用于治療癌癥的針對密蛋白-18的單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】本發明提供抗體，所述抗體可作為治療劑用于治療和/或預防與表達CLD18的細胞相關的疾病，包括腫瘤相關疾病，如胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌。
【專利說明】用于治療癌癥的針對密蛋白-18的單克隆抗體
[0001]本申請是申請號為200680043664.X的中國專利申請的分案申請，原申請是國際申請PCT/EP2006/011302的中國國家階段申請。
【技術領域】
[0002]與常規藥物相比，基于抗體的癌癥療法具有較高特異性和較低副作用譜的潛力。其原因為抗體對正常細胞及贅生性細胞的精確區分以及以下事實，即其作用模式依賴于毒性較少的免疫學抗腫瘤機制，例如補體活化和細胞毒免疫細胞的募集。
[0003]基于抗體的療法的靶標必須具有特定的性質，這形成了正確區分正常細胞及贅生性細胞的基礎。顯然，排他性地局限在腫瘤細胞中并且在正常組織中完全檢測不到的靶標對于開發高效且安全的抗體療法而言是很理想的。另一方面，高水平的過表達也可以是治療窗和低副作用的基礎，例如由于基因擴增而成為抗體曲妥珠單抗(trastuzumab,赫塞汀)優良靶標的2型人表皮生長因子受體(HER-2)。
【背景技術】
[0004]已獲批準或正在臨床開發的用于腫瘤療法的抗體的其他靶標具有不基于靶分子在腫瘤細胞中數量上過表達的獨特性質。對于針對蛋白聚糖MUC-1的抗體，靶標主鏈中的肽重復表位在腫瘤細胞中是低糖基化的，從而改變成其正常狀態的對應物(counterpart)。對于針對CD20 (利妥昔單抗(rituximab))、CD52 (Campath-1H)和CD22 (依帕珠單抗(epratuzumab))的抗體,抗體祀標在腫瘤細胞和正常淋巴細胞中的表達水平相當。這種情況下，抗體對正常細胞的去除是可以容忍的，因為靶標陰性的干細胞恢復了正常的淋巴細胞譜。抗體祀標差異性可接近性的其他實例為癌胚抗原(carcinoembryonal antigen, CEA)和碳酸酐酶IX(carboanhydrase IX, CA9)。這兩種抗原分別在結腸和腎的正常上皮中表達。然而，經放射性標記的成像 抗體確實良好區分了腫瘤及正常組織，而且細胞毒性抗體可以良好地容忍。這很可能是由于CA9和CEA在正常上皮組織中限制性表達在IgG抗體無法接近的腔側。上皮細胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule, Ep-CAM)這種抗原也屬于這一類別。作為上皮細胞的同型細胞粘附分子，它定位于在細胞間隙中。有意思的是，盡管高親和力抗Ep-CAM抗體毒性極高，但中間親和力的抗體卻是良好容忍的。這提示了 Ep-CAM靶標在正常細胞上的可接近性，但也表明抗體結合動力學為治療提供了可能。
[0005]一種可能性是涉及細胞/細胞粘附的其他上皮細胞特異性蛋白質對于抗體方法也有意義，因為它們在正常結構的上皮中幾乎無法接近抗體，但在腫瘤細胞中卻暴露出來。因此，我們對參與組織上皮組織結構的蛋白質作為治療性抗體靶標的適用性進行了分析。一種特別吸引我們注意力的蛋白質是密蛋白18(claudinl8)。
[0006]密蛋白18 (CLD18)分子(Genbank 登記號:剪接變體 I (CLD18A1):NP_057453、NM016369,以及剪接變體 2 (CLD18A2):ΝΜ_001002026、ΝΡ_001002026)是分子量約為27，9/27，72kD的內在跨膜蛋白。密蛋白是位于上皮和內皮的緊密連接中的內在膜蛋白。緊密連接在相鄰細胞之間組織膜內顆粒互聯鏈的網。在緊密連接中，閉合蛋白(occludin)和密蛋白是最主要的跨膜蛋白組分。由于其強胞間粘附特性，它們產生了防止和控制溶質的細胞旁轉運并限制膜脂和蛋白質側向擴散以維持細胞極性的一級屏障。形成緊密連接的蛋白質關鍵性地參與了組織上皮組織結構。我們推測，這些蛋白質在構造良好的上皮中幾乎無法接近抗體，但在腫瘤細胞中則變得暴露出來。
[0007]CLD18是一種四次跨膜蛋白，因此具有四個疏水區。我們得出的數據表明CLD18展示若干不同構象，這些構象可被抗體選擇性尋址。一種構象(CLD18-構象-1)顯示，全部四個疏水區均作為常規跨膜區(transmembrane domain, TM),并形成兩個胞外環(環I由疏水區I和疏水區2環繞而成；環2由疏水區3和疏水區4環繞而成)，像對絕大多數密蛋白家族成員所描述的那樣。另一種構象(CLD18-構象-2)顯示，像對另一四次跨膜家族成員PMP22所描述的那樣(Taylor等，J.Neurosc.Res.62:15-27，2000)，第二個和第三個疏水結構域不完全跨過質膜，從而第一個和第四個跨膜結構域之間的部分(環D3)在胞外。第三種構象(CLD18-構象-3)顯示了由作為常規跨膜結構域的被第一個和第四個疏水區所環繞具有兩個內部疏水區的大胞外結構域。由于環D3中存在經典的N-糖基化位點，密蛋白-18的拓撲學變體CLD18拓撲-2和CLD18拓撲-3帶有額外的胞外N-糖基化位點。
[0008]兩種不同剪接變體的存在給CLD18分子增添了另一層水平上的復雜性，這兩種變體描述于小鼠和人中(Niimi，Mol.Cell.Biol.21:7380-90, 2001)。剪接變體 CLD18A1 和CLD18A2在包括第一個TM和環I的N端前21個氨基酸中存在差異，而C端的一級蛋白質序列相同。
[0009]CLD18A1在正常肺和胃的上皮中選擇性表達，而CLD18A2僅在胃細胞中表達(Niimi, Mo 1.Cell.Biol.21 =7380-90,2001)。最重要的是，CLD18A2 局限在已分化的胃上皮短壽細胞中，但在胃干細胞區中不存在。我們使用靈敏的RT-PCR顯示，兩種變體在任何其他正常人器官中均完全檢測不到，但在若干癌癥類型中強烈表達，包括胃、食管、胰腺和肺的腫瘤以及人癌癥細胞系。表達主要是在這些適應癥的腺癌亞型中。
[0010]該蛋白質的分子量在一些癌癥和鄰近的正常組織中存在差異。在健康組織中觀察到的較高分子量的蛋白質可以通過用去糖基化化合物PNGase F處理組織裂解液而轉變成與癌癥中所觀察到相同的分子量。這提示與其正常組織對應物相比，CLD18在癌癥中N-糖基化較少。這種結構差異很可能產生改變的表位。經典的N-糖基化基序在該分子環D3結構域的116位氨基酸中。
[0011]本發明的術語“CLD18”和“CLD18變體”應包括(i)CLD18剪接變體；(ii)CLD18N糖基化變體；(iii)CLD18構象變體；(iv)位于胞間緊密連接中的游離CLD18和同型/異型相連變體以及(v)CLD18的癌癥相關變體和CLD18非癌癥細胞相關變體。
[0012]CLD18的分子特征和功能特征使得該分子對基于抗體的癌癥療法非常有意義。特別是(i)絕大多數毒性相關正常組織中不存在CLD18 ;(ii)CLD18A2變體的表達局限在作為已分化胃細胞的可分散細胞群體中，這些細胞可由靶標陰性的胃干細胞進行補充；(iii)正常及贅生性細胞之間潛在差異性糖基化的線索；(iv)不同構象拓撲學情況的存在。此外，CLD18作為緊密連接蛋白的作用可能進一步促成良好的治療窗。由于腫瘤細胞表達密蛋白，但經常不像正常上皮組織中可見的那樣通過密蛋白的同型和異型相關聯形成經典的緊密連接，因此腫瘤細胞具有適用于胞外抗體結合及免疫療法的可觀的游離密蛋白庫。有可能在健康上皮中密蛋白的結合表位被屏蔽在緊密連接中，使這些抗體無法接近。[0013]本發明的一個目的是提供可用于治療其中有CLD18表達的疾病(例如腫瘤疾病)的抗體。本文所述抗體還可用于診斷這些疾病 。
【發明內容】
[0014]本發明一般地提供抗體，所述抗體可用作治療劑用于治療和/或預防與表達CLD18的細胞相關的疾病，包括腫瘤相關疾病，如胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌。
[0015]本發明的一個方面涉及能夠結合CLD18并介導殺傷表達CLD18的細胞的抗體。優選地，該抗體與CLD18A1和CLD18A2結合，更優選地，該抗體與CLD18A2結合但不與CLD18A1結合。優選地，本發明的抗體與CLD-構象-1的環I或環2結合并對其具有特異性。在另一優選實施方案中，本發明的抗體與CLD-構象-2的環D3結合并對其具有特異性，特別是與環D3中116位的N糖基化位點處或其周圍結合。在另一實施方案中，本發明的抗體對環D3中116位潛在N糖基化位點未發生糖基化的形式具有特異性。
[0016]本發明抗體對細胞的殺傷優選通過該抗體與所述細胞所表達的CLD18結合來誘導，更優選通過該抗體與所述細胞所表達的CLD18A2結合來誘導。在一個實施方案中，本發明抗體與所述細胞所表達的CLD18A1的結合不誘導殺傷所述細胞。
[0017]所述表達CLD18的細胞優選為癌細胞，特別是選自致瘤性的胃、食管、胰腺、肺、卵巢、結腸、肝、頭頸和膀胱的癌細胞。
[0018]優選地，本發明抗體通過誘導補體依賴性細胞毒性(CDC)介導的裂解、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)介導的裂解、凋亡、同型粘附和/或吞噬作用來介導對細胞的殺傷，優選通過誘導CDC介導的裂解和/或ADCC介導的裂解來介導對細胞的殺傷。
[0019]在一個實施方案中，本發明的抗體不誘導CDC介導的細胞裂解。
[0020]優選地，ADCC介導的細胞裂解在效應細胞存在時發生，所述效應細胞在具體實施方案中選自單核細胞(monocyte)、單個核細胞(mononuclear cell)、NK細胞和PMN,吞卩遼作用是通過巨噬細胞來實現。
[0021 ] 本發明的抗體可以是單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體或人源化抗體或者是抗體片段，并且可選自 IgGl、IgG2 (優選 IgG2a 和 IgG2b)、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、分泌性 IgA、IgD和IgE抗體。
[0022]根據本發明的所有方面，CLD18優選為人CLD18，優選人CLD18A2，并且CLD18A2優選具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，CLD18A1優選具有SEQ ID NO:8的序列。
[0023]在一個特別優選的實施方案中，本發明的抗體與活細胞表面上存在的CLD18的天然表位結合。在另一優選的實施方案中，本發明的抗體對癌細胞(優選胃癌細胞)具有特異性。
[0024]在本發明的某些實施方案中，CLD18表達于細胞表面。
[0025]本發明的抗體可通過包括以下步驟的方法獲得:用具有選自SEQ ID NO:2、4、6、16、18、20、21-23和26-31的氨基酸序列的蛋白質或多肽或其免疫原性片段或者表達所述蛋白質或多肽或其免疫原性片段的核酸或宿主細胞免疫動物。優選地，本發明的抗體對上述蛋白質、多肽或其免疫原性片段具有特異性。
[0026]在一個特別優選的實施方案中，本發明的抗體通過登記號為 DSMACC2 7 37 ( 1 82-D 1 1 06-055)、DSM A CC2 7 38 (I 82-D I I O 6 - O 56)、DSMACC2739 (182-D1 106-057)、DSM ACC2 7 40 ( 1 8 2 -D 1 1 0 6-0 58)、DSMACC2 74 1 ( 1 8 2-D 1 1 06-0 59 )、DSM ACC2 7 42 ( 1 8 2 -D 1 1 06 -0 6 2)、DSMACC2743(182-D1106-067)、DSM ACC2745(182-D758-035)、DSMACC2746(182-D758-036)、DSM ACC2747 (I 82-D758-040)、DSMACC2748 (182_D1 106-061)、DSMACC2808 (182-D1106-279)、DSMACC2809 (182-D1106-294)或 DSM ACC2810 (182-D1106-362)的克隆來產生。
[0027]在一個實施方案中，本發明的抗體與治療劑如毒素、放射性同位素、藥物或細胞毒劑偶聯。
[0028]本發明的另一方面涉及能產生本發明抗體的雜交瘤。優選雜交瘤的登記號為 DSM ACC2737 (182-D1106-055)、DSM ACC2738 (182-D1106-056)、DSMACC2739(182-D1106-057)、DSM ACC2740(182-D1106-058)、DSM ACC2741(182-D1106-059)、DSM ACC2742 (182-D1 106-062)、DSM ACC2743 (I 82-D I I O 6-O 67)、D SMACC2745(182-D758-035)、DSM ACC2746(182-D758-036)、DSM ACC2747(182-D758-040)、DSMACC2748(182-D1106-061)、DSM ACC2808(182-D1106-279)、DSM ACC2809(182-D1106-294)或DSM ACC2810(182-D1106-362)。
[0029]本發明的抗體在本文中通過參考該抗體的命名(如182-D758-035)和/或通過參考產生該抗體的克隆(如26D12)來命名。
[0030]本發明還涉及包含本發明抗體和/或其與治療劑的綴合物以及可藥用載體的藥物組合物。
[0031]本發明的另一方面涉及殺傷表達CLD18(優選CLD18A2)和/或抑制其生長的方法，包括使細胞接觸有效量的本發明抗體和/或其與治療劑的綴合物。CLD18優選在所述細胞的表面表達。
[0032]本發明的另一方面涉及治療或預防與表達CLD18(優選CLD18A2)的細胞相關的疾病或病癥的方法，包括對受試者施用本發明的抗體、其與治療劑的綴合物或者包含本發明抗體或其與治療劑的綴合物的藥物組合物。優選地，所述疾病或病癥為腫瘤相關疾病，在具體實施方案中選自胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌。CLD18優選在所述細胞的表面表達。
[0033]優選地，本發明的抗體能夠區分不同細胞類型(包括癌細胞和非惡性細胞)所表達的CLD18變體。在一個特別優選的實施方案中，本發明的抗體能夠與CLD18A2結合，但不與CLD18A1結合，或者與CLD18A1結合的特異性低于與CLD18A2的結合特異性。
[0034]本發明的術語“結合”優選涉及特異性結合。“特異性結合”指試劑(如抗體)與其特異性靶標(如表位)的結合強于與其他靶標的結合。如果試劑與第一種靶標結合的解離常數(Kd)低于與第二種靶標的解離常數，則其與第一種靶標的結合強于與第二種靶標的結合。優選地，試劑特異性結合的靶標的解離常數(Kd)低于該試劑非特異性結合的靶標的解離常數(Kd)的1/10以下，優選1/20以下，更優選1/50以下，甚至更優選1/100、1/200、1/500 或 1/1000 以下。
[0035]本發明的抗體通過結合CLD18(優選表達在所述細胞表面)介導殺傷表達CLD18(優選表達CLD18A2)的細胞。在一個實施方案中，本發明的抗體誘導補體依賴性細胞毒性(⑶C)，如CLD18表達細胞發生至少約20-40%⑶C介導的裂解，優選約40-50%⑶C介導的裂解，更優選高于50%⑶C介導的裂解。這樣的抗體在本文中通過以下抗體進行示例:37H8、38G5、38H3、39F11、61C2、26B5、26D12、28D10、163E12、175D10、45C1、125E1、 ch_163E12和ch-175D10。作為誘導CDC的替代或補充，本發明的抗體可在效應細胞(如單核細胞(monocyte)、單個核細胞(mononuclear cell)、NK細胞和PMN)存在下誘導CLD18表達細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。這樣的抗體在本文中通過以下抗體進行示例:37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、43A11、61C2、26B5、26D12、28D10、42E12、163E12、175D10、45C1 和125E1。本發明的抗體可具有以下能力:誘導CLD18表達細胞的凋亡、誘導CLD18表達細胞的同型粘附和/或在巨噬細胞存在下誘導CLD18表達細胞的吞噬作用。本發明的抗體可具有一種或多種上述功能特性。優選地，本發明的抗體誘導CLD18表達細胞的CDC介導的裂解和ADCC介導的裂解，更優選誘導CLD18表達細胞的ADCC介導的裂解，而不誘導所述細胞⑶C介導的裂解。本發明抗體的示例性靶細胞包括但不僅限于表達CLD18 (優選CLD128A2)的癌細胞，如致瘤性的胃、胰腺、食管和肺的癌細胞。在一個具體的優選實施方案中，本發明抗體介導的細胞殺傷是CLD18A2特異性的，即本發明抗體介導殺傷(優選CDC和/或ADCC介導的細胞裂解)表達CLD18A2的細胞，但是不介導殺傷表達CLD18A1而不表達CLD18A2的細胞。上述抗體可在例如以下癌癥的治療或預防中用于介導殺傷腫瘤細胞:胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌。
[0036]本發明的抗體可根據其結合特性及其介導效應子對CLD18表達細胞的功能的能力分類到不同類別中。本發明抗體可根據以下特征分類:
[0037].對表達CLD18A1或CLD18A2的細胞的結合特性和/或介導的效應子對所述細胞的功能(區分CLD18剪接變體)，
[0038].對表達糖基化或非糖基化CLD18變體的細胞的結合特性和/或介導的效應子對所述細胞的功能(區分有無N糖基化的CLD18變體)，
[0039].對癌細胞或正常細胞類型的細胞的結合特性和/或介導的效應子對所述細胞的功能(區分腫瘤細胞表達的或正常細胞表達的CLD18變體)，
[0040].對被緊密連接的形成所屏蔽的CLD18表位的結合特性，
[0041].對活細胞誘導CLD18聚集體形成的能力，和
[0042].與非人CLD18變體特別是來自小鼠、大鼠、兔和靈長類的CLD18結合的能力。
[0043]本發明的抗體具有一種或多種以下特性，其中給出本發明抗體(24H5、26B5、26D12、28D10、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、41C6、42E12、43A11、44E10、47D12、61C2、75B8、85A3、9E8、19B9、45C1、125E1、163E12、166E2、175D10、ch_43All、ch_45Cl、ch_125El、ch-163E12、ch-166E2、ch-175D10)的具體實例作為參考:
[0044]a)與 CLD18A2 以及 CLD18A1 結合(如 26D12、28D10、37H8、38H3、39F11、61C2 和41C6)
[0045]b)與 CLD18A2 結合但不與 CLD18A1 結合(如 26B5、37G11、38G5、42E12 和 43A11、45C1、125E1、163E12、166E2、175D10、ch_43All、ch_45Cl、ch_125El、ch_163E12、ch_166E2、ch-175D10)
[0046]c)與腫瘤細胞天然表達的CLD18結合但不與非癌細胞或組織(如胃和肺細胞)天然表達的 CLD18 結合(如 26B5、75B8、24H5、39F11、45C1、125E1、163E12、166E2、175D10)[0047]d)介導⑶C誘導的針對表達CLD18A2細胞的殺傷，而不針對表達CLD18A1的細胞(如 26D12、28D10、37H8 和 39F11、163E12、ch_125El、ch_163E12、ch_175D10)
[0048]e)介導 ADCC 誘導的對表達 CLD18 細胞的殺傷(如 26B5、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、43A11、47D12 和 61C2、ch_163E12、ch_175D10)
[0049]f)介導ADCC誘導的對表達CLD18細胞的殺傷，但不介導⑶C介導的殺傷(如37G1U42E12 和 43A11)
[0050]g)介導ADCC誘導的和CDC誘導的對表達CLD18A2細胞的殺傷(如37H8、38H3、39F11、ch-163E12、ch_175D10)。
[0051 ] 如本文所述示例的，本發明的抗體還包括以下分子，其
[0052]a)與已分化的正常胃細胞結合，但不與胃干細胞結合(如39F11)
[0053]b)不與正常胃組織以及其他正常器官結合，而是排他性地與癌細胞結合(如26B5)
[0054]c)與包含CLD18的116位非糖基化Ash的表位結合
[0055]d)與人及小鼠CLD18結合，使得可以在小鼠中充分進行臨床前毒性研究。
[0056]本發明的抗體可來自不同物種，包括但不僅限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。本發明的抗體還包括嵌合分子，其中來自一個物種(優選人)的抗體恒定區與來自另一物種的抗原結合位點組合。此外，本發明的抗體包括人源化分子，其中來自非人物種的抗體的抗原結合位點與人來源的恒定區和構架區組合。
[0057]本發明的抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體，并包括IgG2a(如IgG2a、κ、λ)、IgG2b (如IgG2b、κ、X)、IgG3(如IgG3、κ、λ)和IgM抗體。然而，本發明也包括其他抗體同種型，包括IgGl、IgAU IgA2、分泌性IgA、IgD和IgE抗體。所述抗體可以是完整抗體或其抗原結合片段，包括如Fab、F(ab' )2、Fv、單鏈Fv片段，或者是雙特異性抗體。此外，所述抗原結合片段包括包含以下部分的結合結構域免疫球蛋白融合蛋白:(i)與免疫球蛋白鉸鏈區多肽融合的結合結構域多肽(如重鏈可變區或輕鏈可變區)，(?)與該鉸鏈區融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區，和(iii)與該CH2恒定區融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區。這樣的結合結構域免疫球蛋白融合蛋白在US2003/0118592和US2003/0133939中有進一步公開。
[0058]本發明的抗體優選以約1-1OOnM或更小的解離平衡常數(Kd)與CLD18解離。優選地，本發明的抗體不與相關細胞表面抗原交叉反應，因此不抑制其功能。
[0059]在一些優選的實施方案中，本發明的抗體可通過一種或多種以下特性進行表征:
[0060]a)對CLD18的特異性，特別是對CLD18A2的特異性；
[0061]b)對CLD18特別是CLD18A2的結合親和性為約IOOnM或更小，優選約5_10nM或更小，更優選約1_3ηΜ或更小，
[0062]c)介導對⑶55/59陰性或⑶55/59陽性細胞的高水平⑶C的能力；
[0063]d)抑制表達CLD18的細胞生長的能力；
[0064]e)誘導表達CLD18的細胞凋亡的能力；
[0065]f)對表達CLD18的細胞誘導同型粘附的能力；
[0066]g)在效應細胞存在下對表達CLD18的細胞誘導ADCC的能力；
[0067]h)延長患有表達CLD18的腫瘤的受試者存活的能力；[0068]i)清除表達CLD18的細胞的能力；
[0069]j)清除表達低水平CLD18的細胞的能力，和/或
[0070]k)在活細胞表面聚集CLD18的能力。
[0071]本發明的抗CLD18抗體可進行衍生、連接或共表達以得到其它的結合特異性。在一個具體實施方案中，本發明提供雙特異性或多特異性分子，其包含至少一種對CLD18的第一結合特異性(如抗CLD18抗體或其模擬體)以及對效應細胞的第二結合特異性，如對Fe受體(例如Fe- Y受體，如Fe- Y RI或其他Fe受體)或T細胞受體(如CD3)的結合特異性。
[0072]因此，本發明包括與CLD18以及Fe受體或T細胞受體(如⑶3)均結合的雙特異性和多特異性分子。Fe受體的實例為IgG受體、Fe- Y受體(Fe- Y R)如Fe- y RI (⑶64)、Fe-YRII(CD32)和Fe-yRIII(CD16)。也可靶向其他Fe受體，如IgA受體(如Fca RI)。所述Fe受體優選位于效應細胞如單核細胞、巨噬細胞或活化單個核細胞的表面上。在一個優選的實施方案中，所述雙特異性和多特異性分子在Fe受體中不同于免疫球蛋白Fe(如IgG或IgA)結合位點的位點處與該受體結合。因此，所述雙特異性和多特異性分子的結合不被生理水平的免疫球蛋白所封閉。
[0073]在另一實施方案中，本發明的抗CLD18抗體與其他功能分子如其他肽和蛋白質(如Fab'片段)進行衍生、連接或共表達。例如，本發明的抗體可以與一種或多種其他分子實體功能性連接(例如通過化學偶聯、遺傳融合、非共價連接等)，所述分子實體例如其他抗體(如用于產生雙特異性或多特異性抗體)、毒素、細胞配體或抗原(如用于產生免疫綴合物，如免疫毒素)。本發明的抗體可以與其他治療部分連接，如放射性同位素、小分子抗癌藥物、重組細胞因子或趨化因子。因此，本發明包括多種抗體綴合物、雙特異性或多特異性分子和融合蛋白，它們均與CLD18表達細胞結合，并可用于將其他分子靶向到這些細胞。
[0074]在另一方面中，本發明提供組合物，如藥物和診斷組合物/試劑盒，其包含與一種本發明抗體或本發明抗體組合配制在一起的可藥用載體。在一個具體實施方案中，該組合物包含抗體組合，所述抗體與不同的表位結合，或者具有不同的功能特征，例如誘導CDC和/或ADCC以及誘導凋亡。在本發明的這一實施方案中，抗體可組合使用，例如作為包含兩種或更多種抗CLD18單克隆抗體的藥物組合物使用。例如，可將具有不同但互補的活性的抗CLD18抗體組合在單一治療中，以實現所需療效。在一個優選的實施方案中，該組合物包含介導⑶C的抗CLD18抗體與誘導凋亡的其他抗CLD18抗體的組合。在另一實施方案中，該組合物包含在效應細胞存在下介導高效殺傷靶細胞的抗CLD18抗體與抑制CLD18表達細胞生長的其他抗CLD18抗體的組合。
[0075]本發明還包括同時或依次施用兩種或多種本發明的抗CLD18抗體，其中至少一種所述抗體為嵌合抗CLD18抗體，且至少一種其他抗體為人抗CLD18抗體，所述抗體結合CLD18中相同或不同的表位。優選地，首先施用本發明的嵌合CLD18抗體，其后施用本發明的人抗CLD18抗體，其中所述人抗CLD18抗體優選長期施用，即作為維持療法。
[0076]本發明的抗體、免疫綴合物、雙特異性和多特異性分子以及組合物可用于抑制表達CLD18 (特別是CLD18A2)的細胞生長和/或選擇性殺傷表達CLD18 (特別是CLD18A2)的細胞的多種方法中，所述方法通過使所述細胞接觸有效量的抗體、免疫綴合物、雙特異性/多特異性分子或組合物從而抑制細胞的生長和/或殺傷細胞來實現。在一個實施方案中，所述方法包括殺傷表達CLD18的細胞，任選地在效應細胞存在下進行殺傷，例如通過CDC、凋亡、ADCC、吞噬作用或通過兩種或更多種這些機制的組合。可以使用本發明抗體抑制或殺傷的CLD18表達細胞包括癌細胞，如致瘤性的胃、胰腺、食管、肺、卵巢、結腸、肝、頭頸和膽囊細胞。
[0077]因此，本發明的抗體可用于治療和/或預防多種涉及CLD18表達細胞的疾病，這通過對患這些疾病的患者施用抗體來實現。可以治療(如改善)或預防的示例性疾病包括但不僅限于致瘤性疾病。可以治療和/或預防的致瘤性疾病的實例包括胃癌、胰腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌。
[0078]在本發明的一個具體實施方案中，施用抗體的受試者還另外用化學治療劑、放射或調節(如增強或抑制)Fe受體(如Fe-Y受體如細胞因子)表達或活性的藥劑進行治療。用于在治療期間施用的典型細胞因子包括粒細胞菌落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-Y (IFN-y)和腫瘤壞死因子(TNF)。典型治療劑包括抗腫瘤劑如阿霉素、順鉬、多西紫杉醇、5-氟尿嘧啶、氨甲喋呤、吉西他濱和環磷酰胺。
[0079]在另一實施方案中，本發明涉及用人CLD18或其肽片段優選是CLD18A2或其肽片段免疫非人動物如小鼠以獲得抗體的免疫策略。用于免疫的優選肽為選自SEQ ID NO:2,
4、6、16、18、20-23和26-31的肽。因此，在一些優選的實施方案中，本發明的抗體為通過用選自SEQ ID NO:2、4、6、16、18、20-23和26-31的肽進行免疫而獲得的抗體。類似地，可以在非人轉基因動物如轉基因小鼠中產生診斷CLD18的抗體。所述非人轉基因動物可以是基因組中包含編碼全部或部分抗體的重鏈轉基因和輕鏈轉基因的小鼠。
[0080]可以用CLD18抗原和/或核酸和/或表達CLD18或其肽片段的細胞的經純化或富集的制劑來免疫野生型以及非人轉基因動物。優選地，所述非人動物能夠通過進行V-D-J重組和同種型轉換而產生多種對CLD18的 人單克隆抗體同種型(如IgG、IgA和/或IgM)。同種型轉換可通過如經典或非經典同種型轉換而發生。
[0081]因此，在另一方面中，本發明提供來自上述非人動物的分離的B細胞。接著可通過與永生化細胞融合而使所述分離的B細胞永生化，以提供本發明抗體的來源(如雜交瘤)。這樣的雜交瘤(即產生本發明抗體的雜交瘤)也包括在本發明的范圍中。
[0082]如本文所示例的，本發明的抗體可直接得自表達該抗體的雜交瘤，或者可以克隆并在宿主細胞(如CHO細胞或淋巴細胞)中重組表達。宿主細胞的其他實例為微生物，如大腸桿菌，以及真菌，如酵母。作為替代的，它們可在非人轉基因動物或植物中重組產生。
[0083]用于產生本發明抗體的優選雜交瘤為在DSMZ (Mascheroder Weglb,31824Braunschweig, Germany ;新地址:Inhoffenstr.7B, 31824Braunschweig, Germany)測序或保藏的雜交瘤，其命名和登記號如下:
[0084]a.182-D1106-055，登記號 DSM ACC2737，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0085]b.182-D1106-056，登記號 DSM ACC2738，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0086]c.182-D1106-057，登記號 DSM ACC2739，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0087]d.182-D1106-058，登記號 DSM ACC2740，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0088]e.182-D1106-059，登記號 DSM ACC2741，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0089]f.182-D1106-062，登記號 DSM ACC2742，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0090]g.182-D1106-067，登記號 DSM ACC2743，保藏于 2005 年 10 月 19 日[0091]h.182-D758-035，登記號 DSM ACC2745，保藏于 2005 年 11 月 17 日
[0092]1.182-D758-036，登記號 DSM ACC2746，保藏于 2005 年 11 月 17 日
[0093]j.182-D758-040，登記號 DSM ACC2747，保藏于 2005 年 11 月 17 日
[0094]k.182-D1106-061，登記號 DSM ACC2748，保藏于 2005 年 11 月 17 日
[0095]1.182-D1106-279，登記號 DSM ACC2808，保藏于 2006 年 10 月 26 日
[0096]m.182-D1106-294，登記號 DSM ACC2809，保藏于 2006 年 10 月 26 日
[0097]n.182-D1106-362，登記號 DSM ACC2810，保藏于 2006 年 10 月 26 日。
[0098]本發明優選的抗體為通過上述雜交瘤產生并可得自上述雜交瘤的抗體——即對于182-D1106-055的情況為37G11，對于182-D1106-056的情況為37Η8，對于182-D1106-057 的情況為 38G5，對于 182-D1106-058 的情況為 38Η3，對于 182-D1106-059 的情況為39F11，對于182-D1106-062的情況為43Α11，對于182-D1106-067的情況為61C2，對于 182-D758-035 的情況為 26Β5，對于 182-D758-036 的情況為 26D12，對于 182-D758-040 的情況為28D10，對于182-D1106-061的情況為42Ε12，對于182-D1106-279的情況為125Ε1,對于182-D1106-294的情況為163Ε12，對于182-D1106-362的情況為17OT10——及其嵌合及人源化形式。
[0099]在一些優選的實施方案中，本發明的抗體(特別是嵌合形式的抗體)包括含有如下重鏈恒定區(CH)的抗體，所述重鏈恒定區包含來自人重鏈恒定區的氨基酸序列，如SEQID NO:46或150所示氨基酸序列或其片段。在另一些優選的實施方案中，本發明的抗體(特別是嵌合形式的抗體)包括含有如下輕鏈恒定區(CL)的抗體，所述輕鏈恒定區包含來自人輕鏈恒定區的氨基酸序列，如SEQ ID NO:41或148所示氨基酸序列或其片段。在一個具體的優選實施方案中，本發明的抗體(特別是嵌合形式的抗體)包括含有如下重鏈恒定區(CH)并含有如下輕鏈恒定區(CL)的抗體，所述重鏈恒定區包含來自人重鏈恒定區的氨基酸序列，如SEQ ID NO:46或150所示氨基酸序列或其片段，所述輕鏈恒定區包含來自人輕鏈恒定區的氨基酸序列，如SEQ ID NO:41或148所示氨基酸序列或其片段。
[0100]包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的CH可由包含SEQ ID NO:45所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:150所示氨基酸序列的CH可由包含SEQ ID NO:149所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的CL可由包含SEQ ID NO:40所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:148所示氨基酸序列的CL可由包含SEQ ID NO:147所示核酸序列的核酸編碼。
[0101]在某些優選的實施方案中，嵌合形式的抗體包括這樣的抗體，其包含重鏈和/或輕鏈，所述重鏈含有選自SEQ ID N0:115、116、117、118、119、120及其片段的氨基酸序列，所述輕鏈含有選自SEQ ID NO:121、122、123、124、125、126、127、128、129及其片段的氨基酸序列。
[0102]在某些優選的實施方案中，嵌合形式的抗體包括這樣的抗體，其包含選自以下可能性(i)至(ix)的重鏈和輕鏈的組合:
[0103]⑴包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:122所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，
[0104](ii)包含SEQ ID NO:116所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:121所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，[0105](iii)包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:123所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，
[0106](iv)包含SEQ ID NO:119所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:126所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，
[0107](V)包含SEQ ID NO:118所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:125所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，
[0108](vi)包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:124所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，
[0109](vii)包含SEQ ID NO: 120所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:127所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，
[0110](Viii)包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:128所示氨基酸序列或其片段的輕鏈，和
[0111](ix)包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列或其片段的重鏈以及包含SEQ ID NO:129所示氨基酸序列或其片段的輕鏈。
[0112]上文使用的“片段”或“氨基酸序列的片段”涉及抗體序列的一部分，即代表N和/C端縮短的抗體序列的序列，其在替換抗體中的所述抗體序列時保留所述抗體對CLD18的結合，并優選保留所述抗體如本文所述的功能，例如CDC介導的裂解或ADCC介導的裂解。優選地，氨基酸序列的片段含有來自所述氨基酸序列的至少80 %、優選至少90 %、95 %、96%、97%、98%或 99%的氨基酸殘基。選自 SEQ ID NO:115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128和129的氨基酸序列的片段優選涉及其中除去了 N端17、18、19、20、21、22或23個氨基酸的所述序列。本文所述氨基酸序列的片段可分別由編碼所述氨基酸序列的核酸序列的片段編碼。
[0113]包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列的重鏈可由包含SEQ ID NO:100所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:116所示氨基酸序列的重鏈可由包含SEQ ID NO:101所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列的重鏈可由包含SEQ ID NO:102所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:119所示氨基酸序列的重鏈可由包含SEQID NO:104所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的重鏈可由包含SEQ ID NO:103所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列的重鏈可由包含SEQ ID NO:105所示核酸序列的核酸編碼。
[0114]包含SEQ ID NO:122所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:107所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:121所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:106所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:123所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:108所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:126所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQID NO:111所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:125所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:110所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:124所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:109所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO: 127所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:112所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:128所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:113所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:129所示氨基酸序列的輕鏈可由包含SEQ ID NO:114所示核酸序列的核酸編碼。[0115]在一個優選的實施方案中，本發明的抗體包含重鏈可變區(VH)，其含有選自SEQID NO:132,133，134，135，136，137及其片段的氨基酸序列。[0116]在一個優選的實施方案中，本發明的抗體包含輕鏈可變區(VL)，其含有選自SEQID NO:138,139，140，141，142，143，144，145，146 及其片段的氨基酸序列。
[0117]在某些優選的實施方案中，本發明的抗體包括這樣的抗體，其包含選自以下可能性(i)至(ix)的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的組合:
[0118]⑴包含SEQ ID NO:132所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:139所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0119](ii)包含SEQ ID NO:133所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:138所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0120](iii)包含SEQ ID NO:134所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:140所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0121](iv)包含SEQ ID NO: 136所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:143所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0122](V)包含SEQ ID NO: 135所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:142所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0123](vi)包含SEQ ID NO: 137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0124](vii)包含SEQ ID NO:137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:144所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0125](viii)包含SEQ ID NO: 137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:145所示氨基酸序列或其片段的VLJP
[0126](ix)包含SEQ ID NO: 137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:146所示氨基酸序列或其片段的VL。
[0127]包含SEQ ID NO:132所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID N0:55所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:133所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID N0:56所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:134所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID NO:57所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:136所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID NO:59所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ IDNO:58所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:137所示氨基酸序列的VH可由包含SEQID NO:60所示核酸序列的核酸編碼。
[0128]包含SEQ ID NO:139所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID N0:62所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:138所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:61所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:140所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:63所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:143所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:66所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:142所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ IDNO:65所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的VL可由包含SEQID NO:64所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:144所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:67所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:145所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:68所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO:146所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:69所示核酸序列的核酸編碼。
[0129]在一個優選的實施方案中，本發明的抗體包含VH，其含有選自以下實施方案(i)至(vi)的CDR1、CDR2和CDR3互補性決定區組:
[0130](i)CDRl:SEQ ID NO:115 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:115 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:115 的 116-125 位，
[0131](ii)CDRl:SEQ ID NO:116 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:116 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:116 的 116-126 位，
[0132](iii)CDRl:SEQ ID NO:117 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:117 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:117 的 116-124 位，
[0133](iv)CDRl:SEQ ID NO:118 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:118 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:118 的 116-126 位，
[0134](v)CDRl:SEQ ID NO:119 的 44-51 位，CDR2:SEQ ID NO:119 的 69-76 位，CDR3:SEQ ID NO:119 的 115-125 位，
[0135](vi)CDRl:SEQ ID NO:120 的 45-53 位，CDR2:SEQ ID NO:120 的 71-78 位，CDR3:SEQ ID NO:120 的 117-128 位。
[0136]在一個優選的實施方案中，本發明的抗體包含VL，其含有選自以下實施方案(i)至(ix)的CDR1、CDR2和CDR3互補性決定區組:
[0137](i)CDRl:SEQ ID NO:121 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:121 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:121 的 115-123 位，
[0138](ii)CDRl:SEQ ID NO:122 的 49-53 位，CDR2:SEQ ID NO:122 的 71-73 位，CDR3:SEQ ID NO:122 的 110-118 位，
[0139](iii)CDRl:SEQ ID NO:123 的 47-52 位，CDR2:SEQ ID NO: 123 的 70-72 位，CDR3:SEQ ID NO:123 的 109-117 位，
[0140](iv)CDRl:SEQ ID NO:124 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:124 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:124 的 115-123 位，
[0141](v)CDRl:SEQ ID NO:125 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:125 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:125 的 115-123 位，
[0142](vi)CDRl:SEQ ID NO:126 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:126 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:126 的 115-122 位，
[0143](vii)CDRl:SEQ ID NO:127 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:127 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:127 的 115-123 位，
[0144](viii)CDRl:SEQ ID NO:128 的47-58位，CDR2:SEQ ID NO:128 的76-78位，CDR3:SEQ ID NO:128 的 115-123 位，和
[0145](ix)CDRl:SEQ ID NO:129 的 47-52 位，CDR2:SEQ ID NO:129 的 70-72 位，CDR3:SEQ ID NO:129 的 109-117 位。
[0146]在一個優選的實施方案中，本發明的抗體包含VH和VL，其分別含有選自以下實施方案⑴至(ix)的CDR1、CDR2和CDR3互補性決定區組:
[0147](i)VH:CDR1:SEQ ID NO: 115 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:115 的 70-77位，CDR3:SEQ ID NO:115 的 116-125 位，VL:CDR1:SEQ ID NO: 122 的 49-53 位，CDR2:SEQ ID NO:122的 71-73 位，CDR3:SEQ ID NO:122 的 110-118 位，
[0148](ii)VH:CDR1:SEQ ID NO:116 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:116 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:116 的 116-126 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:121 的 47-58 位，CDR2:SEQ IDNO:121 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:121 的 115-123 位，
[0149](iii) VH:CDR1:SEQ ID NO:117 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:117 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:117 的 116-124 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:123 的 47-52 位，CDR2:SEQ IDNO:123 的 70-72 位，CDR3:SEQ ID NO:123 的 109-117 位，
[0150](iv)VH:CDR1:SEQ ID NO:119 的 44-51 位，CDR2:SEQ ID NO:119 的 69-76 位，CDR3:SEQ ID NO:119 的 115-125 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:126 的 47-58 位，CDR2:SEQ IDNO:126 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:126 的 115-122 位，
[0151](v)VH:CDR1:SEQ ID NO: 118 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:118 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID N0:118的116-126位，VL:CDR1:SEQ ID NO:125 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:125的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:125 的 115-123 位，
[0152](vi)VH:CDR1:SEQ ID NO: 120 的 45-53 位，CDR2:SEQ ID NO: 120 的 71-78 位，CDR3:SEQ ID NO:120 的 117-128 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:124 的 47-58 位，CDR2:SEQ IDNO:124 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:124 的 115-123 位，
[0153](vii) VH:CDR1:SEQ ID NO:120 的 45-53 位，CDR2:SEQ ID NO:120 的 71-78 位，CDR3:SEQ ID NO:120 的 117-128 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:127 的 47-58 位，CDR2:SEQ IDNO:127 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:127 的 115-123 位，
[0154](viii) VH:CDR1:SEQ ID NO:120 的 45-53 位，CDR2:SEQ ID NO:120 的 71-78 位，CDR3:SEQ ID NO:120 的 117- 128 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:128 的 47-58 位，CDR2:SEQ IDNO:128 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:128 的 115-123 位，和
[0155](ix)VH:CDR1:SEQ ID NO: 120 的 45-53 位，CDR2:SEQ ID NO: 120 的 71-78 位，CDR3:SEQ ID NO:120 的 117-128 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:129 的 47-52 位，CDR2:SEQ IDNO:129 的 70-72 位，CDR3:SEQ ID NO:129 的 109-117 位。
[0156]在另一些優選的實施方案中，本發明的抗體優選包含針對CLD18的單克隆抗體(優選本文所述針對CLD18的單克隆抗體)中重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)的一個或多個互補性決定區(CDR)，優選至少包含CDR3可變區，并且優選包含本文所述重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)的一個或多個互補性決定區(CDR)，優選至少包含CDR3可變區。在一個實施方案中，所述一個或多個互補性決定區(CDR)選自本文所述的CDR1、CDR2和CDR3互補性決定區組。在一個特別優選的實施方案中，本發明的抗體優選包含針對CLD18的單克隆抗體(優選本文所述針對CLD18的單克隆抗體)重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)的互補性決定區CDR1、CDR2和CDR3，并優選包含本文所述重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)的互補性決定區CDR1、CDR2和CDR3。
[0157]在一個實施方案中，如本文所述包含一個或多個⑶R、一組⑶R或⑶R組的組合的本發明抗體包含與其介入構架區(intervening framework region)在一起的所述⑶R。優選地，該部分還將包含第一個和第四個構架區中其一或其二的至少約50%、所述50%為第一個構架區的C端50%和第四個構架區的N端50%。構建通過重組DNA技術產生的本發明抗體可能導致在可變區的N端或C端引入接頭編碼的殘基，所述接頭的引入是為了便于克隆或其他操作步驟，包括引入接頭以連接本發明的可變區與其他蛋白質序列，所述其他序列包括免疫球蛋白重鏈、其他可變結構域(例如在雙抗體的產生中)或蛋白質標簽。
[0158]在一個實施方案中，如本文所述包含一個或多個⑶R、一組⑶R或⑶R組的組合的本發明抗體在人抗體構架區中包含所述CDR。
[0159]本文中提到的在其重鏈中包含特定鏈或特定區域或特定序列的抗體優選涉及所述抗體的所有重鏈均包含所述特定鏈、區域或序列的情況。相應地，這也適用于抗體的輕鏈。
[0160]本發明還涉及核酸，其包含編碼如本文所述抗體或其部分(如抗體鏈)的基因或核酸序列。該核酸可以包含在載體中，例如質粒、粘粒、病毒、噬菌體或者例如在遺傳工程中常規使用的其他載體。所述載體可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，所述載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為本領域技術人員所公知，可包括啟動子、剪接盒以及翻譯起始密碼子。
[0161]優選地，本發明的核酸與允許在真核或原核細胞中表達的上述表達控制序列有效連接。確保在真核或原核細胞中表達的控制元件為本領域技術人員所熟知。
[0162]用于構建本發明核酸分子、構建包含上述核酸分子的載體、將載體引入正確選擇的宿主細胞、引起或實現表達的方法在本領域中是公知的。
[0163]本發明的另一方面涉及包含本文所述核酸或載體的宿主細胞
[0164]本發明的其他特征和優點在以下詳細描述和權利要求中將十分明顯。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0165]圖1顯示轉染了與綠色熒光染料偶聯的CLD18A2的HEK293細胞的免疫熒光分析，所述細胞與用SEQ ID NO: 15進行DNA免疫后的小鼠血清進行了反應，所述SEQ ID NO:15是與輔助表位(helper epitope)相融合的。
[0166]圖 2 顯示轉染了 CLD18A2-myc(SEQ ID NO:3)的 HEK293 細胞及未轉染的 HEK293細胞的Western印跡分析，所述分析使用單克隆小鼠抗c_myc抗體9E11 (Serotec, CRLMCA2200)進行。
[0167]圖3顯示使用轉染了 CLD18A2的CHO細胞和多克隆兔抗CLD18抗體(Zymed，CRL38-8000)進行的免疫熒光分析。
[0168]圖4A和B顯示通過流式細胞術測定的雜交瘤上清液24H5和85A3與瞬時轉染了人CLD18A2和熒光標記的HEK293細胞的結合。圖4C顯示雜交瘤上清液45C1、125E1、163E12、166E2和175D10與穩定轉染了人CLD18A2并用碘化丙錠(propidium iodide)復染的HEK293細胞的結合。
[0169]圖5顯示通過流式細胞術測定的雜交瘤上清液24H5(A)、9E8(B)、26B5(C)和19B9 (D)與瞬時轉染了熒光標記以及人CLD18A2或CLD18A2_Myc或CLD18A2-HA的HEK293細胞的結合。
[0170]圖6A和B顯示通過流式細胞術測定的雜交瘤上清液37H8、43A11、45C1和163E12與穩定轉染了人CLD18A2或CLD18A1的HEK293細胞的結合。[0171]圖7顯示CLD18A2同工型特異性單克隆抗體37G11的免疫熒光分析，所述分析通過在天然(A、B)及多聚甲醛固定(C、D)條件下染色分別轉染了 CLD18A2(A、C)和CLD18A1 (B、D)的 HEK293 細胞來進行。
[0172]圖8顯示CLD18單克隆抗體26B5的免疫熒光分析，所述分析通過在天然(A、B)及多聚甲醛固定(C、D)條件下染色分別轉染了 CLD18A2(A、C)和CLD18A1 (B、D)的HEK293細胞來進行。
[0173]圖9.細胞系 RT-PCR
[0174]使用CLD18A2特異性引物的RT-PCR分析顯示在4/5的測試細胞系中有明確的表達。
[0175]圖10顯示DAN-G細胞(亞克隆F2)和多克隆兔抗CLD18抗體(Zymed，CRL38-8000)的免疫熒光分析。
[0176]圖11顯示KATO-1II細胞(亞克隆3B94D5)和多克隆兔抗CLD18抗體(Zymed，CRL38-8000)的免疫熒光分析。
[0177]圖12A顯示SNU-16細胞(亞克隆G5)與多克隆兔抗CLD18抗體(Zymed，CRL38-8000)的免疫熒光分析。圖12B顯示KATO-1II細胞與本發明單克隆抗體的免疫熒光分析。
[0178]圖13顯示CLD18在KATO-1II和NUGC-4細胞表面的表達，其通過用單克隆抗體61C2和163E12染色隨后進行流式細胞術來進行分析。
[0179]圖 14.人 CLD18A1 (N P_057453)、人 CLD18A2 (NP_001002026)、小鼠CLD18A1 (NP_062789)和小鼠 CLD18A2 (AAL15636)的蛋白質比對。
[0180]圖15A和B顯示通過流式細胞術分析的雜交瘤上清液38G5、38H3、37G11、45C1和163E12分別與瞬時轉染了熒光標記以及小鼠CLD18A1或小鼠CLD18A2的HEK293細胞的結
八
口 ο
[0181]圖16.使用多克隆抗體pl05進行的免疫組化分析
[0182]對正常組織亞組(胃、肺、骨髓和前列腺)的免疫組化染色證實了胃組織特異性(A)。還在胃癌(上面一行)和肺癌(B)中檢測到了表達。僅分化細胞表達CLD18A2，但干細胞不表達(C)。
[0183]圖17.使用單克隆抗體39F11D7進行的免疫組化分析
[0184](A)在正常胃粘膜中檢測到特異性蛋白質表達，而測試的所有其他正常組織均為陰性。
[0185](B)在胃癌和肺癌中發現強CLD18A2表達。
[0186]圖18.使用單克隆抗體 26B5(A)、17?10(B)、43A11(C)、163E12(D)和 45C1 (E)進行的免疫組化分析。所有抗體均顯示HEK293-CLD18A2異種移植腫瘤和胃癌標本的強染色，而用HEK293-模擬對照轉染的腫瘤則不然。
[0187]圖19是比較通過85A3、28D10、24H5或26D12誘導針對穩定轉染了人CLD18A2的HEK293細胞的CDC之后死細胞百分比的圖，使用流式細胞術測定。
[0188]圖 20 是通過 24H5、26D12、28D10、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、41C6、42E12、43A11、44E10、47D12或61C2誘導針對穩定轉染了人CLD18A2或人CLD18A1的貼壁CHO細胞的CDC之后特異性細胞裂解百分比的圖，通過熒光測量來測定。[0189]圖21顯示75B8(A)、28D10(B)或37H8 (C)濃度依賴性誘導針對穩定轉染了人CLD18A2的CHO細胞的⑶C，通過熒光測量來測定。
[0190]圖22顯示在MNC存在下26B5、37H8、38G5、47D12和61C2分別誘導的HEK293-CLD18A2 細胞裂解。
[0191]圖23顯示在MNC存在下26B5、37H8、38G5、47D12和61C2分別誘導的HEK293-CLD18A1 細胞裂解。
[0192]圖24顯示在使用HEK293-CLD18A2細胞的早期治療異種移植模型中本發明抗體對腫瘤生長的抑制。
[0193]圖25A和B顯示在兩種使用HEK293-CLD18A2細胞的早期治療異種移植模型中通過使用本發明抗體治療的存活延長。
[0194]圖26顯不在使用HEK293-CLD18A2細胞的深度治療(advanced treatment)異種移植模型中通過本發明抗體的存活延長。
[0195]圖27A顯示在早期治療異種移植模型中通過本發明抗體的腫瘤生長抑制。圖27B顯示早期治療異種移植模型中通過本發明抗體的存活延長。使用內源表達CLD18A2的DAN-G細胞。
[0196]圖28顯示小鼠組織中的CLD18A2mRNA表達。使用CLD18A2特異性引物的RT-PCR研究顯示，在除胃以外的所有所測試正常組織中均無顯著表達。分析了以下正常組織:1:小腸，2:脾，3:皮膚，4:胃，5:肺，6:胰腺，7:淋巴結，8:胸腺，9:陰性對照。
[0197]圖29顯示正常胃中的CLD18表達。使用CLD18特異性抗體的小鼠胃免疫組化分析顯示了保守的表達模式。盡管表面上皮和更深處的隱窩(crypt)在其細胞表面表達CLD18，但中央頸部區(central neck region)為CLD18陰性。
[0198]圖30顯示小鼠胃組織的蘇木精和伊紅染色。顯示了用37G11處理的小鼠與僅用PBS處理的對照小鼠(C和D)的胃的概況(A)和細節(B)。
[0199]圖31A和B顯示使用本發明抗體(43A11、125E1、163E12、166E2和175D10)對分別穩定轉染了 CLD18A1和A2的HEK293細胞以及內源性表達的KATO-1II細胞進行的流式細胞染色。
[0200]圖32顯示本發明嵌合抗體介導的對CLD18A2表達細胞的⑶C。
[0201]圖33顯示本發明嵌合抗體介導的對KATO-1II細胞的ADCC。
【具體實施方式】
[0202]本文所述抗體可以是與CLD18上存在的表位特異性結合的分離的單克隆抗體。本發明涵蓋的分離的單克隆抗體包括IgA、IgGl-4、IgE、IgM和IgD抗體。在一個實施方案中，所述抗體為IgGl抗體，更具體地為IgGl κ或IgGl λ同種型。在另一實施方案中，所述抗體為IgG3抗體，更具體地為IgG3K或IgG3X同種型。在另一實施方案中，所述抗體為IgG4抗體更特別地為IgG4K或IgG4X同種型。在另一實施方案中，所述抗體為IgAl或IgA2抗體。在另一實施方案中，所述抗體為IgM抗體。
[0203]在一個實施方案中，本發明涉及這樣的抗體，其與表達CLD18的細胞特異性結合，并且優選地(i)與表達CLD18A2的細胞結合，并且(ii)不與不表達CLD18A2但表達CLD18A1的細胞結合。本發明的抗體優選地⑴介導殺傷表達CLD18A2的細胞，并且(ii)不介導殺傷不表達CLD18A2但表達CLD18A1的細胞。
[0204]在另一實施方案中，本發明涉及這樣的抗體，其(i)與表達CLD18的腫瘤細胞結合，(ii)不與表達CLD18的正常胃粘膜細胞結合，和/或(iii)不與表達CLD18的非癌肺組織細胞結合。[0205]本發明還包括這樣的抗體，其⑴介導殺傷表達CLD18的腫瘤細胞，(ii)不介導殺傷表達CLD18的正常胃粘膜細胞，和/或(iii)不介導殺傷表達CLD18的非癌肺組織細胞。
[0206]在一些具體的實施方案中，本發明的抗體(i)結合CLD18A2上不存在于CLD18A1上的表位，優選SEQ ID NO:21、22和23，(ii)結合位于CLD18A2環I上的表位，優選SEQ IDNO:28, (iii)結合位于CLD18A2環2上的表位，優選SEQ ID NO:30，(iv)結合位于CLD18A2環D3上的表位，優選SEQ ID NO:31，(V)結合包括CLD18A2環I和CLD18A2環D3的表位，(vi)結合位于CLD18A2環D3上的非糖基化表位，優選SEQ ID N0:29，或者(vii)結合人和小鼠 CLD18 中存在的表位(分別為 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:37)。
[0207]在一些特別優選的實施方案中，本發明的抗體結合CLD18A2上不存在于CLD18A1上的表位。
[0208]本發明的抗體包括全人抗體。這樣的抗體可以在非人轉基因動物(如轉基因小鼠)中產生，所述轉基因動物能夠通過進行V-D-J重組和同種型轉換而產生多種針對CLD18的人單克隆抗體同種型。這樣的轉基因動物還可以是如US2003/0017534所公開的用于產生多克隆抗體的轉基因兔。
[0209]本發明抗體與CLD18抗原的結合可介導殺傷表達CLD18的細胞(如腫瘤細胞)，例如通過激活補體系統來介導。對表達CLD18的細胞的殺傷可通過一種或多種以下機制發生:表達CLD18的細胞的補體依賴性細胞毒性(⑶C);表達CLD18的細胞的凋亡；表達CLD18的細胞的效應細胞吞噬作用；或者表達CLD18的細胞的效應細胞抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
[0210]為了更易于理解本發明，首先定義一些術語。其他定義在詳述全文中公開。
[0211]術語定義
[0212]術語“CLD18”指密蛋白_18，并包括細胞天然表達的或轉染了 CLD18基因的細胞所表達的任何CLD18的變體(包括CLD18A1和CLD18A2)、構象、同工型(isoform)和種間同源物(species homologs)。優選地，“CLD18” 指人 CLD18，特別是 CLD18A2 (SEQ ID N0:l、2)和 / 或 CLD18A1 (SEQ ID NO:7、8)，更優選 CLD18A2。
[0213]術語“CLD18A1”包括細胞天然表達的或轉染了 CLD18A1基因的細胞所表達的任何人CLD18A1的翻譯后修飾變體、同工型和種間同源物。
[0214]術語“CLD18A2”包括細胞天然表達的或轉染了 CLD18A2基因的細胞所表達的任何人CLD18A2的翻譯后修飾變體、同工型和種間同源物。
[0215]術語“CLD18變體”應包括(i) CLD18剪接變體，(ii) CLD18翻譯后修飾變體，特別是包括N糖基化狀態不同的變體，(iii)CLD18構象變體，特別是包括CLD18-構象-1、CLD18-構象-2和CLD18-構象-3，(iv)位于胞間緊密連接處的游離CLD18和同型/異型相關聯變體，(v)CLD18癌癥相關變體和CLD18非癌癥相關變體。[0216]術語“膜筏(raft) ”指位于細胞質膜外小葉區中的富含鞘脂和膽固醇的膜微結構域。某些蛋白質結合到這些結構域中的能力及其形成“聚集體”或“病灶聚集體”的能力可影響該蛋白質的功能。例如，CLD18分子在結合本發明抗體后遷移到這些結構中，這在質膜中產生高密度的CLD18抗原-抗體復合物。這些高密度的CLD18抗原-抗體復合物能在CDC過程中有效活化補體系統。
[0217]術語“構象”和“拓撲”描述整合的膜分子如何定位在細胞表面的膜中，特別地，其哪個區域在胞外并因而適合結合抗體。例如，CLD18可以三種不同構象存在，這很可能取決于它是否以同聚體或異聚體為優勢，或者它是整合在超分子緊密連接結構中還是“游離的”。這些不同的狀態導致不同的表位適于結合抗體。
[0218]根據本發明，術語“疾病”指任何病理狀態，包括癌癥，特別是本文所述的癌癥形式。
[0219]“腫瘤”指一組異常的細胞或組織，它們通過快速、不受控制的細胞增殖來生長，并在起始該新生物生長的刺激停止后仍繼續生長。腫瘤顯示出部分或完全缺失結構的組織以及與正常組織的功能協調，并通常形成可以為良性或惡性的獨特組織塊。
[0220]“轉移”指癌細胞從其原始部位傳播到身體的其他部位。轉移的形成是非常復雜的過程，依賴于惡性細胞從原發腫瘤中脫離、侵襲胞外基質、透過內皮基底膜以進入體腔和血管以及其后由血轉運后浸潤靶器官。最后，新腫瘤在靶部位的生長依賴于血管發生。腫瘤轉移經常甚至在切除原發腫瘤后發生，因為腫瘤細胞或組分可能殘留并發展出轉移潛力。在一個實施方案中，本發明的術語“轉移”指“遠端轉移”，這是指遠離原發腫瘤和局部淋巴結系統的轉移。
[0221]術語“治療疾病”包括疾病或其癥狀的治療、持續時間的縮短、改善、預防、延緩或抑制其發展或惡化，或者延緩其發作。
[0222]根據本發明，樣品可以是 根據本發明可用的任何樣品，特別是生物樣品如組織樣品(包括體液)和/或細胞樣品，并可以常規方式獲得，例如通過組織活檢(包括鉆孔活檢)和通過收集血、支氣管灌洗液、痰、尿、排泄物或其他體液來獲得。根據本發明，術語“生物樣品”還包括生物樣品的級分。
[0223]術語“抗體”指包含通過二硫鍵互聯的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈或其抗原結合片段的糖蛋白。術語“抗體”還包括抗體(特別是本文所述抗體)的所有重組形式，例如在原核細胞中表達的抗體、未糖基化的抗體以及與抗原結合的抗體片段和下文所述的衍生物。每條重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為VH)和重鏈恒定區組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為VL)和輕鏈恒定區組成。VH和VL區可進一步細分為稱為互補性決定區(CDR)的高變區，它們散布在稱為構架區(FR)的更保守區域中。每條VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從氨基端至羧基端按以下順序排列:FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可介導該免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，所述宿主組織或因子包括免疫系統的多種細胞(如效應細胞)和經典補體系統的第一成分(Clq)。
[0224]術語“人源化抗體”指具有基本來自非人物種免疫球蛋白的抗原結合位點的分子，其中所述分子其余的免疫球蛋白結構是基于人免疫球蛋白的結構和/或序列。所述抗原結合位點可包含融合到恒定結構域上的完整可變結構域，或者僅包含移植到可變結構域中適當構架區的互補性決定區(CDR)。抗原結合位點可以是野生型的，或者通過一個或多個氨基酸替換進行修飾，例如進行修飾以與人免疫球蛋白更為相近。某些形式的人源化抗體保留了全部CDR序列(例如含有來自小鼠抗體的全部六個CDR的人源化小鼠抗體)。其他形式具有一個或多個相對于原始抗體而言發生了改變的CDR。
[0225]術語“嵌合抗體”指這樣的抗體，其中每個重鏈和輕鏈氨基酸序列的一部分與來自特定物種的抗體中相應氨基酸序列同源，或者屬于特定的類別，而該鏈的其余區段則與另一物種中的相應序列同源。一般地，輕鏈和重鏈的可變區均模擬來自一個哺乳動物物種的抗體的可變區，而恒定部分則與來自另一物種的抗體序列同源。這種嵌合形式的一個明顯優點是可使用易于獲得的B細胞或來自非人宿主生物的雜交瘤從目前已知的來源中方便地產生可變區，而與其組合的恒定區來自例如人細胞制備物。所述可變區具有易于制備的優點，并且特異性不受來源的影響，而由于恒定區為人類，因此該抗體在注射時引發人受試者免疫應答的可能性將比恒定區來自非人來源時更低。然而，定義不限于此具體實例。
[0226]本文使用的術語抗體的“抗原結合部分”(或簡稱為“結合部位”)指抗體中保留特異性結合抗原的能力的一個或多個片段。已經顯示，抗體的抗原結合功能可通過全長抗體的片段來實現。屬于抗體的“抗原結合部分”所涵蓋的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH結構域組成的一價片段；(ii)F(ab' ) 2片段，包含通過鉸鏈區處的二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；(V)由VH結構域組成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546) ； (vi)獨立的互補性決定區(O)R),和(vii)可任選地通過合成接頭連接的兩個或更多個獨立的CDR的組合。此外，盡管Fv片段的兩個結構域VL和VH由單獨的基因編碼，但它們可使用重組方法通過合成接頭連接在一起，所述接頭使它們成為單個蛋白質鏈，其中VL和VH區配對形成一價分子(稱為單鏈Fv(SCFv)，參閱如Bird等(1988)Science242:423-426 和 Huston 等(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體還旨在包括于術語抗體的“抗原結合部分”中。另一實例為包含以下部分的結合結構域免疫球蛋白融合蛋白:(i)與免疫球蛋白鉸鏈區多肽融合的結合結構域多肽，(ii)與該鉸鏈區融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區，和(iii)與CH2恒定區融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區。所述結合結構域多肽可以是重鏈可變區或輕鏈可變區。所述結合結構域免疫球蛋白融合蛋白在US2003/0118592和US2003/0133939中有進一步描述。這些抗體片段使用本領域技術人員公知的常規技術獲得，并以與完整抗體相同的方式篩選所述片段 。
[0227]術語“表位”指能夠與抗體結合的蛋白質決定簇，其中術語“結合”在本文中優選指特異性結合。表位通常由分子的化學活性表面基團(如氨基酸或糖側鏈)組成，并通常具有特定的三維結構特征以及特定的電荷特征。構象表位與非構象表位的區別在于在變性劑存在下前者喪失結合，而后者則不然。
[0228]本文使用的術語“不連續表位”指蛋白質抗原上由至少兩個蛋白質一級序列中獨立的區域組成的構象表位。
[0229]術語“雙特異性分子”旨在包括具有兩種不同結合特異性的任何試劑，如蛋白質、肽或者蛋白質或肽復合物。例如，該分子可與(a)細胞表面抗原，和(b)效應細胞表面的Fe受體結合或相互作用。術語“多特異性分子”或“異種特異性分子”旨在包括具有多于兩種不同結合特異性的任何試劑，如蛋白質、肽或者蛋白質或肽復合物。例如，例如，該分子可與(a)細胞表面抗原，(b)效應細胞表面的Fe受體，和(C)至少一種其他組分結合或相互作用。因此，本發明包括但不僅限于針對CLD18并針對其他靶標(如效應細胞上的Fe受體)的雙特異性、三特異性、四特異性和其他多特異性分子。術語“雙特異性抗體”還包括雙抗體。雙抗體是二價雙特異性抗體，其中VH和VL結構域在單個多肽鏈上表達，但使用的接頭太短，以至于不允許同一鏈上的兩個結構域配對，從而迫使結構域與另一鏈上的互補結構域配對并產生兩個抗原結合位點(參閱如Holliger, P.,等(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 ；Poljak, R.J.，等(1994)Structure〗:1121-1123)。
[0230]本發明還包括本文所述抗體的衍生物。術語“抗體衍生物”指抗體的任何修飾形式，例如抗體與另一試劑或抗體的綴合物。在如下情況下本文中使用抗體“來自”特定生殖系序列:即如果抗體通過免疫動物或通過篩選免疫球蛋白基因文庫而得自一系統，并且其中所選抗體的氨基酸序列與該生殖系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列具有至少90%、更優選至少95 %、甚至更優選至少96 %、97 %、98 %或99 %的同一性。通常，來自特定生殖系序列的抗體將與該生殖系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列顯示不多于10個氨基酸差異，更優選不多于5個氨基酸差異，或者甚至更優選不多于4、3、2或I個氨基酸差異。
[0231]本文使用的術語“異源抗體”指連接在一起的兩個或更多個抗體、其衍生物或抗原結合區，其中至少兩個具有不同的特異性。這些不同的特異性包括對效應細胞表面的Fe受體的結合特異性以及對靶細胞(如腫瘤細胞)上的抗原或表位的結合特異性。
[0232]本文所述的抗體可以是人抗體。本文使用的術語“人抗體”旨在包括具有來自人生殖系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區的抗體。本發明的人抗體可包含不是由人生殖系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機誘變或定點誘變或通過體內體細胞突變引入的突變)。
[0233]本文使用的術語“單克隆抗體”指單分子組成的抗體分子制備物。單克隆抗體顯示對特定表位的單結合特異性和親和性。在一個實施方案中，單克隆抗體通過雜交瘤產生，所述雜交瘤包括與永生化細胞融合的 得自非人動物(例如小鼠)的B細胞。
[0234]本文使用的術語“重組抗體”包括通過重組手段制備、表達、產生或分離的所有抗體，例如(a)從免疫球蛋白基因為轉基因或轉染色體的動物(如小鼠)或由其制備的雜交瘤中分離的抗體，(b)從經轉化以表達抗體的宿主細胞(如轉染瘤)中分離的抗體，(C)從重組的組合抗體文庫中分離的抗體，和(d)通過涉及將免疫球蛋白基因序列剪接成DNA序列的任何其他手段制備、表達、產生或分離的抗體。
[0235]本文使用的術語“轉染瘤”包括表達抗體的重組真核宿主細胞，例如CHO細胞、NS/0細胞、HEK293細胞、HEK293T細胞、植物細胞或真菌(包括酵母)細胞。
[0236]本文使用的術語“異源抗體”就產生這種抗體的轉基因生物進行定義。該術語指這樣的抗體，其氨基酸序列或編碼核酸序列對應于不包括該轉基因生物的生物，并且通常來自與該轉基因生物不同的物種。
[0237]本文使用的術語“異源雜合抗體(heterohybrid antibody) ”指具有生物來源不同的輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有與小鼠輕鏈連接的人重鏈的抗體是異源雜合抗體。
[0238]本文所述抗體優選是分離的。本文使用的術語“分離的抗體”旨在指基本不含抗原特異性不同之其他抗體的抗體(例如，特異性結合CLD18的分離抗體基本不含特異性結合除CLD18以外抗原的抗體)。然而，與人CLD18的表位、同工型或變體特異性結合的分離的抗體可與其他相關抗原(如來自其他物種的抗原，如CLD18種間同源物)具有交叉反應性。此外，分離的抗體可基本不含其他細胞材料和/或化學物質。在本發明的一個實施方案中，“分離的”單克隆抗體的組合指具有不同特異性并組合在明確確定的組合物中的抗體。
[0239]根據本發明，術語“結合”優選指“特異性結合”。本文使用的術語“特異性結合”指與預定抗原結合的抗體。通常，抗體結合的親和力對應于約IX 10_7M或更小的KD，并且與預定抗原結合的親和力所對應的Kd比其結合除該預定抗原以外的非特異性抗原(如BSA、酪蛋白)或密切相關抗原的親和力低至少兩個數量級。
[0240]本文使用的術語“KD” (M)旨在指特定的抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。
[0241]本文使用的術語“同種型”指重鏈恒定區基因所編碼的抗體類別(如IgM或IgGl)。
[0242]本文使用的術語“同種型轉換”指抗體的類別或同種型由一個Ig類別變成另一 Ig類別的現象。
[0243]應用于某對象時，本文使用的術語“天然存在的”指該對象可見于自然界這一事實。例如，存在于可從自然界來源分離的生物(包括病毒)中，并且在實驗室中未有意進行人工修飾的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
[0244]本文使用的術語“重排”指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構型，其中V區段在編碼基本完整VH或VL結構域的構象中分別位于緊鄰D-J或J區段的位置。重排的免疫球蛋白(抗體)基因座可通過與生殖系DNA的比較來鑒定，重排的基因座將具有至少一個重組的七聚體/九聚體同源性元件。
[0245]涉及V區段時，本文使用的術語“未重排的”或“生殖系構型”指V區段未重組為與D或J區段緊鄰的構象。
[0246]本文使用的術語“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優選為雙鏈DNA。
[0247]本發明所述的核酸優選是分離的。根據本發明，術語“分離的核酸”指該核酸是(i)在體外擴增的，例如通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，(ii)通過克隆重組產生的，(iii)純化的，例如通過酶切和凝膠電泳分級分離，或者(iv)合成的，例如通過化學合成。分離的核酸是可通過重組DNA技術操作的核酸。
[0248]根據本發明，核酸單獨存在或與其他核酸組合存在，所述其他核酸可以是同源或異源的。在一些優選的實施方案中，核酸與表達控制序列功能性連接，所述表達控制序列對于所述核酸可以是同源或異源的。術語“同源”指還天然地與表達控制序列功能性連接的核酸，術語“異源”指核酸不是天然地與該表達控制序列連接。
[0249]如果表達RNA和/或蛋白質或肽的核酸與表達控制序列以所述核酸的表達或轉錄處在所述表達控制序列的控制或影響之下的方式彼此共價連接，則它們彼此“功能性”連接。如果該核酸待翻譯成功能性蛋白質，而其帶有與編碼序列功能性連接的表達控制序列，所述表達控制序列的誘導引起所述核酸的轉錄，而不導致編碼序列中的移碼或導致所述序列不能翻譯成所需蛋白質或肽。
[0250]根據本發明，術語“表達控制序列”包括啟動子、核糖體結合位點、增強子和調芐基因轉錄或mRNA翻譯的其他控制元件。在本發明的一些具體實施方案中，所述表達控制序列可受到調節。表達控制序列的確切結構可根據物種或細胞類型的功能而變化，但通常包含分別參與轉錄和翻譯起始的5'非轉錄序列和5'及3'非翻譯序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。更具體地，5'非轉錄表達控制序列包含啟動子區，啟動子區包含用于轉錄控制功能性連接核酸的啟動子序列。表達控制序列還可包括增強子序列或上游活化子序列。[0251]根據本發明，術語“啟動子”或“啟動子區”指這樣的核酸序列:其位于所表達核酸序列的上游(5')，并通過提供RNA聚合酶的識別和結合位點來控制該序列的表達。“啟動子區”可包括用于參與基因轉錄調節的其他因子的其他識別和結合位點。啟動子可控制原核或真核基因的轉錄。此外，啟動子可以為“誘導型”，可應答于誘導物而起始轉錄，或者如果轉錄不受誘導物的控制則可以為“組成型”。如果誘導劑不存在，則誘導型啟動子控制下的基因不表達，或表達程度很低。存在誘導物時，該基因開始轉錄，或者轉錄水平提高。一般而言，這通過特異性轉錄因子的結合來介導。
[0252]本發明優選的啟動子包括用于SP6、T3和T7聚合酶的啟動子、人U6RNA啟動子、CMV啟動子及其人工雜合啟動子(如CMV)，其中啟動子的某部分與其他細胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因啟動子的某部分融合，并包含或不包含額外的內含子。
[0253]根據本發明，術語“表達”以其最普遍的意義使用，包括產生RNA或者RNA和蛋白質/肽。還包括核酸的部分表達。此外，表達可瞬時進行或穩定進行。
[0254]在一個優選的實施方案中，本發明的核酸分子存在于載體中，適當時還帶有控制該核酸表達的啟動子。術語“載體”在本文中以其最普遍的意義使用，包括用于核酸的任何中間載體，所述載體使得所述核酸能夠例如引入原核和/或真核細胞中，并且適當時整合進基因組。這類載體優選在該細胞中復制和/或表達。本文使用的術語“質粒”一般指能獨立于染色體DNA進行復制的染色體外的遺傳物質,通常為環狀DNA雙鏈體。
[0255]就用于表達抗體的載體而言，抗體重鏈及輕鏈存在于不同載體中的載體類型和重鏈及輕鏈存在于同一載體中的載體類型均可使用。
[0256]本文就特定核酸和氨基酸序列(如序列表中所示)而言提供的教導應理解為還涉及對所述特定序列的修飾，所述修飾產生與所述特定序列功能等價的序列，例如顯示與該特定氨基酸序列相同或相似的特性的氨基酸序列，以及編碼顯示與該特定核酸序列所編碼氨基酸序列相同或相似的特性的氨基酸序列的核酸序列。一個重要的特性是保留抗體與其靶標的結合，或者維持抗體的效應子功能。優選地，就特定序列而言進行了修飾的序列在替換抗體中的該特定序列時保留所述抗體與CLD18的結合，并優選保留所述抗體如本文所述的功能，例如CDC介導的裂解作用或ADCC介導的裂解作用。
[0257]本領域技術人員會理解，特別是可以修飾CDR、高變區和可變區的序列而不喪失結合CLD18的能力。例如，CDR區可以與本文所述區域相同或高度同源。“高度同源”認為是可以在⑶R中產生I至5、優選I至4例如I至3或I或2個替換。此外，高變區和可變區可被修飾，從而與本文具體公開的區域顯示顯著的同源性。
[0258]應該理解，本文所述的特定核酸還包括為了優化特定宿主細胞或生物中的密碼子使用而進行了修飾的核酸。生物之間密碼子使用的差異可引起多種關于異源基因表達的問題。通過改變原始序列中的一個或多個核苷酸而進行密碼子優化可在待表達所述核酸的同源或異源宿主中引起核酸表達的優化，特別是翻譯效率的優化。例如，如果需根據本發明使用來自人并編碼抗體恒定區和/或構架區的核酸，例如用于制備嵌合或人源化抗體，則為了優化密碼子使用而修飾所述核酸可能是優選的，特別是在如果所述核酸(任選地與異源核酸如來自其他本文所述生物的核酸融合)需在不同于人的其他生物(如小鼠或倉鼠)細胞中表達的情況下。例如，分別編碼人輕鏈和重鏈恒定區的核酸序列(如SEQ ID NO:40和45的序列)可經修飾，以包含一個或多個、優選至少1、2、3、4、5、10、15、20個并優選多達
10、15、20、25、30、50、70或100個或更多核苷酸替換，所述替換引起密碼子使用的優化，但不引起氨基酸序列的改變。這樣的核苷酸替換優選指分別將SEQ ID NO:40和45中的核苷酸替換為不引起所編碼氨基酸序列改變的經修飾的對應物，所述核苷酸分別選自下文SEQID NO:40和45的比對中所述的替換；或者指分別編碼人輕鏈和重鏈恒定區的其他核酸序列中相應位置的相應替換。優選地，在編碼人輕鏈和重鏈恒定區的核酸序列中分別實現下文SEQ ID NO:40和45的比對中所示的全部替換，所述替換使用不引起所編碼氨基酸序列改變的經修飾對應物。
[0259]SEQ ID NO:40 與 SEQ ID NO:147 的比對:
[0260]CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT 60
[0261]IIIIIIIII Il Il Il IIIIIIIII Il Il Illlll Illl
[0262]CGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCC 60
[0263]GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAG I20
[0264]Il Il Ml Il IIIIIIIIIIM Illlll Ill I Illlll Il Il
[0265]GGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAG I20
[0266]TGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAC 180 [0267]IIIIIIIII Illlll N N NI IIIIIIIII INN IIIIIII
[0268]TGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGAC 180
[0269]AGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAG 240
[0270]IIIIIII llllllllll IIIIIIIIIIM ΝΙΝΙ N IIIIIII
[0271 ] AGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAG 240
[0272]AAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAG 300
[0273]ii mu ii ιιιιιιιιι ii inn iiiiiii I inn 11 I
[0274]AAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAG 300
[0275]AGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG 324
[0276]IIIIIIIIIIM INN IN
[0277]AGCTTCAACAGGGGCGAGTGCTAG 324
[0278]SEQ ID NO:45 與 SEQ ID NO:149 的比對:
[0279]GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC 60
[0280]mm Il IIIIIIIII NI I llllllllll Il Illlll IN
[0281 ] GGCCCAAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCC 60
[0282]CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC I20
[0283]IIIIIIIIIIM lllllllllllllllll Il INN NI Illlll
[0284]CTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGA I20
[0285]GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC 180
[0286]IIIIIM llllllllllllllll Il Il Il NI I Il Il NI
[0287]GCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGC 180
【權利要求】
1.能夠結合CLD18并介導殺傷CLD18表達細胞的抗體。
2.權利要求1的抗體，所述抗體結合CLD18A1和CLD18A2。
3.權利要求1的抗體，所述抗體結合CLD18A2但不結合CLD18A1。
4.權利要求1-3中任一項的抗體，其中所述對細胞的殺傷是通過所述抗體與所述細胞表達的CLD18結合誘導的。
5.權利要求1-4中任一項的抗體，其中所述對細胞的殺傷是通過所述抗體與所述細胞表達的CLD18A2結合誘導的。
6.權利要求1-5中任一項的抗體，其中所述對細胞的殺傷不是通過所述抗體與所述細胞表達的CLD18A1結合誘導的。
7.權利要求1-6中任一項的抗體，其中所述CLD18表達細胞為癌細胞。
8.權利要求7的抗體，其中所述癌細胞選自致瘤性的胃癌、食管癌、胰腺癌和肺癌細胞。
9.權利要求1-8中任一項的抗體，所述抗體通過誘導補體依賴性細胞毒性(CDC)介導的裂解、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)介導的裂解、凋亡、同型粘附和/或吞噬作用來介導所述對細胞的殺傷。
10.權利要求1-9中任一項的抗體，所述抗體通過誘導CDC介導的裂解和/或ADCC介導的裂解來介導所述對細胞的殺傷。
11.權利要求1-10中任一項的抗體，所述抗體不誘導所述細胞的CDC介導的裂解。
12.權利要求9-11中任一項的抗體，其中所述ADCC介導的裂解在效應細胞存在下發生，所述效應細胞選自單核細胞、單個核細胞、NK細胞和PMN。
13.權利要求9-12中任一項的抗體，其中所述吞噬作用通過巨噬細胞來實現。
14.權利要求1-13中任一項的抗體，所述抗體為單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體或者抗體片段。
15.權利要求1-14中任一項的抗體，所述抗體選自IgGl、IgG2優選IgG2a和IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgAU IgA2、分泌性 IgA、IgD 和 IgE 抗體。
16.權利要求2-15中任一項的抗體，其中CLD18A2具有SEQID NO:2的氨基酸序列。
17.權利要求2-16中任一項的抗體，其中CLD18A1具有SEQID NO:8的氨基酸序列。
18.權利要求1-17中任一項的抗體，所述抗體與活細胞表面存在的CLD18的天然表位結合。
19.權利要求1-18中任一項的抗體,所述抗體對癌細胞優選胃癌細胞具有特異性。
20.權利要求1-19中任一項的抗體，其中所述CLD18在所述細胞的表面上表達。
21.權利要求1-20中任一項的抗體，所述抗體可通過包括以下步驟的方法獲得:用具有選自SEQ ID N0:2、4、6、16、18、20-23和26-31的氨基酸序列的蛋白質或肽或其免疫原性片段或者表達所述蛋白質或肽或其免疫原性片段的核酸或宿主細胞來免疫動物。
22.由以下列登記號保藏的克隆所產生的抗體:DSMACC2737，DSM ACC2738，DSMACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSMACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 或 DSM ACC2810。
23.能產生權利要求1至22中任一項的抗體的雜交瘤。
24.以下列登記號保藏的雜交瘤:DSMACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSMACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSMACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 或 DSM ACC2810。
25.綴合物，其包含與治療劑偶聯的權利要求1至22中任一項的抗體。
26.權利要求25的綴合物，其中所述治療劑為毒素、放射性同位素、藥物或細胞毒劑。
27.藥物組合物，其包含權利要求1至22中任一項的抗體和/或權利要求25或26的綴合物以及可藥用載體。
28.抑制表達CLD18的細胞生長和/或殺傷所述細胞的方法，包括使所述細胞接觸權利要求I至22中任一項的抗體和/或權利要求25或26的綴合物。
29.治療或預防與CLD18表達細胞相關的疾病或病癥的方法，包括對受試者施用權利要求I至22中任一項的抗體、權利要求25或26的綴合物或權利要求27的藥物組合物。
30.權利要求29的方法，其中所述疾病或病癥為腫瘤相關疾病。
31.權利要求30的方法，其中所述腫瘤相關疾病選自胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌和膀胱癌。
32.權利要求28-31中任一項的方法，其中所述CLD18為CLD18A2。
33.權利要求28-32中任一 項的方法，其中所述CLD18在所述細胞的表面上表達。
【文檔編號】A61P35/00GK103509110SQ201310084216
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2006年11月24日 優先權日:2005年11月24日
【發明者】烏爾·沙欣, 厄茲萊姆·圖雷奇, 迪爾克·烏澤納, 斯特凡·弗里茨, 克里斯托夫·烏赫雷克, 貢達·勃蘭登堡, 哈拉爾德-格哈德·格佩特, 安雅·克里斯蒂娜·施羅德, 菲利普·蒂爾 申請人:加尼梅德藥物公司, 約翰內斯·古滕伯格美因茲大學，由校長代表