一種三齒型連接子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種三齒型連接子及其應用，所述三齒型連接子可用于獲得抗體藥物偶聯物。所述抗體藥物偶聯物如式Ⅰ所示：L–(T-A–D)n?Ⅰ。其中L是抗體，抗體片段或蛋白；T是三齒型連接子部分；A是可斷裂連接子組合或不可斷裂連接子部分；D是藥物部分；n是一個范圍在0-8的整數；所述三齒型連接子部分的結構如式Ⅱ所示：其中W是取代的芳基，雜芳基，鏈烷基，環烷基，雜環烷基，或其中任意組合。
【專利說明】一種三齒型連接子及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及應用抗體藥物偶聯物治療腫瘤或其它疾病，尤其涉及應用一種特殊的三齒型連接子來制備抗體藥物偶聯物以控制藥物/抗體比值(DAR)。
【背景技術】
[0002]作為新型的靶向治療藥物，抗體藥物偶聯物(ADC)開創了腫瘤治療方法的新紀兀(Carter 等，2008, Cancer J.14:154-169;Chari 等，2008, Acc.Chem.Res.41:98-107;Senter 等，2009, Curr.0pin.Chem.Biol.13:235 - 244;Teicher 等，2009, Curr.Cancer Drug Targets9:982-1004;Ducry 等，2010，Bioconjugate Chem.21:5-13;Lash等，2010, In vivo:The Business&Medicine Report32-38;Casi 等，2012, J.Control.Rel.161:422-428)。在美國的西雅圖基因公司(Seattle Genetics, Inc.)和免疫原公司(ImmunoGen, Inc.)引領下，很多跨國制藥企業和初創公司都開展了這一領域的研發。據美國華爾街報告披露，截止2011年5月，總計有36個ADC項目進入臨床前和臨床階段。2011年8月美國食品藥品監督管理局(FDA)批準西雅圖基因公司研制的用于治療霍奇金淋巴瘤以及復發性間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)的新藥Adcetris?上市(Katz等，2011，Clin.Cancer Res.17:6428-6436)。健泰科生物技術公司(Genentech)研制的用于治療乳腺癌的新藥T-DMl正在進行三期臨床試驗并取得了滿意的效果，有可能于2013年初獲得FDA批準上市(Mathew 等,2011, Curr.0pin.0ncol.23:594-600)。
[0003]抗體藥物偶聯物一般由三部分組成:抗體或抗體類配體,小分子藥物,和將配體與藥物偶聯起來的連接子。抗體藥物偶聯物的作用機制如下:抗體或抗體類配體特異性地識別細胞表面抗原并與之結合；形成的結合物以內吞的方式進入細胞內，同時將小分子藥物帶入細胞；抗體被酶解或連接子自身斷裂，小分子藥物以適當的活性成分形式釋放出來，殺死目標細胞。抗體藥物偶聯物采用的小分子細胞毒性藥物活性非常高，通常比目前在一線應用的化療藥物活性高10-1000倍以上。用于抗體藥物偶聯物的細胞毒性藥物主要包括美登素類(Maytansinoids, EP0425235; US5208020, 5416064; 7276497，7473796，7851432; US2007/0269447, 2011/0158991 ;W02004/103272, 2012/061590)，耳抑素肽類(Auristatins, US6884869, 7498298)，卡奇霉素類(Calicheamicins, US5606040, 5770710)，阿霉素類(Doxorubicins, Dubowchik 等，2002, Bioconjugate Chem.13:855-869),苯并二吡咯類抗生素類(duocarmycins和CC-1065類，US7129261)，以及吡咯并苯二氮卓二聚體類(PBD dimmers, W02005/040170)等。抗體藥物偶聯物采用的連接子需滿足以下要求:在細胞外具有足夠的穩定性，保證小分子藥物不與配體脫離；進入細胞后，可斷裂的連接子在適當條件下斷裂，釋放出活性小分子藥物；對于不可斷裂的連接子，活性成分則由小分子，連接子，以及由配體酶解產生的氨基酸殘基構成。
[0004]目前進入臨床試驗的抗體藥物偶聯物結構中，高活性的細胞毒性藥物通常是通過連接子連接在配體表面的賴氨酸殘基，或者抗體鉸鏈區域的半胱氨酸殘基(由鏈間二硫鍵部分還原得到)上，最佳的藥物/配體比值(DAR)為2-4。抗體表面大量的賴氨酸殘基(超過80個)以及偶聯反應的非選擇性，導致偶聯數目和位點的不確定性，進而導致生成的抗體藥物偶聯物的不均一性。例如，T-DMl (平均DAR值為3.5)的DAR值分布為0-8 (Lazar等,2005, Rapid Commun.Mass Spectrom.19:1806-1814)。同樣，盡管抗體絞鏈區的鏈間二硫鍵只有四對，但為達到最佳平均DAR值(2-4)的要求，需要部分還原鏈間二硫鍵(Sun等，2005，Bioconjugate Chem.16:1282-1290)。由于現有的還原劑(DTT，TCEP 等)無法選擇性地還原鏈間二硫鍵，因此生成的偶聯物也不是均一的產物，由多種組分組成，其主要組分的DAR值為0，2，4，6，8，而且對應每一種特定DAR值的組分都存在由于連接位點不同而形成的異構體。抗體藥物偶聯物產品的不均一性可以導致各成員組分間藥物動力學性質，效價以及毒性的不均一性。例如，具有較高DAR值的組分在體內被清除得更快，并導致更高的毒性(Boswell 等,2011,Bioconjugate Chem.22: 1994-2004)。[0005]為了解決抗體藥物偶聯物均一性問題，定點偶聯技術近來得到了更多的青睞，這一技術從位點和數量兩方面來控制抗體藥物之間的偶聯。西雅圖基因公司選擇性地用絲氨酸部分置換組成鏈間二硫鍵的半胱氨酸，從而將可用于偶聯的位點從8個降低到4個或2 個(TO2006/065533; Mcdonagh 等，2006，Protein Eng.Des.Sel.19:299-307)。這樣得到的具有確定位點和DAR值的抗體藥物偶聯物，與從不均一偶聯物中分離出來的具有同樣DAR值的組分，表現出同樣的體外和體內特性，包括抗腫瘤活性,藥物動力學,和最大耐受量。應用噬菌體展示技術預測合宜的偶聯位點，健泰科公司通過重組的方式在抗體的輕鏈和重鏈上引入半胱氨酸，在不影響抗體蛋白折疊組裝和改變與抗原結合力的前提下，提供可用于偶聯的巰基基團(US7855275;US2011/0301334;W02008/141044，2009/052249;Junutula 等，2008, Nat.Biotechnol.26:925-933;Junutula 等，2010，Clin.Cancer Res.16:4769-4778)。應用此項技術生產的抗體藥物偶聯物表現出令人滿意的近均一組分具有的體內特性。與上述技術不同的是，Ambrx(W02006/069246, 2007/059312)，Allozyne(US2008/0096819;W02007/130453, 2009/026393)，Sutro(W02010/081110)，以及Redwood(US2010/0210543)等公司都采用非天然氨基酸抗體/蛋白改造技術,在抗體/蛋白的合宜位點引入帶有可偶聯基團的非天然氨基酸，從而實現抗體/蛋白的定點修飾，包括聚乙二醇修飾，糖基化修飾，以及抗體藥物偶聯物。盡管以上技術都能夠實現偶聯藥物位點和數量的可控，所應用的抗體/蛋白都是通過基因重組的方式得到的。基因重組技術需要大量的工作和精巧的設計，以尋找合宜的位點供藥物偶聯或聚乙二醇修飾，因此非常耗時而且研發費用較高。
[0006]針對以上偶聯技術存在的問題，通過簡單的化學方法實現定點偶聯目的會節省大量的人力物力財力，因此更加富有吸引力。一種平衡轉移烷基化交叉偶聯試劑(ETAC)被開發用于定點偶聯技術，該試劑可與鉸鏈區二硫鍵完全還原/部分還原成巰基的抗體反應，生成鏈間交叉偶聯的結構(Liberatore 等，Bioconjugate Chem.1:36-50; del Rosario 等，1990，Bioconjugate Chem.1:51-59)。交叉偶聯的產品不僅收率較低(30%左右)，而且均一性較差，含有O到4組鏈間交叉偶聯的組分。韓國的LegoChem Biosciences (LCB)公司報道了一種定點偶聯技術，包括定點功能化步驟和正交藥物偶聯步驟，但是技術的細節并沒有披露(BioSpectrum, 2012，39)。
[0007]因此，本領域迫切需要提供高效、簡單、實用的化學偶聯方法。
【發明內容】
[0008]本發明旨在提供一種可用于化學偶聯方法制備抗體藥物偶聯物的新型三齒型連接子。
[0009]在本發明的第一方面，提供了一種如式I所示的抗體藥物偶聯物，
[0010]L-(T-A-D)n I
[0011]其中L是抗體，抗體片段或蛋白^是三齒型連接子部分；A是連接子部分；D是藥物部分；n是一個范圍在0-8的整數；
[0012]所述三齒型連接子部分的結構如式II所示:
[0013]
【權利要求】
1.一種如式I所示的抗體藥物偶聯物， L- (T-A-D)n I 其中L是抗體，抗體片段或蛋白；T是三齒型連接子部分；Α是連接子部分；D是藥物部分；n是一個范圍在0-8的整數； 所述三齒型連接子部分的結構如式II所示:
2.如權利要求1所述的抗體藥物偶聯物，其特征在于，所述A是可斷裂連接子組合或不可斷裂連接子。
3.如權利要求2所述的抗體藥物偶聯物，其特征在于，所述A的結構如式III或IV所示: C-Ee-Ff III Gg IV 其中C是可斷裂連接子；E，F是自殺式連接子；e，f是在0-5范圍內的整數而是不可斷裂連接子；g是0-5范圍內的整數。
4.如權利要求1-3任一項所述的抗體藥物偶聯物，其特征在于，所述抗體藥物偶聯物的結構如式V、V1、VII或VDI所示:
5.如權利要求1所述的抗體藥物偶聯物，其特征在于，所述抗體為針對細胞表面受體和腫瘤相關抗原的抗體。
6.如權利要求1所述的抗體藥物偶聯物，其特征在于，所述藥物為細胞毒性藥物，治療自身免疫疾病的藥物和抗炎癥的藥物。
7.一種結構如式I所示的三齒型連接子:
8.一種結構如式3所示的三齒型連接子:
9.一種結構如式4所示的三齒型連接子:
10.一種結構如式5所示的三齒型連接子:
11.一種結構如式6所示的三齒型連接子:
12.—種結構如式IX所示的三齒型連接子在制備抗體藥物偶聯物中的應用:
13.如權利要求12所述的應用，其特征在于，所述的三齒型連接子的結構如式1、式2、式3、式4、式5或式6所不:
【文檔編號】A61P35/00GK103933575SQ201310025021
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月23日 優先權日:2013年1月23日
【發明者】安德強, 曾迪, 韓念和, 楊航, 朱鵬, 冉云根, 李明振, 薦立, 楊春 申請人:上海新理念生物醫藥科技有限公司