專利名稱：Hpv16l2重組腺病毒疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的復制缺陷型重組腺病毒的制備方法。
背景技術：
人乳頭狀瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)屬乳多空病毒科,是無包膜的閉環雙鏈DNA病毒。現已明確，高危型HPV如HPV16U8的持續感染與宮頸癌的發生密切相關，被確定為導致宮頸癌的主要病因，其中又以HPV16型最為常見(Bosch F X, J Natl CancerInst, 1995,87:796 - 802.)。基于HPV的宮頸癌預防和治療性疫苗已經開展了很長時間，其中又以HPV的主要衣殼蛋白LI為重點研究對象，目前臨床上已經有了比較成功的疫苗誕生，分別是默克公司的四價疫苗和葛蘭素史克公司的兩價疫苗。不同型別的HPV LlVLP在空間構想上存在差異，導致了其不可以產生很好的交叉保護，但只是簡單的增加LlVLP的價位而謀求增加交叉保護的效果又會增加疫苗的安全風險和副作用，嚴重制約著基于LI的疫苗的研究。大量的實驗證實，HPV16的次要衣殼蛋白L2的N端具有中和多種HPV基因型的交叉中和表位，是很有前景的候選宮頸癌疫苗(KawanaK，Virology, 1998,245:353-359)。針對于L2的蛋白疫苗目前已經有報道，并且已經取得了一些階段性的成果，但是蛋白疫苗純化工藝繁瑣，成本高昂，不利于在發展中國家進行推廣，同時其免疫原性較差也嚴重制約了進一步研究。本發明試圖構建一種成本低廉，同時可有效激發機體產生特異性免疫反應的疫苗。研究表明，復制缺陷型重組腺病毒嗜性廣泛，能夠感染包括粘膜上皮細胞在內的多種細胞，介導外源基因在 細胞內的穩定表達并刺激機體產生特異性體液及細胞免疫反應，重組腺病毒還可將抗原呈遞給免疫系統，有效激發局部和遠端粘膜表面的特異性免疫反應，被認為是最為理想的免疫載體之一(Xiang Z Q，J Immunol, 1999，162:6716-6723)。與此同時，復制缺陷型重組腺病毒基因不與受體細胞基因組發生整合，具有良好的生物安全性(McConnell M J, Human Gene Therapy, 2004, 15(11):1022-1033.)。此外，重組腺病毒還具有便于大規模培養制備、成本低廉等優點，因此是理想的HPV候選預防性疫苗之一。所以我們確定以重組腺病毒作為HPV16L2基因的病毒載體。
發明內容
為了使SEQ ID No:1序列能夠獲得高效表達和呈遞，本發明提供一種HPV16L2復制缺陷型重組腺病毒疫苗。本發明的技術方案如下:本發明提供一種HPV16L2復制缺陷型重組腺病毒疫苗，含有SEQ ID No:1所示核酸序列。本發明還提供制備上述HPV16L2復制缺陷型重組腺病毒疫苗的方法，包括如下步驟:
(I)將SEQ ID No:1所示的核苷酸序列克隆到腺病毒穿梭質粒中，得到重組腺病毒穿梭質粒。(2)用步驟(I)制備的重組腺病毒穿梭質粒和pBHGloxAEl，3Cre質粒共轉染腺病毒包裝細胞，得到含有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒。 所述腺病毒穿梭質粒是質粒PDC316，所述腺病毒包裝細胞是293細胞。本發明更進一步提供一種HPV16L2復制缺陷型重組腺病毒疫苗，其有效成分為上述HPV16L2復制缺陷型重組腺病毒。本發明提供的HPV16L2復制缺陷型重組腺病毒疫苗可用于制備預防和治療子宮頸癌和食管癌的藥物。所述復制缺陷型重組HPV16L2腺病毒應用于制備預防和治療有一種或多種HPV病毒引起的子宮頸癌以及食管癌的藥物制劑，所述一種或多種HPV病毒選自16、18,31 和 45 型。本發明實現的技術效果如下:本發明提供的HPV16L2復制缺陷型重組腺病毒，用于制備HPV16L2復制缺陷型重組腺病毒疫苗，產生良好的細胞免疫和體液免疫，得到良好的預防效果。
圖1:pDC316_HPV16L2重組穿梭質粒酶切驗證結果圖；圖2:HPV16L2細胞內蛋白表達Western印跡分析結果圖；圖3:HPV16L2復制缺陷型重組腺病毒疫苗細胞免疫結果圖；圖4:HPV16L2復制缺陷型重組腺病毒疫苗體液免疫結果圖。
具體實施例方式實施例1:含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒的構建1.含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒穿梭質粒的構建(I)大腸桿菌DH5 α感受態細胞的制備:從37°C培養16 20h的新鮮平板上挑取DH5 α單菌落，接種于5ml不含抗菌素的LB培養基中，37°C劇烈振蕩培養過夜(12 16h)。次日從上述培養物中吸取0.5ml按1:100轉入50ml LB培養基中繼續培養約3h，至菌液的0D600值為3時，在無菌條件下將細菌轉移到一個無菌、用冰預冷的50ml離心管中，冰浴30min。在4°C條件下,4000rpm離心IOmin,棄上清，將管倒置lmin，使殘留培養液流盡，以IOml用冰預冷的lOOmmol/L CaCl2溶液重懸細菌沉淀，冰浴30min。4°C，4000rpm離心IOmin,棄上清,每50ml初始培養物用2ml預冷的含15%甘油的lOOmmol/L CaCl2溶液重懸細菌沉淀，分裝成200 μ I每管，_80°C保存備用。(2) SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的獲得:以含 SEQ ID No:1 所不的核苷酸序列的 pl6L2H(provided by Prof.JohnSchiller)質粒為模板進行PCR擴增，PCR體系:模板質粒I μ 1，上游引物I μ 1，下游引物I μ I, IOXPfu BufferlOy l,dNTP8y l,Pfu2y l,DMS05y l,ddH2072 y 1，總體系 100 μ I。經過30個循環(94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s)獲得SEQ ID No:1所示的核苷酸序列片段，PCR反應產物通過切膠回收進行純化，具體操作參見試劑盒說明書。
(3) pDC316腺病毒穿梭質粒及pBHGloxAEl，3Cre腺病毒腺病毒骨架質粒的小量制備分別挑取pDC316或pBHGloxAEl, 3Cre質粒轉化單菌落分別接種于5ml含相應抗生素的LB培養基中，37°C振蕩培養過夜。將培養物移入1.5ml Eppendorf管中，12000rpm 離心 60s,棄上清，用 100 μ I 預冷的溶液 I [50mmoI /T, Glucose, 2Smmol /I,Tris-HCl (ρΗ8.0)，IOmmoI/L EDTA (pH8.0)]重懸菌體，劇烈振蕩混勻；加入200 μ I新鮮配制的溶液II (0.2mol/L NaOH, 1%SDS)，溫和混勻，冰浴3min，至液體清亮；加入150 μ I預冷的溶液III (IOOml中含5mol/L KAc60ml,冰乙酸11.5ml，水28.5ml)溫和混勻，冰浴IOmin,12000rpm離心lOmin，小心吸取上清，將上清轉移至另一離心管中，加入2倍體積的無水乙醇室溫沉淀30min, 12000rpm離心IOmin,棄上清,沉淀用70%乙醇洗一次,室溫晾干后，用30μ I 含 RNaseAdOOy g/ml)的 TE (ρΗ8.0)溶解沉淀，37°C 水浴 30min 后置 _20°C 保存備用。(4)含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒穿梭質粒的構建上述實施例1.(2)中經過純化的SEQ ID No:1所示的核苷酸序列片段用內切酶EcoRI和HindIII進行雙酶切；使用EcoRI和HindIII對實施例1.(3)中小量制備的腺病毒穿梭質粒PDC316進行雙酶切。酶切體系:SEQ ID No:1所示的核苷酸序列片段(或pDC316)20 μ 1，BSA0.5 μ 1，10Xbuffer45y 1，內切酶 EcoRI2y 1，HindII 12 μ 1，ddH2020.5 μ 1，總的酶切體系50μ 1，37°C消化3h。雙酶切反應產物分別使用凝膠回收試劑盒進行純化，具體操作參見試劑盒說明書。建立連接反應體系，將含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列片段與PDC316片段進行連接，連接反應體系:含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列7 μ 1，pDC3161y 1，10Χ連接bufferly 1，Τ4連接酶1μ I。16°C連接過夜。將過夜連接產物分別加入ΙΟΟμΙ DH5a感受態細胞中，輕輕旋轉混勻，冰浴30min。將管移入42°C水浴箱中水浴90s,然后將管快速轉移到冰浴中，使細胞 冷卻I 2min。每管加入500 μ I不含抗生素的LB培養基，將管轉移至37°C搖床上，溫育45min(轉速<150rpm)。取50 μ I已轉化的感受態細胞，用一個無菌的彎頭玻璃涂布棒輕輕涂到含相應抗生素的瓊脂平板表面，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養12 16h。分別挑取相應重組質粒轉化單菌落接種于5ml含相應抗生素的LB培養基中，37°C振蕩培養過夜。將培養物移入1.5ml Eppendorf管中，12000rpm 離心 60s,棄上清，用 ΙΟΟμΙ 預冷的溶液 I [50mmo I /T, Glucose, 2 Smmol /I,Tris-HCl (ρΗ8.0)，IOmmoI/L EDTA (pH8.0)]重懸菌體，劇烈振蕩混勻；加入200 μ I新鮮配制的溶液II (0.2mol/L NaOH, 1%SDS)，溫和混勻，冰浴3min，至液體清亮；加入150 μ I預冷的溶液III (IOOml中含5mol/L KAc60ml,冰乙酸11.5ml，水28.5ml)溫和混勻，冰浴IOmin,12000rpm離心lOmin，小心吸取上清，將上清轉移至另一離心管中，加入2倍體積的無水乙醇室溫沉淀30min, 12000rpm離心lOmin,棄上清,沉淀用70%乙醇洗一次,室溫晾干后，用30μ I 含 RNaseA(100y g/ml)的 TE (pH8.0)溶解沉淀，37°C 水浴 30min 后置 _20°C 保存備用，重組穿梭質粒命名為PDC316-HPV16L2。(5)含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒穿梭質粒的鑒定建立酶切反應體系，分別雙酶切小量制備的pDC316-HPV16L2腺病毒穿梭質粒，酶切體系為:重組穿梭質粒5 μ 1，BSA0.2 μ 1,10Xbuffer42 μ I,內切酶EcoRIl μ 1，HindIIIly I, ddH2010.8 μ 1，總的酶切體系20 μ 1，37°C消化2h。酶切產物用I %瓊脂糖凝膠電泳分離，結果顯示，重組質粒可以雙酶切下1422bp左右特異性條帶(參見圖1 )。酶切鑒定陽性菌落送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，測序結果顯示核酸序列正確。實施例2:含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒的構建和純化(I)含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒質粒和骨架質粒的制備使用QIAGEN Plasmid Giga Kits質粒大量提取試劑盒分別提取重組腺病毒骨架質粒pBHGloxAEl，3Cre及重組腺病毒穿梭質粒pDC316_HPV16L2。具體實驗步驟見QIAGENPlasmid Giga Kits 使用手冊。(2)含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒的包裝:·
將新鮮消化的293細胞接種到75cm2細胞培養瓶中，加入15ml完全培養基，根據康碧泉QuickShuttle-293轉染試劑說明進行轉染:將40 μ g的pDC316_HPV16L2質粒、pBHGloxAEl, 3Cre質粒和100 μ I轉染試劑分別稀釋到400 μ I生理鹽水中。合并上述兩溶液并混勻。將上述復合物直接加入到細胞培養基中，輕搖細胞培養瓶以混勻。將細胞培養瓶移至37°C 5%C02孵箱中進行培養。轉染后7 10天，用細胞刮將細胞刮下，800rpm離心5min，棄上清，用2ml無菌PBS重懸細胞沉淀；_20°C和37°C反復凍融4次；3000rpm離心lOmin，吸取上清，即為原代病毒，命名為rAd-HPV16L2，-70°C保存備用。用Iml上清接種293細胞，37°C 5%C02孵育lh，然后加入含2%小牛血清的DMEM維持液(6ml)并觀察細胞病變。觀察結果顯示，被轉染的293細胞出現細胞腫脹、圓縮等典型的細胞病變。(3)含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒的純化:使用Biomiga ViraTrap Adenovirus Purification Miniprep Kit 腺病毒純化試劑盒對重組腺病毒進行純化。具體實驗步驟見Biomiga ViraTrap AdenovirusPurification Miniprep Kit 使用手冊。實施例3:含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒的鑒定及滴度分析:(I)含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒中HPV16L2基因的表達:分別以10個MOI的rAd-HPV16L2重組腺病毒和rAd-GFP病毒感染I X 106293細胞，48h后將細胞刮下，預冷PBS洗2遍，按照TRIzoI試劑說明提取細胞總蛋白，溶于1%SDS溶液中，0.1%SDS透析3次，4°C IOOOOg離心lOmin，收集上清，進行SDS-PAGE電泳，轉膜，用鼠抗HPV16L2單克隆抗體為一抗,辣根酶標記羊抗鼠IgG抗體為二抗,進行Western印跡分析(參見圖2)。結果顯示，rAd-HPV16L2可見明顯的特異性條帶，而細胞對照和rAd-EGFP對照看不見條帶。(2)含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒滴度測定:TCID5tl實驗的基礎是應用極限稀釋法使293細胞出現病變從而估計滴度。細胞的準備:準備IOml含2%胎牛血清的DMEM重懸細胞，將細胞濃度調至I X 105/ml，接種于96孔細胞培養板，每孔加入ΙΟΟμΙ。細胞貼壁后將上清棄去。病毒的稀釋:第一管中加入0.9ml含2%胎牛血清的DEME，其余則加入1.8ml。第一管中加入0.1ml病毒原液。上下抽吸5次使他們混勻。每一次稀釋后都更換吸頭。從第一管中吸取0.2ml加入第二管。重復這個稀釋步驟直到最高稀釋度。96孔板的每一排10孔作為一個稀釋度。11，12列不加病毒作為陰性對照。實驗孔每孔加入0.1ml不同稀釋度病毒。把96孔板放在37°C孵箱培養10天，觀察病變。只要有一個小病變此孔即作為陽性對待，如果不易判斷可跟陰性對照做比較。最后按公式T=101+d(s_°_5)計算病毒的滴度(d為稀釋度的對數值，s為病變比例的和)。結果顯示,重組腺病毒的滴度達到I X 109PFU/ml。實施例4:含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒免疫原性的研究:(I)動物免疫:4-6周齡，雌性BALB/c小鼠。共分3組，每組組各10只小鼠，分別為PBS對照組、rAd-EGFP對照組和重組腺病毒rAd_HPV16L2。使用劑量為I X IO8PFU/只，肌肉注射，初次免疫后2周進行加強免疫。于加強免疫后2周摘取小鼠的脾臟并收集各組小鼠血清。(2)血清標本和脾細胞的收集:免疫前以眼眶取血方式分別采集各組小鼠血清，加強免疫2周后以摘眼球方式采集各組小鼠血清。室溫靜置30min后，5000rpm離心5min，收集血清，分裝小份置-20°C保存。在超凈臺中取出小鼠脾臟。在35mm培養皿中放入4ml EZ-Sep Mousel X淋巴細胞分離液。研磨小鼠脾臟，把懸有脾臟細胞的分離液立即轉移到15ml離心管中，覆蓋400uL的1640培養基(保持液面分界明顯)。室溫，800g離心30min。吸出淋巴細胞層，再加入10mll640培養基，顛倒洗滌。室溫，250g離心IOmin收集細胞。傾倒上清液，用無血清培養基重懸細胞，細胞計數。(3) ELISP0T檢測細胞免疫向預包被的ELISP0T的板子中 每孔加入200 μ I EZ-Culture無血清培養基，室溫靜置5-10min后將其扣出，加入細胞懸液，每孔100μ 1，細胞濃度為3Χ 105cells/well，并設置好正負對照。每孔中選擇好的預測好的刺激物10μ 1，所有樣品和刺激物加完后，蓋好板蓋。放入37°C，5% CO2培養箱培養16-20hr。結果顯示，含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒免疫誘導產生了良好的細胞免疫效果，每I X IO6細胞可以產生870個免疫斑點，參見圖3。(4)抗HPV交叉中和抗體的檢測按文獻報道的方法(Buck,C.B.，D.V.Pastrana, D.R.Lowy, et, al.J.Virol.2004, 78:751 - 757.)制備 HPV16、18、33、45 假病毒顆粒。在檢測前 6h 接種3X104cells/well293FT細胞于96孔細胞培養板中，將HPV16、18、33、45假病毒顆粒與系列稀釋的血清孵育lh，將假病毒顆粒-待測血清混合液加入接種有293FT細胞的96孔板上，繼續孵育72h，取40 μ I細胞培養上清，按順序加入新的96孔板中，加入20 μ 10.05%CHAPS,加入200 μ I顯色底物，室溫避光孵育2h，Bio-Rad550型酶標儀測定405nm波長下的OD值。結果判定:中和抗體的滴度定義為SEAP活性較陰性對照組降低50%的血清最大稀釋度。結果顯示，含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒免疫誘導的血清中和抗體平均滴度可達1:80 (P〈0.01)，參見圖4。本發明提供如上限定的含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒作為預防和治療子宮頸癌以及食管癌疫苗的應用。根據本發明含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒的一個優選實施方案，含SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的重組腺病毒疫苗可誘導產生良好的細胞免疫，通過ELISP0T檢測特異性斑點數不低于870/106細胞，同時可在免疫小鼠體內誘導不小于1:40的抗HPV血清交叉中和抗體。1.序列 ISEQ ID No:1所示的核苷酸序列:latgaggcaca agaggagcgc caagaggacc aagagggcca gcgccaccca gctgtacaag
61acctgcaagc aggccggcac ctgccccccc gacatcatcc ccaaggtgga gggcaagacc121atcgccgacc agatcctgca gtacggcagc atgggcgtgt tcttcggcgg cctgggcatc181ggcaccggca gcggcaccgg cggcaggacc ggctacatcc ccctgggcac caggcccccc241accgccaccg acaccctggc ccccgtgagg ccccccctga ccgtggaccc cgtgggcccc301agcgacccca gcatcgtgag cctggtggag gagaccagct tcatcgacgc cggcgccccc361accagcgtgc ccagcatccc ccccgacgtg agcggcttca gcatcaccac cagcaccgac421accacccccg ccatcctgga catcaacaac accgtgacca ccgtgaccac ccacaacaac481cccaccttca ccgaccccag cgtgctgcag ccccccaccc ccgccgagac cggcggccac541ttcaccctga gcagcagcac catcagcacc cacaactacg aggagatccc catggacacc601ttcatcgtga gcaccaaccc caacaccgtg accagcagca cccccatccc cggcagcagg661cccgtggcca ggctgggcct gtacagcagg accacccagc aggtgaaggt ggtggacccc721gccttcgtga ccacccccac caagctgatc acctacgaca accccgccta cgagggcatc781gacgtggaca ac accctgta cttcagcagc aacgacaaca gcatcaacat cgcccccgac841cccgacttcc tggacatcgt ggccctgcac aggcccgccc tgaccagcag gaggaccggc901atcaggtaca gcaggatcgg caacaagcag accttgagga ccaggagcgg caagagcatc961ggcgccaagg tgcactacta ctacgacttg agcaccatcg accccgccga ggagatcgag1021ctgcagacca tcacccccag cacttacacc accaccagcc acgccgccag ccccaccagc1081atcaacaacg gcctgtacga catctacgcc gacgacttca tcaccgacac cagcaccacc1141cccgtgccca gcgtgcccag caccagcctg agcggctaca tccccgccaa caccaccatc1201cccttcggtg gcgcctacaa catccccctg gtgagcggcc ccgacatccc catcaacatc1261accgaccagg cccccagcct gatccccatc gtgcccggca gcccccagta caccatcatc1321gccgacgccg gcgacttcta cctgcacccc agctactaca tgctgaggaa gaggaggaag1381aggctgccct acttcttcag cgacgtgagc ctggccgcct ga2.序列 2上游引物:tatagaattcatgaggcacaagaggagcgc下游引物:tatcaagctttcaggcggccaggctcacgt
權利要求
1.HPV16L2重組腺病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述腺病毒含有密碼子優化型HPV16L2的核苷酸序列SEQ ID No:1，包括如下步驟: (1)使用限制性內切酶EcoRI和HindIII消化重組腺病毒穿梭質粒pDC316，然后將回收片段和同樣用內切酶EcoRI和HindIII雙酶切的SEQ ID No:1所示的核苷酸片段連接，得到重組腺病毒穿梭質粒PDC316-HPV16L2 ； (2)用步驟(I)制備的重組腺病毒穿梭質粒和重組腺病毒骨架質粒共轉染腺病毒包裝細胞，得到攜帶有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列的HPV16L2重組腺病毒疫苗。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的腺病毒骨架質粒是質粒pBHGloxAEl, 3Cre。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述的腺病毒包裝細胞是質293細胞。
4.根據權利要求1所述的方法制備的HPV16L2重組腺病毒疫苗的應用，其特征在于，所述復制缺陷型重組HPV16L2腺病毒應用于制備預防和治療有一種或多種HPV病毒引起的子宮頸癌以及食管癌 的藥物制劑，所述一種或多種HPV病毒選自16、18、31和45型。
全文摘要
本發明涉及HPV16L2重組腺病毒疫苗的制備方法。其特征在于，所述腺病毒含有密碼子優化型HPV16L2的核苷酸序列SEQ ID No1，包括如下步驟使用限制性內切酶EcoRI和HindIII消化重組腺病毒穿梭質粒pDC316，然后將回收片段和同樣用內切酶EcoRI和HindIII雙酶切的SEQ ID No1所示的核苷酸片段連接，得到重組腺病毒穿梭質粒pDC316-HPV16L2；用制備的重組腺病毒穿梭質粒和重組腺病毒骨架質粒共轉染腺病毒包裝細胞，得到攜帶有SEQ ID No1所示的核苷酸序列的復制缺陷型重組腺病毒。所述病毒應用于制備預防和治療HPV病毒引起的子宮頸癌以及食管癌的藥物制劑。本發明產生良好的細胞免疫和體液免疫，得到良好的預防效果。
文檔編號A61P31/20GK103191444SQ20131011195
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月2日 優先權日2013年4月2日
發明者周玉柏, 曾毅, 郭艷濤, 李澤琳, 李勁濤 申請人:北京工業大學