調節SIRPα-CD47相互作用以增加造血干細胞植入和用于此的化合物的制作方法

專利名稱：調節SIRPα-CD47相互作用以增加造血干細胞植入和用于此的化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及調節SIRPa -⑶47相互作用以增加造血干細胞植入以及用于此的化合物。在某些實施方式中，提供分離的SIRPa和⑶47多肽、片段及融合蛋白，用于增強造血干細胞植入。此外，還提供通過給予上述多肽而增加造血干細胞植入的方法。
背景技術：
從骨髓(BM)或G-CSF動員的外周血(PB)中移植人造血干細胞(HSC)已經成為干細胞生物中最重要的臨床應用之一。在患腫瘤性疾病的個體內進行HSC移植使得可能應用高劑量化療方案及隨后的HSC復蘇來克服由于化療導致的造血失敗，提高血液和非血液腫瘤的治愈率。此外，遺傳疾病如地中海貧血和某些免疫缺陷可通過基因修正HSC的自體移植或通過同種異體HSC移植而治療。一個使HSC移植成功的關鍵發現是將人白細胞抗原(HLA)系統確定為人主要組織相容性復合物。盡管供者與宿主之間的HLA不匹配在移植排斥中起主要作用，但移植失敗甚至常常發生在接受未經處理但HLA—致的移植物的患者身上(Thomas, E.D.et al.(1997)Blood 49,511-33 ；Storb, R.et al.(1977)N Engl J Med296,61-6)。該情形中，移植排斥部分與次要組織相容性抗原的不匹配相關(Gale，R.P.etal.(1981) Blood 57，9-12)。除HLA單倍體之外，尚未表征其他調節HSC移植的基因。HSC定位于由成纖維細胞間質、成骨細胞、破骨細胞、巨噬細胞和內皮細胞構成的支持性微環境壁龕中(Suda，T.et al.(2005)Trends Immunol 26,426-33) 去除 HSC與這種壁龕的相互作用，例如 通過封閉特異性粘附蛋白或趨化因子受體，則阻止HSC植入(Lapidot, T.et al.(2005)Blood 106，1901-10)。此夕卜，自然殺傷(NK)細胞和巨噬細胞，為免疫系統的兩種固有組分，已證實可分別在鼠類HSC移植(Murphy，ff.J.et al.(1987) JExp Med 165，1212-7)和人造血干細胞異種移植(McKenzie，J.L.et al.(2005)Blood 106，1259-61)中發揮作用。對移植后造血干細胞植入機制的深入理解，包括控制調節性通路的基因，可最終轉化成較好的臨床結局。非肥胖性糖尿病/重癥聯合免疫缺陷NOD.Prdcksc7sc (NOD.SCID)小鼠中的異種移植已經成為人HSC移植的“金標準”試驗。該檢測基于人HSC在靜脈內注射后再植這些動物的免疫系統的能力(Hematopoiesis-A Development Approach (ed.Zon,L.1.) 99-118(Oxford University Press, New York, USA,2001)中的 Wang, J.C.Y.etal.“Normal and leukemic human stem cells assayed in immune-deficient mice，，)。啟動人異種移植的細胞可操作性定義為SCID小鼠再植細胞(SRC)，擁有屬于HSC的屬性，且不同于體外分析的較成熟的祖細胞。該系統已使在人HSC區室內進行增殖、分化和自我更新屬性的分析成為可能。
信號調節蛋白(SIRP)包括細胞表面糖蛋白家族，其在骨髓(包括巨噬細胞、粒細胞、髓系樹突狀細胞和肥大細胞)和神經細胞(在Barclay, A.N.& Brown, M.H.，Nat RevImmunol 6，457-64 (2006)總結了 ;另參見WO 97/48723)上表達。SIRP構成一個種類多樣的多基因免疫受體家族，涵蓋抑制性(SIRPa)、激動性(SIRP3)、非信號性(SIRPy)和可溶性(SIRPS)成員。⑶47是一種廣泛表達的跨膜糖蛋白，作為SIRP a的細胞配體發揮作用，結合SIRP a的胞外NH2末端。關于SIRP a在宿主細胞被巨噬細胞所吞噬過程中的抑制性作用，已有清楚的記載。然而，較近期的研究結果還證實了通過SIRP a結合介導的其他正向信號傳導作用(Shultz, L.D.et al.(1995) J Immunol 154，180-91)。為了達到生物學效果，人們已提出多種途徑來破壞⑶47-SIRP a相互作用。這些途徑涵蓋采用片段型/截短型SIRP a和/或CD47蛋白以及針對二者的抗體(見例如國際專利申請公開號WO 99/40940 ;美國專利申請公開號2003/0026803和2006/0135749 ；以及美國專利號6，913，894)，用于改善免疫功能(見例如，國際專利申請公開案號WO99/40940 ;以及美國專利申請公開案號2003/0026803和2007/0113297)，以及用于異種移植(見例如美國專利申請公開案號2005/0255550和2007/0157328)。目前仍然需要鑒定能夠支持HSC植入以及移植后造血作用的分子。

發明內容
根據一個方面，本發明提供一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組:a)SEQ IDNO:1的氨基酸序列；b) —種由SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段組成的多肽，其中該片段包含 SEQ ID NO:1 的殘基 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126中的至少一個；以及c) a)和b)中多肽的一種，其中，在該多肽全長中，每7個氨基酸中包含至多一個氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的殘基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 中的至少一個且結合人 CD47。根據另一方面，本發明提供一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組:a) —種由SEQ ID NO:2的氨基酸序列組成的多肽；b) —種由SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段組成的多肽；以及c) a)和b)中多肽的其中一種，在該多肽全長中，每7個氨基酸中包含至多一個氨基酸插入、缺失或取代；其中:i)該多肽中SEQ ID NO:2位點31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 處殘基的至少一個被 SEQ ID NO:1 的對應殘基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126取代;或者 ii)該多肽中，SEQ ID NO:2的殘基129和130中的至少一個缺失。根據另一方面，本發明提供一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組:a)由一種氨基酸序列組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4-13組成的組；b)由一種氨基酸序列的片段組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4-13組成的組；以及c) a)和b)中所述多肽的一種，其中，在所述多肽的全長 中，每7個氨基酸中有至多一個氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽結合人CD47。根據另一方面，本發明提供一種能夠結合人Sirp a的多肽以及針對人Sirp a的抗體。優選地，該多肽是融合于IgG的Fe部分的人CD47的胞外區。根據另一方面，本發明提供一種藥物組合物，包含本文所述多肽以及一種藥用載體。
根據另一方面，本發明提供一種用于增加哺乳動物體內造血干細胞植入的方法，包括給予該哺乳動物治療有效量的本文所述多肽。根據另一方面，本發明提供一種應用本文所述多肽來增加哺乳動物體內造血干細胞植入或者制備用于增加哺乳動物體內造血干細胞植入的藥物的用途。根據另一方面，本發明提供一種本文所述多肽，用于增加哺乳動物體內的造血干細胞植入。根據另一方面，本發明提供一種包含編碼本文所述多肽的序列的分離核酸。根據另一方面，本發明提供一種包含本文所述核酸的表達載體。根據另一方面，本發明提供包含本文所述載體的培養細胞。根據另一方面，本發明提供一種生成多肽的方法，包括在允許該多肽表達的條件下培養本文所述細胞。根據另一方面，本發明提供一種用于增加人體內造血干細胞植入的方法，包括調節人Sirp a與人⑶4之間的相互作用。根據另一方面，本發明提供一種鑒定可增加人體內造血干細胞植入的化合物的方法，包括a)使人Sirpa胞外區和人CD47胞外區中至少一種與至少一種待測化合物相接觸；b)確定所述至少一種待測化合物可結合于該人Sirp a和人CD47中的至少一種；c)使該待測化合物與間質環境中的人造血細胞相接觸；以及d)確定在待測化合物存在的情況下，造血干細胞植入是否增加。根據另一方面 ，本發明提供一種測定人體內影響造血干細胞植入的遺傳多態性的方法，包括a)對來自多個進行造血細胞移植的患者的Sirp a基因進行測序；b)測定多個患者Sirp a基因中的核苷酸差異；以及c)將該核苷酸差異與造血干細胞植入進行關聯，以確定相關多態性。根據另一方面，本發明提供一種確定受體體內造血干細胞植入的可能性的方法，包括a)對來自受體的Sirpa基因進行測序；以及b)確定該相關多態性是否存在。


在下列具體說明中，本發明優選實施方式的這些以及其他特征將變得更加明顯，其中參照了下列附圖，其中:圖1示出了 NOD品系背景中，體內及體外的人造血支持。(a)用人BM(上圖；細胞劑量:RAG-2敲除品系40xl06單核細胞，SCID和N0D/SCID小鼠20xl06個細胞)或CB (下圖，每個受體15xl06個細胞)細胞移植后4周，從小鼠BM提取的DNA的DNA印跡分析。通過比較樣品泳道與對照人/小鼠DNA混合物中2.7kb a衛星條帶(箭頭)的強度，來測定人細胞植入的水平。(b、c)人Lin-CB細胞在受照小鼠BM間質上的嵌合LTC中產生的CFC數量。如所指明的，照射后，將來自NOD、NOR、B6、ICR、C3H和BALB/c雄性小鼠的BM細胞培養5周，隨后以1.1xlO5(b)或0.6-6.0xlO5 (c)個Lin-CB細胞進行接種。培養5周后，收集細胞并在標準的克隆原細胞的甲基纖維素試驗中測定CFC總數。數據以3-6次獨立實驗的平均值示出。圖2示出了 Iddl3基因座的品系特異性差異對體外和體內人造血細胞移植的支持的影響。(a)人 Lin-CB 細胞在來自 NOD 同類系(NOR.N0D_Idd4、NOR.NOD-1 dd5 NOR.N0D-1dd9、N0R.N0D_Iddl3、)NOR 同類系(NOR.NOD_Iddl3)和 B6.NOD_Iddl3 小鼠的間質上的嵌合LTC中CFC的生成情況。如圖1b中所述建立鼠BM間質層，并接種0.36-2.0xlO5(C)個人Lin-CB細胞。培養5周后，收集細胞，并通過在甲基纖維素試驗中鋪種來測定CFC的數量。在每一個實驗中，NOD間質均用做陽性對照，B6和NOR細胞均用做陰性對照。將數據針對NOD培養中生成的CFC數量(=100% )進行標準化，并以至少3次獨立培養的均值而示出。BB、Iddl3純合性B6的BM間質；NN，Iddl3基因純合性NOD的BM間質。(b)用350cGy 照射 8-9 周齡的 NOD.SCID (n = 11)或 NOD.N0R-1ddl3.SCID (n = 8)，并靜脈內注射0.37-1.5x10s個Lin-⑶34+細胞。移植后6_7周，處死小鼠并通過流式細胞檢測評估受體BM中人⑶45+細胞的植入情況。圖3示出的是鑒定Iddl3中與支持人造血作用相關的關鍵區域。(a)圖示了 NOD和NOR背景上多種同類系品系中染色體2。候選間隔的基因定位用指向右側染色體示意圖的條紋線表示。同類系品系的正式命名如下:l.N0D.N0R-D2Jyh443-D2Mit452，2.NOR.N0D-D2Jyh443-D2Jyhl493,3.NOR.BN_D2Jyh443_D2Jyh 1493，4.NOR.N0D_DlNgul46-Rampl/D2Jyh443-D2Jyhll92,5.NOD.N0R-D2Jyh443-D2Gul482,6.NOD.N0R-D2Jyh443-D2Jyh3941,7.NOR.N0D-DlNgul46-Rampl/D2Gull88-D2Jyhl493,8.NOR.BN_D2Jyh767_Flizl。(b)人Lin-CB細胞在a中所述NOD或NOR Iddl3亞同類系小鼠間質上的嵌合LTC中的CFC生成情況。如圖2a進行培養及表示數據。品系命名如a中所述。圖4示出了 SIRP a的蛋白序列比對。從BM源巨噬細胞制備的cDNA用做PCR擴增NOD和NOR小鼠Sirp a轉錄本的模板。B6小鼠序列來自EnsEMBL數據庫。蛋白結構域以開放的框表示。圖5示出了來自NOD、NOR和同類系NOR.N0D_Iddl3小鼠品系的BM源性巨噬細胞中SIRPa的免疫印跡分析。(a)將制 備自BM源性巨噬細胞(用或不用LPS(100ng/ml)和IFN-gamma(10ng/ml)進行處理)的裂解物利用針對SIRP a胞漿結構域的多克隆抗體進行免疫印跡分析，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為上樣對照。(b)將BM源性巨噬細胞的裂解物在N-糖苷酶F存在或不存在的情況下，于37°C孵育12小時，隨后針對SIRP a胞漿結構域的多克隆抗體進行免疫印跡分析。將N-糖苷酶F處理和未處理的樣品進行共電泳。分子量標準以千道爾頓表示(kD)。圖6示出了 Sirpa對鼠巨噬細胞介導的人造血作用抑制的調節。(a)巨噬細胞在LTC中介導的人造血作用抑制。將MS-5細胞接種于96孔組織培養板中(2000個細胞/孔)。將從NOD、NOR和NOR.N0D_Iddl3雜合小鼠收集的腹腔巨噬細胞以200-20，000個細胞/孔的量進行接種(每個量重復5次)，第二天每個孔均加入2000個人Lin-CB細胞。培養3-4周后，收集細胞并通過在甲基纖維素試驗中鋪種而測定人CFC數量。誤差棒表示標準差。(b)示出的是用對照病毒(CEP)或表達NOD源性Sirp a的病毒(SIRP)感染前后，Jurkat細胞和NOR BM源性巨噬細胞中SIRP a表達的蛋白印跡分析。蛋白裂解物用針對SIRP a的多克隆抗體進行免疫印跡。泳道I Jurkat細胞；泳道2:感染CEP的Jurkat細胞；泳道3:感染SIRP的Jurkat細胞；泳道4:N0R巨噬細胞；泳道5:感染SIRP的NOR巨噬細胞；泳道6:N0D巨噬細胞。感染SIRP慢病毒引起NOD巨噬細胞中NOD SIRP a的高水平表達(泳道5)。(c)Sirpa對巨噬細胞介導的人造血作用抑制的影響。NOR BM源性巨噬細胞用對照(NOR-CEP)慢病毒或表達NOD源性Sirp a基因的慢病毒(N0R-N0D SIRP)感染，然后以20-20，000個細胞/孔的量接種于已建立的MS-5間質培養基上(每個量重復5次)。如上所述，第二天每個孔加入2000個Lin-CB細胞，3.5周后，測定培養物中得到的人CFC0 NOR-NOD SIRP孔中人造血作用的支持顯著優于NOR-CEP孔(20個細胞/孔時，P =
0.032 ;2000-20，000個細胞/孔時，P = 0.008)。誤差棒表示標準差。圖7示出了 NOD SIRP a使與人⑶47的種屬交叉反應性增加。(a_d)人CD47(hCD47)與來自NOD和NOD.N0R_Iddl3同類系小鼠的BM源性巨噬細胞上的鼠SIRPa結合的流式細胞分析。(a)⑶Ilb表達的直方圖；水平棒表示⑶Ilb+門。圖b至d中的圖均以⑶Ilb進行門控。(b) 二維等高線圖，示出了 SIRPa和h⑶47-Fc染色。(c)相比于同型對照(黑色)，SIRP a表達的直方圖(灰色)。(d)h⑶47-Fc染色(灰色)與人IgG-Fc對照(黑色)疊加的直方圖。(e)鼠SIRP a與h⑶47-Fc的免疫沉淀。將來自N0D、N0R和NOD.N0R-1ddl3同類系小鼠的BM源性巨噬細胞的蛋白提取物在SDS-PAGE上進行電泳，并用多克隆抗SIRPa抗體進行免疫印跡。每一個圖均展示了總裂解物、與對照人IgG-Fc蛋白的免疫沉淀物(IP hFc)以及與h⑶47-Fc融合蛋白的免疫沉淀物(IP h⑶47-Fc)。上圖比較的是NOD和NOR提取物，下圖比較的是NOD和NOD.N0R-1ddl3 (Iddl3cg)提取物。圖8示出了鼠和人SIRPa IgV結構域的蛋白序列比對。(a)從BM巨噬細胞制備的cDNA 用做 PCR 擴增 NOD 和 NOR 小鼠 Sirp a 轉錄本的模板。C57BL/6 (B6) ,BALB/c 和 129/Sv序列從EnsEMBL和NCBI數據庫獲得。開放框代表SIRP a的X線結晶結構中鑒定的b_折疊片層，對應Ig重鏈可變區中的類似區域。小鼠品系之間不同的氨基酸以陰影表示。B6用做母本序列。(b)包含IgV結構域的SIRP a的外顯子3從人HapMap第一階段發布的37個個體基因組DNA擴增而來。開放框區域和陰影氨基酸表示與(a)中相同的特征，Vl用做母本序列。種屬之間正向同源位置標記*的殘基在NOD與其他品系以及與人之間呈多態性。標記+的殘基在人類呈多態性，且定位于該蛋白“頂端”暴露于溶劑的表面上，預測CD47在該位置結合。圖9示出了通過對從所示出人HapMap樣品中每一個(表格的左側)PCR擴增而來的SIRP a IgV結構域進·行獨立測序來驗證三種SNP分析的區分能力。圖10示出了⑶47蛋白，包含胞外IgV樣環、5個跨膜區和較短的胞漿尾巴。圖11示出了(a) —個直方圖，描繪通過用不同質粒骨架(paDNA和pIAP369)制備的mCD47-Fc和兩個h⑶47_Fc構建體轉染的培養細胞上清中蛋白生成情況，以及(b) —個SDS-PAGE免疫印跡，描繪的是從培養上清中純化后的融合蛋白。圖12示出了(a)將Kozak序列引入包含mCD47_Fc的pIAP369質粒構建體中以及(b)插入pIAP369質粒中的序列hCD47-Fc，展示了 Kozak共有序列、hCD47片段、連接段和Fe。圖13示出了(a)用含Kozak的質粒轉染的細胞上清中測定的小鼠和人⑶47_Fc生成情況以及(b)展示抗人Fe抗體與蛋白G純化的⑶47-Fc蛋白發生反應的免疫印跡。圖14示出了一個試驗，設計用來量化h⑶47-Fc和mCD47_Fc (未示出)與NOD和NOR小鼠SIRP a的親和性。圖15 示出了(a)mCD47 與 NOD 和 NOR SIRP a 結合的結果，以及(b)hCD47 與 NOD和NOR SIRPa結合的結果。圖16是一個展不SIRPa -CD47介導的信號傳導的不意圖。
圖17示出了制備人HSC“容許”的截短型NOD SIRPa (“NOD-A-Cyto”)(左側)。圖18示出了利用感染了“空”慢病毒的NOR巨噬細胞(N0R-CEP“菱形”)、未感染病毒的NOD巨噬細胞(NOD uninf ;填充三角形)、感染“空”慢病毒的NOD巨噬細胞(N0D-CEP ；圓圈)、感染含全長NOD SIRP a的慢病毒的NOR巨噬細胞(N0R-SIRP ;方形)以及感染含截短型NOD SIRP a的慢病毒的NOR巨噬細胞(NOD- A -cyto ;開放三角形)的人HSC存活情況。圖19示出了一個研究的示意圖，用來評估體內CD47融合蛋白對HSC植入的影響。圖20示出了一個研究的示意圖，其中，用SIRPa的蛋白或小分子激動劑處理可促進臨床移植情形中人HSC植入。
具體實施例方式以下說明書中列出了許多具體細節，以提供對本發明的透徹理解。然而，應該理解，無需這些具體細節即可實施本發明。如本文中使用的，“保守性氨基酸取代”指根據某些共同屬性對氨基酸進行分組。一種確定單個氨基酸之間共同屬性的功能性途徑是分析同源生物的對應蛋白之間氨基酸變化的歸一化頻率(Schulz, G.E.and R.H.Schirmer., Principles and Structure,Springer-Verlag)。根據這些分析,可確定氨基酸分組,其中同一組內氨基酸可彼此優先互換，且因此在對整體蛋白結構的影響方面彼此最為相似(Schulz,G.E.and R.H.Schirmer.,Principles and Structure, Springer-Verlag)。以該方式進行氨基酸分組的實例包括:(i)帶電組，由 Glu 和 Asp、Lys、Arg 和 His 組成,(ii)帶正電 組，由Lys、Arg和His組成，(iii)帶負電組，由Glu和Asp組成，(iv)芳香組，由 Phe、Tyr 和 Trp 組成，(V)氮環組，由His和Trp組成，(vi)較大的脂肪族非極性組，由Val、Leu和Ile組成。(vii)輕微極性組，由Met和Cys組成，(viii)小殘基組，由 Ser、Thr、Asp、Gly、Ala、Glu、Gln 和 Pro 組成，(ix)脂肪族組，由Val、Leu、lie、Met和Cys組成，以及(X)小輕基組，由Ser和Thr組成。除了上面展示的組，每一種氨基酸殘基還可形成其自己的組，由單個氨基酸形成的組可簡單地由該氨基酸在本領域中通常使用的一個和/或三個字母縮略詞表示。如本文中使用的，“培養細胞”表示一種已在體外維持和/或繁殖的細胞。培養細胞包括原代培養細胞和細胞系。如本文中使用的，“培養所述細胞”表示提供有助于多肽表達的培養條件。這些培養條件在本領域中為人熟知。如本文中使用的，“植入”干細胞特別是已擴增的造血干細胞，表示將該干細胞置入動物體內，例如通過注射，其中該干細胞在體內持續存在。這一點可通過造血干細胞如促進正在進行的血細胞形成的能力而簡單測定。如本文中使用的，提到多肽或多核苷酸時，“片段”表示僅由該參照序列的完整多肽序列和結構(或核苷酸序列和結構)的一部分構成的多肽或多核苷酸。多肽片段可包括該天然多肽的C末端缺失和/或N末端缺失，或者可由該分子的一個內在部分衍生而來。類似的，多核苷酸片段可包括該天然多核苷酸的3’和/或5’缺失，或者可由該分子的一個內在部分衍生而來。如本文中使用的，“融合蛋白”指一種復合多肽，即一種單一的連續性氨基酸序列，由兩個(或多個)獨立的異源性多肽構成，而這兩個多肽在平常情況下并非融合于一個單一的氨基酸序列內。因此，融合蛋白包括的單一氨基酸序列可包含兩個完全不同的氨基酸序列或兩個相似或相同的多肽序列，只要這些序列并非存在于天然的單一氨基酸序列的同一構象中。融合蛋白通常可利用重組核酸法即通過重組基因融合產物的轉錄和翻譯而制備，該融合包括一個編碼本發明所述多肽的節段以及一個編碼異源性多肽的節段，或者通過本領域中熟知的化學合成法而制備。在融合蛋白的組成多肽之間，可包含一個連接多肽。術語“融合構建體”或“融合蛋白構建體”通常表示編碼融合蛋白的多核苷酸。在一個實施方式中，融合蛋白是本文所述多肽融合于Ig分子的一部分。融合蛋白的Ig部分可包括免疫球蛋白的恒定區，例如人c y I結構域或C Y 4結構域(例如人Ig C Y I或Ig Cy4的鉸鏈區、CH2 和 CH3 區)(見例如，Capon et al.，U.S.Pat.N0.5，116，964 ；5, 580，756 ；5, 844，095等)。在一個優選實施方式中，Ig融合蛋白包括本文所述與免疫球蛋白的恒定區(例如，Fe部分)結合的多肽。如本文中使用的，“造血干細胞”指骨髓、肝、脾或臍血來源能夠發育成任何成熟骨髓和/或淋巴細胞的細胞。如本文中使用的，提到核酸分子、多肽或其他生物分子時，“分離的”表示該核酸或多肽已從獲得該多肽或核酸的遺傳環境中分離出來，還可以表示與天然狀態已經發生改變。例如，天然存在于活體 動物內的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但從其天然狀態的共存物質中分離出來的相同多核苷酸或多肽則是“分離的”，如該術語在本文中所應用的。因此，重組宿主細胞內生成和/或包含的多肽或多核苷酸可認為是分離的。還可認為“分離的多肽”或“分離的核酸分子”是已從重組宿主細胞或天然來源部分或幾乎全部純化的多肽或核酸分子。還可認為本發明所述肽可表現出調節生物學如細胞內事件的能力。如本文中使用的，“調節”指對感興趣生物學過程的刺激性或抑制性效應，相對于本發明所述肽不存在時該過程的水平或活性。如本文中使用的，術語“巨噬細胞抑制”或“抑制巨噬細胞”指減小或阻止巨噬細胞作用、活性和/或效應。如本文中使用的，“核酸分子”表不DNA分子(例如，cDNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及例如通過采用核苷酸類似物生成的DNA或RNA類似物。核酸分子可以為寡核苷酸或多核苷酸，可為單鏈或雙鏈。如本文中使用的，“可操作性連接”指元件的排布，其中如此描述的元件經配置可發揮其通常功能。因此，可操作性連接于編碼序列的控制元件能夠實現該編碼序列的表達。該控制元件無需與編碼序列相鄰，只要其能夠發揮作用指導其表達即可。因此，例如，可在啟動子和編碼序列之間干擾未翻譯但已轉錄的序列，啟動子仍然可以認為是“可操作性連接于”編碼序列。類似地，“與患者體內表達相容的控制元件”是那些能夠實現該患者體內編碼序列表達的元件。如本文中使用的，“藥用載體”表示任何以及所有溶劑、分散媒介、涂層、抗細菌和抗真菌試劑、等張和吸收延緩試劑以及可生理性相容的試劑等。藥用載體的實例包括水、鹽、磷酸緩沖鹽、葡聚糖、甘油、乙醇等中的一種或多種及其組合。在多種情況下，優選該組合物中包括等張試劑例如糖類、多醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。藥用載體可進一步包括輔料如濕化或乳化劑、防腐劑或緩沖液，這將增強該藥學試劑的保存期或有效性。如本文中使用的，“多肽”和“蛋白”可互換使用，表示蛋白、蛋白片段、修飾的蛋白、氨基酸序列及合成的氨基酸序列。所述多肽可為糖基化或非糖基化。如本文中使用的，“間質”指器官的支持組織或基質，可與該器官或實質的功能元件區分開。如本文中使用的，“治療有效量”指在某些劑量和必需的特定時間段時對獲得預期治療結局有效的量。藥理學試劑的治療有效量可隨諸如疾病狀態、年齡、性別和患者體重以及該藥理學試劑消除個體內預期反應的能力等因素而不同。治療有效量還可指一個量，其中該藥理學試劑的治療的有益效果超過任何毒性或有害效應。根據一個方面，本發明提供一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組:a)SEQ IDNO:1的氨基酸序列；b) —種由SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段組成的多肽，其中該片段包含 SEQ ID NO:1 的殘基 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126中的至少一個；以及c) a)和b)中多肽的其中一種，其中，在該多肽全長中，每7個氨基酸中包含至多一個氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽包含SEQ ID N0:1的殘基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 中的至少一個且結合人CD47。根據另一方面，本發明提供一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組:a) —種由SEQ ID NO:2的氨基酸序列組成的多肽；b) —種由SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段組成的多肽；以及c)a)和 b)中多肽的其中一種，其中，在該多肽全長中，每7個氨基酸中包含至多一個氨基酸插入、缺失或取代；其中:i)該多肽中SEQ ID NO:2的位點31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 處殘基的至少一個被 SEQ ID NO:I 的對應殘基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 取代；或者ii)該多肽中，SEQ ID NO:2的殘基129和130中的至少一個缺失。根據另一方面，本發明提供一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組:a)由一種氨基酸序列組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4-13組成的組；b)由一種氨基酸序列的片段組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4-13組成的組；以及c) a)和b)中所述多肽的一種，其中，在所述多肽的全長中，每7個氨基酸中有至多一個氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽結合人CD47。根據另一方面，本發明提供一種能夠結合人Sirp a的多肽以及針對人Sirp a的抗體。優選地，該多肽是融合于IgG的Fe部分的人CD47的胞外區。在某些實施方式中，該多肽是所述片段，且在SEQ ID NO:1內的殘基50-57、63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、114-125 或 128-141 之間，SEQ ID NO:2 內的殘基50-57、63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、114-125 或 128-143之間，在 SEQ ID NO:4、7、
8、9 和 12 中任何一種的殘基 24-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77-83、88-99 或 102-116 之間；或者 SEQ ID NO:5、6、10、11 和 13 中的殘基 24-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77_83、88-99或102-115之間的區域內包含至少3個連續的氨基酸。在某些實施方式中，所述氨基酸插入、缺失或取代是保守性氨基酸取代。在一個優選實施方式中，該多肽結合人⑶47。在一個優選實施方式中，該多肽結合人Sirp a。在某些實施方式中，該多肽是所述片段，且按照優先度逐漸增加的順序，長度在6-30個氨基酸之間、在8-28個氨基酸之間、在10-26個氨基酸之間、在12-24個氨基酸之間以及在14-22個氨基酸之間。本文所述多肽可融合于第二種多肽，其優選為IgG的Fe部分。根據一個優選實施方式，本發明提供一種多肽，其包含的⑶47胞外區融合于IgG的Fe部分，優選用于增加人體內的造血干細胞植入。根據另一方面，本發明提供一種藥學組合物，包含本文所述多肽以及一種藥學可接受的載體。根據另一方面，本發明提供一種用于增加哺乳動物體內造血干細胞植入的方法，包括給予該哺乳動物治療有效量的本文所述多肽。優選地，造血干細胞植入的增加是由于巨噬細胞的抑制。根據另一方面，本發明提供本文所述多肽在用于增加哺乳動物體內造血干細胞植入或用于制備用于增加哺乳動物體內造血干細胞植入的藥物中的應用。

根據另一方面，本發明提供一種本文所述多肽，用于增加哺乳動物體內的造血干細胞植入。根據另一方面，本發明提供一種分離的核酸，包含一個編碼本文所述多肽的序列。根據另一方面，本發明提供一種包含本文所述核酸優選包含Kozak共有序列的表達載體。 根據另一方面，本發明提供一種包含本文所述載體的培養細胞。根據另一方面，本發明提供一種生成多肽的方法，包括在適于該多肽表達的條件下培養本文所述細胞。根據另一方面，本發明提供一種用于增加人體內造血干細胞植入的方法，包括調節人Sirp a與人⑶47之間的相互作用。優選地，其中人Sirpa與人⑶47之間的相互作用通過給予至少一種治療有效量的下列物質加以調節:a) —種能夠結合于人Sirp a胞外區的多肽；b)針對人Sirp a的抗體c) 一種能夠結合于人CD47胞外區的多肽；以及d)針對人⑶47的抗體。因此，本發明還提供了前述多肽或方法用于增加人體內造血干細胞植入或用于制備增加人體內造血干細胞植入的藥物的應用。優選地，造血干細胞植入的增加是由于巨噬細胞的抑制。在一個實施方式中，能夠結合于人Sirp a胞外區的多肽包括可溶性人⑶47或其片段，優選CD47的胞外區。優選地，該可溶性人CD47或其片段融合于第二種蛋白。在另一個實施方式中，能夠結合于人CD47胞外區的多肽包括可溶性人Sirp a或其片段，優選Sirpa的胞外區。優選地，該可溶性人Sirp a或其片段融合于第二種蛋白。在優選實施方式中，所述第二種蛋白是IgG的Fe部分。
根據另一方面，本發明提供一種鑒定可增加人體內造血干細胞植入的化合物的方法，包括a)使人Sirp a和人CD47胞外區中至少一種與至少一種待測化合物接觸；b)確定所述至少一種待測化合物可結合于人Sirp a和人CD47中至少一種；c)使該待測化合物與間質環境中的人造血細胞相接觸；以及d)確定在待測化合物存在的情況下，造血干細胞植入是否增加。根據另一方面，本發明提供一種測定人體內影響造血干細胞植入的遺傳多態性的方法，包括a)對來自多個進行造血細胞移植的患者的Sirp a基因進行測序；b)測定來自多個患者的Sirpa基因中的核苷酸差異；以及c)將該核苷酸差異與造血干細胞植入進行關聯，以確定相關多態性。優選地，該核苷酸差異引起氨基酸差異。根據另一方面，本發明提供一種確定受體體內造血干細胞植入的可能性的方法，包括a)對來自受體的Sirpa基因進行測序；以及b)確定該相關多態性是否存在。優選地，該相關多態性引起的氨基酸差異優選為下列其中至少一個:(a) SEQ IDNO:2 位點 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 處殘基的至少一種被 SEQ ID NO:1 的對應殘基 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126取代；或者ii)SEQ ID NO:2的殘基129和130中的至少一個缺失。本發明的優勢將進一步通過下列實施例加以闡述。本文中列出的這些實施例以及其特殊細節僅為了說明而不應理解為對本發明權利要求的限制。實施例材料&方法小鼠將CB17-scid/scid (SCID)、N0D/LtSz-Prdkcsc/sc (NOD.SCID) (Shultz, L.D.etal.(1995) J Immunol 154，180-91)、C57BL/6 (B6)、C3H、ICR 和 BALB/C 小鼠在無菌條件下飼養并保管于Ontario腫瘤中心(多倫多，加拿大)。Ragf^(RAGj)、RAG_2.Prf+和RAG-2.3碑+小鼠，均為 B6 背景，從 GenPharm International (Mountain View，CA)獲得。NOD、NOD.SCID,NOD.N0R_Iddl3、N0D.N0R_Idd4、N0D.N0R_Idd5、N0D.N0R_Idd9、N0R.N0D_Iddl3 和B6.N0D-1ddl3小鼠在病童醫院(多倫多,加拿大)于無特異性病原體或屏障條件下供養。所有的同類系小鼠均通過育種者的標記物指導性選擇從NOD/Jsd與N0R/Lt祖先原始雜交而生成。按照家系，NOD與NOR基因組約88%—致，其基因組中的差異位點分布在染色體1、2、4、5、7、10、11、12、14和18上。育種者用微衛星標志物篩查所有可區分NOD與NOR的遺傳基因座，因此所有同類系的親本的背景等位基因均是純合性的。本研究中用來定義同類系小鼠的微衛星標志物列于表I中。表1.用來定位同類系小鼠的微衛星標志物。

權利要求
1.一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組: a)由一種氨基酸序列組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQID NO:4-13組成的組； b)由一種氨基酸序列的片段組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQID NO:4-13組成的組；以及 c)a)和b)中所述多肽的一種，其中，在所述多肽的全長中，每7個氨基酸中有至多一個氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽結合人CD47。
2.根據權利要求1所述的多肽，其中所述多肽是所述片段，并且在SEQID NO:4,7,8,9 和 12 的任何一個內的殘基 24-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77-83、88-99 或 102-116之間區域或者在 SEQ ID NO:5、6、10、11 和 13 內的殘基 24-31、37-45、48-54、62-66、69_74、77-83,88-99或102-115之間區域中至少一個內包含至少3個連續的氨基酸。
3.根據權利要求1至2中任一項所述的多肽，其中所述氨基酸插入、缺失或取代是保守性氨基酸取代。
4.根據權利要求1至2中任一項所述的多肽，沒有氨基酸的插入、缺失或取代。
5.根據權利要求1至2中任一項所述的多肽，其中所述多肽結合人CD47。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的多肽，其中所述多肽是所述片段，并且長度在6到30個氨基酸之間。
7.根據權利要求6所述的多肽，其中所述片段的長度在8到28個氨基酸之間。
8.根據權利要求7所述的多肽，其中所述片段的長度在10到26個氨基酸之間。
9.根據權利要求8所述的多肽，其中所述片段的長度在12到24個氨基酸之間。
10.根據權利要求9所述的多肽，其中所述片段的長度在14到22個氨基酸之間。
11.一種多肽，包含權利要求1-10中任一項所述的多肽融合于第二種多肽。
12.根據權利要求11所述的多肽，其中所述第二種蛋白是IgG的Fe部分。
13.一種藥物組合物，包含權利要求1-12中任一項所述的多肽以及一種藥用載體。
14.權利要求1-12中任一項所述的多肽在制備用于增加哺乳動物體內造血干細胞植入的藥物中的應用。
15.根據權利要求1-12中任一項所述的多肽，用于增加哺乳動物體內的造血干細胞植入。
16.—種分離的核酸,包含編碼權利要求1-12中任一項所述多肽的序列。
17.—種表達載體，包含可操作性地連接于表達控制序列的權利要求16所述的核酸。
18.—種培養細胞，包含權利要求17所述的載體。
19.一種生產多肽的方法,包括在適于所述多肽表達的條件下培養權利要求18所述的細胞。
全文摘要
本發明涉及調節SIRPα-CD47相互作用以增加造血干細胞植入和用于此的化合物。在某些實施方式中，提供分離的SIRPα和CD47多肽、片段及融合蛋白，用于增強造血干細胞植入。此外，還提供通過給予上述多肽而增加造血干細胞植入的方法。本發明的一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組a)由一種氨基酸序列組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQ ID NO4-13組成的組；b)由一種氨基酸序列的片段組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQ ID NO4-13組成的組；以及c)a)和b)中所述多肽的一種，其中，在所述多肽的全長中，每7個氨基酸中有至多一個氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽結合人CD47。
文檔編號A61P7/00GK103242444SQ20131010295
公開日2013年8月14日 申請日期2008年10月10日 優先權日2007年10月11日
發明者杰恩·丹斯卡, 約翰·E·迪克, 塔蒂亞娜·普拉索拉瓦, 竹中克人 申請人:大學健康網絡, 多倫多兒童醫院