991)；Marks 等，J.Mol.Biol.222:581-597 (1992) ；Marks 和 Bradbury,于 Methods inMolecular Biology248:161-175(Lo 編,Human Press,Totowa, NJ, 2003) ；Sidhu 等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004) ；Lee 等,J.Mol.Biol.340 (5): 1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc.Natl.Acad.Sc1.USAlOl (34): 12467-12472 (2004);及 Lee 等，J.1mmunol.Methods284 (1-2): 119-132(2004)。
[0211]在某些噬菌體展示方法中，將VH和VL基因的全集分別通過聚合酶鏈式反應(PCR)克隆，并在噬菌體文庫中隨機重組，然后可以對所述噬菌體文庫篩選抗原結合噬菌體，如記載于 Winter 等,Ann.Rev.Tmmunol., 12:433-455 (1994)的。卩遼菌體通常以單鏈 Fv (scFv)片段或以Fab片段展示抗體片段。來自經免疫的來源的文庫提供針對免疫原的高親和力抗體，而不需要構建雜交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在沒有任何免疫的情況中提供針對一大批非自身和還有自身抗原的抗體的單一來源，如由Griffiths等，EMBOJ, 12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通過自干細胞克隆未重排的V基因區段，并使用含有隨機序列的PCR引物編碼高度可變的CDR3區并在體外實現重排來合成生成未免疫文庫，如由 Hoogenboom 和 Winter, J.Mol.Biol.，227:381-388 (1992)所描述的。描述人抗體噬菌體文庫的專利公開文本包括例如:美國專利N0.5，750, 373、和美國專利公開文本N0.2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936 和 2009/0002360。
[0212]認為自人抗體文庫分離的抗體或抗體片段是本文中的人抗體或人抗體片段。
[0213]5.多特異性抗體
[0214]在某些實施方案中，本文中提供的抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同位點具有結合特異性的單克隆抗體。在某些實施方案中，結合特異性之一針對c-met，而另一種針對任何其它抗原(例如B-raf)。在某些實施方案中，雙特異性抗體可以結合c-met的兩個不同表位。也可以使用雙特異性抗體來將細胞毒劑定位于表達c-met的細胞。雙特異性抗體可以以全長抗體或抗體片段制備。
[0215]用于生成多特異性抗體的技術包括但不限于具有不同特異性的兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表達(見 Milstein 和 Cuello, Nature305:537 (1983)、W093/08829、和Traunecker等，EMBO J.10:3655 (1991))、和“突起-入-空穴”工程化(見例如美國專利N0.5，731，168)。也可以通過用于生成抗體Fe-異二聚體分子的工程化靜電操縱效應(W02009/089004A1);交聯兩個或更多個抗體或片段(見例如美國專利N0.4，676，980，及Brennan等，Science, 229:81 (1985));使用亮氨酸拉鏈來生成雙特異性抗體(見例如Kostelny等，J.1mmunol.，148 (5): 1547-1553 (1992));使用用于生成雙特異性抗體片段的“雙抗體”技術(見例如 Hollinger 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv(sFv) 二聚體(見例如Gruber等，J.1mmunol., 152:5368(1994));及如例如Tutt等J.1mmunol.，147:60(1991)中所描述的,制備三特異性抗體來生成多特異性抗體。
[0216]本文中還包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點的工程化改造抗體，包括“章魚抗體”(見例如US2006/0025576A1)。
[0217]本文中的抗體或片段還包括包含結合c-met及另一種不同抗原(諸如EGFR)的抗原結合位點的“雙重作用FAb”或“DAF” (見例如US2008/0069820)。
[0218]6.抗體變體[0219]在某些實施方案中，涵蓋本文中提供的抗體的氨基酸序列變體。例如，可以期望改善抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。可以通過將合適的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或者通過肽合成來制備抗體的氨基酸序列變體。此類修飾包括例如對抗體的氨基酸序列內的殘基的刪除、和/或插入和/或替代。可以進行刪除、插入、和替代的任何組合以得到最終的構建體，只要最終的構建體擁有期望的特征，例如，抗原結合。
[0220]在某些實施方案中，提供了具有一處或多處氨基酸替代的抗體變體。替代誘變感興趣的位點包括HVR和FR。可以將氨基酸替代引入感興趣的抗體中，并且對產物篩選期望的活性，例如保留/改善的抗原結合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
[0221]一類替代變體牽涉替代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或多個高變區殘基。一般地，為進一步研究選擇的所得變體相對于親本抗體會具有某些生物學特性的改變(例如改善)(例如升高的親和力、降低的免疫原性)和/或會基本上保留親本抗體的某些生物學特性。例示性的替代變體是親和力成熟的抗體，其可以例如使用基于噬菌體展示的親和力成熟技術諸如本文中所描述的那些技術來方便地生成。簡言之，將一個或多個HVR殘基突變，并將變體抗體在噬菌體上展示，并對其篩選特定的生物學活性(例如結合親和力)。
[0222] 氨基酸序列插入包括長度范圍為I個殘基至含有100或更多個殘基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基殘基的抗體。抗體分子的其它插入變體包括抗體的N或C端與酶(例如對于ADEPT)或延長抗體的血清半衰期的多肽的融合物。
[0223]在某些實施方案中，改變本文中提供的抗體以提高或降低抗體糖基化的程度。可以通過改變氨基酸序列，使得創建或消除一個或多個糖基化位點來方便地實現對抗體的糖基化位點的添加或刪除。
[0224]在抗體包含Fe區的情況中，可以改變其附著的碳水化合物。由哺乳動物細胞生成的天然抗體通常包含分支的、雙觸角寡糖，其一般通過N連接附著于Fe區的CH2域的Asn297。見例如Wright等TIBTECH15:26-32 (1997)。寡糖可以包括各種碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附著于雙觸角寡糖結構“主干”中的GlcNAc的巖藻糖。在一些實施方案中，可以對本發明抗體中的寡糖進行修飾以創建具有某些改善的特性的抗體變體。
[0225]在一個實施方案中，提供了抗體變體，其具有缺乏附著(直接或間接)于Fe區的巖藻糖的碳水化合物結構。例如，此類抗體中的巖藻糖量可以是1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。通過相對于附著于Asn297的所有糖結構(例如，復合的、雜合的和高甘露糖的結構)的總和，計算Asn297處糖鏈內巖藻糖的平均量來測定巖藻糖量，如通過MALD1-T0F質譜術測量的，例如如記載于W02008/077546的。Asn297指位于Fe區中的約第297位(Fe區殘基的Eu編號方式)的天冬酰胺殘基；然而，Asn297也可以由于抗體中的微小序列變異而位于第297位上游或下游約±3個氨基酸，即在第294位和第300位之間。此類巖藻糖基化變體可以具有改善的ADCC功能。見例如美國專利公開文本 N0.US2003/0157108(Presta, L.) ；US2004/0093621 (Kyowa Hakko KogyoC0.，Ltd)。涉及“脫巖藻糖基化的”或“巖藻糖缺乏的”抗體變體的出版物的例子包括:US2003/0157108 ；W02000/61739 ；W02001/29246 ；US2003/0115614 ；US2002/0164328 ；US2004/0093621 ；US2004/0132140 ；US2004/0110704 ；US2004/0110282 ；US2004/0109865 ；W02003/085119 ；W02003/084570 ；W02005/035586 ；W02005/035778 ；W02005/053742 ；W02002/031140 ；Okazaki 等 J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004) ；Yamane-Ohnuki 等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能夠生成脫巖藻糖基化抗體的細胞系的例子包括蛋白質巖藻糖基化缺陷的 Lecl3CH0 細胞(Ripka 等 Arch.Biochem.Biophys.249:533-545 (1986)；美國專利申請 No US2003/0157108A1, Presta, L ;及 W02004/056312A1, Adams 等，尤其在實施例11)，和敲除細胞系，諸如α -1, 6-巖藻糖基轉移酶基因FUT8敲除CHO細胞(見例如 Yamane-Ohnuki 等 Biotech.Bioeng.87:614 (2004) ；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.，94 (4): 680-688 (2006);及 W02003/085107)。
[0226]進一步提供了具有兩分型寡糖的抗體變體，例如其中附著于抗體Fe區的雙觸角寡糖是通過GIcNAc兩分的。此類抗體變體可以具有降低的巖藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此類抗體變體的例子記載于例如W02003/011878 (Jean-Mairet等)；美國專利 N0.6，602，684 (Umana 等)；及 US2005/0123546 (Umana 等)。還提供了在附著于 Fe 區的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。此類抗體變體可以具有改善的CDC功能。此類抗體變體記載于例如 W01997/30087(Patel 等)；W01998/58964(Raju, S.);及W01999/22764(Raju, S.)。
[0227]在某些實施方案中，可以將一處或多處氨基酸修飾引入本文中提供的抗體的Fe區中，由此生成Fe區變體。Fe區變體可以包含在一個或多個氨基酸位置包含氨基酸修飾(例如替代)的人Fe區序列(例如，人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc區)。
[0228]在某些實施方案中，本發明涵蓋擁有一些但不是所有效應器功能的抗體變體，所述效應器功能使其成為如 下應用的期望候選物，其中抗體的體內半衰期是重要的，而某些效應器功能(諸如補體和ADCC)是不必要的或有害的。
[0229]具有降低的效應器功能的抗體包括那些具有Fe區殘基238，265，269，270，297，327和329中的一個或多個的替代的(美國專利N0.6，737，056)。此類Fe突變體包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的兩處或更多處具有替代的Fe突變體，包括殘基265和297替代成丙氨酸的所謂的“DANA” Fe突變體(美國專利N0.7，332，581)。
[0230]描述了具有改善的或降低的對FcR的結合的某些抗體變體(見例如美國專利N0.6，737，056 ;TO2004/056312，及 Shields 等，J.Biol.Chem.9 (2): 6591-6604 (2001))。
[0231]在某些實施方案中，抗體變體包含具有改善ADCC的一處或多處氨基酸替代，例如Fe區的位置298、333、和/或334(殘基的EU編號方式)的替代的Fe區。
[0232]在一些實施方案中，對Fe區做出改變，其導致改變的(即，改善的或降低的)Clq結合和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如記載于美國專利N0.6, 194,551、W099/51642、及 Idusogie 等 J.1mmunol.164:4178-4184(2000)的。
[0233]具有延長的半衰期和改善的對新生兒Fe受體(FcRn)的結合的抗體記載于US2005/0014934Al(Hinton等)，新生兒Fe受體(FcRn)負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等,J.1mmunol.117:587 (1976)及 Kim 等,J.1mmunol.24:249 (1994))。那些抗體包含其中具有改善Fe區對FcRn結合的一處或多處替代的Fe區。此類Fe變體包括那些在Fe區殘基 238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434中的一處或多處具有替代，例如，Fe區殘基434的替代的(美國專利N0.7，371，826)。
[0234]還可見Duncan 和 Winter, Nature322:738-40 (1988);美國專利 N0.5，648，260 ;美國專利N0.5，624，821 ;及W094/29351，其關注Fe區變體的其它例子。
[0235]在某些實施方案中，可以期望創建經半胱氨酸工程化改造的抗體，例如，“thioMAb”，其中抗體的一個或多個殘基用半胱氨酸殘基替代。在具體的實施方案中，替代的殘基存在于抗體的可接近位點。通過用半胱氨酸替代那些殘基，反應性硫醇基團由此定位于抗體的可接近位點，并且可以用于將抗體與其它模塊，諸如藥物模塊或接頭-藥物模塊綴合，以創建免疫綴合物，如本文中進一步描述的。在某些實施方案中，可以用半胱氨酸替代下列殘基之任一個或多個:輕鏈的V205 (Kabat編號方式)；重鏈的Al 18 (EU編號方式);和重鏈Fe區的S400(EU編號方式)。可以如例如美國專利N0.7，521，541所述生成經半胱氨酸工程化改造的抗體。
[0236]在某些實施方案中，可以進一步修飾本文中提供的抗體以含有本領域知道的且易于獲得的額外非蛋白質性質模塊。適合于抗體衍生化的模塊包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3- 二氧戊環、聚-1，3，6-三卩惡烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或隨機共聚物)、和右旋糖苷或聚(η-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的穩定性，聚乙二醇丙醛在生產中可能具有優勢。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附著到抗體上的聚合物數目可以變化，而且如果附著了 超過一個聚合物，那么它們可以是相同或不同的分子。一般而言，可根據下列考慮來確定用于衍生化的聚合物的數目和/或類型，包括但不限于抗體要改進的具體特性或功能、抗體衍生物是否將用于指定條件下的治療等。
[0237]在另一個實施方案中，提供了抗體和可以通過暴露于輻射選擇性加熱的非蛋白質性質模塊的綴合物。在一個實施方案中，非蛋白質性質模塊是碳納米管(Kam等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA102:11600-11605 (2005))。輻射可以是任何波長的，并且包括但不限于對普通細胞沒有損害，但是將非蛋白質性質模塊加熱至抗體-非蛋白質性質模塊附近的細胞被殺死的溫度的波長。
[0238]在一個實施方案中，藥物是包含與一種或多種細胞毒劑，諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白質毒素、細菌、真菌、植物、或動物起源的酶活性毒素、或其片段)、或放射性同位素綴合的抗體(諸如c-met抗體)的免疫綴合物。
[0239]在一個實施方案中，免疫綴合物是抗體-藥物綴合物(ADC)，其中抗體與一種或多種藥物綴合，包括但不限于美登木素生物堿(見美國專利N0.5，208，020,5, 416，064和歐洲專利EP0425235B1) ；auristatin諸如單甲基auristatin藥物模塊DE和DF(MMAE和MMAF)(見美國專利 N0.5，635，483 和 5，780，588 及 7，498，298);多拉司他汀(dolastatin)；加利車霉素(calicheamicin)或其衍生物(見美國專利N0.5，712，374，5，714，586，5，739，116，5，767，285，5，770，701，5，770，710，5，773，001 和 5，877，296 ；Hinman 等，CancerRes.53:3336-3342(1993);及 Lode 等，Cancer Res.58:2925-2928 (1998));蒽環類抗生素諸如道諾霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(見 Kratz 等,Current Med.Chem.13:477-523(2006) ； Jeffrey 等,Bioorganic&Med.Chem.Lettersl6:358-362 (2006)；Torgov 等，Bioconj.Chem.16: 717-721 (2005) ；Nagy 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA97:829-834(2000) ；Dubowchik 等，Bioorg.&Med.Chem.Lettersl2:1529-1532(2002)；King 等，J.Med.Chem.45:4336-4343(2002);及美國專利 N0.6，630，579);甲氨蝶呤；長春地辛(vindesine);紫杉燒(taxane)諸如多西他賽(docetaxel)、帕利他塞、larotaxel、tesetaxel、和 ortataxel ;單端抱霉素(trichothecene);和 CC1065。
[0240]在另一個實施方案中，免疫綴合物包含與酶活性毒素或其片段綴合的如本文中所描述的抗體，所述酶活性毒素包括但不限于白喉A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAP1、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、釀霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端抱菌素(trichothecenes)。
[0241]在另一個實施方案中，免疫綴合物包含與放射性原子綴合以形成放射性綴合物的如本文中所描述的抗體。多種放射性同位素可用于生成放射性綴合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212 和 Lu 的放射性同位素。在使用放射性綴合物進行檢測時，它可以包含供閃爍法研究用的放射性原子，例如tc99m或1123，或供核磁共振(NMR)成像(又稱為磁共振成像，mri)用的自旋標記物，諸如再一次的碘-123、碘-131、鋼_111、氣_19、碳-13、氣-15、氧_17、禮、猛或鐵。 [0242]可以使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來生成抗體和細胞毒劑的綴合物，諸如N-琥珀酰亞氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亞氨基硫烷(IT)，亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯甲酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯甲酰基)_乙二胺)、二異硫氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5_ 二氟-2，4- 二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可以如Vitetta等，Science238:1098 (1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯的例示性螯合劑。參見W094/11026。接頭可以是便于在細胞中釋放細胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩定接頭、肽酶敏感性接頭、光不穩定接頭、二甲基接頭或含二硫化物接頭(Chari等，CancerRes52:127-131 (1992);美國專利 N0.5，208，020)。
[0243]本文中的免疫綴合物或ADC明確涵蓋，但不限于用交聯試劑制備的此類綴合物，所述交聯試劑包括但不限于 BMPS、EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS、MPBH、SBAP, SIA、SIAB, SMCC, SMPB, SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、和sulfo-SMPB，及SVSB (琥珀酰亞氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它們是商品化的(例如，來自 Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL.，U.S.A)。
[0244]化療劑[0245]本發明的聯合療法可另外包含用一種或多種化療劑進行的治療。組合施用包括使用分開的配制劑或單一藥物配制劑的共施用或同時施用和任一次序的序貫施用，其中優選有一段時間所有活性劑同時發揮它們的生物學活性。如果施用的話，由于藥物的組合作用或可歸于化療劑施用的消極副作用，通常以關于它們已知的或任選降低的劑量施用化療劑。可依照制造商的說明書或根據從業人員憑經驗確定的那樣使用此類化療劑的制備和劑量給藥日程。
[0246]上文公開了可組合的多種化療劑。在一些實施方案中，要組合的化療劑選自下組:類紫杉醇(taxoid)(包括多西他塞(docetaxel)和帕利他塞(paclitaxel))、長春藥(vinca)(諸如長春瑞濱(vinorelbine)或長春堿(vinblastine))、鉬化合物(諸如卡鉬(carboplatin)或順鉬(cisplatin))、芳香酶抑制劑(諸如來曲唑(Ietrozole)、阿那曲唑(anastrazole)、或依西美坦(exemestane))、抗雌激素(例如氟維司群(fulvestrant)或他莫昔芬(tamoxifen))、依托泊苷(etoposide)、塞替哌(thiotepa)、環憐酸胺(cyclophosphamide)、甲氨蝶呤(methotrexate)、脂質體多柔比星(liposomaldoxorubicin)、PEG 化脂質體多柔比星(pegylated liposomal doxorubicin)、卡培他濱(capecitabine)、吉西他濱(gemcitabine)、C0X-2 抑制劑(例如塞來考昔(celecoxib))、或蛋白體抑制劑(例如PS342)。在一些實施方案中，化療劑為替莫唑胺(temozolomide)和/或達卡巴嗪(dacarbazine)。
[0247]II1.組合療法
[0248]一方面，提供了用于治療具有癌癥的患者的方法，其包括施用有效(例如治療有效)量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。在一些實施方案中，c-met拮抗劑為抗c-met抗體(例如MetMAb)。在一些實施方案中，治療包括與B_raf拮抗劑(諸如vemurafenib)組合施用抗c_met抗體(例如MetMAb)。在一些實施方案中，抗c_met抗體為 MetMAb(onartuzumab)。
[0249]另一方面，提供了用于治療形成對B-raf拮抗劑的抗性的可能性升高的癌癥患者的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
[0250]另一方面，提供了用于提高對B-raf拮抗劑的敏感性的方法，其包括對癌癥患者施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
[0251]另一方面，提供了用于恢復對B-raf拮抗劑的敏感性的方法，其包括對癌癥患者施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
[0252]另一方面，提供了用于延長B-raf拮抗劑敏感性時段的方法，其包括對癌癥患者施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
[0253]另一方面，提供了用于治療具有B-raf抗性癌癥的患者的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
[0254]另一方面，提供了用于延長對B-raf拮抗劑的響應的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
[0255] 另一方面，提供了延遲或阻止形成HGF介導的B-raf抗性癌癥的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
[0256]另一方面，提供了用于治療其癌癥已顯示表達B-raf生物標志物(例如突變型B-raf生物標志物)的患者的方法，其包括測定患者的癌癥是否表達c-met生物標志物，并且如果該患者的癌癥表達c-met生物標志物的話,施用B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
[0257]另一方面，提供了用于治療其癌癥已顯示表達B-raf生物標志物(例如突變型B-raf生物標志物)的患者的方法，其包括:(i)監測正在用b-raf拮抗劑治療的患者以確定該患者的癌癥是否形成c-met生物標志物表達,并(ii)在該患者的癌癥顯示出表達c-met生物標志物的情況中修改該患者的治療方案，在B-raf拮抗劑之外還包括c_met拮抗劑。
[0258]另一方面，提供了用于治療其癌癥已顯示表達B-raf生物標志物(例如突變型B-raf生物標志物)的患者的方法，其包括:(i)監測正在用B-raf拮抗劑治療的患者以確定該患者的癌癥是否形成對該拮抗劑的抗性，(?)測試該患者以確定該患者的癌癥是否表達c-met生物標志物，并(iii)在該患者的癌癥顯示出表達c-met生物標志物的情況中修改該患者的治療方案，在B-raf拮抗劑之外還包括c-met拮抗劑。
[0259]術語癌癥涵蓋增殖性病癥的集合，包括但不限于癌前生長、良性腫瘤、和惡性腫瘤。良性腫瘤仍然局限于起源部位且沒有能力滲透、侵入、或轉移至遠端部位。惡性腫瘤會侵入并損害它們周圍的其它組織。它們還能獲得脫離起源部位并傳播至身體其它部分(轉移)(通常經由血流或在淋巴結所處位置經由淋巴系統)的能力。原發性腫瘤以發生它們的組織類型來分類；轉移性腫瘤以衍生癌細胞的組織類型來分類。隨著時間消逝，惡性腫瘤的細胞變得越來越異常，而且表現出更不像正常細胞。癌細胞外觀的這種變化稱作腫瘤等級(tumor grade),而且將癌細胞描述為完全分化的(well-differentiated)(低級)、中度分化的(moderately-differentiated)、不良分化的(poorly-differentiated)、或未分化的(undifferentiated)(高級)。完全分化的細胞相當正常，表現為和類似它們起源的正常細胞。未分化的細胞指已經變得如此異常以致于不再可能確定其起源的細胞。
[0260]癌癥分期系統描述癌癥在解剖學上已經傳播了多遠，而且試圖將具有相似預后和處理的患者置于相同分期組中。可實施數項測試來幫助癌癥分期，包括活檢和某些影像檢測諸如胸部X-射線、乳房X射線照片、骨掃描、CT掃描、和MRI掃描。驗血和臨床評估也用于評估患者的整體健康和檢測癌癥是否已經傳播至某些器官。
[0261]為了對癌癥分期，美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer)首先使用類系統將癌癥(特別是實體瘤)置于字母分類中。給癌癥指派字母T(腫瘤大小)、N(可觸知的結節)、和/或M(轉移)。Tl、T2、T3、和T4描述漸增的原發性病灶尺寸；N0、N1、N2、N3指示漸進發展中的結節累及；而MO和Ml反映遠端轉移的存在與否。
[0262]在第二種分期方法中，也稱作整體階段分組(Overall Stage Grouping)或羅馬數字分期(Roman Numeral Staging),將癌癥分成O期至IV期,摻入了原發性病癥的尺寸以及結節傳播和遠端轉移的存在。在這種系統中，將癌癥分組成四期，以羅馬數字I至IV表示，或者歸類為“復發”。對于有些癌癥，O期稱作“原位”或“Tis”，諸如乳腺癌的原位導管癌或原位小葉癌。高級腺瘤也可歸類為O期。一般而言，I期癌癥是小的局限性癌癥，其通常是可治愈的，而IV期通常代表不能手術治療的或轉移性的癌癥。II期和III期癌癥通常是局部高級的和/或展現出涉及局部淋巴結。一般而言，較高期數指示更嚴重的(extensive)疾病，包括更大的腫瘤尺寸和/或癌癥傳播至鄰近原發性腫瘤的附近淋巴結和/或器官。這些階段有精確定義，但是定義對每一種癌癥是不同的，而且是熟練技術人員已知的。
[0263]許多癌癥登記諸如NCI的“監視流行病學和最終結果程序”(Surveillance, Epidemiology, and End Results Program) (SEER)使用概括分期(summary staging)。這種系統用于所有類型的癌癥。它將癌癥病歷分成五大類:
[0264]“原位”指只存在于它開始的細胞層中的早期癌癥。
[0265]“局限性的”指癌癥限于它開始的器官，沒有傳播的證據。
[0266]“區域性的”指癌癥已經傳播超出起源(原發性)部位至附近的淋巴結或器官和組織。
[0267]“遠端的”指癌癥自原發性部位傳播至遠端器官或遠端淋巴結。
[0268]“未知的”用于描述沒有足夠信息來指明階段的情況。
[0269]另外，癌癥在原發性腫瘤被清除后幾個月或幾年復現是常見的。在所有可見的腫瘤都被根除后復現的癌癥稱作復發性疾病。在原發性腫瘤的區域中復現的疾病是局部復發的，而作為轉移復現的疾病稱作遠端復發。
[0270]腫瘤可以是實體瘤或者是 非實體瘤或軟組織腫瘤。軟組織腫瘤的例子包括白血病(例如慢性髓細胞性白血病(chronic myelogenous leukemia)、急性髓細胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成人急性成淋巴細胞性白血病(adult acutelymphoblastic leukemia)、急性髓細胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成熟 B細胞急性成淋巴細胞性白血病(mature B-cell acute lymphoblastic leukemia)、慢性淋巴細胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia)、多形核細胞性白血病(polymphocyticleukemia)、或毛細胞性白血病(hairy cell leukemia))或淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、或何杰金氏病(Hodgkin’s disease))。實體瘤包括血液、骨髓、或淋巴系統以外的身體組織的任何癌癥。實體瘤可進一步分成上皮細胞起源的那些和非上皮細胞起源的那些。上皮細胞實體瘤的例子包括胃腸道、結腸、乳腺、前列腺、肺、腎、肝、胰腺、卵巢、頭和頸、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、膽囊、唇(labium)、鼻咽、皮膚、子宮、男性生殖器官、泌尿器官、膀胱、和皮膚的腫瘤。非上皮起源的實體瘤包括肉瘤、腦瘤、和骨瘤。在一些實施方案中，癌癥為黑素瘤(例如B-raf突變體黑素瘤)。在一些實施方案中，癌癥為結腸直腸癌。在一些實施方案中，癌癥為乳腺癌(例如Her2陽性乳腺癌)。在一些實施方案中，癌癥為乳頭狀甲狀腺癌。定義中提供了癌癥的其它例子。
[0271]在一些實施方案中，患者的癌癥已顯示表達B-raf生物標志物。在一些實施方案中，B-raf生物標志物為突變型B-raf。在一些實施方案中，突變型B_raf為B_raf V600。在一些實施方案中，B-raf V600為B-raf V600E。在一些實施方案中，突變型B_raf為組成性有活性的。
[0272]在一些實施方案中，患者的癌癥已顯示表達c-met生物標志物。本文中描述了c-met活性和表達的檢測。
[0273]在一些實施方案中，B-raf抗性癌癥意味著癌癥患者在接受B_raf拮抗劑療法時有進展(即該患者是“B-raf不應性的”)，或者患者在完成基于B-raf拮抗劑的療法方案之后I個月，2個月，3個月，4個月，5個月，6個月，7個月，8個月，9個月，10個月，11個月，12個月，或更久內有進展。
[0274]在一些實施方案中，vemurafenib抗性癌癥意味著癌癥患者在接受基于vemurafenib的療法時有進展(即該患者是“vemurafenib不應性的”)，患者患者在完成基于B-raf拮抗劑的療法方案I個月，2個月，3個月，4個月，5個月，6個月，7個月，8個月，9個月，10個月，11個月，12個月，或更久內有進展。
[0275]在一些實施方案中，在用B-raf拮抗劑治療后或者例如在暴露于HGF后(例如HGF介導的抗性)形成(獲得)對例如B-raf抑制劑的抗性。在其它實施方案中，患者(例如具有B-raf抗性癌癥的患者)先前沒有用B-raf拮抗劑治療過。
[0276]在一些實施方案中，患者當前正在用B-raf拮抗劑治療。在一些實施方案中，患者先前用B-raf拮抗劑治療過。在一些實施方案中，患者先前沒有用B-raf拮抗劑治療過。
[0277]—方面，用別的癌癥藥物治療癌癥患者。在一些實施方案中，別的癌癥藥物是化療劑。在一些實施方案中，別的癌癥藥物是Yervoy。在一些實施方案中，別的癌癥藥物是癌癥免疫療法藥劑。在一些實施方案中，別的癌癥藥物是一種不同的(別的)B_raf拮抗劑。在一些實施方案中，別的癌癥藥物是一種不同的(別的)c-met拮抗劑。
[0278]一方面，提供了用于降低癌細胞中B-raf磷酸化的方法，其包括使細胞接觸B_raf拮抗劑和c-met拮抗劑。在一些實施方案中，細胞對B-raf拮抗劑有抗性(在一些實施方案中，已經形成了對B-raf拮抗劑的抗性)。在一些實施方案中，細胞表達c-met生物標志物。
[0279]—方面，提供了用于降低癌細胞中PI3K介導的信號傳導的方法，其包括使細胞接觸B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。在一些實施方案中，細胞對B_raf拮抗劑有抗性(在一些實施方案中，已經形成了對B-raf拮抗劑的抗性)。在一些實施方案中，細胞表達c-met生物標志物。 [0280]一方面，提供了用于降低癌細胞中PI3K介導的信號傳導的方法，其包括使細胞接觸B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。在一些實施方案中，細胞對B_raf拮抗劑有抗性(在一些實施方案中，已經形成了對B-raf拮抗劑的抗性)。在一些實施方案中，細胞表達c-met生物標志物。
[0281]一方面，提供了用于降低癌細胞中MAPk介導的信號傳導的方法，其包括使細胞接觸B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。在一些實施方案中，細胞對B_raf拮抗劑有抗性(在一些實施方案中，已經形成了對B-raf拮抗劑的抗性)。在一些實施方案中，細胞表達c-met生物標志物。
[0282]一方面，提供了用于降低癌細胞中AKT介導的信號傳導的方法，其包括使細胞接觸B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。在一些實施方案中，細胞對B_raf拮抗劑有抗性(在一些實施方案中，已經形成了對B-raf拮抗劑的抗性)。在一些實施方案中，細胞表達c-met生物標志物。
[0283]一方面，提供了用于降低癌細胞中ERK介導的信號傳導的方法，其包括使細胞接觸B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。在一些實施方案中，細胞對B_raf拮抗劑有抗性(在一些實施方案中，已經形成了對B-raf拮抗劑的抗性)。在一些實施方案中，細胞表達c-met生物標志物。
[0284]一方面，提供了用于降低癌細胞中B-raf介導的信號傳導的方法，其包括使細胞接觸B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。在一些實施方案中，細胞對B_raf拮抗劑有抗性(在一些實施方案中，已經形成了對B-raf拮抗劑的抗性)。在一些實施方案中，細胞表達c-met生物標志物。
[0285]一方面，提供了用于降低癌細胞生長和/或增殖，或提高癌細胞凋亡的方法，其包括使細胞接觸B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。在一些實施方案中，細胞對B_raf拮抗劑有抗性(在一些實施方案中，已經形成了對B-raf拮抗劑的抗性)。在一些實施方案中，細胞表達c-met生物標志物。
[0286]一方面，提供了用于提高癌細胞凋亡的方法，其包括使細胞接觸B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。在一些實施方案中，細胞對B-raf拮抗劑有抗性(在一些實施方案中，已經形成了對B-raf拮抗劑的抗性)。在一些實施方案中，細胞表達c-met生物標志物。
[0287]會以與優良醫學實踐一致的方式配制、劑量給藥和施用本發明中所使用的治療劑。在此內容中考慮的因素包括所治療的具體病癥、所治療的具體受試者、患者個體的臨床狀況、病癥的起因、投遞藥劑的部位、施藥的方法、施藥的日程安排、要組合的藥劑的藥物-藥物相互作用、和醫學從業人員知道的其它因素。
[0288]使用本領域已知的標準方法通過將具有期望純度的活性成分與任選的生理學可接受載體、賦形劑或穩定劑混合來制備治療用配制劑(Remington’ s PharmaceuticalSciences (第 20 版)，A.Gennaro 編,2000, Lippincott, ffilliams&ffilkins, Philadelphia，PA)。可接受的載體包括鹽水，或緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA ;糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN?、PLUR0NICS? 或 PEG。
[0289]任選但優選的是，配制劑含有藥學可接受鹽，優選氯化鈉，且優選大約為生理濃度。任選的是，本發明的配制劑可含有藥學可接受防腐劑。在一些實施方案中，防腐劑的濃度范圍為0.1-2.0%，典型的是v/v。合適的防腐劑包括藥學領域已知的那些。苯甲醇、酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、和對羥基苯甲酸丙酯是優選的防腐劑。任選的是，本發明的配制劑可包括藥學可接受表面活性劑，其濃度為0.005-0.02%。
[0290]本文中的配制劑還可含有超過一種所治療具體適應癥所必需的活性化合物，優選活性互補且彼此沒有不利影響的那些。合適的是，此類分子以對于預定目的有效的量組合。
[0291]活性成分還可包載于例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊中(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、在膠狀藥物傳遞系統中(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)、或在粗滴乳狀液中。此類技術公開于 RemingtonJ s Pharmaceutical Sciences,見上文。
[0292]依照已知方法給人類患者施用本發明的治療劑，諸如靜脈內施用(像推注或通過一段時間里的連續輸注)，通過肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口月艮、表面、或吸入路徑。回體(ex vivo)策略也可用于治療性應用。回體策略涉及用編碼c-met或B-raf拮抗劑的多核苷酸轉染或轉導自受試者獲得的細胞。然后將經過轉染或轉導的細胞返回受試者。細胞可以是極其多種類型之任一，包括但不限于造血細胞(例如，骨髓細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突細胞、T細胞、或B細胞)、成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞、角質形成細胞、或肌肉細胞。
[0293] 例如，如果c-met或B-raf拮抗劑是抗體，那么通過任何合適手段施用抗體，包括胃腸外、皮下、腹膜內、肺內、和鼻內，及(如果想要局部免疫抑制治療的話)病灶內施用。胃腸外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內、或皮下施用。另外，合適的是，通過脈沖輸注來施用抗體，特別是使用遞減劑量的抗體。優選的是，通過注射給予劑量給藥，最優選的是，通過靜脈內或皮下注射給予劑量給藥，這部分取決于施藥是短期的還是長期的。
[0294]在另一個例子中，在病癥或腫瘤位置允許時，局部施用c-met或B-raf拮抗性化合物，例如通過直接注射，而且可以周期性重復注射。也可以在手術切除腫瘤后系統地/全身地將c-met或B-raf拮抗劑投遞至受試者或直接投遞至腫瘤細胞，例如腫瘤或腫瘤床，用以預防或降低局部復發或轉移。
[0295]組合中的治療劑的施用通常在規定的時間段里進行(通常是數分鐘、數小時、數天或數周，這取決于所選擇的組合)。聯合療法旨在涵蓋這些治療劑以序貫方式的施用(也就是說，其中在不同時間施用每一種治療劑)，以及這些治療劑或治療劑中至少兩種以基本上同時的方式的施用。
[0296]可以通過相同路徑或不同路徑來施用治療劑。例如，可以通過靜脈內注射來施用組合中的B-raf和/或c-met拮抗劑，同時可以口服施用所述組合中的蛋白激酶抑制劑。或者，例如，可以口服施用這兩種治療劑，或者可以通過靜脈內注射來施用這兩種治療劑，這取決于具體的治療劑。治療劑的施用次序也隨著具體藥劑而變化。
[0297]根據疾病的類型和嚴重程度，施用于患者的初始候選劑量是約I μ g/kg至IOOmg/kg(例如0.l-30mg/kg)每種治療劑,例如或是通過一次或多次分開施藥或是通過連續輸注。根據上文所述因素，典型日劑量的范圍可以是約I μ g/kg至約100mg/kg或更多。對于持續數天或更長的重復施藥，根據狀況，持續治療直至根據上文所述方法的測量，癌癥得到治療。然而，其它劑量方案也可能是有用的。在一個例子中，如果c-met或B-raf拮抗劑是抗體，那么以范圍為大約5mg/kg至大約150mg/kg的劑量每兩至三周施用本發明的抗體。如果c-met或B-raf拮抗劑是口服小分子化合物,那么可以以范圍為大約25mg/kg至大約50mg/kg的劑量每天施用藥物。此外，本發明的口服化合物可以在傳統的高劑量間歇方案下施用，或者使用沒有安排中斷的更低且更頻繁的劑量(稱作“節拍療法”(metixmomictherapy))來施用。在使用間歇方案時，例如，可以每天給予藥物，持續2_3周,接著中斷I周；或者，可以每天給予藥物，持續4周，接著中斷2周，這取決于日劑量和具體適應癥。本發明療法的進展易于通過常規技術和測定法來監測。
[0298]本申請涵蓋通過基因療法來施用c-met和/或B_raf拮抗劑。參見例如1996年3月14日公布的W096/07321，其關注使用基因療法來產生胞內抗體。
[0299]IV.診斷方法
[0300]在一些實施方案中，本文中的患者進行診斷測試，例如在治療之前和/或期間和/或之后。
[0301]一方面，提供了用于測定c-met生物標志物表達的方法，其包括測定患者的癌癥是否表達c-met生物標志物的步驟,其中c-met生物標志物表達指示患者很可能具有B_raf拮抗劑抗性癌癥。在一些實施方案中，患者的癌癥已顯示表達B-raf生物標志物(諸如突變型B-raf)。在一些實施方案中，c-met生物標志物表達為蛋白質表達且使用IHC在來自該患者的樣品中測定。在一些實施方案中，用B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑治療患者。
[0302]一方面，提供了用于測定c-met生物標志物表達的方法，其包括測定患者的癌癥是否表達c-met生物標志物的步驟,其中c-met生物標志物表達指示患者很可能形成B_raf抗性癌癥。在一些實施方案中，患者的癌癥已顯示表達B-raf生物標志物(諸如突變型B-raf)。在一些實施方案中，c-met生物標志物表達為蛋白質表達且使用IHC在來自該患者的樣品中測定。在一些實施方案中，用B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑治療患者。
[0303]一方面，提供了用于測定c-met生物標志物表達的方法，包括測定患者的癌癥是否表達c-met生物標志物的步驟,其中c-met生物標志物表達指示患者是用c_met拮抗劑和B-raf拮抗劑治療的候選者:用于提高患者的癌癥對B-raf拮抗劑敏感性，恢復患者的癌癥對B-raf拮抗劑的敏感性，延長患者的癌癥對B-raf拮抗劑的敏感性時段，和/或阻止患者的癌癥中形成HGF介導的B-raf藥物抗性。在一些實施方案中，患者的癌癥已顯示表達B-raf生物標志物(諸如突變型B-raf)。在一些實施方案中，c-met生物標志物表達為蛋白質表達且使用IHC在來自該患者的樣品中測定。在一些實施方案中，用B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑治療患者。
[0304]本發明還涉及用于為具有已顯示表達B-raf生物標志物(例如突變型B_raf生物標志物)的癌癥的患者選擇療法的方法，其包括在來自該患者的樣品中測定c-met生物標志物的表達，并基于該生物標志物的表達水平選擇癌癥藥物。在一個實施方案中，如果癌癥樣品表達c-met生物標志物的話,選擇患者用c-met拮抗劑(例如抗c_met抗體)與B_raf拮抗劑組合治療。在一些實施方案中，使用治療有效量的c-met拮抗劑和B-raf拮抗劑對該患者治療癌癥。如此，在一些實施方案中，如果患者的癌癥樣品表達c-met生物標志物的話，選擇患者用c-met拮抗劑(例如抗c-met抗體)治療，并(在選擇后)使用治療有效量的c-met拮抗劑和B-raf拮抗劑對該患者治療癌癥。在另一個實施方案中，如果癌癥樣品以基本上檢測不到水平表達c-met生物標志物的話，選擇患者用除c-met拮抗劑以外的癌癥藥物治療。在一些實施方案中，使用治療有效量的除c-met拮抗劑以外的癌癥藥物(例如用B-raf拮抗劑治療 )對該患者治療癌癥。如此，在一些實施方案中，如果癌癥樣品以基本上檢測不到水平表達c-met生物標志物的話，選擇患者用除c-met拮抗劑以外的癌癥藥物(例如B-raf拮抗劑,例如vemurafenib)治療,并(在選擇后)使用治療有效量的c_met拮抗劑對該患者治療癌癥。
[0305]另一方面，本發明提供了用于將患者鑒定為用B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑治療的候選者的方法，其包括測定患者的癌癥表達c-met生物標志物。在一些實施方案中，患者已經(先前)用B-raf拮抗劑治療過。在一些實施方案中，患者的癌癥對所述B-raf拮抗劑有抗性(例如具有獲得性抗性)。
[0306]另一方面，本發明提供了用于將患者鑒定為有風險形成對B-raf拮抗劑的抗性的方法，其包括測定患者的癌癥表達c-met生物標志物。在一些實施方案中，患者已經(先前)用B-raf拮抗劑治療過。在一些實施方案中，患者正在用B-raf拮抗劑治療。
[0307]—方面，本發明提供了用于測定黑素瘤患者的預后的方法，其包括在來自該患者的樣品中測定c-met生物標志物的表達，其中c-met生物標志物為HGF且HGF的表達是受試者中癌癥的預兆。在一些實施方案中，升高的HGF表達是用B-raf抑制劑(例如vemurafenib)治療患者時例如縮短的無進展存活和/或縮短的總體存活的預兆。在一些實施方案中，測定患者血清中的HGF表達，例如使用ELISA。在一些實施方案中，患者血清中的HGF表達超出中值HGF表達水平(諸如一種群體中的中值HGF表達水平)。在一些實施方案中，患者血清中的HGF表達超出例如約330ng/ml。在一些實施方案中，患者血清中的HGF表達超出約 300ng/ml, 310ng/ml, 320ng/ml, 330ng/ml, 340ng/ml, 350ng/ml, 360ng/ml, 370ng/ml,380ng/ml,390ng/ml,400ng/ml,420ng/ml,440ng/ml,460ng/ml,480ng/ml,500ng/ml,或更大。在一些實施方案中，選擇患者用有效量的c-met拮抗劑和B-raf拮抗劑治療。在一些實施方案中，用有效量的c-met拮抗劑和B-raf拮抗劑治療患者。檢測HGF表達，例如通過IHC (例如對腫瘤或腫瘤基質)。
[0308]用于檢測c-met表達，活化和擴增的方法是本領域已知的。一方面，使用包括下述步驟的方法測定c-met生物標志物表達:(a)用抗c-met抗體對樣品(諸如患者癌癥樣品)實施IHC分析；和(b)測定樣品中的c-met生物標志物表達。在一些實施方案中，相對于參照值確定c-met IHC染色強度。在一些實施方案中，大量的c-met生物標志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF檢測測定的)指示患者很可能具有B_raf拮抗劑抗性癌癥。在一些實施方案中，高c-met為低的，中等的或高的測定c-met表達,例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c_met染色強度而言。在一些實施方案中，高c-met為中等的或高的測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c_met染色強度而言。在一些實施方案中，“低” c-met為低的或無測定c-met表達,例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549,H441，H1155JPHEK_293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中，“低”c-met表達為無測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，Hl 155，和HEK-293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中，使用本文中公開的c-met染色強度評分方案(例如表A中的)來測定c-met生物標志物表達。在一些實施方案中，該方法進一步包括基于IHC得分將患者分層。在一些實施方案中，IHC得分為I。在一些實施方案中，IHC得分為O且在患者的癌癥中觀察到c-met表達。
[0309]在一些實施方案中，c-met表達為多核苷酸表達。在一些實施方案中，多核苷酸為RNA0在一些實施方案中 ，多核苷酸為DNA。在一些實施方案中，患者的癌癥已顯不表達大于2，大于3，大于4，大于5，大于6，大于7，大于8，或更高的c-met拷貝數(例如通過FISH分析)。在一些實施方案中，c-met拷貝數小于8,小于7,小于6,小于5,小于4,小于3。
[0310]本發明涵蓋可以依照本發明的方法來檢測HGF。如此，在一些實施方案中，c-met生物標志物為HGF，和在又一些實施方案中，HGF表達為自分泌表達。在一些實施方案中，在患者的癌癥中檢測HGF表達。在一些實施方案中，在患者的腫瘤基質中檢測HGF表達。在一些實施方案中，在患者血清中檢測HGF表達，例如使用ELISA。
[0311 ] 一方面，使用如下方法測定c-met生物標志物表達，該方法包括測定樣品(諸如患者的癌癥樣品)中c-met生物標志物表達的步驟，其中患者的樣品已經使用抗c-met抗體進行IHC分析。在一些實施方案中，相對于參照值確定c-met IHC染色強度。在一些實施方案中，大量的c-met生物標志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF檢測測定的)指示患者很可能具有B-raf拮抗劑抗性癌癥。在一些實施方案中，高c-met為低的，中等的或高的測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441,H1155jPHEK-293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中，高c-met為中等的或高的測定c-met表達，例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，Hl 155，和HEK-293的c-met染色強度而言。在一些實施方案中，“低”c-met為低的或無測定c_met表達,例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，Hl 155，和HEK-293的c_met染色強度而言。在一些實施方案中，“低”c-met表達為無測定c-met表達,例如相對于如本文中描述的對照細胞團粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c_met染色強度而言。在一些實施方案中，使用本文中公開的c-met染色強度評分方案(例如表A中的)來測定c-met生物標志物表達。
[0312]在一些實施方案中，IHC分析進一步包括形態學染色，或是在之前或是在之后。在一個實施方案中，使用蘇木精對載玻片的細胞核染色。蘇木精廣泛可得。合適的蘇木精的一個例子是蘇木精II (Ventana)。當期望淺藍色核時，可以在蘇木精染色之后使用發藍試劑。本文中公開了使用IHC檢測c-met生物標志物，而且本文中公開了 c_met染色強度評分方案，例如表A中的。如本文中記錄的，可以檢測其它生物標志物。本文中公開了例示性的其它生物標志物。在本文中公開的任何發明的一些實施方案中，高c-met生物標志物表達為met診斷陽性臨床狀態，如依照本文中表A定義的。在本文中公開的任何發明的一些實施方案中，低c-met生物標志物表達為met診斷陰性臨床狀態，如依照本文中表A定義的。
[0313]一方面，使用包括下述步驟的方法來測定c-met生物標志物表達:(a)實施Western印跡,ELISA,磷酸-ELISA,使用磷酸-met抗體的IHC,使用抗HGF抗體的IHC中的一項或多項；并(b)測定樣品中c-met生物標志物(包括例如HGF)的表達。
[0314]一方面，使用包括下述步驟的方法來測定c-met活化:(a)實施使用磷酸-c_met抗體的IHC或磷酸-ELISA中的一項或多項；并(b)測定樣品中磷酸-c_met生物標志物(例如磷酸-c-met)的存在。
[0315]一方面，使用如下方法測定c-met生物標志物表達，該方法包括測定c_met下游信號傳導途徑分子的表達或活性，例如AKT (例如磷酸-AKT)的表達或活性，ERK(例如磷酸-ERK)的表達或活性的步驟。
[0316]一方面，使用包括下述步驟的方法來測定c-met生物標志物表達:(a)對樣品(諸如患者癌癥樣品)實施基因表達序型分析，PCR(諸如rtPCR或等位基因特異性PCR)，5’核酸酶測定法(例如Taq-man)，RNA-seq，微陣列分析，SAGE, MassARRAY技術，原位雜交(例如針對c-met和/或HGFmRNA)，IHC (例如針對c-met和/或HGF多肽)或FISH ;并(b)測定樣品中的c-met生物標志物表達。
[0317]如本文中記錄的，可以檢測其它生物標志物。本文中公開了例示性的其它生物標志物。在一些實施方案中，檢測ALK生物標志物。在一些實施方案中，檢測FGF，FGFR，H)GF，和/或PGFR生物標志物中的一項或多項。
[0318]用于檢測B-raf和突變型B_raf的方法是本領域已知的且商品化的。參見例如Hailat et al, Diagn Mol Pathol.2012Mar ;21 (I): 1-8。在一些實施方案中，使用如下方法檢測V600E突變(也稱作V599E(1796T>A))，該方法包括測定外顯子15的密碼子600中核苷酸第1799位處單堿基突變(T>A)的存在。此突變也可源自核苷酸第1799-1800位處的雙堿基突變TG>AA。也可以通過評估第1799位來檢查該雙堿基突變。在一些實施方案中，還可以對核酸評估第1800位處替代的存在。密碼子600處也可存在其它突變。這些包括V600K, V600D，和V600R。在一些實施方案中，檢測V600E突變的特征也能檢測其它密碼子600突變，例如V600D，V600K和/或V600R。在一些實施方案中，探針還能檢測密碼子601處的突變。
[0319] V600E突變的存在可以通過對核酸(例如基因組DNA或mRNA)評估第1799位處堿基替代的存在測定。在一些實施方案中，核酸分析方法為下述一項或多項:使用等位基因特異性寡核苷酸的雜交，引物延伸，等位基因特異性連接，測序，或電泳分離技術，例如單鏈構象多態性(SSCP)和異源雙聯體分析。例示性測定法包括5'核酸酶測定法，等位基因特異性PCR，模板指導的染料-終止子摻入，分子信標等位基因特異性寡核苷酸測定法，單堿基延伸測定法，和使用實時焦磷酸測序的突變分析。可以使用各種技術(諸如微芯片，熒光極化測定法，和矩陣輔助激光解吸附離子化(MALDI)質譜術)來實施對擴增序列的分析。可使用的兩種別的方法是基于Flap核酸酶的侵入性切割的測定法和采用掛鎖探針的方法。
[0320]在一些實施方案中，突變型B-raf為B_raf V600E(包含V600E突變(GTG>GAG)的B-raf多肽)。在一些實施方案中，突變型B-raf為B_raf V600K (GTG)AAG)，V600R (GTG)AGG)，V600E (GTG)GAA)和 / 或 V600D (GTG)GAT)中的一種或多種。在一些實施方案中，突變型B-raf為殘基V600處的突變體。在一些實施方案中，突變型B_raf多核苷酸包含T1799A突變。在一些實施方案中，突變型B-raf多核苷酸包含外顯子11和/或外顯子15中的突變。在一些實施方案中，使用包括下述步驟的方法來檢測突變型B-raf表達:
(a)對樣品(諸如患者癌癥樣品)實施基因表達序型分析，PCR(諸如rtPCR或等位基因特異性PCR)，5’核酸酶測定法，IHC，雜交測定法，RNA-seq，微陣列分析，SAGE, MassARRAY技術，或FISH中的一項或多項；并(b)測定樣品中突變型B-raf生物標志物的表達。在一些實施方案中，使用包括下述步驟的方法來檢測突變型B-raf生物標志物表達:(a)對自患者癌癥樣品(諸如FFPE固定的患者癌癥樣品)提取的核酸實施PCR ;并(b)測定樣品中突變型B-raf生物標志物的表達。
[0321]對來自患者的樣品測試本文中一種或多種生物標志物的表達。組織或細胞樣品的來源可以是固體組織，如來自新鮮的，冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活檢或吸出物；血液或任何血液組分；體液，諸如腦脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或間隙液；來自受試者的妊娠或發育任何時間的細胞。組織樣品可能包含在自然界中天然不與組織混雜的化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩沖劑、固定劑、營養物、抗生素、等等。本文中腫瘤樣品的例子包括但不限于腫瘤活檢、腫瘤細胞、血清或血漿、循環中的血漿蛋白質、腹水、衍生自腫瘤或展現出腫瘤樣特性的原代細胞培養物或細胞系，以及保存的腫瘤樣品，諸如福爾馬林固定、石蠟包埋的腫瘤樣品或冷凍的腫瘤樣品。在一個實施方案中，患者樣品為福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)的腫瘤樣品(例如黑素瘤腫瘤樣品或結腸直腸癌腫瘤樣品或腫瘤基質的樣品)。可以在用癌癥藥物(諸如抗c-met拮抗劑)治療患者之前獲得樣品。可以自原發性腫瘤或自轉移性腫瘤獲得樣品。可以在第一次診斷癌癥時或者例如在腫瘤已經轉移之后獲得樣品。在一些實施方案中，腫瘤樣品為肺，皮膚，淋巴結，骨，肝，結腸，甲狀腺，和/或卵巢的。
[0322]用于測定基因擴增、蛋白質、或mRNA表達的各種方法包括但不限于基因表達序型分析、聚合酶鏈式反應(PCR)(包括定量實時PCR (qRT-PCR))、等位基因特異性PCR、RNA-Seq, FISH、微陣列分析、基因表達連續分析(SAGE)、MassARRAY、蛋白質組學、免疫組織化學(IHC)、等。在一些實施方案中，對蛋白質表達定量。此類蛋白質分析可以使用IHC來實施，例如對患者腫瘤樣品實施。
[0323]現在會更加詳細地描述用于測定生物標志物表達的各種例示性方法。
[0324]1.基因表達序型分析[0325]一般而言，基因表達序型分析的方法可分成兩大組:基于多核苷酸雜交分析的方法，和基于多核苷酸測序的方法。本領域中已知用于樣品中mRNA表達定量的最常使用的方法包括Northern印跡和原位雜交(Parker&Barnes, Methods in MolecularBiologylO6:247-283 (1999)) ；RNA 酶保護測定法(Hod, Biotechniquesl3:852-854 (1992));及聚合酶鏈反應(PCR) (Weis 等，Trends in Genetics8:263-264 (1992))。或者，可采用能識別特定雙鏈體(包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、及DNA-RNA雜合雙鏈體或DNA-蛋白質雙鏈體)的抗體。基于測序的基因表達分析的代表性方法包括基因表達連續分析(SAGE)和通過大規模平行簽名測序(MPSS)的基因表達分析。
[0326]2.聚合酶鏈式反應(PCR)和5’核酸酶測定法
[0327]—種靈敏且靈活的定量方法是PCR，其例如可用于比較不同樣品群中的，正常和腫瘤組織中的，有或無藥物處理下的mRNA水平，表征基因表達樣式，區分密切相關的mRNA，及分析RNA結構。然而，應當注意，本文所述核酸分析方法中也可使用其它核酸擴增方案(即除PCR以外的)。例如，合適的擴增方法包括連接酶鏈式反應(參見例如Wu&Wallace，Genomics4:560-569，1988);鏈置換測定法(參見例如 Walker et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:392-396, 1992 ;美國專利N0.5，455，166);和數種基于轉錄的擴增系統，包括美國專利 N0.5，437，990,5, 409，818、和 5，399，491 中記載的方法；轉錄擴增系統(TAS) (Kwoh etal., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:1173-1177，1989);和自持續序列復制(3SR) (Guatelliet al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:1874-1878, 1990 ;TO92/08800)。或者，可使用擴增探針至可檢測水平的方法，諸如QP -復制酶擴增(Kramer&Lizardi, Nature339:401-402, 1989 ；Lomeli et al. ，Clin.Chem.35:1826-1831，1989)。例如Abramson and Myers in CurrentOpinion in Biotechnology4:41_47, 1993提供了關于已知擴增方法的綜述。
[0328]可以從起始組織樣品分離mRNA。起始材料典型的是分別從人腫瘤或腫瘤細胞系及相應的正常組織或細胞系分離的總RNA。如此，可從多種原發性腫瘤中分離RNA，包括乳房、肺、結腸、前列腺、腦、肝、腎、胰、脾、胸腺、睪丸、卵巢、子宮等腫瘤或腫瘤細胞系，及來自健康供體的合并DNA。如果mRNA的來源是原發性腫瘤，那么mRNA可從例如冷凍的或歸檔的石蠟包埋且固定(例如福爾馬林固定)的組織樣品提取。用于提取mRNA的通用方法是本領域眾所周知的，公開于分子生物學的標準教科書中，包括Ausubel等人，《Current Protocols of Molecular Biology)), John Wiley and Sons, 1997。用于從石臘包埋組織提取RNA的方法公開于例如Rupp and Locker, Lab Invest.56:A67 (1987) ；DeAndres et al.，BioTechniquesl8:42044 (1995)。具體而言，RNA 分離可使用來自商業制造商諸如Qiagen的純化試劑盒、緩沖液組和蛋白酶依照制造商的說明書進行。例如，來自培養細胞的總RNA可使用Qiagen RNeasy微型柱分離。其它商品化RNA分離試劑盒包括MASTERPURE?完整DNA和RNA純化試劑盒(EPICENTRE?，Madison,ffis.)和石臘塊RNA分離試劑盒(Ambion, Inc.)。來自組織樣品的總RNA可使用RNA Stat-60 (Tel-Test)分離。從腫瘤制備的RNA可通過例如氯化銫密度梯度離心來分離。
[0329]由于RNA不能充當PCR的模板，在一些實施方案中，通過PCR進行基因表達序型分析的第一步是將RNA模板逆轉錄成cDNA，接著是它在PCR反應中的指數式擴增。在其它實施方案中，可以使用組合逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)反應，例如如美國專利N0.5，310，652 ;5，322，770 ;5，561，058 ;5，641，864 ;和 5，693，517 中記載的。最常用的兩種逆轉錄酶是禽類成髓細胞白血病病毒逆轉錄酶(AMV-RT)和莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒逆轉錄酶(MMLV-RT)。逆轉錄步驟典型的使用特異性引物、隨機六聚物或oligo-dT引物引發，取決于表達序型分析的境況和目標。例如，提取的RNA可使用GENEAMP?RNA PCR試劑盒(Perkin Elmer, Calif., USA)遵循制造商的說明書逆轉錄。然后可將衍生的cDNA作為模板用于后續PCR反應。
[0330]可以使用TaqMan?或V -核酸酶測定法，如美國專利N0.5，210，015 ;
5, 487, 972 ；和 5,804,375;及 Holland et al., 1988, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:7276-7280中記載的。TAQMAN? PCR典型的利用Taq或Tth聚合酶的5’ -核
酸酶活性來水解與其靶擴增子結合的雜交探針，但是可使用具有等效5’核酸酶活性的任何酶。使用兩種寡核苷酸引物來生成擴增子，典型的是PCR反應的。第三種寡核苷酸或探針設計用于檢測位于前兩種PCR引物之間的核苷酸序列。探針是Taq DNA聚合酶不可延伸的且用報道熒光染料和淬滅熒光染料標記。在兩種染料正如它們在探針上的那樣位置靠近時，任何激光誘發的來自報道染料的發射受到淬滅染料的淬滅。在擴增反應期間，Taq DNA聚合酶以模板依賴性方式切割探針。所得探針片段在溶液中解離，來自所釋放報道染料的信號不再受到第二熒光團的淬滅效應的作用。每合成一個新的分子就釋放一個分子的報道染料，未淬滅報道染料的檢測提供了數據定量闡述的基礎。該測定法中采用的雜交探針可以是例如在V600E突變位點在突變型和野生型BRAF等位基因之間進行區分的等位基因特異性探針。或者，可以使用等位基因特異性引物和結合擴增產物的經標記探針實施該方法。
[0331]任何適合于檢測降解產物的方法均可用于5'核酸酶測定法。通常，用兩種熒光染料標記檢測探針，一 種染料能夠淬滅另一種染料的熒光。將染料附著于探針，優選一種附著于5'端，另一種附著于內部位點，使得探針處于未雜交狀態時發生淬滅且使得在兩種染料之間發生DNA聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性對探針的切割。擴增導致在染料之間切割探針，伴隨著對淬滅的消除及來自最初被淬滅的染料可觀察的熒光增加。通過測量反應熒光的增加來監測降解產物的積累。美國專利N0.5，491，063和5，571，673 (通過述及將二者收入本文)記載了用于檢測與擴增伴隨發生的探針降解的備選方法。5’-核酸酶測定法數據最初可以表述為Ct，或循環閾值(threshold cycle)。正如上文所討論的，在每個循環期間記錄熒光值并代表至擴增反應中該點時擴增的產物的量。首次記錄到有統計學意義的熒光信號的點即循環閾值(Ct)。
[0332]為了將錯誤和樣品間變異的影響降至最低，通常使用內部標準物進行PCR。理想的內部標準物在不同組織間以恒定水平表達，不受實驗處理的影響。最頻繁的用于基因表達樣式標準化的RNA是持家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和P-肌動蛋白的mRNA。
[0333]在一些實施方案中，檢測V600E的探針(例如TTS155_BRAF_MU)也檢測V600D (1799—1800TG>AT)和 V600K (1798—1799GT>AA)。在一些實施方案中，檢測 V600E 突變的探針也檢測 K601E(1801A>G)和 V600R(1798— 1799GT>AG)。
[0334]在一些實施方案中，可使用與探針序列基本上同一的序列。與探針序列基本上同一的序列包括那些與探針雜交至相同互補序列的。如此，在一些實施方案中，用于本發明的探針序列至少包含15個連續核苷酸，有時是至少16、17、18，19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30個連續核苷酸。在一些實施方案中，引物具有TTS155_BRAF_MU或TTS148-BRAF_WT的至少27、28、29、或30個連續核苷酸。在其它實施方案中，用于本發明的引物與TTS155-BRAF_MU或TTS148_BRAF_WT具有至少80%同一性，在一些實施方案中是至少85%同一性，且在其它實施方案中是至少90%或更高同一性。
[0335]多份發表的期刊論文給出了使用固定的、石蠟包埋的組織作為RNA來源用于基因表達序型分析的代表性方案的步驟，包括mRNA分離、純化、引物延伸和擴增(例如 Hailat et al, Diagn Mol Pathol.2012Mar ；21(I):1-8 ；Godfrey et al., J.Molec.Diagnostics〗:84-91 (2000) ；Specht et al.，Am.J.Pathol.158:419-29 (2001))。簡言之，在一些實施方案中，一種代表性方法由切出石蠟包埋的腫瘤組織樣品的約10微米厚切片開始。然后，提取mRNA，并除去蛋白質和DNA。分析RNA濃度后，在必要時可包括RNA修復和/或擴增步驟，并使用基因特異啟動子逆轉錄RNA，隨后是PCR。
[0336]PCR引物和探針是基于待擴增基因中存在的內含子序列設計的。在這個實施方案中，引物/探針設計的第一步是描繪基因內的內含子序列。這可通過公眾可得到的軟件來進行，諸如由 Kent, W.,Genome Res.12 (4): 656-64 (2002)開發的 DNA BLAT 軟件或 BLAST 軟件，包括其變異。后續步驟遵循完全建立的PCR引物和探針設計方法。
[0337]為了避免非特異性信號，可能重要的是在設計引物和探針時掩蓋(mask)內含子內的重復序列。這可容易的通過使用Repeat Masker程序來實現，該程序可通過貝勒醫學院(Baylor College of Medicine)在線獲得，它針對重復元件文庫篩選DNA序列并返回其中掩蓋了重復元件的查詢序列。然后可使用任何商品化或通過其它途徑公眾可獲得的引物/探針設計包將掩蓋后的內含子序列用于設計引物和探針序列，諸如Primer Express(Applied Biosystems) ；MGB assay-by-design(Applied Biosystems)；Primer3 (Rozen and Skal etsky (2000) Primer3在萬維網上供一般用戶和生物學家編程員使用 ° 在 Krawetz S, Misener S 編的《Bioinformatics Methods and Protocols:Methodsin Molecular Biology))中，Humana Press, Totowa, N.J.,第 365-386 頁)。
[0338]PCR引物設計中考慮的因素包括引物長度、解鏈溫度(melting temperature, Tm)、G/C含量、特異性、互補引物序列、和3’ -末端序列。一般而言，最佳的PCR弓丨物通常長17-30個堿基，包含約20-80%諸如例如約50-60% G+C堿基。典型的優選Tm在50和80°C之間，例如約50-700C ο
[0339]關于PCR引物和探針設計的進一步指導參見例如Dieffenbach et al.,“GeneralConcepts for PCR Primer Design” (PCR 引物設計的一般概念)，在《PCR Primer, ALaboratory Manual》 中，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,1995,第 133-155 頁；Innis and Gelfand, “Optimization of PCRs，，(PCR 的優化)，在《PCRProtocols, A Guide to Methods and Applications》中，CRC Press, London,1994,第5-11 頁；及 Plasterer, Τ.Ν.，Primerselect:Primer and probe design.Methods Mol.Biol.70:520-527(1997)，將其完整公開內容明確收入本文作為參考。
[0340]另一方面，可利用靶核酸的等位基因特異性擴增來檢測核酸突變的存在或缺失。擴增涉及使用等位基因特異性引物。
[0341]在一個實施方案中，本發明是靶序列的變體(其以數種變體序列的形式存在)的等位基因特異性擴增的方法，該方法包括:提供樣品，其可能含有靶序列的至少一種變體；提供第一寡核苷酸，其至少與靶序列的一種或多種變體部分互補；提供第二寡核苷酸，其至少與靶序列的一種或多種變體部分互補但具有至少一個與靶序列的僅一種變體互補的內部選擇性核苷酸；提供適合于所述第一和第二寡核苷酸雜交至靶序列的至少一種變體的條件；提供適合于核酸聚合酶延伸寡核苷酸的條件；其中在所述第二寡核苷酸對其所雜交的靶序列變體具有所述互補內部選擇性核苷酸時，所述聚合酶能夠延伸所述第二寡核苷酸，且在所述第二寡核苷酸對其所雜交的靶序列變體具有非互補內部選擇性核苷酸時，實質性更少；并將雜交和延伸步驟的程序重復多次。
[0342]在本發明的一些實施方案中，擴增涉及聚合酶鏈式反應，即模板變性、寡核苷酸引物對模板的退火(雜交)、和核酸聚合酶延伸引物的重復循環。在一些實施方案中，退火和延伸發生于同一溫度步驟。
[0343]在一些實施方案中，擴增反應涉及熱啟動方案。在等位基因特異性擴增的背景好，可以通過使用熱啟動方案來增強等位基因特異性引物就錯配靶而言的選擇性。本領域知道多種熱啟動方案，例如使用蠟、將關鍵試劑與反應混合物的其余部分分開(美國專利N0.5，411，876)、使用由抗體可逆滅活的核酸聚合酶(美國專利N0.5，338，671)、由設計成特異性結合其活性溫度的寡核苷酸可逆滅活的核酸聚合酶(美國專利N0.5，840，867)或使用具有可逆化學修飾的核酸聚合酶(如記載于例如美國專利N0.5，677，152和N0.5，773，528)。
[0344]在本發明的一些實施方案中，等位基因特異性擴增測定法是實時PCR測定法。在實時PCR測定法中，擴增的測量為“閾循環”或Ct值。在等位基因特異性實時PCR測定法的背景中，匹配和錯配模板之間Ct值的差異是等位基因之間的區分或測定法選擇性的一種度量。較大差異指示錯配模板擴增的較大延遲，并因此指示等位基因之間的較大區分。錯配模板常常以比匹配模板大得多的量存在。例如，在組織樣品中，只有小部分的細胞可能是惡性的且攜帶等位基因特異性擴增測定法所靶向的突變(“匹配模板”)。正常細胞中存在的錯配模板可以不太有效地擴增，但是正常細胞的壓倒性數目會克服任何擴增延遲并消除突變型模板的任何優勢。為了在存在野生型模板的情況中檢測罕見突變，等位基因特異性擴增測定法的特異性是至關重要的。COBAS? 4800BRAF V600突變測試是商品化的，且利用實時PCR技術。用熒光染料(其充當報道物)和淬滅劑分子(其吸收(淬滅)來自完整探針內的報道物染料的熒光發射)標記反應中的每一種靶特異性寡核苷酸探針。在每個擴增循環期間，與擴增子中的單鏈DNA序列互補的探針結合并隨后受到ZOOTNA聚合酶的5’至3’核酸酶活性切割。一旦通過這種核酸酶活性將報道物染料與淬滅劑分開，在報道物染料受到適宜光譜激發時，可以測量特征性波長的熒光。使用兩種不同報道物染料標記靶特異性BRAF野生型(WT)探針和BRAF V600E突變探針。通過在專用光通道中在兩種特征性波長測量熒光，可以在一個反應孔中獨立檢測兩種BRAF序列的擴增。
[0345]在一些實施方案中，依照美國專利公開文本N0.2011/0311968利用在B_raf和V600E B-raf之間區分的引物。
[0346] 在一些實施方案中，使用包括下述各項的方法來檢測突變型B-raf多核苷酸(例如DNA): (a)對自患者癌癥樣品(諸如FFPE固定的患者癌癥樣品)提取的核酸(例如基因組DNA)實施PCR;并(b)測定樣品中突變型B-raf多核苷酸的表達。在一些實施方案中，使用包括下述各項的方法來檢測突變型B-raf多核苷酸表達:(a)將第一和第二寡核苷酸雜交至B-raf靶序列的至少一種變體；其中所述第一寡核苷酸至少與靶序列的一種或多種變體部分互補且所述第二寡核苷酸至少與靶序列的一種或多種變體部分互補且具有至少一個與靶序列的僅一種變體互補的內部選擇性核苷酸；(b)用核酸聚合酶延伸第二寡核苷酸；其中在所述選擇性核苷酸與靶形成堿基對時，所述聚合酶能夠優先延伸所述第二寡核苷酸，且在所述選擇性核苷酸與靶不形成堿基對時，實質性較少；并(c)檢測所述寡核苷酸延伸的產物，其中延伸表示存在寡核苷酸對其具有互補選擇性核苷酸的靶序列變體。在一些實施方案中，使用包括下述各項的方法來檢測突變型B-raf多核苷酸(例如DNA): (a)對自患者癌癥樣品(例如FFPE固定的患者癌癥樣品)提取的核酸(例如基因組DNA)實施PCR;并(b)測定樣品中突變型B-raf多核苷酸的表達。在一些實施方案中，使用包括下述各項的方法來檢測突變型B-raf多核苷酸(例如DNA): (a)自患者癌癥樣品(諸如FFPE固定的患者癌癥樣品)分離DNA(例如基因組DNA) ； (b)對自患者癌癥樣品提取的DNA實施PCR;并(c)測定樣品中突變型B-raf多核苷酸的表達。
[0347]在一些實施方案中，使用包括下述各項的方法來檢測突變型B-raf多核苷酸表達:(a)自患者癌癥樣品(諸如FFPE固定的患者癌癥樣品)分離DNA(例如基因組DNA)；
(b)將第一和第二寡核苷酸雜交至DNA中B-raf靶序列的至少一種變體；其中所述第一寡核苷酸至少與靶序列的一種或多種變體部分互補且所述第二寡核苷酸至少與靶序列的一種或多種變體部分互補且具有至少一個與靶序列的僅一種變體互補的內部選擇性核苷酸；
(c)用核酸聚合酶延伸第二寡核苷酸；其中在所述選擇性核苷酸與靶形成堿基對時，所述聚合酶能夠優先延伸所述第二寡核苷酸，且在所述選擇性核苷酸與靶不形成堿基對時，實質性較少；并(d)檢測所述寡核苷酸延伸的產物，其中延伸表示存在寡核苷酸對其具有互補選擇性核苷酸的靶序列變體。在一些實施方案中，使用包括下述各項的方法來檢測突變型B-raf多核苷酸表達:(a)將第一和第二寡核苷酸雜交至B_raf祀序列的至少一種變體；其中所述第一寡核苷酸至少與靶序列的一種或多種變體部分互補且所述第二寡核苷酸至少與靶序列的一種或多種變體部分互補且具有至少一個與靶序列的僅一種變體互補的內部選擇性核苷酸；(b)用核酸聚合酶延伸第二寡核苷酸；其中在所述選擇性核苷酸與靶形成堿基對時，所述聚合酶能夠優先延伸所述第二寡核苷酸，且在所述選擇性核苷酸與靶不形成堿基對時，實質性較少；并(c)檢測所述寡核苷酸延伸的產物，其中延伸表示存在寡核苷酸對其具有互補選擇性核苷酸的靶序列變體。
[0348]在一些實施方案中，使用包括下述各項的方法來檢測突變型B-raf多核苷酸(例如DNA):(a)對自患者癌癥樣品(諸如FFPE固定的患者癌癥樣品)提取的核酸(例如基因組DNA)實施PCR; (b)通過對PCR擴增的核酸測序來測定突變型B-raf多核苷酸的表達。在一些實施方案中，使用測序(例如Sanger測序或焦磷酸測序)來檢測突變型B_raf多核苷酸(例如DNA)。
[0349]3.其它核酸突變檢測方法
[0350]也可以通過直接測序來檢測核酸突變(例如第1799位核苷酸處(GTG>GAA)，其導致谷氨酰胺替代B-raf第600位氨基酸處纈氨酸)的存在(或缺失)。方法包括基于雙脫氧測序的方法和諸如Pyrosequencing?寡核苷酸長產物等方法。此類方法常常采用擴增技術，諸如PCR。另一種用于測序的類似方法不要求使用完全PCR，但是通常只使用引物延伸一個熒光標記的雙脫氧核糖核酸分子(ddNTP)，其與要調查的核苷酸互補。可以經由檢測延伸了一個堿基且熒光標記的引物來鑒定多態性位點處的核苷酸(例如Kobayashi etal, Mol.Cell.Probes, 9:175-182, 1995)。
[0351]也可以通過使用變性梯度凝膠電泳來分析使用擴增反應(例如PCR)生成的擴增產物。可以基于DNA在溶液中的不同序列依賴性解鏈特性和電泳遷移來鑒定不同等位基因(參見例如 Erlich, ed.，PCR Technology, Principles and Applications for DNAAmplification, ff.H.Freeman and Co, New York, 1992，Chapter7)。
[0352]在其它實施方案中，可以使用單鏈構象多態性分析(其通過單鏈PCR產物的電泳遷移改變來鑒定堿基差異)來區分祀序列的等位基因，如記載于例如Orita et al., Proc.Nat.Acad.Sc1.86，2766-2770(1989)。可以如上文所述來生成擴增的PCR產物，并加熱或以其它方式變性，以形成單鏈擴增產物。單鏈核酸可重折疊或形成二級結構，其部分依賴于堿基序列。可以將單鏈擴增產物的不同電泳遷移率與靶區的對比文件之間的序列差異關聯起來。
[0353]可以使用等位基因特異性擴增或引物延伸方法來檢測突變(例如核酸突變)的存在或缺失。這些反應通常涉及使用設計為經由引物3’端(例如3’核苷酸或倒數第二個3’核苷酸)的錯配特異性靶向突變型(或野生型)位點的引物。當聚合酶缺乏糾錯活性時，錯配的存在影響聚合酶延伸引物的能力。例如，為了使用基于等位基因特異性擴增或延伸的方法來檢測V600E突變型序列，設計在BRAF的第600位密碼子中的第1799位核苷酸處與突變型A等位基因互補的引物，使得3’末端核苷酸在突變型位置處雜交。可以通過引物啟動延伸的能力來確定突變型等位基因的存在。如果3’末端是錯配的，那么延伸受阻。如此，例如，如果引物在3’端與突變型等位基因核苷酸匹配，那么該引物會有效延伸。也可以使用在第1799位特 異性來自BRAF野生型序列的等位基因特異性引物來實施擴增。
[0354]典型地，所述引物與第二引物在擴增反應中聯合使用。第二引物在與突變位置無關的位點處雜交。自兩種引物進行擴增，產生可檢測產物，其表示存在的特定等位基因形式。基于等位基因特異性擴增或延伸的方法記載于例如W093/22456;美國專利N0.5，137，806 ;美國專利N0.5，595，890 ;美國專利N0.5，639，611 ;及美國專利N0.4，851，331。
[0355]使用基于等位基因特異性擴增的基因型測定，等位基因的鑒定只要求檢測擴增的靶序列的存在或缺失。用于檢測擴增的靶序列的方法是本領域公知的。例如，所記載的凝膠電泳和探針雜交測定法常常用于檢測核酸的存在。
[0356]在一種備選的無探針方法中，通過監測反應混合物中雙鏈DNA的總量的增加來檢測擴增的核酸，如記載于例如美國專利N0.5，994，056 ;及歐洲專利公開文本N0.487，218和N0.512，334。雙鏈靶DNA的檢測依賴于各種DNA結合染料(例如SYBR綠)在結合至雙鏈DNA時展示的熒光的增加。
[0357]如本領域技術人員會領會的，可以在采用多種等位基因特異性引物的反應中實施等位基因特異性擴增方法以靶向特定等位基因。用于此類多重應用的引物一般用可區分標記物進行標記，或者選擇成使得自等位基因生成的擴增產物通過尺寸可區分。如此，例如，可以使用一個擴增反應通過擴增產物的凝膠分析來鑒定一份樣品中的野生型和突變型V600E等位基因二者。
[0358]等位基因特異性寡核苷酸引物可以是與雜交區中的等位基因之一準確互補的，或者可以在除寡核苷酸3’末端以外的位置具有一些錯配。例如，等位基因特異性寡核苷酸中的倒數第二個3’核苷酸可以是錯配的。在其它實施方案中，錯配可以發生于兩種等位基因序列的(非突變型)位點。
[0359]在一些實施方案中，以利用固定化靶或固定化探針的測定法型式實施等位基因特異性雜交。此類型式是本領域公知的，而且包括例如點印跡型式和反向點印跡測定法型式，記載于美國專利 N0.5，310，893 ；N0.5，451，512 ；N0.5，468，613 ;及吣.5，604，099，通過述及將每一篇收入本文。
[0360]4.RNN-Seq
[0361]RNA-Seq(也稱作全轉錄組鳥槍測序(WTSS))指使用高通量測序技術來對cDNA測序以獲得關于樣品的RNA內容物的信息。描述RNA-Seq的出版物包括:Wang etal.“RNA-Seq:a revolutionary tool for transcriptomics，，Nature Reviews Genetics10 (I): 57-63 (January2009) ；Ryan et al.BioTechniques45 (I): 81-94 (2008) JMaher etal.^Transcriptome sequencing to detect gene fusions in cancer〃.Nature458(7234):97-101 (January2009)。
[0362]5.微陣列
[0363]差異基因表達也可使用微陣列技術來鑒定或驗證。如此，可使用微陣列技術在新鮮的或石蠟包埋的腫瘤組織中測量乳腺癌相關基因的表達序型。在這種方法中，在微芯片基片上涂布(plate)或排列(array)感興趣多核苷酸序列(包括cDNA和寡核苷酸)。然后使排列的序列與來自感興 趣細胞或組織的特異性DNA探針雜交。正如在PCR方法中一樣，mRNA的來源典型的是從人腫瘤或腫瘤細胞系及相應的正常組織或細胞系分離的總RNA。如此，RNA可以從多種原發性腫瘤或腫瘤細胞系分離。如果mRNA的來源是原發性腫瘤，那么mRNA可從例如冷凍的或歸檔的石蠟包埋且固定(例如福爾馬林固定)的組織樣品提取，所述組織樣品是日常臨床實踐中常規制備和保存的。
[0364]在微陣列技術的一個具體實施方案中，將PCR擴增的cDNA克隆的插入物以密集陣列應用至基片。優選的是，將至少10，000種核苷酸序列應用至基片。以每種10，000個成分固定在微芯片上的微陣列基因適于在嚴格條件下雜交。熒光標記的cDNA探針可通過從感興趣組織提取的RNA的逆轉錄中摻入熒光核苷酸來生成。應用至芯片的經標記cDNA探針與陣列上的每個DNA斑點以特異性發生雜交。嚴格清洗以除去非特異性結合的探針后，通過共聚焦激光顯微鏡檢術或通過其它檢測方法諸如CCD照相機掃描芯片。每種陣列成分的雜交的定量容許評估相應mRNA的豐度。憑借雙重有色熒光，將從兩種RNA來源生成的分開標記的cDNA探針與陣列成對雜交。如此同時測定來自對應于每種指定基因的兩種來源的轉錄物的相對豐度。小型化規模的雜交提供了大量基因表達樣式的便利且快速評估。此類方法已經顯示出檢測以每個細胞少數拷貝表達的罕見轉錄物所要求的靈敏度及可再現的檢測表達水平的至少約2倍差異(Schena et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93(2): 106-149(1996))。微陣列分析可使用商品化設備遵循制造商的方案進行，諸如使用Affymetrix GENCHIP?技術、或Incyte的微陣列技術。
[0365]為大規模分析基因表達而開發的微陣列方法使得有可能系統搜索多種腫瘤類型中的癌癥分類和后果預測的分子標志物。
[0366]6.基因表達連續分析(SAGE)
[0367]基因表達連續分析(SAGE)是容許同時且定量分析大量基因轉錄物且不需要為每種轉錄物提供個別雜交探針的一種方法。首先，生成包含足以唯一鑒定一種轉錄物的信息的一種短序列標簽(約10-14bp)，倘若該標簽是從每種轉錄物內的一個唯一位置得到的。然后，將許多轉錄物連接起來以形成長、連續分子，它們可測序，以同時揭示多種標簽的身份(identity)。任何轉錄物群的表達樣式可通過測定個別標簽的豐度并鑒定與每種標簽對應的基因來定量評估。更多詳情參見例如Velculescu etal.,Science270:484-487(1995) ；Velculescu et al.，Cell88:243-51(1997)。
[0368]7.MassARRAY 技術
[0369]MassARRAY(Sequenom, San Diego, Calif.)技術是一種使用質譜術(MS)進行檢測的自動化、高通量基因表達分析方法。依照此方法，在分離RNA、逆轉錄并PCR擴增之后，對cDNA進行引物延伸。純化cDNA衍生的引物延伸產物，并分配到芯片陣列上，該芯片陣列預先加載有MALD1-TOF MS樣品制備所需要的成分。通過分析所獲得的質譜中的峰面積對反應中存在的各種cDNA定量。
[0370]8.免疫組化
[0371]免疫組化(“IHC”)方法也適用于檢測本發明的生物標志物的表達水平。組織切片的免疫組化染色已經證明是一種評估或檢測樣品中蛋白質存在的可靠方法。免疫組化技術利用抗體來探查和顯現原位細胞抗原，通常通過顯色或者熒光方法。如此，使用對每種標志物特異性的抗體或抗血清，優選多克隆抗血清，最優選單克隆抗體來檢測表達。如下文極為詳細討論的，抗體可通過直接標記抗體自身來檢測，例如用放射性標記物、熒光標記物、半抗原標記物諸如生物素、或酶諸如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。或者，未標記一抗與經標記二抗聯合使用 ，包括對一抗特異性的抗血清、多克隆抗血清或單克隆抗體。免疫組化方案和試劑盒是本領域眾所周知的，而且可通過商業途徑獲得。
[0372]現有兩種常用的IHC方法:直接和間接測定法。根據第一種測定法，直接測定抗體與靶抗原的結合。這種直接測定法使用經過標記的試劑，諸如熒光標簽或酶標記的第一抗體(primary antibody),其不需要進一步的抗體相互作用就能顯現。在一種典型的間接測定法中，未偶聯的第一抗體結合至抗原，然后經過標記的第二抗體(secondary antibody)結合至第一抗體。若第二抗體偶聯有酶標記物，則添加顯色底物或熒光底物以提供抗原的顯現。因為數個第二抗體可以與第一抗體上的不同表位反應，所以發生信號放大。
[0373]用于免疫組化的第一和/或第二抗體通常用可檢測模塊進行標記。可利用許多標記物，一般可分成以下幾類:
[0374](a)放射性同位素,諸如 35S、14C、1251、3H 和 1311。例如，可使用 Current Protocolsin Immunology,卷 I 和 2，Coligen 等編，ffiley-1nterscience, New York, N.Y., Pubs.1991中描述的技術用放射性同位素標記抗體，并可使用閃爍計數來測量放射性。
[0375](b)膠體金顆粒。
[0376](C)熒光標記物，包括但不限于稀士螯合物(銪螯合物)、德克薩斯紅、若丹明、熒光素、丹酰、麗絲胺、傘形酮、藻紅蛋白、藻藍蛋白、或商品化熒光團諸如SPECTRUM ORANGE?和SPECTRUM GREEN?、和/或上述一種或多種的衍生物。例如，可使用Current Protocols in Immunology,見上文中披露的技術使突光標記物與抗體偶聯。可使用熒光計對熒光進行定量。
[0377](d)可利用各種酶-底物標記物且美國專利N0.4，275，149中提供了有關它們中的一些的綜述。酶一般催化可使用多種技術測量的顯色底物的化學改變。例如，酶可以催化可通過分光光度法測量的底物的顏色改變。或者，酶可以改變底物的熒光或化學發光。上文描述了用于對熒光改變進行定量的技術。化學發光底物通過化學反應變成電子激發態，然后可發射可測量(例如使用化學發光計)或給熒光受體提供能量的光。酶標記物的例子包括螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶；美國專利N0.4，737，456)、螢光素、2，3- 二氫酞嗪二酮類、蘋果酸脫氫酶、尿素酶、過氧化物酶諸如辣根過氧化物酶(HRPO)、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(諸如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。用于使酶與抗體偶聯的技術描述于O’Sullivan等，Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in EnzymeImmunoassay, Methods in Enzym.，J.Langone 和 H.Van Vunakis 編，Academic Press, NewYork, 73:147-166(1981)。
[0378]酶-底物組合的例子包括例如:
[0379](i)辣根過氧化物酶(HRPO)，其以過氧化氫為底物，其中過氧化氫氧化染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺鹽酸鹽(TMB))。
3,3-Diaminobenzidine (DAB)也可以用于觀察HRP標記的抗體；
[0380](ii)堿性磷酸酶(AP)與作為顯色底物的對硝基苯基磷酸酯；和
[0381](iii) β -D-半乳糖苷酶(β -D-Gal)與顯色底物(例如對硝基苯基_β _D_半乳糖苷)或熒光底物(例如4-甲基傘形基-β -D-半乳糖苷)。
[0382]本領域技術人員可利用許多其它酶-底物組合。有關它們的一般性綜述參見美國專利 N0.4，275，149 和 4，318，980。
[0383]有時，將標記物與抗體間接偶聯。熟練技術人員了解實現這一目的的多種技術。例如，可將抗體與生物素偶聯，而且可以將上述四大類標記物中的任一種與親合素偶聯，或反之亦然。生物素選擇性結合親合素，由此標記物可與抗體以這種間接方式偶聯。或者，為了實現標記物與抗體的間接偶聯，將抗體與小型半抗原偶聯，并將上述不同類型的標記物之一與抗半抗原抗體偶聯。由此，可實現標記物與抗體的間接偶聯。
[0384]在上文討論的樣品制備規程外，可能還需要在IHC之前、期間或之后對組織切片進行進一步的處理。例如，可以實施表位修復法，諸如在檸檬酸鹽緩沖液中對組織樣品進行加熱(參見例如 Leong 等 Appl.1mmunohistochem.4 (3): 201 (1996))。
[0385]在任選的封閉步驟后，將組織切片在合適條件下暴露于第一抗體足夠時間，使得第一抗體結合至組織樣品中的靶蛋白抗原。實現這一目的的適宜條件可以通過常規實驗來確定。
[0386]抗體與樣品的結合程度通過使用上文討論的任一種可檢測標記物來測定。優選地，標記物是酶標記物(例如HRP0)，其催化顯色底物諸如3，3’ - 二氨基聯苯胺色原體的化學變化。優選的是，將酶標記物偶聯至特異性結合第一抗體的抗體(例如第一抗體是家兔多克隆抗體，第二抗體是山羊抗家兔抗體)。
[0387]可以將如此制備的標本放置好并蓋上蓋玻片。然后進行載玻片評估，例如利用顯微鏡。
[0388] IHC可以與形態學染色組合，或是在之前或是在之后。脫石蠟后，可以用形態學染料對封固在載玻片上的切片染色以進行評估。使用的形態學染料提供組織切片的精確形態學評估。可以用一種或多種染料對切片染色，每種染料獨特染色不同細胞成分。在一個實施方案中，使用蘇木精來對載玻片上的細胞核染色。蘇木精廣泛可得。合適蘇木精的一個例子是蘇木精II (Ventana)。當期望淺藍色核時，可以在蘇木精染色之后使用發藍試劑。本領域技術人員會領會，通過延長或縮短載玻片保持在染料中的時間長度可以對給定組織優化染色。
[0389]用載玻片制備和IHC加工的自動化系統是商品化的。Ventana? BenchMark XT系統是此類自動化系統的一個例子。
[0390]染色后，可以通過顯微術的標準技術來分析組織切片。通常，病理學家或類似人員對組織評估異常或正常細胞或特定細胞類型的存在并提供感興趣細胞類型的位置。如此，例如，病理學家或類似人員會檢查載玻片并鑒定正常細胞(諸如正常肺細胞)和異常細胞(諸如異常或贅生肺細胞)。可以使用定義感興趣細胞位置的任何手段(例如X-Y軸上的坐標)。
[0391 ] 適合用于IHC的抗c-met抗體是本領域公知的，而且包括SP-44 (Ventana)、DL-21 (Upstate)、MET4、ab27492 (Abeam)、PA1-37483 (Pierce Antibodies)。本領域技術人員理解，例如使用本文中公開的IHC方案,通過與c-met抗體比較,可以鑒定和表征別的合適的抗c-met抗體。抗磷酸c-met抗體是本領域已知的且包括來自Cell SignallingTechnologies的抗磷酸c_met抗體Π234/5。適合用于IHC的抗HGF抗體是本領域公知的且包括:ab24865 (Abeam)，H00003082-A01 (Abnova), MA1-24767 (Thermo Fisher),LS-C123743(Life Span)。如本文中使用的，要理解，在患者腫瘤的樣品中檢測HGF涵蓋例如在患者腫瘤的樣品中存在的腫瘤基質中檢測HGF以及在腫瘤細胞中檢測HGF。用于在血清中檢測HGF的測定法(諸如ELISA測定法)是商品化的且本領域已知的。參見例如Catenacci et al, Cancer Discovery (2011) 1:573。
[0392]在一些實施方案中，可以利用具有各種染色強度的對照細胞團粒作為IHC分析的對照以及評分對照。例如，H441(強c-met染色強度)；A549 (中等c-met染色強度)；Hl 703 (弱 c-met 染色強度)，HEK-293 (293)(弱 c-met 染色強度);和 T0V-112D (陰性 c-met染色強度)或Hl 155 (陰性c-met染色強度)。在一些實施方案中，例示性c-met IHC評分強度可以參考本文中圖1和/或2。在一些實施方案中，圖1描繪例示性0、1+、2+和3+c-metIHC評分強度，例如依照下文表A的評分方案。
[0393]在一些實施方案中，可以依照表A來評估C-met染色強度標準:
[0394]表A
[0395]
【權利要求】
1.一種用于治療具有癌癥的患者的方法，其包括施用有效量的B-raf.拮抗劑和c-met拮抗劑。
2.一種用于治療形成對B-raf拮抗劑的抗性的可能性升高的癌癥患者的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
3.一種用于提高和/或恢復對B-raf拮抗劑的敏感性的方法，其包括對癌癥患者施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
4.一種用于延長B-raf拮抗劑敏感性時段的方法，其包括對癌癥患者施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
5.一種用于治療具有B-raf拮抗劑抗性癌癥的患者的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
6.一種用于延長B-raf拮抗劑響應持續時間的方法，其包括施用有效量的B_raf拮抗劑和c-met拮抗劑。
7.一種用于在患者中延遲或阻止形成HGF介導的B-raf拮抗劑抗性癌癥的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗 劑和c-met拮抗劑。
8.權利要求1-7任一項的方法，其中所述患者的癌癥顯示出表達B-raf生物標志物。
9.權利要求8的方法，其中所述B-raf生物標志物為B_rafV600。
10.權利要求8的方法，其中所述B-raf生物標志物為B_rafV600E。
11.權利要求8-10任一項的方法，其中使用包括下述各項的方法測定所述患者的癌癥中的突變型B-raf生物標志物表達:(a)對樣品實施基因表達序型分析、PCR雜交測定法、原位雜交、5 ’核酸酶測定法突變檢測測定法、RNA-seq、微陣列分析、SAGE、MassARRAY技術、或FISH中一項或多項，和(b)測定樣品中突變型B-raf生物標志物的表達。
12.權利要求11的方法，其中使用包括下述各項的方法測定所述患者的癌癥中的突變型B-raf生物標志物表達:(a)對自患者癌癥樣品提取的基因組DNA實施PCR，和(b)測定樣品中突變型B-raf生物標志物的表達。
13.權利要求1-12任一項的方法，其中所述患者的癌癥顯示出表達c-met生物標志物。
14.權利要求13的方法，其中c-met生物標志物為多肽。
15.權利要求14的方法，其中使用免疫組織化學(IHC)測定c-met生物標志物表達。
16.權利要求15的方法，其中通過測定肝細胞生長因子(HGF)的表達來測定c-met生物標志物表達。
17.權利要求16的方法，其中HGF在腫瘤或腫瘤基質中表達。
18.權利要求16的方法，其中在所述患者的血清中測定HGF表達。
19.權利要求1-18任一項的方法，其中所述c-met拮抗劑為拮抗性抗c_met抗體。
20.權利要求1-19任一項的方法，其中所述c-met拮抗劑為onartuzumab、crizotinib、tivantinib、carbozantinib、MGCD-265、ficlatuzumab、人源化 TAK-701、rilotumumab, foretinib、h224Gll、DN-30、MK-2461、E7050、MK-8033、PF-4217903、AMG208、JNJ-38877605, EMD120483U INC-280, LY-2801653、SGX-126, RP1040, LY2801653、BAY-853474、和/或LA480中一項或多項。
21.權利要求1-20任一項的方法，其中所述B-raf拮抗劑為sorafenib、PLX4720、PLX-3603、GSK2118436、GDC-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2，3_b]吡啶-3-羰基)-2，4- 二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺、vemurafenib、GSK2118436、RAF265 (Novartis)、XL281、ARQ736、BAY73-4506 中一項或多項。
22.權利要求21的方法,其中所述B-raf拮抗劑為vemurafenib。
23.權利要求21的方法，其中所述B-raf拮抗劑為GSK2118436。
24.權利要求1-23任一項的方法，其中同時施用所述B-raf拮抗劑和所述c_met拮抗劑。
25.權利要求1-23任一項的方法,其中序貫施用所述B-raf拮抗劑和所述c_met拮抗劑。
26.權利要求25的方法,其中在所述c-met拮抗劑之前施用所述B_raf拮抗劑。
27.權利要求26的方法,其中在所述B-raf拮抗劑之前施用所述c_met拮抗劑。
28.權利要求1-27任 一項的方法，其進一步包括對所述受試者施用至少一種別的治療。
29.權利要求1-28任一項的方法，其中所述癌癥為黑素瘤、結腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌或乳頭狀甲狀腺癌。
30.權利要求29的方法，其中所述癌癥為顯示出表達B-rafV600的黑素瘤。
31.權利要求1-30任一項的方法，其中所述癌癥對B-raf拮抗劑有抗性。
32.權利要求1-30任一項的方法，其中所述患者先前未用B-raf拮抗劑治療過。
33.一種用于測定c-met生物標志物表達的方法，其包括測定患者的癌癥是否表達c-met生物標志物的步驟,其中c-met生物標志物表達指示該患者是用c_met拮抗劑和B-raf拮抗劑治療的候選:提高所述患者的癌癥對B-raf拮抗劑的敏感性,恢復所述患者的癌癥對B-raf拮抗劑的敏感性，延長所述患者的癌癥對B-raf拮抗劑的敏感性的時段，和/或阻止所述患者的癌癥中形成HGF介導的B-raf拮抗劑抗性。
34.一種用于將患者鑒定為用B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑治療的候選的方法，其包括:(a)測定所述患者的癌癥表達c-met生物標志物；并(b)將所述患者鑒定為用B_raf拮抗劑和c-met拮抗劑治療的候選。
35.一種用于將患者鑒定有風險形成對B-raf拮抗劑的抗性的方法，其包括:(a)測定所述患者的癌癥表達c-met生物標志物；并(b)將所述患者鑒定為有風險形成對B-raf拮抗劑的抗性。
36.權利要求34或35的方法，其中在步驟(a)和(b)之后，用有效量的c-met拮抗劑和B-raf拮抗劑治療所述患者。
37.一種測定B-raf拮抗劑治療患者中癌癥的治療功效的方法，其包括通過免疫測定法、ELISA、雜交測定法、PCR、5’核酸酶測定法、IHCjP /或RT-PCR測定自所述患者獲得的樣品中c-met生物標志物和/或B-raf生物標志物的存在情況,并選擇所述患者用B_raf拮抗劑進行治療。
38.權利要求37的方法，其進一步包括選擇所述患者用c-met拮抗劑進行治療。
39.權利要求38的方法，其進一步包括用有效量的B-raf拮抗劑和c-met拮抗劑治療所述患者。
40.一種確定黑素瘤患者預后的方法，其包括測定來自所述患者的樣品中c-met生物標志物的表達情況,其中c-met生物標志物為HGF且HGF表達預示所述受試者中的癌癥。
41.一種試劑盒,其包含c-met拮抗劑和B_raf拮抗劑。
42.權利要求41的試劑盒，其進一步包含用于治療黑素瘤患者的方法的用法說明書，該方法包括將有效量的c-met拮抗劑和B-raf拮抗劑施用于所述患者。
43.一種制品，其包含包裝在一起的藥學可接受載體中的c-met拮抗劑和包裝插頁，該包裝插頁指示該c-met拮抗劑用于基于B-raf生物標志物的表達來治療具有黑素瘤的患者，其中該治療與B-raf拮抗劑組合。
【文檔編號】A61K31/4439GK103930111SQ201280055708
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年9月19日 優先權日:2011年9月19日
【發明者】T.R.威爾遜, H.科彭, M.莫錢特, J.塞特爾曼 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司