基于優化MERS-CoV棘突蛋白編碼基因的重組5型腺病毒載體疫苗的制作方法
【專利說明】基于優化MERS-CoV棘突蛋白編碼基因的重組5型腺病毒載體 疫苗
[0001 ]技術領域本發明設及一種可表達MERS-CoV棘突蛋白的重組5型腺病毒載體疫苗
【背景技術】 [0002] 中東呼吸系統綜合癥冠狀病毒(Middle East Respiratory Syn化ome Coranavirus，MERS-CoV)是2012年4月在中東地區，從一名患有急性呼吸窘迫綜合征病人體 內分離獲得的一種新型冠狀病毒，其病死率較高。據WK)官方數據顯示，截止至2015年2月26 日，全球實驗室確診MERS-CoV感染者共計1030例，其中包括381例死亡病例。研究表明單峰 駝可能為該病毒的動物傳染源和儲存宿主，但其傳染途徑尚不明確，目前亦無有效藥物對 抗其感染，因此研制一種有效疫苗預防MERS-CoV感染迫在眉睫。
[0003] MERS-CoV與其他冠狀病毒相似，是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒。病毒表面的棘 突蛋白S蛋白是病毒包膜上特異性的組織結構，在病毒的表面形成大量刺突，在病毒入侵祀 細胞W及病毒與細胞發生交互作用時發揮著重要的作用。多項研究表明，S蛋白疫苗可W產 生高效價的抗SARS-CoV病毒中和抗體，有效的預防SARS-CoV感染。因此冠狀病毒疫苗的研 發通常WS抗原作為主要祀抗原。
[0004] 人腺病毒載體具有高效價、易構建的特性，并且其基因組中有合適的基因插入位 點，因此，被廣泛地用于基因治療或疫苗研制。用腺病毒載體研制的預防急性呼吸綜合癥的 疫苗，已經過臨床測驗.目前，已知人腺病毒50余種，分為7個亞型(A-G)，其中人腺病毒5型 是一種呼吸道病原體，是目前為止應用最多，效果最為理想的一種腺病毒載體。為評價應用 人腺病毒載體制備抗MERS-CoV重組疫苗，本發明構建了載有MERS-CoV S基因的復制缺陷型 重組5型腺病毒載體疫苗rAd5/MERS-S。大量擴增和純化后，經肌肉注射或灌胃途徑免疫，6- 8周齡的雌性BALB/c小鼠，通過細胞免疫和體液免疫指標的檢測，在小鼠體內評估該重組疫 苗的免疫原性。
【發明內容】
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[000引研發一種表達MERS-CoV棘突蛋白的重組5型腺病毒載體疫苗，并在小鼠體內檢測 該疫苗的免疫效果。
【附圖說明】
[0006] 圖 1: Ad5-GFP 及 Ad5-M 邸 S-S 的構建
[0007] 圖2 Ad5-GFP及Ad5-MERS-S的westernblot(A)和免疫巧光(B)鑒定結果 [000引圖3:動物免疫和標本檢測示意圖
[0009] 圖4:免疫后4w(A)和16w(B)血清IgG抗體檢測
[0010] 圖5:免疫后4w(A)和16w(B)血清IgA抗體檢測
[0011] 圖6:圖6免疫后4w和16w肺泡灌洗液(A，B)，小腸灌洗液(C，D)和大腸灌洗液化，F) IgA抗體檢測
[001引圖7:免疫后4w(A)和16w(B)血清中和抗體檢測
[0013] 圖8:免疫后4w和16w脾細胞化ISpot檢測
【具體實施方式】：
[0014] 下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而 不是限定。W下實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如《分子克隆實驗 指南》(第Ξ版，科學出版社，2005)等本領域常用工具書中所述的條件，或按試劑生產廠家 所建議的條件進行。
[0015] 實施例1:攜帶優化的MERS-CoV S基因的重組5型腺病毒的包裝及鑒定
[0016] 依據GenBank(JX869059)中MERS-CoV基因序列，優化并人工合成S基因。將優化后 的S基因插入到pShuttle-CMV載體構建重組質粒pSh5-MERS-S(見圖1)。將其線性化處理后 與pA祀as廠1共同轉染大腸桿菌BJ5183,獲得重組質粒pAd5-MERS-S.。化cl線性化處理重組 質粒pAd5-MERS-S后，用脂質體2000轉染皿K293細胞，獲得重組病毒Ad5-MERS-S。經過2次 CsCl梯度離屯、后，獲得純化的重組病毒Ad5-MERS-S。同樣方法獲得重組病毒Ad5-GFP用于對 照。
[0017] 重組病毒Ad5-MERS-S感染肥K293細胞，劑量為lOvp/細胞。轉染48小時后，提取細 胞總蛋白，經SDS-PAGE電泳后，電轉至PVDF膜，用1: 200兔抗MERS-CoV抗體及1: 200的山羊抗 兔二抗鑒定S蛋白的表達。轉染重組病毒Ad5-MERS-S的肥K293細胞經固定后，用兔抗MERS- CoV-抗W及FITC標記山羊抗兔二抗結合后，巧光顯微鏡下觀察蛋白的表達情況。同時用重 組病毒Ad5-GFP轉染肥K293細胞做對照。WesternBlot和免疫巧光均見S目的蛋白的表達(見 圖2)。
[0018] 實施例2:動物免疫與樣品收集：
[0019] 2. mBALB/c小鼠為實驗動物，將純化后的重組病毒免疫小鼠，W檢測其所誘導的 體液免疫和細胞免疫應答，具體的免疫方案如下
[0020] 選取4-6周齡雌性BALB/c小鼠，如表1所示隨機分為5組，每組10只，分別肌肉或灌 胃注射免疫重組病毒Ad5-MERS-S或Ad5-GFP。免疫后4周，每組隨機抽取5只小鼠，處死后分 離小鼠血清，肺泡灌洗液，大腸和小腸灌洗液W及脾臟淋己細胞。用于檢測疫苗所誘導的體 液免疫和細胞免疫水平。免疫后16周，處死剩余小鼠，分離血清，肺泡灌洗液，大腸和小腸灌 洗液W及脾臟淋己細胞。用于疫苗誘導的長效免疫效果檢測(見圖3)。
[0021 ]表1動物免疫分組
[0022]
[0023] 實施例3:免疫血清中抗原特異性抗體的檢測：
[0024] 3. 1免疫血清中抗原特異性IgG的ELISA測定：受體結合結構域（Receptor bingding domain，RBD)為棘突蛋白S的部分片段，采用重組R抓蛋白包被化ISA板，lOOng/ 孔。將免疫血清用稀釋液從1:100作倍比稀釋，二抗為辣根過氧化物酶皿P標記的山羊抗小 鼠 IgG二抗，W未免疫小鼠血清稀釋后檢測的A450/630值的平均值的2.1倍作為界值，各組 實驗動物血清檢測IgG抗體見圖4。由圖可見，重組病毒Ad5-MERS-S免疫后，無論肌肉注射還 是灌胃途徑，均在小鼠體內誘導了高效價的抗原特異性IgG抗體，抗體在小鼠體內可持續至 少16w。短期內（4w)肌肉注射可誘導較高水平的IgG抗體(見圖4A)，長期后（16w)兩種免疫方 式誘導的特異性IgG抗體未見明顯差別（見圖4B)。
[002引3.2系統和粘膜抗原特異性IgA的化ISA測定：采用重組RBD蛋白包被化ISA板， lOOng/孔。檢測免疫后小鼠血清，肺泡灌洗液，大腸和小腸灌洗液中IgA的表達。二抗為皿P 標記的山羊抗小鼠 IgA二抗。如圖5所示，重組病毒Ad5-MERS-S經灌胃途徑免疫小鼠，可在其 體內誘導系統（血清)抗原特異性IgA的表達，且IgA抗體在小鼠血清中可持續至少16W。同 樣，在重組病毒Ad5-MERS-S灌胃途徑免疫小鼠的大腸和小腸灌洗液中均檢測到IgA的表達， 且在體內持續時間至少達免疫后16w。
[0026] 實施例4.免疫血清中和抗體的檢測：
[0027] 4.1假病毒中和實驗：
[0028] 免疫小鼠血清WPBS進行倍比稀釋，各取50ul與等體積的MERS-CoV假病毒懸液(病 毒含量為200TCID50)混勻，37°C解育化后加入于96孔培養的化h7細胞培養板中進行感染。 37°C5%C02解育48h后，將所感染的細胞裂解并進行巧光素酶活性分析。每個樣本均做3孔 進行重復，避免誤差。血清的中和活性采用W下計算方法獲得：
[0029] 將陰性對照血清與MERS-CoV假病毒懸液共解育所獲得的相對巧光素酶讀值作為 RLU1，W免疫血清與MERS-CoV假病毒懸液共解育所獲得的相對巧光素酶讀值作為化U2，貝。 各血清的中和率(Neutra 1 i sat ion Rate) NR = (RLU1-RLU2) /RLU1。
[0030] 將血清中和率達50%時，抗體的稀釋倍數計算于圖7,可見重組病毒Ad5-MERS-S無 論經肌肉注射或經灌胃途徑免疫小鼠，均可誘導小鼠中和抗體的產生，且該中和抗體在小 鼠血清中可持續至少16w。
[0031 ]實施例4.免疫小鼠細胞免疫水平檢測：
[0〇3引采用ELISpot實驗：處死小鼠，無菌條件下分離脾細胞，調整淋己細胞濃度至 IXloVml。用稀釋的化rified Anti-mouse IFN-丫包被化ISpot板過夜。將小鼠淋己細胞 (5X105/孔）加入到包含抗原膚的膚池（終濃度4μg/ml)中刺激Mh后，用Biotinylated Anti-mouse IFN- 丫做二抗，ELISPOT計數儀讀數分析產生IFN- 丫的細胞數。如圖8所示，重 組病毒Ad5-MERS-S經灌胃途徑免疫小鼠則未能在小鼠體內誘導有效的細胞免疫應答。經肌 肉注射免疫小鼠，可在其體內誘導較高水平的細胞免疫應答，且該細胞免疫應答在小鼠體 內可持續至少16w。
【主權項】
1. 一種優化的編碼中東呼吸系統綜合癥冠狀病毒(MERS-CoV)S蛋白的合成基因。2. 高效表達MERS-CoV S蛋白的重組5型腺病毒載體疫苗的制備。3. 該制劑作為常規疫苗(肌肉注射)或粘膜疫苗（口服或灌胃）在MERS-CoV預防與治療 中的應用。
【專利摘要】發明名稱：基于優化MERS-CoV棘突蛋白編碼基因的重組5型腺病毒載體疫苗。本發明首先優化合成了中東呼吸綜合癥冠狀病毒(MERS-CoV)棘突蛋白(S)的編碼基因，將其插入pShuttle-CMV載體，獲得重組質粒pAd5-MERS-S；轉染HEK293細胞，獲得拯救病毒Ad5-MERS-S。證實S蛋白高效表達后制備純化的病毒Ad5-MERS-S，經肌肉注射或灌胃途徑免疫B？ALB/c小鼠，通過ELISPot、IgG及中和抗體檢測，證明該重組腺病毒載體疫苗有較強免疫原性，可在小鼠體內誘導有效的免疫應答(體液免疫，細胞免疫及粘膜免疫)，可作為理想的疫苗用于預防或治療MERS-CoV感染。
【IPC分類】C12N15/50, A61K39/215, A61K48/00, A61P31/14
【公開號】CN105543248
【申請號】CN201510109558
【發明人】譚文杰, 魯茁壯, 郭小娟, 藍佳明, 鄧瑤, 陳紅, 洪濤
【申請人】中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年3月13日