專利名稱：一種綠臭蛙抗氧化肽odorranain-H-OM及其編碼序列的基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子遺傳學領域,尤其是一種綠臭娃抗氧化肽odorranain-H-OM及編碼序列的基因與應用。
背景技術：
任何包含一個未成對電子的原子或原子團，均稱之為自由基。生物體系主要遇到的是氧自由基，例如超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫、脂質過氧自由基、二氧化氮自由基、一氧化氮自由基、單線態氧和臭氧。細胞內的自由基來源包括紫外線的照射，電離輻射，藥物，環境毒素，黃嘌呤氧化酶，內質網上的細胞色素P-450酶類和質膜NADPH氧化酶等。線粒體內膜上的氧化呼吸鏈被認為是細胞內氧自由基的主要來源。在較高濃度下，活性氧自由基對生物細胞的細胞結構、核酸、脂類和蛋白質造成損傷。造成DNA損傷，進一步引起復制錯誤、基因組不穩定、轉錄意外起始或終止，從而導致生物體變異或疾病發生；弓丨起細胞膜流動性和通透性改變，導致細胞結構和功能改變；引起蛋白質氧化，導致蛋白質變性和失活。目前一些變異實驗表明，慢性的氧化損傷尤其是來自炎癥的慢性氧化損傷跟腫瘤發生有關。例如，潰瘍性結腸炎常常伴隨高發的結腸直腸癌。在自由基與神經系統疾病方面，由于大腦用氧量極高，外加富含多不飽和脂肪酸和參與氧化還原反應的金屬離子如鐵和銅，導致大腦成為容易被氧離子自由基攻擊的器官。抗氧物目前在國內外應用廣泛，需求量逐漸增多，現在被用于預防治療多種疾病，如心血管疾病、腫瘤、關節炎、腎功能損傷、糖尿病、自身免疫性疾病等。此外，抗氧化物近年在化妝品領域的應用興起，尤其是天然抗氧化物。由于皮膚的光老化作用是由于紫外線誘導皮膚細胞產生大量的氧自由基堆積而造成的。現在許多護膚品中加入抗氧化劑，有減少雀斑、防輻射、延緩衰老、調節免疫和提高皮膚自我保護的作用。關于衰老的學說有很多種，其中自由基學說是較為廣泛認可的一種。有研究發現氧氣消耗和衰老之間存在聯系，例如低耗氧可以解釋為什么蜂王壽命能比會飛的工蜂壽命長50倍；大型動物單細胞耗氧量平均比小型動物細胞少所以壽命一般較長；長壽物種的抗氧化系統往往較為強大，如動物中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽、類胡蘿卜素類和維生素E含量較高。除此之外，活性氧自由基還與多種人類疾病有關，如心腦血管疾病、缺血再灌注損傷、類風濕性關節炎和糖尿病等。為了抵抗活性氧自由基對機體的損害，在漫長的進化過程中生物體形成多種不同的自由基清除系統，包括非基因編碼的小分子物質，如尿酸、維生素C、維生素E、胡蘿卜烯類、硫辛酸和輔酶Q等；基因編碼的大分子抗氧化酶類，如超氧化物歧化酶(S0D)、過氧化氫酶、過氧化物酶、硫氧還蛋白酶系統和谷胱甘肽酶系統；基因編碼的小分子抗氧化肽類，如從兩棲類蛙科動物皮膚中發現的各種小分子抗氧化多肽。各種不同類型的自由基清除劑在醫藥和化妝品領域具有極大的應用潛力，如維生素C、超氧化物歧化酶(SOD)和小分子抗氧化多肽。綠臭娃margaratae)屬于兩棲綱無尾目娃科臭娃屬。目前關于綠臭娃來源抗氧化多肽的研究還沒有報道。
發明內容
技術要求
本發明所要解決的技術問題是提供一種綠臭娃抗氧化肽odorranain-H-OM。本發明還要解決的技術問題是提供上述蛋白的編碼序列。本發明還要解決的技術問題是提供上述蛋白在制備抗氧化藥物或化妝品添加劑的應用。本發明是這樣實現的:一種綠臭娃抗氧化肽odorranain-H-OM,它是具有序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白質。所述的綠臭娃抗氧化肽odorranain-H-OM具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；該綠臭蛙抗氧化肽odorranain-H-OM為直鏈多肽，含有27個氨基酸殘基，分子量為2995.71 Da，等電點為 9.78。綠臭娃抗氧化 肽odorranain-H-OM的編碼基因，它是下列核苷酸之一:
(1)序列表中SEQID NO:1所不的核昔酸序列；
(2)編碼序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸；
(3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。綠臭娃抗氧化肽odorranain-H-OM的編碼基是序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。綠臭娃抗氧化肽odorranain-H-OM在制備抗氧化藥物或化妝品添加劑中的應用。有益效果
本發明克隆得到綠臭蛙抗氧化肽odorranain-H-OM的編碼基因，并利用化學合成的方法合成了綠臭娃抗氧化肽odorranain-H-OM,它具有極強的抗氧化活性、分子量小、結構簡單、溶血活性低、制備方法簡單等有益特點。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。本發明的實施例1:綠臭娃抗氧化肽odorranain-H-OM基因克隆。I)綠臭蛙皮膚總RNA提取:
①取300 mg綠臭蛙皮膚組織，放入研缽中加入液氮研磨成粉末，轉移到EP管中，加入Iml總RNA提取緩沖液(Trizol，美國Invitrogen公司產品)，充分混勻，而后于4°C，12000rpm 離心 10 min。
②離心取上清，加入0.2 ml氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，而后以4°C，12000 rpm離心10分鐘，棄除沉淀。③上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，以4°C，12000 rpm離心10分鐘，收集沉淀用75% (V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為綠臭蛙皮膚總RNA。2)綠臭蛙皮膚cDNA文庫構建:采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit。(l)cDNA第一鏈合成(mRNA反轉錄):
①經DEPC處理(DEPC處理是在含0.1% (V/V) DEPC的水浸泡過夜，高壓滅菌，烘干)的離心管中加入I P I綠臭娃皮膚總RNA、1 μ I 3’端一鏈合成引物(3’In-Fusion SMARTerCDS Primer)和2.5 μ I DEPC處理的水(DEPC處理的水是含0.1% DEPC (V/V)的水，放置過夜，高壓滅菌)使總體積達到4.5 μ 1，混勻后短暫離心(2000 rpm, 30 S)，離心后于72°C保溫3分鐘；保溫后再將離心管在42°C孵育2分鐘。②在上述離心管中加入以下試劑(均為CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建庫試劑盒中配備)，2.0 μ I 5 X第一鏈緩沖液、0.25 μ I 100 mM DTTU.0 μ I 10 mM dNTP Mix、1.0 μ I SMARTerV Oligonucleotide、。.25 μ I RNase Inhibitor 和 1.0 μ I SMARTScribe ReverseTranscriptase反轉錄酶,混合離心管中試劑并短暫離心(2000 rpm, 30 s),在42°C保溫90 min，然后68°C保溫10 min。保溫處理后將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2 μ I所合成的cDNA第一鏈備用。(2)采用長末端聚合酶鏈式反應(LD- PCR)方法擴增第二鏈(所用試劑均為CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建庫試劑盒中配備)①將 2 μ I cDNA 第一鏈(mRNA 反轉錄)、80 μ I 去離子水、10 μ I IOXAdvantage 2PCR 緩沖液、2 μ I 50XdNTP 混合物、2 μ I 5’PCR 引物、2 μ I CDS ΠΙ/3’ PCR 引物以
及 2 μ I 50 XAdvantage 2 Polymerase Mix 在 95°C預熱的 PCR 管中進行混合。②在PCR儀中按以下程序擴增:95°C，1 min ; 18個循環:95°C，15 sec，65°C，30sec,68°C,6 min。循環結束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈一 80°C保存。(3)綠臭娃抗氧化肽odorranain-Μ-ΟΜ基因克隆篩選:
根據蛙科抗菌肽信號肽區保守序列設計正向引物進行PCR擴增，其序列為5’ -CCAAAGATGTTCACCTTGAAG-3’， PCR 另一擴增引物為 CL0NTECH 公司 In-FusionSMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 中的 3，-PCR 引物，其序列為S’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-S'PCR反應在如下條件下進行:94 °C 4 min,94 °C 30 sec,57°C 30 sec和72 V I min，30個循環。擴增完成后用膠回收試劑盒(天根生物)進行目的片段回收。將回收的目的片段連接到PMD19-T載體(Takara，大連)，轉化進CaCl2-MgCl2法制備好的DH5ci感受態細胞。涂板并進行氨芐青霉素和藍白斑雙重篩選，挑取單菌落用M13引物PCR檢測插入片段大小。挑取陽性菌落,搖菌提取質粒,使用Applied BiosystemsDNA sequencer, model ABI PRISM 377 進行核苷酸測序。測定結果:編碼綠臭娃抗氧化肽odorranain-M-OM的基因自5’端至3’端序列SEQ ID No:1所示綠臭蛙抗氧化肽odorranain-M-OM基因核苷酸的序列表為:序列長度為339個堿基，序列類型:核酸，鏈數:單鏈，拓撲學:直鏈狀，序列種類:cDNA，來源:綠臭蛙皮膚。
實施例2:綠臭娃抗氧化肽odorranain-M-OM的化學合成。1、綠臭蛙抗氧化肽odorranain-M-OM的化學合成方法:根據基因推導的成熟肽氨基酸序列，用自動多肽合成儀(433A, Applied Biosystems)合成其全序列,通過HPLC反相柱層析脫鹽。I1、分子量測定采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALD1-T0F)。II1、純化的綠臭娃抗氧化肽odorranain-M-OM用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALD1-T0F)，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。綠臭娃抗氧化肽odorranain-M-OM是綠臭娃抗氧化肽odorranain-M-OM基因編碼的一種直連多肽，含有二十七個氨基酸殘基，分子量2995.71 Da，等電點9.78。綠臭蛙抗氧化肽odorranain-M-OM全序列如如SEQ ID No:2所示。實施例3:綠臭娃抗氧化肽odorranain-M-OM:
1> odorranain-M-OM抗氧化活性測定:
ABTS (3-ethyIbezothiazoIine-6-sulfonic acid) (3_ 乙基苯并噻唑啉 _6_ 橫酸)用PBS緩沖液(ρΗ7.4)配成2 mM的ABTS儲存液。將ABTS儲存液和70 mM過硫酸鉀(K2S2O8)水溶液按體積比250:1混合，于室溫避光放置15-16 h。試驗開始前，將ABTS.+釋至734nm波長處的吸光值為0.80 ± 0.03。將4 μ 不同濃度的上述odorranain-M-OM抗氧化肽樣品和96 μ 上述校正過的ABTS.+溶液混合，室溫放置10 min后，于734 nm波長處檢測反應液的吸光值。空白對照組為溶解樣品所用滅菌去離子水。實驗做三個平行(表I)。ABTS.+清除率 I(%)= (Ab — Aa)/ Ab X100 (AB:空白對照組吸光值；AA:樣品組吸光值)。表1.0dorranain-M-OM 抗氧化活性
權利要求
1.一種綠臭娃抗氧化肽odorranain-H-OM,其特征在于:它是具有序列表中SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQID NO:2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的綠臭娃抗氧化肽odorranain-H-OM,其特征在于:所述的綠臭娃抗菌肽odorranain-H-OM具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；該綠臭娃抗氧化肽odorranain-H-OM為直鏈多肽，含有27個氨基酸殘基，分子量為2995.71 Da，等電點為9.78。
3.—種如權利要求1所述的綠臭娃抗氧化肽odorranain-H-OM的編碼基因,其特征在于:它是下列核苷酸之一: (1)序列表中SEQID NO:I所不的核昔酸序列； (2)編碼序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸； (3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的綠臭娃抗氧化肽odorranain-H-OM的編碼基因,其特征在于:綠臭娃抗氧化肽odorranain-H-OM的編碼基是序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
5.—種如權利要求1所述的綠臭娃抗氧化肽odorranain-H-OM在制備抗氧化藥物或化妝品添加劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種綠臭蛙抗氧化肽odorranain-H-OM，它是具有序列表中SEQIDNO1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQIDNO2的氨基酸殘基序列經過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQIDNO2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQIDNO2衍生的蛋白質。本發明克隆得到綠臭蛙抗氧化肽odorranain-H-OM的編碼基因，并利用化學合成的方法合成了綠臭蛙抗氧化肽odorranain-H-OM，它具有極強的抗氧化活性、分子量小、結構簡單、溶血活性低、制備方法簡單等有益特點。
文檔編號A61K38/17GK103193876SQ20131013131
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月16日 優先權日2013年4月16日
發明者周江, 凌桂英, 高久香, 李莉, 王義鵬 申請人:貴州師范大學