專利名稱：一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子的制備方法及其N-末端氨基酸序列，本發明還涉及灰星鯊軟骨血管生成抑制因子在制備抑制血管生成、防治腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
血管生成在人體發育和組織修復等正常生理過程中發揮重要作用，同時也是腫瘤、糖尿病性視網膜病、風濕性關節炎和慢性炎癥等血管增生性疾病的重要病理特征之一。1970年，Folkman認為腫瘤的生長依賴于新生血管的生成,而通過抑制腫瘤的血管生成可達到治療腫瘤的目的。目前，已有的研究證明當腫瘤的體積達到疒3 mm2以上時就必須依賴新生血管為其繼續增殖提供必需的氧氣和營養物質，而此時抑制腫瘤的血管生成,就會切斷腫瘤的營養供給,導致腫瘤的退化、萎縮。因此，以抗血管生成為主的腫瘤生物治療研究成為近十多年來抗腫瘤藥物的研究熱點。與常規抗腫瘤藥物相比，腫瘤血管生成抑制劑具有許多優勢:處于增生狀態的血管有相對較高的靶分子表達，故腫瘤血管生成抑制劑治療腫瘤具有良好的特異性。實體瘤生長和轉移均須依賴血管生成，因而抗血管治療具有廣譜性。血管內皮細胞暴露于血流中，藥物可直接發揮作用，故劑量小、療效高、副作用相對較輕。內皮細胞基因表達相對穩定，不易產生耐藥性。因此，抗血管生成的腫瘤治療策略在未來的腫瘤治療中將發揮重要的作用。申請人:研究發現，以灰星鯊軟骨為原料，制備血管生成抑制因子的研究處于空白階段，而灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1在制備抑制血管生成、防治腫瘤的藥物中的應用更是未見報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1的N-末端氨基酸序列，具有這種N-末端氨基酸序列的灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1顯示強抑制血管生成活性。本發明的目的尚在于提供一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1的方法。本發明的目的還在于提供一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1的藥理性質，以利用于制備藥物。本發明為解決上述第一個技術問題所采取的技術方案為:一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1，其特征在于該血管生成抑制因子的N末端15個氨基酸殘基的排列順序為 DPGTCDYKGADEFAK SEQ ID NO:1，亦即 Asp-Pro-Gly-Thr-Gly-Asp-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asp-Glu-Phe-Ala-Lys SEQ ID NO: 1，分子量為 11.9 kDa，最適 pH 為 7.0-8.5，穩定 pH 為5.0_9.0 ο
本發明為解決上述第二個技術問題所采取的技術方案為:一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
O灰星鯊軟骨蛋白粗提液的提取:將灰星鯊軟骨破碎勻漿，按固液比I g:5^10 mL加入到濃度為1.0 mol/L鹽酸胍溶液中，于4 °C以下振蕩抽提2Γ36 h后，抽提溶液于4 V以下、5 000 r/min離心l(Tl5 min,去除殘洛,收集上清液；上清液繼續在4。(^下10 000r/min離心15 20 min,取上清液；將上清液裝入截留分子量為8 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液于4°C以下透析18 24 h，每隔6 h更換Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液I次，透析袋內溶液即為灰星鯊軟骨蛋白粗提液。2)灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分的制備:灰星鯊軟骨蛋白粗提液置于4 °C以下預冷0.5 1 h，緩慢加入4 °C以下預冷的丙酮至其濃度為30%，靜置0.5 1 h后，于4 V以下10 000 r/min離心15 25 min,取離心上清液加入4 °C以下預冷的丙酮至丙酮濃度達60%，靜置0.5 I h后，4 °C以下、9 000 r/min離心15 25 min，取沉淀置于截留分子量為8kDa的透析袋內用雙蒸水于4 1:以下透析18 24 h，每隔6 h更換雙蒸水I次，透析液冷凍干燥，得灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分；
3)灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分的離子交換層析純化:將上述得到的灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分溶于Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液中，配成濃度為10 15 mg/mL溶液，用0.45微米微孔濾膜過濾除去不溶物質，濾液加入到DEAE-52纖維素層析柱中，用水、
0.09 0.11 mol/L, 0.45 0.55 mol/L和0.90 1.10 mol/L NaCl溶液進行洗脫，洗脫速度為3 5mL/min,每5 mL洗脫液收集I試管,并根據每試管洗脫液280 nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖，每一色譜峰為一組分，其中，對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高組分為灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分；
4)灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分的凝膠色譜純化:將灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分溶于Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液，配成濃度為15 20 mg/mL溶液，用0.45微米微孔濾膜過濾除去不溶物質，濾液加入到Sephadex G_75層析柱中，用Tris-HCl (pH7.6)緩沖液進行洗脫，洗脫速度為0.8 1.5 mL/min,每3 mL洗脫液收集I試管，并根據每試管洗脫液280 nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖，每一色譜峰為一組分，其中，對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高組分為灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1j^反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測為單一峰，SDS-PAGE測定分子量為11.9 kDa。本發明為解決上述第三個技術問題所采取的技術方案為:一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1的應用，其特征在于BSFN-1對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成具有顯著抑制作用；腹腔注射BSFN-1還可對荷Lewis肺癌小鼠肺癌組織的血管內皮細胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和血小板衍生生長因子(TOGF)三種促血管生成因子的表達有明顯的抑制作用，BSFN-1具有安全無毒副作用和活性強等優點，可用于制備抑制血管生成、防治腫瘤的藥物。與現有技術相比，本發明的優點在于:提取、純化工藝較簡單，易于操作，制得的血管生成抑制因子活性顯著，安全無毒，可用于腫瘤疾病的治療。
圖1是本發明實施例用DEAE-52纖維素離子交換層析柱進行分離純化時所獲得的分離峰圖，其中橫軸為接收試管數，縱向軸是280nm吸光度；
圖2是本發明實施例用Sephadex G_75層析時所獲得的分離峰圖，其中橫軸為接收試管數，縱向軸是280nm吸光度；
圖3是本發明實施例用ZORBAX 300SB-C18 HPLC柱進行層析時所獲得的分離峰圖，其中橫軸為洗脫時間t (min)，縱向軸是280nm吸光度(mAU)；
圖4是本發明實施例用SDS-PAGE電泳-考馬斯亮藍染色法顯示圖，縱軸為分子量(kDa)，其中泳道為I標準分子量蛋白質，泳道2為BSFN-1電泳條帶；
具體實施例方式以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例:一種灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-1的制備方法，制備流程如下:灰星鯊軟骨〃組織破碎〃鹽酸胍抽提〃丙酮分級沉淀分〃離子交換層析純化〃凝膠滲透色譜純化〃血管生成抑制因子BSFN-1。I)灰星鯊軟骨蛋白粗提液的提取:將灰星鯊軟骨破碎勻漿，按固液比I g:8 mL加入到濃度為1.0 mol/L鹽酸胍溶液中，于4 °C以下振蕩抽提24 h后，抽提溶液于4 °C以下、5 000 r/min離心15 min,去除殘洛,收集上清液；上清液繼續在4。(^下10 000 r/min離心20 min，取上清液；將上清液裝入截留分子量為8 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl (pH7.6)緩沖液于4°C以下透析24 h，每隔6 h更換Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液I次，透析袋內溶液即為灰星鯊軟骨蛋白粗提液。2)灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分的制備:灰星鯊軟骨蛋白粗提液置于4 °C以下預冷I h，緩慢加入4 °C以下預冷的丙酮至其濃度為30%，靜置I h后，于4 °C以下10000 r/min離心15 min,取離心上清液加入4 °C以下預冷的丙酮至丙酮濃度達60%,靜置Ih后,4 °C以下、9 000 r/min離心15 min,取沉淀置于截留分子量為8 kDa的透析袋內用雙蒸水于4 1:以下透析24 h，每隔6 h更換雙蒸水I次，透析液冷凍干燥，得灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分；
3)灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分的離子交換層析純化:將上述得到的灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分溶于Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液中，配成濃度為10 mg/mL溶液，用0.45微米微孔濾膜過濾除去不溶物質，濾液加入到DEAE-52纖維素層析柱中，用水、0.10 mol/L、0.50 mol/L和1.00 mol/L NaCl溶液進行洗脫，洗脫速度為3 mL/min，每5 mL洗脫液收集I試管，并根據每試管洗脫液280 nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖(圖1)，每一色譜峰為一組分，其中，對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高組分為灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分；
4)灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分的凝膠色譜純化:將灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分溶于Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液，配成濃度為15 mg/mL溶液，用0.45微米微孔濾膜過濾除去不溶物質，濾液加入到S印hadex G-75層析柱中，用Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液進行洗脫，洗脫速度為1.0 mL/min，每3 mL洗脫液收集I試管，并根據每試管洗脫液280 nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖(圖 2)，每一色譜峰為一組分，其中，對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高組分為灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1。
所得的BSFN-1經反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測為單一峰(圖3 )，所得的BSFN-1經12%的SDS-PAGE電泳-考馬斯亮藍染色法顯示為一條帶，分子量為11.9 kDa(圖4)。將制得的BSFN-1作雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用的測定，測定方法參考賀國安、羅進賢、張添元等“改進的雞胚絨毛尿囊膜技術一無氣室孵育法”(記載于《中山大學學報(自然科學版)》，2003年第2冊(第42卷):第126-128頁)。結果表明，灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-1顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成并呈劑量依賴關系(表I)
表I灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-1對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制作用
權利要求
1.一種灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-1，其特征在于該灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-1的N末端15個氨基酸殘基的排列順序為DPGTCDYKGADEFAK SEQ ID NO: 1，亦即Asp-Pro-Gly-Thr-Gly-Asp-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asp-Glu-Phe-Ala-Lys,分子量為 11.9 kDa，最適pH 為 7.0-8.5，穩定 pH 為 5.0-9.0。
2.—種權利要求1所述的一種灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-1的制備方法，其特征在于包括以下步驟: O灰星鯊軟骨蛋白粗提液的提取:將灰星鯊軟骨破碎勻漿，按固液比I g:5^10 mL加入到濃度為1.0 mol/L鹽酸胍溶液中，于4 °C以下振蕩抽提2Γ36 h后，抽提溶液于4 V以下、5 000 r/min離心l(Tl5 min,去除殘洛,收集上清液；上清液繼續在4。(^下10 000r/min離心15 20 min,取上清液；將上清液裝入截留分子量為8 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液于4°C以下透析18 24 h，每隔6 h更換Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液I次，透析袋內溶液即為灰星鯊軟骨蛋白粗提液； 2)灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分的制備:灰星鯊軟骨蛋白粗提液置于4°C以下預冷0.5 1 h，緩慢加入4 °C以下預冷的丙酮至其濃度為30%，靜置0.5 1 h后，于4 °C以下10 000 r/min離心15 25 min,取離心上清液加入4 °C以下預冷的丙酮至丙酮濃度達60%,靜置0.5 I h后，4 °C以下、9 000 r/min離心15 25 min，取沉淀置于截留分子量為8 kDa的透析袋內用雙蒸水于4 1:以下透析18 24 h，每隔6 h更換雙蒸水I次，透析液冷凍干燥，得灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分； 3)灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分的離子交換層析純化:將上述得到的灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分溶于Tris-H Cl (pH 7.6)緩沖液中，配成濃度為10 15 mg/mL溶液，用0.45微米微孔濾膜過濾除去不溶物質，濾液加入到DEAE-52纖維素層析柱中，用水、0.09 0.11 mol/L,0.45 0.55 mol/L和0.90 1.10 mol/L NaCl溶液進行洗脫，洗脫速度為3 5mL/min,每5 mL洗脫液收集I試管,并根據每試管洗脫液280 nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖，每一色譜峰為一組分，其中，對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高組分為灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分； 4)灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分的凝膠色譜純化:將灰星鯊軟骨蛋白離子交換層析活性組分溶于Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液，配成濃度為15 20 mg/mL溶液，用0.45微米微孔濾膜過濾除去不溶物質，濾液加入到Sephadex G_75層析柱中,用Tris-HCl (pH7.6)緩沖液進行洗脫，洗脫速度為0.8 1.5 mL/min,每3 mL洗脫液收集I試管，并根據每試管洗脫液280 nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖，每一色譜峰為一組分，其中，對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高組分為灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-1j^反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測為單一峰，SDS-PAGE測定分子量為11.9 kDa。
3.權利要求1所述的一種灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-1可用于制備抑制血管生成、防治腫瘤的藥物。
全文摘要
本發明涉及一種灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-I及其制備方法和應用，該血管生成抑制因子的N末端15個氨基酸殘基的排列順序為DPGTGDYKGADEFAKSEQIDNO:1，亦即Asp-Pro-Gly-Thr-Gly-Asp-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asp-Glu-Phe-Ala-Lys，分子量為11.9kDa。制備時將灰星鯊軟骨勻漿，鹽酸胍抽提，丙酮沉淀分級、以及離子交換層析和凝膠層析，得一單峰，即為抑制因子BSFN-I。灰星鯊血管生成抑制因子BSFN-I可用于制備抑制血管生成、防治腫瘤的藥物。
文檔編號A61K38/17GK103232537SQ20131006168
公開日2013年8月7日 申請日期2013年2月28日 優先權日2013年2月28日
發明者王斌, 羅紅宇, 栗麗, 王玉梅 申請人:浙江海洋學院