專利名稱：一種載丹參酮iia的納米給藥系統的制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種納米給藥系統的制備方法及用途，具體地，涉及一種載丹參酮IIA的納米給藥系統一種載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法及用途。
背景技術：
利用納米技術制備的納米粒子(nanoparticles)具有比表面積大，表面原子數、表面能和表面張力隨粒徑的下降急劇增加，各納米單位間存在著或強或弱的相互作用，這些特點使納米粒子具有小尺寸效應，表面效應及很強的吸附性和生物活性，表現出許多優異性能和全新的功能，可作為藥物的載體，改變藥物體內分布特征，提高了藥物吸收利用度和穩定性，改善藥物性質和靶向性，藥物緩釋，藥物作用時間延長，藥物劑量減少，減輕或避免毒副作用，且利于儲存，用于疾病的治療，是近年來腫瘤治療新的發展領域，已顯示出良好的優勢。國外研究發現聚乳酸(PLGA)-阿霉素納米微粒靜脈注入肝轉移瘤小鼠體內，由于肝臟Kupffer細胞具有高吞噬活性，吞噬載藥納米微粒后在肝內起到藥物儲存庫作用，緩慢釋放抗腫瘤藥物，與游離阿霉素相比，抗腫瘤效果顯著，同時體外試驗亦證實了吞噬載藥阿霉素納米微粒的巨噬細胞J774A1能釋放有活性的藥物，殺滅肝腫瘤M5076細胞，且納米微粒誘導巨噬細胞增加，釋放細胞毒性因子(如NO等)增加藥物作用，導致腫瘤細胞死亡增加，表明PLGA可以作為一種有效的藥物載體，靶向性強，具有緩釋特性，有望用于肝臟腫瘤治療。國內研究發現磁性阿霉素白蛋白納米微粒(100-1000 nm)肝動脈給藥后靶向性好，肝臟分布均勻，其它臟器心、肺、腎和脾組織少，肝組織阿霉素濃度是游離阿霉素的3倍，外加定位磁場干預下，治療大鼠肝癌療效顯著，明顯高于游離阿霉素白蛋白和阿霉素療效，且毒性反應小，荷瘤大鼠生存期延長。選擇生物相容性可降解的PLGA材料制備PLGA-去甲斑蝥素納米控釋抗腫瘤制劑，粒徑87.14-179.12nm，平均126.14 nm，通過體外抗肝癌細胞SMMC-7721抑瘤實驗和體內抗小鼠肝癌和肺癌抑瘤實驗均表現出明顯的腫瘤抑制作用，且具有良好的量-效作用關系，靜脈給藥略優于腹腔給藥，LD50僅為裸藥的50%左右，顯著 延長局部有效血藥濃度，提高藥物生物利用度，減少給藥量和毒副作用。為進一步肝癌的臨床治療提供理論依據。中藥納米載藥系統除具有以上作用外，尚有低毒的優勢，并可能解決抗癌中藥全身給藥難以在腫瘤局部達到有效抗癌濃度的難題。大量的研究表明，中藥納米化不僅可以有效地提高藥物的吸收度、減少藥物的用量、消除或降低藥物的毒副反應，而且可改善藥物的輸送，目前已經呈現出了良好的發展勢頭和應用前景。當納米微粒足夠小，粒徑為50-100nm時，在體內被肝實質細胞吸附，粒徑為100_200nm時，被肝臟網狀內皮系統吸附。當粒徑在100-150nm,表面覆以特殊包被后，即可逃避Kuppffer細胞的吞卩遼。若利用特定基因片段的專一性，將配體結合在納米載體上，在啟動子的作用下與腫瘤細胞膜上目標受體進行特異性結合，從而發揮更好的靶向作用。肝癌屬中醫“癥瘕”、“積聚”等范疇，臨床上瘀血是肝癌常見的中醫癥候，活血化瘀是肝癌重要的中醫治法之一。中藥丹參是活血化瘀的要藥，中醫運用丹參治療該病歷史悠久，早在兩千多年前的《神農本草經》已有明確記載。丹參酮II A是丹參的有效成分之一，最早用于心腦血管疾病。近年研究發現，丹參酮II A對肝癌、胃癌等多種癌細胞具有顯著的殺傷作用。近年來其抗腫瘤活性也被陸續報道，機制涉及抑制腫瘤細胞增殖和DNA合成、誘導腫瘤細胞分化和凋亡，對腫瘤細胞產生殺傷，影響腫瘤相關基因的表達和端粒酶活性，抑制侵襲和轉移等多個方面。但是丹參酮II A為脂溶性非醌類成分，難溶于水，體內給藥后在短時間內達到血藥峰濃度，半衰期短，給藥后藥物廣泛分布于胃、小腸、肝臟、肺臟、胰腺等多器官中并被迅速清除，排出體外。這種藥代動力學特點限制了丹參酮II A在腫瘤治療領域的使用。
發明內容
本發明的目的是提供一種用于丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法及用途，改善丹參酮II A的靶向性和腫瘤局部藥物聚集、持續發揮抗腫瘤效應，降低全身毒副反應，提聞丹參酮II A抗肝癌效應。為了達到上述目的，本發明提供了一種載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其中，該納米給藥系統是以纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽(cRGDMf飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL)聚合物作為載體的載丹參酮IIA (TSIIA)的納米粒。所述的納米給藥系統的制備方法包含:
步驟I，制備纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸:在室溫下于N，N’ -羰基二咪唑和二甲亞砜的混合有機溶劑中，使摩爾比為1-60:1-60的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸與纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽攪拌反應3-48 h，反應產物在水中進行透析，所使用的透析袋截留分子量為1000-10000，然后在凍干機上0-60°C溫度下凍干1-72 h，低溫干燥保存；所述的N，N’-羰基二咪唑與二甲亞砜摩爾比為1-60:1-60。
步驟2，纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸和丹參酮IIA摩爾比為1-60:1-60時，將二者混合于溶劑中，通過機械攪拌、超聲或高壓乳勻乳化制成納米粒。上述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其中，所述納米粒的直徑為10-2000 nm ;作為載體的所述聚合物的分子量為1.5X 103-9.5X 106。上述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其中，所述的丹參酮IIA和載體聚合物的摩爾比為1-60:1-60 ;所述聚合物中乳酸和羥基乙酸摩爾比為1-80:1-80，羥基乙酸和賴氨酸摩爾比為90-50:10-50，聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸和纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽摩爾比為1-60:1-60。其中，乳酸和羥基乙酸摩爾比優選為50-80:2-50，例如50:50、70:30或80:20等；羥基乙酸和賴氨酸摩爾比優選為 50-70:10-20，例如:70:10,60:10 或 50:20，mPEG-PLGA-PLL 和 cRGD 摩爾比優選為1:20-50，例如 1:20、1:30 或 1: 50 ;TSIIA和 mPEG-PLGA-PLL-cRGD 的摩爾比優選為 1:20-50，例如 1:20、1:30 或 1:5。上述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其中，所述的步驟I還包含: 步驟1.1，制備聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸，抽真空加熱干燥耐熱玻璃管，力口入摩爾質量比為1-80:1-80的丙交酯和乙交酯原料，再加入占原料總量質量百分比為1°/Γ15%、分子量范圍為35(Γ5000的聚乙二醇單甲醚，并加入催化劑，通氮氣，加熱溶解抽真空，冷卻固化抽真空2小時后封管，120-150°C反應8-50h ;所述的催化劑包含辛酸亞錫、乳酸鋅、SnCl2.2H20或對甲苯磺酸，所述的聚乙二醇單甲醚與催化劑的摩爾比為1-20:1-20。步驟1.2，在有機溶劑中和常壓氮氣保護下，使摩爾比為1:1-15:1-15:1_15的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸、N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸、N, N- 二環己基碳二亞胺和4- 二甲氨基吡啶反應f 3天，反應溫度為(T40°C;反應產物過濾，堿洗水洗或透析，濃縮，力口冰甲醇或冰乙醚沉淀出產物，過濾，真空干燥。步驟1.3，在有機溶劑中和0°C下，將摩爾比為1-50:1-80的步驟1.2所得產物與三氟乙酸反應廣4小時，產物旋蒸去除溶劑與未反應三氟乙酸，殘渣溶于有機溶劑，冰甲醇或冰乙醚沉淀，過濾，真空干燥。步驟1.4，有機溶劑中和室溫下，將摩爾比為1-60:1的步驟1.3所得產物與ε -芐氧羰基-L-賴氨酸羧酸酐反應f 5天，反應產物濃縮，冰甲醇或冰乙醚沉淀，過濾，真空干燥。步驟1.5，在0°C下，將步驟1.4所得產物、三氟乙酸和33%的氫溴酸-醋酸溶液反應0.5-8 h，步驟1.4所得產物和三氟乙酸為等摩爾，33%的氫溴酸-醋酸溶液占總體積的1-50%。反應產物采用冰甲醇或冰乙醚沉淀，過濾，真空干燥，得到聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸。上述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其中，所述的步驟I的反應過程在氮氣保護下進行。上述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其中，步驟2所述的纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸和丹參酮IIA均為水溶液，摩爾濃度分別為0.001-10000 μ M和0.001-10000 μ M0上述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其中，所述的步驟2是通過復乳法、薄膜乳化法、透析法、乳化蒸發法、界面沉淀法或自組裝法中的任意一種制備納米粒。所述的復乳法為:取纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸溶于有機溶劑中，加入丹參酮IIA溶液，超聲乳化，再加入水分散介質中，再次超聲乳化；然后在室溫下攪拌0.5-5 h，揮發除去有機溶劑。所述的薄膜乳化法為:取纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸和丹參酮IIA溶于有機溶劑中，旋轉蒸發成膜，然后加入水中，室溫下攪拌0.5-6 h。所述的透析法為:取纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸溶于有機溶劑中，加入丹參酮IIA，將攪拌均勻的溶液在攪拌的條件下滴入水中，然后將溶液裝入透析袋中透析3-72h，除去有機溶劑。所述的乳化蒸發法為:取纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸和丹參酮IIA溶于有機溶劑中，再加入水分散介質中，超聲或高壓乳勻乳化，然后在室溫下攪拌2-4 h，揮發除去有機溶劑。所述的界面沉淀法為:取 纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸和丹參酮IIA藥物溶于有機溶劑中，在不斷的攪拌條件下，將上述溶液加入水分散介質中，加壓揮發除去有機溶劑。所述的自組裝法為:取纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸溶于水中，加入丹參酮IIA，再將攪拌均勻的溶液在攪拌的條件下滴入水中，然后將溶液裝入透析袋中透析3_72h。上述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其中，步驟2所述的水分散介質為添加表面活性劑的水溶液，所述的表面活性劑包含右旋糖苷40-70、普朗尼克F68或聚乙烯醇等各種適合于制備納米粒的表面活性劑，其濃度為0.01-10% w/v。上述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其中，步驟2所述的有機溶劑包含乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇和二甲亞砜等各種適合于制備納米粒的有機溶劑中的任意一種或兩種的混合。上述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其中，步驟2所述的超聲采用的強度范圍為10-1000W。上述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其中，步驟2所用的透析袋的截留分子量范圍為100-10000。本發明還提供了一種根據上述方法制備的載丹參酮IIA的納米給藥系統的用途，其中，該納米給藥系統用于制備能夠進行長循環、生物降解、緩控釋、被動靶向、主動靶向、運送活性物質的抗腫瘤藥物。上述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的用途，其中，可將所得的包載丹參酮IIA藥物的納米遞送載體制備成不同類型的膠囊劑、片制劑、丸劑、散劑、顆粒劑、滴丸劑和膜劑
坐寸ο
上述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的用途，其中，所述的藥物是采用靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、瘤內注射、口服或經皮給藥等方式的藥物。上述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的用途，其中，所述的藥物可以制備成凍干劑保存和應用，所用的凍干支架劑包含海藻糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、右旋糖苷、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇等，支架劑含量為0.01-20% w/v。本發明提供的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法和用途具有以下優點:
該制備方法簡便，適于大規模生產，特別適應于制備具有長循環、可生物降解、緩控釋、
被動靶向、主動靶向、運送活性物質、抗腫瘤的藥物，尤其是制備抗腸癌的藥物。通過本發明制備的納米粒，其粒徑在10 2000 nm，表面光滑，均勻度好，顆粒規則無粘連，再分散性好，載藥量和包封率高，可用于制備靜脈或肌肉注射或口服給藥的緩釋納米粒，作為腫瘤靶向給藥。制備的納米粒可以分散在固體、半固體或溶液中。優選的是制成注射給藥的藥物制劑形式，尤其是供靜脈注射用。本發明制備的載丹參酮IIA (TSIIA)的納米給藥系統將能夠有效的降低TSIIA的毒性，增強其靶向性和治療效果。該mPEG-PLGA-PLL-cRGD聚合物給藥系統還具有運送除丹參酮IIA的不同抗癌藥物的功能。
圖1為本發明制備的載丹參酮IIA的納米給藥系統的mPEG-PLGA-PLL-cRGD合成路線圖。
圖2k 圖2D為本發明制備的載丹參酮IIA的納米給藥系統的透射電鏡和粒徑分布(A和B)以及ζ電位(C和D)圖。圖3為本發明制備的載丹參酮IIA的納米給藥系統的藥物釋放曲線圖。圖4Α和圖4Β為本發明制備的載丹參酮IIA的納米給藥系統(粒徑為100_400nm)對H印G2肝癌細胞的細胞攝取圖。圖5A和圖5B為本發明制備的載丹參酮IIA的納米給藥系統對荷HepG2肝癌裸鼠的靶向成像圖。圖6 A和圖6B為本發明制備的載丹參酮IIA的納米給藥系統對HepG2肝癌細胞的毒性示意圖。圖7為本發明制備的載丹參酮IIA的納米給藥系統對裸鼠肝癌生長抑制圖。圖8為本發明制備的載丹參酮IIA的納米給藥系統對肝癌裸鼠生存時間的影響圖。圖9A 圖9D為本發明制備的載丹參酮IIA的納米給藥系統對肝癌瘤體壞死程度的影響圖。
具體實施例方式
以下結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步地說明。實施例1:乳酸和羥基乙酸摩爾比為50:50，羥基乙酸和賴氨酸摩爾比為70:10，mPEG-PLGA-PLL 和 cRGD 摩爾比為 1:20，TSIIA 和 mPEG-PLGA-PLL-cRGD 的摩爾比為 1:20。實施例2:乳酸和羥基乙酸摩爾比為70:30，羥基乙酸和賴氨酸摩爾比為6:10，mPEG-PLGA-PLL 和 cRGD 摩爾比為 1:30，TSIIA 和 mPEG-PLGA-PLL-cRGD 的摩爾比為 1:30。實施例3:乳酸和羥基乙酸摩爾比為80:20，羥基乙酸和賴氨酸摩爾比為50:20，mPEG-PLGA-PLL 和 cRGD 摩爾比為 1:50，TSIIA 和 mPEG-PLGA-PLL-cRGD 的摩爾比為 1: 5。取實施例f實施例3中的任意一種配比，按以下方法制備以纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽(cRGD)修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL)聚合物為載體的載丹參酮IIA (TSIIA)的納米粒。步驟I，如圖1所示，制備cRGD修飾的mPEG-PLGA-PLL-cRGD。其中，h為小時，d為天，LA為丙交酯，Sn(Oct)2為辛酸亞錫，mPEG為聚乙二醇單甲醚，PLGA為聚乳酸/羥基乙酸，DCC為二環己基碳二亞胺，DMAP為4- 二甲氨基吡啶，BOC為苯丙氨酸，HAc為醋酸，HBr為氫溴酸，Poly(Ne-(Z)-L-1ysine)為帶芐氧羰基有保護基團的聚賴氨酸，PLL為聚賴氨酸。 步驟1.1:抽真空加熱干燥耐熱玻璃管，加入一定摩爾質量比的丙交酯和乙交酯原料(比例為8:2、7:3或5;5)，加入占原料總量質量百分比為1°/Γ15%、分子量范圍為350^5000的乙二醇單甲醚，再加入催化劑，通氮氣，加熱溶解抽真空，冷卻固化抽真空2小時后封管，120-150°C反應8-50h。步驟1.2:將一定量上步所得產物溶于有機溶劑，攪拌加入N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸，即Boc-Phe (I 15 eqv.)、N, N-二環己基碳二亞胺(I 15 eqv.), O 40°C緩慢滴力口4- 二甲氨基吡啶，氮氣保護，室溫攪拌f 3天，過濾，堿洗水洗(或透析)，濃縮，加冰甲醇或冰乙醚沉淀出產物，過濾，真空干燥。
步驟1.3:取上步所得產物溶于干燥有機溶劑中，氮氣保護，(TC攪拌滴加干燥的三氟乙酸，滴加1(Γ60分鐘，繼續反應廣3小時，旋轉蒸發去除溶劑與未反應三氟乙酸，殘渣溶于有機溶劑，冰甲醇或冰乙醚沉淀，過濾，真空干燥。步驟1.4:取上步所得產物溶于干燥有機溶劑中，加入ε -芐氧羰基-L-賴氨酸羧酸酐(I飛Oeqv.)，氮氣保護，室溫反應I飛天，濃縮，冰甲醇或冰乙醚沉淀，過濾，真空干燥。步驟1.5:取上步所得產物溶于定量三氟乙酸中，加入少量體積分數為33%的HBr醋酸溶液，(TC反應0.5-8 h，冰甲醇或冰乙醚沉淀，過濾，真空干燥。將所得產物與cRGD按等摩爾比共同溶于含有N，N’ -羰基二咪唑(⑶I)的二甲亞砜(DMSO)溶液中，然后在氮氣保護的條件，緩慢攪拌反應3-48 h，最后將反應后的產物進行透析，于凍干機上凍干，即得產物mPEG-PLGA-PLL-cRGD，低溫干燥保存。步驟2:采用以下任意一種方法制備包載丹參酮IIA(TSIIA)藥物的mPEG-PLGA-PLL-cRGD 納米 粒。采用復乳法制備，取4 mg或20 mg材料mPEG-PLGA-PLL-cRGD溶于200 μ I或1000μ I 二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合溶劑中，加入0.2 mg或4 mg TSIIA藥物溶液，超聲乳化(300 W或500 W，IOs X 4)，再加入2.2ml或6 ml濃度為0.5%或2%的普朗尼克F68水分散介質中，再次超聲乳化(300 W或500 W，IOs X 4)。然后室溫下攪拌0.5-5 h除去有機相，即得粒徑為100-600nm的納米粒溶液。采用薄膜乳化法制備，取4 mg或20 mg材料mPEG-PLGA-PLL-cRGD和0.2 mg或4 mg TSIIA藥物溶于400 μ I或2000 μ I丙酮溶劑中，旋轉蒸發成膜，隨后加入4 ml或12 ml的水溶液，室溫下攪拌0.5-6 h，即得粒徑為100_600nm的納米粒溶液。采用透析法制備，取4 mg或20 mg材料mPEG-PLGA-PLL-cRGD溶于200 μ I 二甲亞砜溶劑中，加入0.4 mg或者6 mg TSIIA藥物，將攪拌均勻的溶液在攪拌的條件下滴入2ml或10 ml水中，之后將溶液裝入透析袋(截留分子量為7000)中透析3_72小時，除去有機溶劑，即得粒徑為100-600nm的納米粒溶液。采用乳化蒸發法制備，取4 mg或20 mg材料mPEG-PLGA-PLL-cRGD和0.2 mg或4mg TSIIA溶于400 μ I或2000 μ I丙酮/ 二氯甲烷的混合溶劑中，加入2.2 ml或44 ml濃度為0.5%或2 %的含聚乙烯醇(PVA)的水分散介質中，超聲或高壓乳勻乳化，乳液在室溫下攪拌2或4 h,揮盡有機溶劑，即得粒徑為100-600nm的納米粒溶液。采用界面沉淀法制備，取4 mg或20 mg材料mPEG-PLGA-PLL-cR⑶和0.2 mg或4 mg TSIIA藥物溶于400 μ I或2000 μ I丙酮溶劑中，在不斷的攪拌條件下，將上述溶液注入2.2 ml或44 ml的濃度為0.5%或2 %的PVA水分散介質中，加壓揮發去除丙酮，即得粒徑為100-600nm的納米粒溶液液。采用自組裝法制備，取4 mg或20 mg材料mPEG-PLGA-PLL-cRGD溶于200 μ I或1000 μ I水溶液中，加入0.4 mg或8 mg TSIIA藥物，將攪拌均勻的溶液在攪拌的條件下滴入2 ml或者10 ml水中，之后將溶液裝入透析袋(截留分子量為3000或7000)中透析3或72小時，除去有機溶劑；即得粒徑為100-600nm的納米粒溶液。所得的載丹參酮IIA的納米給藥系統的透射電鏡和粒徑分布以及ζ電位圖，參見圖2Α 圖2D所示。采用的儀器為Η-800透射電子顯微鏡，日本日立公司，標尺為700 nm;NicompTM_380ZLS粒度測定儀,美國粒度分析儀器(Particle Sizing Systems)公司。
同時還可將包載丹參酮IIA藥物的納米遞送載體制備成不同類型的膠囊劑、片制劑、丸劑、散劑、顆粒劑、滴丸劑和膜劑等。實施例4:納米粒體外藥物釋放的測定。選用透析法來作為體外藥物釋放實驗的測試方法。主要的操作步驟是:量取按實施例 I 的配比的 TSIIA、TSIIA-mPEG-PLGA-PLL 和 TSIIA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD 各 3 份，每份lml，分別加2 ml的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)分散均勻，裝置于預先處理好的透析袋中，扎緊透析袋兩端，懸浮于具塞錐形瓶中，錐形瓶中加入18 ml PBSCpH 7.4)，將其置于SHA-C型恒溫水浴振蕩器中(溫度為37 1:，120次/分鐘持續振蕩)。再分別于1、2、3、4、6、16、24、48、72、96、120、144、168、192 h取樣，每次吸取透析袋外溶液2 ml，隨后立即補入溫度為37°〇的PBS溶液2 ml。將取出的2 ml溶液于紫外分光光度儀298 nm處測定吸收度，根據標準曲線方程計算溶液中的TSIIA濃度和累積釋放量，以累積釋放藥物的百分率(％)對時間(h)作圖，繪制釋藥曲線。通常高分子材料制備的載藥納米粒，其釋放藥物的速度主要受高分子骨架材料降解的速度影響，體外藥物釋放曲線如圖3所示，載藥納米粒隨著時間的延長能夠將藥物逐步釋放出來,TSIIA-mPEG-PLGA-PLL和 TSIIA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD 納米粒在 120 h 累積釋放量分別為72.26%和98.46%ο實施例5:TSI IA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD 納米粒(粒徑為 100_400nm)對 H印G2 肝癌細胞的細胞攝取。羅丹明B (Rb)被用做熒光探針包裹于納米粒中制備出Rb-TSIIA-mPEG-PLGA-PLL和Rb-TSIIA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒，以便來觀察納米粒的細胞攝取。將H印G2細胞和HUVECs鋪共聚焦培養皿，每孔細胞的密度為4X IO6個，0.5 ml培液，在37 °C, CO2體積分數為5%的細胞培養箱中培養過夜，待細胞貼壁后，去除培養液。分別在不同孔中加入含等量 Rb-TSIIA-mPEG-PLGA-PLL 和 Rb-TSIIA-mPEG- PLGA- PLL-cRGD 納米粒的培養液 0.2ml, 37 °〇細胞培養箱中·繼續培養2 h。吸取出培養液，加入4 %多聚甲醛固定20min，用PBS漂洗3次，之后用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)培養10 min，漂洗3次。之后于激光共聚焦顯微鏡下觀察攝入到細胞中納米粒的分布情況。上述實驗進行避光操作。如圖4A和圖4B所示(Die為微分干涉顯微觀察)，用Rb-TSIIAiPEG-PLGA-PLL納米粒(A組)培養的HUVECs的熒光強度，要明顯低于用Rb-TSIIA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒(B組)培養的HUVECs的熒光強度，這證明Rb-TSIIA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒的細胞攝取效率要明顯高于Rb-TS 11 A-mPEG-PLGA-PLL納米粒。主要原因是由于Rb-TSIIA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒可能通過主動結合HUVECs表達的整合素ανβ3，進而來提高靶向效率，而Rb-TS II A-mPEG-PLGA-PLL納米粒通常則是被動的通過細胞吞噬而被攝取細胞，因此Rb-TS II A-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒的細胞攝取效率要高于 Rb-TSIIA-mPEG-PLGA-PLL 納米粒。表明 TSIIA-mPEG-PLGA-PLL 和TSII A-mPEG-PLGA-PLL-cRGD載藥納米粒能有效提高TSIIA的細胞毒性，這將有助于提高腫瘤治療的效果。實施例6:mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒(粒徑為100_300nm)對荷H印G2肝癌裸鼠的靶向成像。1.!fepG2裸鼠肝腫瘤模型的建立。
(I)制備人肝癌細胞株!fepG2細胞懸液。人肝癌細胞株H印G2細胞復蘇后，穩定傳代2-3次。取處于對數生長期的細胞，常規胰蛋白酶消化制備單細胞懸液。臺盼蘭染色，活細胞比率> 95%，用生理鹽水重懸細胞，計數調整細胞濃度為I X 107/ml。(2)細胞接種。取4-6周齡BALB/C nu/nu裸鼠6只，體重20g±2g，雄性。常規消毒裸鼠背部近右上肢皮膚。用Iml微量注射器及23號針頭吸取人肝癌細胞株H印G2單細胞懸液。確定針頭位于裸鼠右側近前肢皮下后，注入0.2ml制備好的單細胞懸液，細胞數約為2X106。術畢酒精棉球壓迫穿刺點半分鐘。隔離鼠籠內SPF條件下，恒溫恒濕飼養。(3)組織塊接種。經過5-7天的潛伏期后，可見接種部位逐漸長大，待裸鼠皮下腫瘤生長至1-1.2cm時進行手術，選擇腫瘤生長旺盛且無潰破的荷瘤裸鼠，脫頸椎處死，皮膚予1%碘伏、75%酒精消毒，小心用眼科剪剪開皮膚。沿移植瘤包膜小心剝離皮下腫瘤組織。將剝離的移植瘤塊于無菌條件下，生理鹽水沖洗凈表面的血污，去除壞死組織和纖維組織。取腫瘤邊緣的新鮮的腫瘤組織，用眼科剪剪成約ImmX ImmX Imm大小的組織塊備用。取4-6周齡BALB/C nu/nu裸鼠用0.6%的戊巴比妥鈉2-3ml行腹腔注射麻醉，手術野皮膚消毒，取左肋緣下切口，長約1cm，逐層入腹，顯露肝左葉，用尖的彎血管鉗將肝左葉包膜下隧道，將瘤塊接種人肝包膜下，并用8-0的外科無創縫線縫合固定。仔細檢查無活動性出血后，5-0絲線全層關腹，術后不禁飲食。2.活體靶向熒光成像實驗。HepG2裸鼠 肝腫瘤模型建模成功后，隨機平均分為以下兩組:(A)Rb-mPEG-PLGA-PLL NPs, (B) Rb-mPEG-PLGA-PLL-RGD NPs。采取尾靜脈注射Rb-mPEG-PLGA-PLL和Rb-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒，整個實驗過程注射一次，各組動物的飼養條件完全相同，各組動物體重無差異。荷SW620腸癌小鼠在活體靶向熒光成像之前，均先注射麻醉劑，使之處于麻醉狀態，用LB983型動物活體成像儀分別在4h和32 h進行活體革巴向突光成像。羅丹明B (Rb)被作為熒光探針包裹于納米粒中以便來觀察納米粒的靶向腫瘤情況。納米粒被尾靜脈注入荷瘤裸鼠后，分別于4h和32h成像。如圖5A和圖5B所示，注射納米粒 4h 后，與 Rb-TSIIA-mPEG-PLGA-PLL 納米粒相比，注射 Rb-TSIIA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒的荷瘤裸鼠腫瘤部位的熒光強度要強，但差別不明顯。注射納米粒24 h后，注射Rb-TS 11 A-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒的荷瘤裸鼠腫瘤的熒光強度逐漸增強。而且Rb-TSI I A-mPEG-PLGA-PLL 納米粒相比，注 Rb-TSIIA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD 納米粒的荷瘤裸鼠腫瘤部位顯示出較高的熒光強度，這表明Rb-TSIIA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒能更有效地靶向腫瘤。提示本專利所用的mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒遞送載體能有效的將藥物遞送到腫瘤部位。實施例7 =TSI I A-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒的細胞毒性。CKK-8比色法觀察納米粒的細胞毒性，取生長密度為5 X 104/ml的HUVECs鋪96孔板，100 μ I/孔，常規培養過夜，吸棄培養基，分別加入不同濃度的TSIIA，TSIIA-mPEG-PLGA-PLL 和 TSIIA- mPEG-PLGA- PLL-cRGD 納米粒，并以新鮮培養基添補至200 μ I /孔，每組設3個復孔。對照組加入等體積新鮮培養液。實驗終止前Ih每孔加入CCK-8試劑20 μ 1，培養結束時以酶標儀檢測吸光度(Α450值)，計算H印G2肝癌細胞生存率。從圖6Α和圖6Β中可以看出，隨著濃度的增力口，mPEG-PLGA-PLL和mPEG-PLGA-PLL-cRGD空白納米粒的細胞生存率在96%到90%之間，無明顯變化，表明其基本無毒性。與TSIIA相比，載TSIIA納米粒的細胞毒性明顯增加，表明TSIIA-mPEG-PLGA-PLL和TSIIA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD載藥納米粒能有效提高TSIIA的細胞毒性，這將有助于提高腫瘤治療的效果。實施例8 =TSI I A-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒對裸鼠肝癌瘤體生長的影響。1.HepG2裸鼠肝腫瘤模型的建立(具體方法見實施例6)。2.丹參酮IIA對裸鼠人肝癌抑制作用實驗分組和給藥。裸鼠接種后約14天，選擇腫瘤平均大小為0.5X0.5cm左右，腫瘤生長良好，無自發性出血壞死、瘤周無感染病灶的荷瘤裸鼠為實驗模型。將荷瘤鼠隨機分為4組:每組12只，組內編號。Gl 生理鹽水組(NS，13.5 ml/kg), nl=12。G2 TSIIA 組(含藥 lmg/kg)，n2=12。G3 TSIIA-mPEG-PLGA-PLL 納米組(含藥 I mg/kg)，n3=12。G4 TSII A-mPEG-PLGA-PLL-cRGD 納米組(含藥 I mg/kg)，n4=12。尾靜脈注射,每組12只，每次0.5ml, I次/天,連續給藥7天。3.療效觀察。腫瘤生長率:各組6只裸鼠于治療后第8天處死，測量腫瘤長徑(a)和短徑(b)，按公式V=ab2/2計算腫瘤體積，根據治療前后的腫瘤體積比計算腫瘤生長率(Growthrates, GR)。GR =治療后的腫瘤體積/治療前的腫瘤體積。經方差分析治療后各組瘤體重量有顯著性異(F=354.047，P>0.01)。與生理鹽水組相比:丹參酮IIA組、丹參酮IIA各納米粒組瘤體均明顯縮小。提示丹參酮IIA以納米的劑型給藥療效明顯提高。且載藥納米粒經過RGD修飾后瘤體重量明顯減輕、腫瘤生長抑制率明顯提高(P < 0.01)。參見圖7。實施例9 =TSI I A-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米粒對肝癌裸鼠生存時間的影響。
1.HepG2裸鼠肝腫瘤模型的建立(具體方法見實施例6)。2.丹參酮IIA對裸鼠人肝癌抑制作用實驗分組和給藥(具體方法見實施例8)。3.生存時間觀察。生存時間:各組隨機取6只大鼠治療后次日起觀察生存天數，并以生理鹽水組為對照組計算生命延長率(％)。生命延長率(％)=(治療組平均存活天數-對照組平均存活天數)/對照組平均存活天數X100%。治療后各組荷瘤裸鼠平均生存時間有顯著差異(F=50.1984，P〈0.01)，參見圖8。與生理鹽水組相比，施藥治療各組裸鼠生存時間均明顯延長(P〈0.01)。丹參酮IIA組生存時間與各納米組相比有顯著性差異(P〈0.01)。RGD修飾的丹參酮IIA多級靶向納米組與其他各組相比有顯著性差異。 實施例10:TSIIA-mPEG-PLGA-PLL-cR⑶納米粒對肝癌裸鼠腫瘤壞死程度的比較。
1.HepG2裸鼠肝腫瘤模型的建立(具體方法見實施例6)。2.丹參酮IIA對裸鼠人肝癌抑制作用實驗分組和給藥(具體方法見實施例8)。3.瘤體壞死程度觀察。腫瘤壞死程度各組取6只裸鼠于治療后第8天處死，完整切取處死的小鼠瘤塊，置10%福爾馬林液中固定，常規石蠟包埋，取瘤體最大剖面作2 3處病理切片，HE染色，光鏡下，根據壞死組織所占整個瘤體面積的比例分為三度:輕度(O 30%)、中度(31% 70%)及重度(71% 100%),比較各組腫瘤壞死程度。治療后病理結果顯示，生理鹽水組腫瘤以輕度壞死為主，丹參酮IIA組腫瘤以中度壞死為主，丹參酮IIA多級靶向納米粒組腫瘤以中度壞死及重度壞死為主，RGD修飾的丹參酮IIA多級靶向納米粒組腫瘤以重度壞死為主，腫瘤壞死程度顯著重于其他各組(Ρ〈0.01)。參見圖9Α 圖9D。在本發明中，以mPEG-PLGA-PLL為基礎材料經過纈氨酸-精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸-谷氨酸環肽的修飾成為纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸聚合物(簡稱mPEG-PLGA-PLL-cRGD)，然后將丹參酮IIA (TSIIA)包裹在mPEG-PLGA-PLL-cRGD聚合物中形成以載TSIIA的纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽(VRGDG，cRGD)修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(TSIIA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD)納米給藥系統，該系統將能夠有效的降低TSIIA的毒性，增強其靶向性。納米給藥系統的靶向能力是將藥物準確遞送至靶點并取得良好治療效果的關鍵。TSIIAe-mPEG-PLGA-PLL-cRGD納米給藥系統可以很好的解決這個問題。研制的納米載體系統直徑可保持在10 — 500 nm。因為正常組織周圍的血管沒有縫隙，而腫瘤組織周圍的血管有100納米左右的縫隙，所以納米粒子就會從這些縫隙中滲透出來，并利用增強的滲透保留效應聚集于腫瘤部位 ，然后攻擊癌細胞，但不會損害正常細胞，從而達到被動靶向的效果。納米粒上的cRGD靶向基團可以與靶點特異性結合，具有受體介導的靶向給藥系統形成的主動靶向效應，使丹參酮IIA抗腫瘤藥物比較準確送到腫瘤細胞中，實現惡性腫瘤的靶向治療。采用本發明所設計的以纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽(VRGDG，cRGD)修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸(mPEG-PLGA-PLL-cRGD)聚合物為載體，以丹參酮IIA(TSIIA)為模型藥制備的TSIIA-mPEG-PLGA-PLL的納米給藥系統將具有良好的靶向遞送能力和治療效果。同種藥物使用不同的藥物載體所制備出的藥物劑型，由于其應用的不同，所以載體材料的選擇、制備方法也有相應不同。比如，另一種丹參酮IIA的載藥系統，丹參酮IIA聚乳酸納米粒則主要是靜脈給藥，進入血液循環后可能經肝臟網狀內皮系統(RES)攝取，聚集在RES豐富的肝臟部位，可以使肝臟部位的藥物濃度大大增加，從而起到被動靶向的作用，所以制備的納米藥物在粒徑、藥物包封率、載藥率等方面有其一定的要求。而本發明的丹參酮II A-聚乳酸/羥基乙酸微球主要應用于肝動脈栓塞給藥，是利用數字減影血管造影(DSA)下肝動脈給藥，利用微球的栓塞性及緩釋性，所以藥物微球在粒徑、藥物包封率、載藥率等方面于丹參酮II A聚乳酸納米粒不同，這都決定了整個制備過程如載體材料的選擇、制備方法的不同，所以不同種藥物劑型，都是利用其各自的特點而應用于肝癌的治療。
盡管本發明的內容已經通過上述優選實施例作了詳細介紹，但應當認識到上述的描述不應被認為是對本發明的限制。在本領域技術人員閱讀了上述內容后，對于本發明的多種修改和替代都將是顯而易 見的。因此，本發明的保護范圍應由所附的權利要求來限定。
權利要求
1.一種載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其特征在于，所述的納米給藥系統是以纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸的聚合物作為載體的載丹參酮IIA的納米粒； 所述的納米給藥系統的制備方法包含: 步驟I，制備纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸:在室溫下于N，N’ -羰基二咪唑和二甲亞砜的混合有機溶劑中，使摩爾比為1-60:1-60的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸與纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽攪拌反應3-48 h，反應產物在水中進行透析，所使用的透析袋截留分子量為1000-10000，然后在凍干機上0-60°C溫度下凍干1-72 h，低溫干燥保存； 步驟2，纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸 和丹參酮IIA摩爾比為1-60:1-60時，將二者混合于溶劑中，通過機械攪拌、超聲或高壓乳勻乳化制成納米粒。
2.如權利要求1所述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其特征在于，所述納米粒的直徑為10-2000 nm ;作為載體的所述聚合物的分子量為1.5X 103-9.5X 106。
3.如權利要求1所述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其特征在于，所述的丹參酮IIA和載體聚合物的摩爾比為1-60:1-60 ； 所述聚合物中乳酸和羥基乙酸摩爾比為1-80:1-80，羥基乙酸和賴氨酸摩爾比為90-50:10-50,聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸和纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽摩爾比為1-60:1-60。
4.如權利要求1所述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其特征在于，所述的步驟I的反應過程在氮氣保護下進行。
5.如權利要求1所述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其特征在于，步驟2所述的纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸和丹參酮IIA均為水溶液，摩爾濃度分別為0.001-10000 μ M和0.001-10000 μ Mo
6.如權利要求5所述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其特征在于，所述的步驟2是通過復乳法、薄膜乳化法、透析法、乳化蒸發法、界面沉淀法或自組裝法中的任意一種制備納米粒； 所述的復乳法為:取纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸溶于有機溶劑中，加入丹參酮IIA溶液，超聲乳化，再加入水分散介質中，再次超聲乳化；然后在室溫下攪拌0.5-5 h，揮發除去有機溶劑； 所述的薄膜乳化法為:取纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸和丹參酮IIA溶于有機溶劑中，旋轉蒸發成膜，然后加入水中，室溫下攪拌0.5-6 h ； 所述的透析法為:取纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸溶于有機溶劑中，加入丹參酮IIA，將攪拌均勻的溶液在攪拌的條件下滴入水中，然后將溶液裝入透析袋中透析3-72h，除去有機溶劑； 所述的乳化蒸發法為:取纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸和丹參酮IIA溶于有機溶劑中，再加入水分散介質中，超聲或高壓乳勻乳化，然后在室溫下攪拌2-4 h，揮發除去有機溶劑； 所述的界面沉淀法為:取纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸和丹參酮IIA藥物溶于有機溶劑中，在不斷的攪拌條件下，將上述溶液加入水分散介質中，加壓揮發除去有機溶劑； 所述的自組裝法為:取纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸溶于水中，加入丹參酮IIA，再將攪拌均勻的溶液在攪拌的條件下滴入水中，然后將溶液裝入透析袋中透析3-72h。
7.如權利要求6所述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其特征在于，所述的水分散介質為添加表面活性劑的水溶液，所述的表面活性劑包含右旋糖苷40-70、普朗尼克F68或聚乙烯醇，其濃度為0.01-10% w/v。
8.如權利要求6所述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，其特征在于，所述的有機溶劑包含乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇、二甲亞砜中的任意一種或兩種的混合。
9.一種如權利要求8中任意一項的方法制備的載丹參酮IIA的納米給藥系統的用途，其特征在于，該納米給藥系統用于制備能夠進行長循環、生物降解、緩控釋、被動靶向、主動靶向、運送活性物質的抗腫瘤藥物。
10.如權利要求9所述的載丹參酮IIA的納米給藥系統的用途，其特征在于，所述的藥物能夠制備成凍干劑，所用的凍干支架劑包含海藻糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、右旋糖苷、山梨醇、甘露醇或聚乙二醇， 支架劑的含量為0.01-20% w/v。
全文摘要
本發明公開了一種載丹參酮IIA的納米給藥系統的制備方法，包含步驟1，制備纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸；步驟2，纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸和丹參酮IIA摩爾比為1-60:1-60時，制備載丹參酮IIA的纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸環肽修飾的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸羥基乙酸-聚賴氨酸納米粒。本發明還提供了該方法制備的載丹參酮IIA的納米給藥系統的用途。本發明提供的方法制備的載丹參酮IIA的納米給藥系統，能夠有效的降低丹參酮IIA的毒性，增強其靶向性和治療效果。
文檔編號A61K9/00GK103110567SQ20131007639
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月11日 優先權日2013年3月11日
發明者王炎, 李琦, 朱惠蓉, 秦建民, 范忠澤, 周利紅, 陳紅宇, 宋大遷, 葉乃菁 申請人:上海中醫藥大學附屬普陀醫院