專利名稱：蜂毒抗菌肽Anoplin在食管癌治療中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及蜂毒抗菌肽Anoplin的抗腫瘤作用。具體地，本發明涉及:治療受試者中癌癥、緩解受試者中癌癥癥狀或抑制癌細胞增殖的方法；蜂毒抗菌肽Anoplin在制備用于治療癌癥、緩解癌癥癥狀或抑制癌細胞增殖的藥物、藥劑或藥物組合中的用途；以及涉及一種藥學產品，其包括作為活性成分的蜂毒抗菌肽Anoplin和包括涉及該藥學產品的說明書。
背景技術：
癌癥是一類嚴重危害人類健康的疾病，目前全球癌癥死亡人數高于艾滋病、結核病和瘧疾死亡人數的總和，已成為全球頭號殺手[1]。全世界每年死于惡性腫瘤的人數超過700萬，其中中國約有160多萬人。美國癌癥學會負責人約翰.塞弗林說，如今全球每8名死者中就有I人死于癌癥。而白血病是一類造血系統的惡性疾病，是國內十大高發惡性腫瘤之一，占腫瘤發病率的第六位,在我國各年齡組惡性腫瘤的死亡率中分別占男性的第6位和女性的第8位，在兒童及35歲以下的死亡率中占第I位。WHO預計，在全球范圍內，新增癌癥病例和癌癥患者死亡率也將會以每年1%的速度遞增，而在中國、俄羅斯和印度這些國家增長速度會更快，估計到2030年全球將可能有7500萬人遭受癌癥的折磨，將新增2700萬癌癥病例，死于癌癥的人數將達到1700萬人，這一數字對許多國家的健康護理體系來說是難以承受的。近年來，隨著臨床上多種抗生素的大量應用，已經導致了多藥耐藥問題的出現。青霉素、大環內酯類、甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲基異噁唑、四環素類、氟奎諾酮、氯霉素、萬古霉素等抗生素的耐藥及多藥耐藥的致病菌的感染也逐年呈上升趨勢，嚴重的威脅人類的健康。因此常規抗生素的抗性增加問題已經成為全球公共衛生問題，對新的抗生素的需求激勵了人類治療學對發展抗菌肽的興趣[2_4]。抗菌肽是生物防御系統中產生的一類對抗外源性病原體的肽類物質，是生物天生的、非特異性防御系統的重要組成部分。目前研究者已經從細菌、昆蟲、無脊椎動物、脊椎動物、人體和植物體中分離得到了上千種抗菌肽[3_5]。大多數天然分離的抗菌肽及數千種由它們改造而來的抗菌肽都具有廣譜的抗菌活性。它們大多能夠殺死革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，令人振奮的是有一小部分的抗菌肽已被證明具有抗腫瘤、抗病毒的活性[4_11]，一些抗菌肽也被證明具有中和脂多糖以及恢復適當免疫應答的能力[5]。越來越多的研究提出了一些陽離子抗菌肽，這些抗菌肽對細菌有毒性作用但是對哺乳動物的正常細胞無毒性作用。這些研究相當大程度上提高了陽離子抗菌肽的重要性，無論是人工合成的還是從天然物中提取的抗菌肽對于增強免疫系統的免疫力和作為臨床上使用的抗生素都具有非常大的潛力。目前，一些抗菌肽已經參與臨床前和臨床試驗包括促進傷口愈合，治療囊性纖維病，輸尿管感染，痤瘡，以及參與干細胞移植[12 15]。Anoplin是最近 從獨居黃蜂毒液中分離得到的一種迄今發現的最短的具有線性α-螺旋結構的抗菌肽[16]，僅由10個氨基酸組成,其序列為:Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-1le-Lys-Thr-Leu-Leu-NH2。研究發現Anoplin具有明顯的對抗革蘭氏陰性和陽性菌生長的作用，而對人類的紅血球無溶血作用[17]。但是到目前為止還未見文獻報道該迄今發現的自然界存在的最小的線性多肽是否具有抗腫瘤的作用。因此，本發明成果將來若能市場化，市場空間將比較龐大，發展前景也十分可觀。附:抗菌肽Anoplin的一級結構序列:Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-1le-Lys-Thr-Leu-Leu-NH
發明內容
為了向腫瘤患者提供治療腫瘤或腫瘤相關癥狀的新途徑或提供更廣泛的選擇，本發明的發明人研究發現抗菌肽Anoplin具有顯著的抗腫瘤或腫瘤相關癥狀的作用。因此，本發明一方面提供了一種治療或緩解受試者中腫瘤或腫瘤相關癥狀或抑制腫瘤細胞的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的抗菌肽Anoplin。本發明的另一方面提供了抗菌肽Anoplin在制備用于治療腫瘤的藥物、藥劑或藥物組合物中的用途。本發明的再一方面提供了一種藥學產品，其包括作為活性成分的抗菌肽Anoplin;以及包括該涉及藥學產品的說明書。
圖1為Anoplin對腫瘤細胞作用24h，48h，72h和96h的MTT實驗結果，其中:(A)MEL 細胞；(B) K562 細胞；(C) TE-1 細胞；(D) Bel-7404 細胞；圖2 為 Anoplin 對 MEL 細胞在 24h (A)，48h (B) , 72h (C)和 96h (D)四個時間點作用的可見光顯微鏡圖片；圖3為PI染色實驗檢測Anoplin對腫瘤細胞細胞膜通透性的影響，其中:(A)MEL細胞對照組和不同劑量Anoplin處理組的PI熒光染色照片；(B)K562細胞對照組和不同劑量Anoplin處理組的PI熒光染色照片；圖4為掃描電鏡技術檢測Anoplin處理前后對腫瘤細胞的細胞膜表面形態的影響。(A)未經加藥處理的MEL細胞，細胞膜結構完整，有大量的微絨毛。(B)加入162μΜ的Anoplin處理的MEL細胞，細胞膜結構破壞，出現大量孔洞，細胞內容物大量外泄。(C)加入100 μ M Anoplin處理的MEL細胞，細胞膜結構部分破壞，細胞內容物滲出。(D)未經加藥處理的K562細胞，細胞膜結構完整，細胞膜表面光滑。(E)加入300 μ M Anoplin處理的K562細胞，細胞膜結構破壞，出現斷裂和縫隙。(F)加入225 μ M Anoplin處理的Κ562細胞，細胞膜結構部分破壞，出現孔洞，細胞內容物滲出。
具體實施例方式本發明的發明人選用人慢性粒性白血病細胞K562，小鼠紅白血病細胞MEL，人食管癌細胞TE-1和人肝癌細胞Bel-7404為腫瘤細胞。研究發現抗菌肽Anoplin具有抗腫瘤
作用。 因此，本發明一方面提供了一種治療或緩解受試者中腫瘤或腫瘤相關癥狀的方法，其中包括向所述受試者施用有效量的抗菌肽Anoplin。本發明也提供了一種抑制腫瘤細胞增殖的方法，其包括將所述腫瘤細胞與抗菌肽Anoplin接觸的步驟。本發明的另一方面提供了抗菌肽Anoplin在制備用于治療或緩解受試者中腫瘤或腫瘤相關癥狀或抑制腫瘤細胞增殖的藥物或藥劑或藥物組合物中的用途。本發明的再一方面提供了一種藥學產品(例如藥物或藥劑)或藥物組合物，其包括作為活性成分的抗菌肽Anoplin ;以及包括該涉及藥學產品的說明書。對于本發明所述的受試者，其優選為哺乳動物，更優選為人。雖然本發明以腫瘤細胞進行了舉例說明，但術語“腫瘤”可包括血癌及其他癌癥，以及相關癥狀。對于本發明的抗菌肽Anoplin，其可為任何能夠治療或緩解受試者中腫瘤或腫瘤癥狀的抗菌肽Anoplin。當然,本領域技術人員可對抗菌肽Anoplin進行各種修飾以提高其抗腫瘤功效。這類修改的抗菌肽Anoplin也是在本發明的范圍之內的。本發明的作為活性成分的抗菌肽Anoplin可以連同藥學上可接受的載體一起使用。除活性成分外，本發明的方法、用途和產品還可以包含合適的藥學上可接受的載體，包括促進活性化合物加工成制劑的賦形劑和助劑。例如適于注射或輸注的制劑包括水性和非水性無菌注射液和水性和非水性無菌混懸劑，所述無菌注射液可任選地包含抗氧劑、緩沖劑、抑菌劑和能使制劑與目的接收者的血液等壓的溶質，所述無菌混懸劑可包括懸浮劑和增稠劑。所述制劑可存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿，并且可以保存在凍結干燥的(凍干)條件，在立即使用前僅需要加入無菌液體載體，例如注射用水。本發明的活性成分任選地可與固體賦形劑相組合，且任選地磨碎所得到的混合物，并且需要時，在加入合適的助劑后，加工顆粒的混合物，以獲得所需劑型。合適的賦形劑特別是填充劑例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纖維素或淀粉制劑、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要時，可以加入崩解劑，例如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽例如海藻酸鈉。
本發明的活性成分的有效量可為治療或緩解腫瘤或腫瘤癥狀或抑制腫瘤細胞的任何量，其可以是相當于約0.l-15mg抗菌肽Anoplin,優選0.2_12mg抗菌肽Anoplin的劑量單位。更優選地，劑量單位包括約2-5mg的抗菌肽Anoplin。最優選地,劑量單位包括約3-4mg的抗菌肽Anoplin。有效量的測定在本領域技術人員的能力內，特別是根據本文提供的公開內容的啟示下。根據本發明，本發明的藥學產品(藥物、藥劑)或藥物組合物可以以任意有效劑量數施用給藥受試者。優選地，本發明的藥學產品(藥物、藥劑)或藥物組合物可以以多次劑量給藥，例如從約2至約15次劑量，更優選從約4-10次劑量，最優選約6次劑量。在特別優選的實施方案，在給藥過程中，以每三周給藥約一次的頻率將本發明的藥學產品(藥物、藥劑)或藥物組合物給藥至受試者，例如注射、輸注或口服。在特別優選的實施方案，給藥為通過注射。應當理解本發明的藥學產品(藥物、藥劑)或藥物組合物可以按用于通過任意適宜的途徑給藥的任意適宜的方式配制。本發明的藥學產品(藥物、藥劑)或藥物組合物的劑量單位是基于常規進行給藥受試者。例如，劑量單位可以給藥多于每日一次、每周一次、每月一次等。劑量單位可以是以兩次/周為基礎給藥，即每周兩次，例如每三天一次。
如本文所使用的，“包含”與“包括”、“含有”或“特征在于”同義，并且是包括在內的或開放性的，并且不排除另外的未陳述的元件或方法步驟。術語“包含”在本文中的任何表述，特別是在描述本發明的方法、用途或產品時，應理解為包括基本上由所述組分或元件或步驟組成和由所述組分或元件或步驟組成的那些產品、方法和用途。本文示例性描述的本發明適當地可以在不存在本文未具體公開的任何一種或多種元件、一種或多種限制的情況下進行實踐。本發明的藥學產品中所包含的涉及該藥學產品的說明書可以含有如下內容:適應癥(例如腫瘤)、施用劑量(例如上述所示例性說明的)以及可能產生的副作用等等。本文已采用的術語和表述用作描述性而不是限制性術語，并且在此種術語和表述的使用中不預期排除所示和所述特征或其部分的任何等價物，但應認識到各種修飾在請求保護的本發明的范圍內是可能的。因此，應當理解盡管本發明已通過優選實施方案和任選特征具體公開，但本領域技術人員可以采用本文公開的概念的修飾和變化，并且此類修飾和變化被視為在如由附加權利要求定義的本發明的范圍內。為更清楚地說明本發明，現結合如下實施例進行詳細說明，但這些實施例僅僅是對本發明的示例性描述，并不能解釋 為對本申請的限制。實施例1.材料和方法1.1材料、儀器和試劑1.1.1細胞株及多肽人慢性粒性白血病細胞K562、小鼠紅白血病MEL細胞、人食管癌TE-1細胞和人肝癌Bel-7404細胞均購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫。抗菌肽Anoplin由杭州中肽公司采用固相多肽合成方法合成。1.1.2主要試劑DMEM培養基Gibco公司FBSHyclone 公司臺盼藍Sigma公司MTTSigma 公司DMSO(二甲基亞諷) Sigma-Aldrich 公司PI聯科生物有限公司Hoechst33342碧云天生物科技有限公司細胞周期檢測試劑盒凱基生物有限公司細胞凋亡檢測試劑盒貝博生物有限公司1.1.3試劑配制磷酸鹽緩沖液(Phosphatebuffer saline, PBS):8g 氯化鈉,0.2g 氯化鉀，2.9g 磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，IL去離子水，4°C保存。Anoplin用PBS配成3X 10_3M的母液。配成的母液經0.22 μ m濾膜過濾除菌后分裝至1.5mL的EP管中，_20°C分別保存。1.2實驗方法1.2.1細胞培養
MEL，K562，TE-1 和 Bel-7404 細胞分別培養于含 10%FBS (Fetal bovine serum)的 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培養基中(含谷氨酰胺、IOmM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -l-piperazineethanesulfonic acid)、1.0mM 丙酮酸鈉、lOOU/mL 青霉素和100 μ g/mL鏈霉素)，于37°C、5%C02、飽和濕度下培養，每3天傳代一次，取對數生長期細胞用于實驗。1.2.2MTT比色法檢測抗菌肽Anoplin對細胞活力的影響(I)收集對數生長期的細胞，1000轉離心3分鐘，棄掉舊培養基，加適量新鮮培養基進行細胞計數。(2)將細胞濃度均調整為3X104/ml接種于96孔板中，每孔100μ1，則為3000個細胞每孔。小鼠骨髓細胞調至10000個細胞每孔。(3)懸浮細胞鋪完后立即加入稀釋為不同濃度的兩種抗菌肽20 μ 1，對照組細胞則加入20 μ I培養基。(4)藥物加完后加入80 μ I DMEM培養基將體系補充至200 μ I。(5)將細胞培養在37°C、5%C02及飽和濕度環境下，在24h，48h，72h和96h四個時間點培養結束前4h每孔加入10 μ I (5mg/ml)MTT,培養4小時后離心并吸掉上層液體，向每孔加入150μ1 DMSO溶解紫色結晶，最后用酶標儀檢測570nm的光吸收值。根據下面公式計算藥物的抑制率:抑制率=(加藥組OD值-對照組OD值)/對照組OD值*100%1.2.3普通光學顯微鏡觀察抗菌肽Anoplin對腫瘤細胞形態和數量的影響(I)收集對數生長期的細胞，1000轉離心3分鐘，棄掉舊培養基，加適量新鮮培養基進行細胞計數。
(2)將細胞濃度均調整為3X104/ml接種于96孔板中，每孔100μ1，則為3000個
細胞每孔。 (3)懸浮細胞鋪完后立即加入稀釋為不同濃度的兩種抗菌肽20 μ I，并且加入不同濃度的紫杉醇20μ I作為陽性藥物對照，對照組細胞則加入20μ I培養基。(4)藥物加完后加入80 μ I DMEM培養基將體系補充至200 μ 1.
(5)將細胞培養在37°C、5%C02及飽和濕度環境下，在24h，48h，72h和96h四個時間點在普通光學顯微鏡下觀察細胞形態變化并拍照。1.2.4小分子PI熒光染色實驗觀察抗菌肽Anoplin對細胞膜通透性的影響PI是一種小分子熒光染料，可以通過破損的細胞膜進入細胞核中與核內染色物質結合，但是完整的細胞膜不能攝入P1.
(I)收集對數生長期的MEL細胞，1000轉離心3分鐘，棄掉舊培養基，加適量新鮮培養基進行細胞計數。(2)將細胞濃度均調整為3X104/ml接種于96孔板中，每孔100μ1，則為3000個
細胞每孔。(3)懸浮細胞鋪完后立即加入稀釋為不同濃度的兩種抗菌肽20 μ 1，對照組細胞則加入20 μ I培養基。(4)藥物加完后加入80 μ I DMEM培養基將體系補充至200 μ 1.
(5)將細胞培養在37°C、5%C02及飽和濕度環境下，在12h時吸掉培養基，加入稀釋后的PI染液50 μ 1，37°C、5%C02及飽和濕度環境下培養10分鐘后于熒光顯微鏡下觀察。
(6)在GREEN濾光片下觀察細胞內熒光變化情況。1.2.5掃描電鏡實驗觀察抗菌肽Anoplin對細胞膜的作用(I)用多聚賴氨酸包被玻片，備用。(2)收集對數生長期的細胞，1000轉離心3分鐘，棄掉舊培養基，加適量新鮮培養基進行細胞計數。(3)先把包被好的玻片置于24孔板中，再將細胞濃度均調整為3X 104/ml接種于24孔板中，每孔400 μ 1，則為12000個細胞每孔。(4)懸浮細胞鋪完后立即加入稀釋為不同濃度的兩種抗菌肽80 μ 1，對照組細胞則加入80 μ I培養基。(5)藥物加完后加入520 μ I DMEM培養基將體系補充至1000 μ 1.
(6)將細胞培養在37°C、5%C02及飽和濕度環境下24h.
(7)加入Iml PBS漂洗5分鐘，洗兩次，洗掉培養基。(8)每孔加入lml3%戊二醛溶液，4度固定2小時。吸掉戊二醛，PBS洗兩次。(9)每孔加入lml2%四氧化鋨溶液，4度固定2小時。吸掉2%四氧化鋨溶液，PBS洗兩次。(10)乙醇梯度脫水:50%-70%-80%-90%-100% 每次 5 分鐘。(11)乙腈置換:50%-70%-80%-90%-100%每次15分鐘至純乙腈時將乙腈吸干，保鮮膜封口，扎小洞。(12)在凍干機里干燥 大約45分鐘，樣品達到完全干燥。(13)鍍金膜。(14) Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡檢測細胞膜變化。2.實驗結果2.1MTT法檢測抗菌肽Anoplin對腫瘤細胞生長的抑制作用MTT實驗結果顯示抗菌肽Anoplin在24h，48h，72h和96h能劑量和時間依賴的抑制腫瘤細胞MEL (圖1A)，K562 (圖1B)，TE-1 (圖1C)和Bel-7404 (圖1D)的增殖。2.2普通光學顯微鏡觀察抗菌肽Anoplin對腫瘤細胞形態和數量的影響通過普通光學顯微鏡實時觀察能更直觀的顯示出抗菌肽Anoplin對腫瘤細胞增殖的抑制作用，見圖2。2.3小分子PI熒光染色實驗觀察抗菌肽Anoplin對細胞膜通透性的影響通過PI攝取實驗發現，抗菌肽Anoplin處理后腫瘤細胞的細胞膜的通透性發生了明顯變化。Anoplin未處理的對照細胞在突光顯微鏡下看不到突光,而加了 Anoplin處理的腫瘤細胞除了了明顯的紅色熒光，且紅色熒光的數量隨著藥物濃度的增加而加強，見圖3。2.4掃描電鏡實驗觀察抗菌肽Anoplin對細胞膜的作用進一步用掃描電鏡實驗研究發現，抗菌肽Anoplin處理腫瘤細胞后，細胞膜發生了明顯變化。未處理的對照細胞細胞膜表面光滑，可見大量微絨毛，而抗菌肽Anoplin處理后的腫瘤細胞的細胞膜出現了孔洞，斷裂，形態不規則等變化，見圖4。可見抗菌肽抑制腫瘤細胞的增殖主要是通過破壞腫瘤細胞的細胞膜而起作用的。綜上可見，抗菌肽Anoplin對所測試的四種腫瘤細胞都具有抑制其生長的作用。且其抑制機理可能是通過破壞腫瘤細胞的細胞膜結構而實驗的。
本領域普通技術人員應當理解，可以在本發明的實踐中釆用除具體例示那些外的方法和原材料等而無需過度實驗。任何此類方法和原材料等的所有的本領域已知的功能等價物都預期包括在本發明中。本領域技術人員還應當理解，可對本說明書及權利要求書中描述的本發明進行各種變動和修飾，且本發明包括所有此類變動和修飾。本發明還包括本說明書中單獨或同時提及或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及所述步驟或特征中的任何2個或更多個的任何和所有組合。參考文獻:[I]黃治虎，陳寶安，歐陽建等.我國白血病流行病學調查的現狀和對策[J].臨床血液學雜志，2009; 22:166-167.
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權利要求
1.蜂毒抗菌肽Anoplin在制備用于治療受試者中食管癌癥、緩解受試者中食管癌癥狀或抑制食管癌細胞增殖的藥物中的用途。
2.根據權利要求1中所述的用途，其中所述的受試者為哺乳動物。
3.根據權利要求2所述的用途，其中所述的哺乳動物為人。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的用途，其中所述的蜂毒抗菌肽Anoplin是PEG化的。 ·
全文摘要
本發明涉及蜂毒抗菌肽Anoplin在食管癌治療中的用途。具體地，本發明涉及治療受試者中食管癌、緩解受試者中食管癌癥狀或抑制食管癌細胞增殖的方法；蜂毒抗菌肽Anoplin在制備用于治療食管癌、緩解食管癌癥癥狀或抑制食管癌細胞增殖的藥物、藥劑或藥物組合中的用途；以及涉及一種藥學產品，其包括作為活性成分的蜂毒抗菌肽Anoplin和包括涉及該藥學產品的說明書。
文檔編號A61P35/00GK103142995SQ20131006910
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月4日 優先權日2013年3月4日
發明者付彩云, 盧燕, 朱麗娜, 趙輔昆, 張世馥 申請人:浙江理工大學