Caspase-3抑制劑在制備促進腦中風后神經再生的制劑中的用途

Caspase-3抑制劑在制備促進腦中風后神經再生的制劑中的用途
【專利摘要】本發明屬細胞生物學領域，涉及Caspase-3抑制劑在制備促進腦中風后神經功能重塑制劑中的用途。本發明經腦中風小鼠模型動物實驗，結果顯示，在腦中風的恢復期，caspase-3在腦室下區和海馬齒狀回的新生神經前體細胞中的表達明顯增加，體外培養提取的神經前體細胞顯示，caspase-3限制神經前體細胞的自我更新能力，但并不引起細胞的凋亡；所述caspase-3通過降低Akt的磷酸化對神經再生進行調控；實驗結果證實，用caspase-3抑制劑抑制caspase-3活性能顯著促進腦室下區的神經前體細胞的增殖和遷移，從而促進神經元的再生和腦中風后的神經功能恢復。
【專利說明】Caspase-3抑制劑在制備促進腦中風后神經再生的制劑中的用途

【技術領域】
[0001]本發明屬細胞生物學領域，涉及Caspase-3抑制劑在促進腦中風后神經再生中的用途，具體涉及Caspase-3抑制劑在制備促進腦中風后神經功能重塑制劑中的用途。

【背景技術】
[0002]據報道，腦中風是全球性致死和致殘的主要原因之一。有研究指出，tPA溶栓治療對急性缺血性腦腦中風具有明顯的療效；但是，許多未能及時接受tPA溶栓治療的腦中風患者，往往會留下嚴重的后遺癥，包括偏癱、感覺缺失、記憶損失等。盡管醫學界一直在不斷地努力，但是至今仍然沒有有效的針對腦腦中風后神經功能受損的治療方法。
[0003]近年的研究表明，神經再生一直存在于成年哺乳動物的腦室下區和海馬齒狀回。腦中風時，會刺激上述兩個區域的神經再生反應，導致神經前體細胞遷移到梗死的邊緣并進一步分化為成熟的神經元；新生的神經元有助于修復腦中風造成的神經功能缺失。
[0004]已知Caspases屬于半胱氨酸蛋白酶家族，在凋亡中起著中樞性的調節作用。Caspase已經被證明在許多的中樞神經系統疾病中起著介導程序性神經元死亡的作用。研究顯示，Caspase-3是一種主要的凋亡執行因子，是程序性細胞死亡的關鍵執行分子之一；Caspase-3能夠裂解許多的細胞底物，并且誘導DNA斷片化(凋亡的主要特征)；有文獻報道，在腦缺血和腦外傷急性期抑制caspase-3活性可強力地保護神經元受損。近來的研究證明caspase激活,尤其是caspase-3激活，與許多不引起細胞死亡的生物過程有關，例如樹突減少、突觸抑制、細胞分化及代償增殖等生物過程；還有研究發現，腦中風后在非凋亡的星形膠質細胞中檢測到大量的caspase-3 ;但是,迄今尚未見有關Caspase-3在腦中風后神經再生中的作用的報道。
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【發明內容】

[0067]本發明的目的是提供Caspase-3抑制劑在促進腦中風后神經再生中的用途，具體涉及Caspase-3抑制劑在制備促進腦中風后神經功能重塑制劑中的用途。
[0068]本發明所述的Caspase-3抑制劑可通過市購渠道獲得，本發明的實施例中優選caspase-3 抑制劑 Z-DEVD-fmk。
[0069]本發明的Caspase-3抑制劑進行了腦中風小鼠模型動物實驗，結果顯示，所述caspase-3為抑制腦中風后神經再生的關鍵內源性成分,抑制caspase-3的活性能增加腦中風后的神經再生反應；結果表明，抑制caspase-3能增強腦中風后大腦組織神經功能重塑。
[0070]本發明的動物實驗中采用的材料包括:
[0071 ] ①試劑和抗體(均可通過市購渠道獲得);
[0072]②腦中風模型
[0073]按現有技術的方法制備小鼠模型；取6片冠狀動脈切片(20 μ m)進行H&E染色后測量腦梗死的大小；梗死采用NIHImageJ軟件分析測定，并表示為對側半腦的百分比；
[0074]采用的實驗方法包括:
[0075]①BrdU標記，②注射Caspase-3抑制劑，③行為學測試，④免疫組織化學，⑤TUNEL染色，⑦FlUOT0-JadeB染色，⑧細胞計數，⑨神經球培養和免疫細胞化學及⑩流式細胞術坐寸ο
[0076]實驗中進行如下分析:
[0077]①Westernblot 分析
[0078]分離腦中風后第12天的缺血側大腦半球的腦室下區，使用含有蛋白酶抑制劑cocktails的RIPA裂解液提取腦室下區或神經球中的蛋白；離心后，通過BCA蛋白分析法測定蛋白濃度；等量的蛋白樣本分別加到8%，10%和12%Tris-甘氨酸凝膠上電泳，轉移到PVDF膜上；膜用5%的脫脂牛奶(脫脂奶粉溶于含0.1%吐溫20的TBS)封閉，一抗孵育，力口入辣根過氧化物酶結合的二抗后，然后通過B1-1mageAnalysisSystem(B1-Rad)掃描光密度進行定量；
[0079]②數據分析
[0080]數值用平均值土標準差表示；在經過Bonfeironi’ s多重比較檢測后，采用單因素方差分析進行數據處理；兩組比較時，采用未配對雙尾Studentt檢驗或MannWhitneyU檢驗，P〈0.05為有統計學差異；
[0081]實驗結果顯示了:
[0082](I)腦中風后神經干細胞和細胞死的時間、空間分布情況，
[0083]腦中風刺激腦室下區和海馬齒狀回區的神經再生反應，梗死周邊的皮層區對腦中風后腦功能的恢復起關鍵作用；結果表明，缺血大腦中神經再生和細胞死亡展現著不同的時間和空間模式，并且在損傷側大腦皮層區神經再生比細胞死亡持續的時間更長；
[0084](2)在腦中風恢復期caspase-3在神經再生區的表達明顯上升，在腦中風的恢復期，caspase-3與其在急性期所起的作用不同；
[0085]確定caspase-3的細胞定位；Caspase_3與BrdU或DCX雙染發現，caspase-3在腦室下區)和海馬齒狀回區的BrdU陽性新生細胞和DCX陽性的神經前體細胞中均有表達，表明上述caspase-3陽性細胞是增殖的神經前體細胞；此外，在上述區域未檢測到caspase_7和 caspase-8 ；
[0086]采用抗caspase-3抗體和斷裂DNA標記物(TUNEL)進行雙染,結果顯示,caspase-3陽性細胞并不呈現TUNEL陽性，caspase-3陽性細胞的核為非固縮；
[0087]采用DNA凝膠電泳檢測或采用甲酚紫、FlUOT0-JadeB染色檢測組織學特征，結果顯示，腦室下區和海馬齒狀回區既無DNA損傷也無神經元損傷的組織學特征；表明，在腦中風恢復期，神經再生區域增殖的神經前體細胞激活caspase-3但與凋亡無關；
[0088](3)腦中風后抑制caspase-3活性促進神經前體細胞的增殖
[0089]結果表明，caspase-3抑制對神經再生的影響不是在減少腦梗死損傷之后產生；與對照組比較，Z-DEVD-fmk處理組的小鼠腦室下區的BrdU陽性細胞數和BrdU陽性的神經前體細胞分別增加45.8%和34.3% ；
[0090]檢測腦中風后14天時Z-DEVD-fmk處理組和對照組腦室下區的細胞死亡情，Z-DEVD-fmk對14天的TUNEL陽性細胞數沒有影響(Z-DEVD-fmk處理組，2.00±0.89 ;對照組，1.50 ± 1.22; P=0.34, n=6)；
[0091]上述結果表明，caspase-3在腦中風后對神經前體細胞的增殖起著重要的作用；
[0092](4) Caspase限制體外培養神經前體細胞的自我更新
[0093]選取腦中風后第七天小鼠缺血側腦室下區的神經球進行體外培養，在神經球形成階段，觀察到caspase-3在神經球中的表達,免疫細胞化學染色進一步確認上述現象；實驗結果還顯不，87.3%的caspase-3陽性細胞為TUNEL陰性,表明神經球中表達的caspase-3可能不參與細胞的凋亡過程；
[0094]米用caspase-3抑制劑Z-DEVD-fmk處理培養的神經球，該處理明顯抑制了caspase-3的表達，但未見Z-DEVD-fmk處理組和對照組神經球凋亡率有實質的差異；此外，對TUNEL陽性的神經前體細胞計數顯示Z-DEVD-fmk處理未改變細胞的死亡率(Z-DEVD-fmk處理組和對照組TUNEL陽性細胞百分率:1.92±0.04比1.86±0.03;n=15)；
[0095]分離出原代神經球，檢驗caspase-3對二代神經球形成的影響，結果顯示，Z-DEVD-fmk處理雖然對神經球的直徑和BrdU陽性率均無明顯影響，但Z-DEVD-fmk處理能夠產生更多的二代神經球，結果表明，caspase-3不是神經前體細胞死亡的執行因子，caspase-3參與調節神經前體細胞的自我更新；
[0096](5) Akt憐酸化介導caspase-3的作用
[0097]監測腦中風后12天Z-DEVD-fmk處理小鼠的腦室下區caspase-3已知底物的表達水平，結果顯示，Z-DEVD-fmk未改變磷酸化ERK、磷酸化JNK和磷酸化p38的水平，但顯著增加了磷酸化Akt的水平；結果表明，在腦中風期,抑制caspase-3的活性能通過調節磷酸化Akt促進神經前體細胞的增殖；進一步的結果表明，神經球的培養基中預先加入Akt抑制劑LY294002后，Z-DEVD-fmk對神經前體細胞自我更新的調節能力明顯降低；上述結果表明，腦中風后caspase-3對神經前體細胞增殖的調節作用是通過磷酸化Akt途徑；
[0098](6)抑制caSpaSe3活性促進神經元再生和腦中風后神經功能的重塑
[0099]采用對照劑或Z-DEVD-fmk處理小鼠，并在腦中風后14天和42天檢測其大腦，結果顯示，在腦中風后42天而不是14天時對照劑和Z-DEVD-fmk處理的小鼠腦室下區BrdU陽性細胞數均減少，表明神經前體細胞已經從腦室下區遷移到缺血半球受損區；與對照組相比，Z-DEVD-fmk處理組42天時大腦皮層的BrdU陽性細胞數明顯增加，表明抑制caspase-3促進腦中風后新生細胞的遷移；所述Z-DEVD-fmk沒有改變BrdU和GFAP陽性的細胞數目(fcdU和GFAP雙陽性細胞數，Z-DEVD-fmk處理組與對照劑組:104.61 ±38.71比85.56±15.28; P=0.29，n=6)，但其顯著增加了損傷皮層區域BrdU和NeuN雙陽性的細胞數目；結果表明，抑制caspase-3能夠促進神經元細胞的再生；抑制caspase-3提高了腦中風后小鼠的運動活性；
[0100]采用beam-walking實驗檢測小鼠的運動缺失,結果顯示,在腦中風后一天時所有小鼠呈現相似的功能缺失，且Z-DEVD-fmk處理組和對照組小鼠在功能缺失方面沒有顯著差異；與對照組比較，Z-DEVD-fmk處理組的小鼠在腦中風后14天時前肢錯步數顯著減少，在28天時后肢的錯步數顯著減少；
[0101]本發明實驗的結果表明，所述caspase-3在腦中風恢復期起著非凋亡的作用；caspase-3限制體外培養的缺血腦室下區的神經前體細胞的自身更新，采用小鼠腦中風模型，發現在神經再生區caspase-3的局部上調對于神經前體細胞的增殖、遷移和成熟具有重要的影響；進一步，結果表明，抑制caspase-3的活性能改善腦中風后的功能恢復；該結果表明caspase-3是調控腦中風后神經再生的一種關鍵要素；
[0102]本實驗的結果表明，caspase-3表達的增加與腦中風誘導的神經前體細胞的增加時間基本一致；在增殖的神經前體細胞中caspase-3的表達與腦中風后細胞的凋亡過程無關；抑制caspase-3的活性增加神經前體細胞的增殖，和促進再生的神經元的增殖；上述結果與caspase-3缺失增加皮層神經元密度的實驗結論相符；本實驗雖然未檢測到caspase-3抑制劑對梗死大小的影響,但結果證實caspase-3抑制劑對神經功能恢復起重要的作用，抑制caspase-3引起的神經元再生是導致神經功能恢復的主要原因；
[0103]本實驗的結果還表明，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt失活介導了 caspase-3對神經前體細胞增殖的作用；進一步證實caspase-3的作用與ERK, JNK或p38通路無關；然而，除Akt通路外，多種其它的caspase-3底物也參與caspase-3的作用；
[0104]上述實驗結果顯示，在腦中風的恢復期，caspase-3在腦室下區和海馬齒狀回的新生神經前體細胞中的表達明顯增加，然而上述神經前體細胞卻未表現出凋亡的跡象；經對提取的缺血小鼠的腦室下區和海馬齒狀回的神經前體細胞進行體外培養，結構顯示caspase-3有限制神經前體細胞的自我更新能力，但并不引起細胞的凋亡；實驗結果還顯示,caspase-3對神經再生的調控機制是通過降低Akt的磷酸化,結果表明，使用caspase-3抑制劑抑制其活性能夠顯著促進腦室下區的神經前體細胞的增殖和遷移，從而促進神經元的再生和腦腦中風后的神經功能恢復；抑制caspase-3對急性腦腦中風具有保護作用，caspase-3可作為治療腦中風的藥物新靶點。
[0105]本發明所述的Caspase-3抑制劑可制備促進腦中風后神經再生的制劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0106]圖1.腦中風后神經再生和細胞死的發生和發展過程，
[0107]其中(A):假手術組小鼠和腦中風后第1、3、7、14天小鼠腦室下區，海馬齒狀回及梗死周邊大腦皮層代表性的BrdU免疫組化照片，標尺，100 μ m(最上和中間)，25 μ m(底部)，LV, Iateralventricle (腦室下區)；GCL, granulecell layer (顆粒細胞層);HIL, hiIus (海馬齒狀回門區)，S，sham(假手術組)；
[0108](B):腦中風后BrdU陽性細胞的時程定量，數值表示為平均值土標準差(每組n=3)，*與假手術組比，Ρ〈0.05 ；
[0109](C):假手術組小鼠和腦中風后第1、3、7、14天小鼠腦室下區，海馬齒狀回及梗死周邊皮層代表性的TUNEL染色照片，箭頭指示TUNEL陽性細胞，標尺，5ym(最上和中間)，20 μ m (底部)；
[0110](D):腦中風后TUNEL陽性細胞的時程定量，數值表示為平均值土標準差(每組n=3)，*與假手術組比，Ρ〈0.05。
[0111]圖2.在腦中風恢復期，Caspase-3在腦室下區和海馬齒狀回的表達增加，
[0112]其中，A，B:假手術組小鼠和腦中風后第1、3、7、14天小鼠腦室下區，海馬齒狀回區代表性的 caspase-3 免疫染色照片，Cas-3, caspase-3; LV, lateral ventricle (腦室下區)；GCL, granulecelllayer (顆粒細胞層);HIL, hilus (海馬齒狀回門區)。標尺50 μ m (A), 25 μ m(B)；
[0113]C:腦中風后腦室下區和海馬齒狀回區caspase-3陽性細胞的時程定量，S，sham (假手術組)，數值表示為平均值土標準差(每組n=3)，*與假手術組比，P〈0.05。
[0114]圖3.腦中風恢復期，caspase-3在神經再生區增殖的神經前體細胞中的表達增加，
[0115]其中A，B:腦中風后14天，caspase-3在腦室下區的BrdU陽性細胞和DCX陽性細胞中廣泛表達，標尺，20 μ m ；
[0116]C，D:腦中風后14天，caspase-3在海馬齒狀回區BrdU陽性細胞和DCX陽性細胞中廣泛表達，標尺，20 μ m ；
[0117]E，F:腦中風后14天，腦室下區和海馬齒狀回區caspase-3和TUNEL陽性細胞沒有共定位關系，標尺，20 μ m(小標尺，2 μ m)；
[0118]G，H:腦中風后14天，腦室下區和海馬齒狀回區的caspase-3陽性細胞沒有呈現核固縮現象(箭頭)，標尺，20 μ m ;
[0119]1:腦中風后14天，側腦室下區和海馬齒狀回的組織經過瓊脂糖凝膠電泳未檢測到DNA階梯狀分布(第三道和第四道)，DNA標識在第一道展示，第二道是取自腦中風后三天缺血區的組織作為陽性對照，標尺，20 μ m ;
[0120]J:腦中風后14天，缺血側腦室下區和海馬齒狀回通過甲酚紫染色未檢測到神經元損傷，底部是取自腦中風后一天的缺血區作為陽性對照，標尺，20 μ m ;
[0121]K:腦中風后14天，缺血側腦室下區和海馬齒狀回通過Fluoro-JadeB染色未檢測到壞死的神經元，底部是取自腦中風后一天的缺血區作為陽性對照，標尺，20 μ m,每項觀察重復3次實驗。
[0122]圖4.在腦中風恢復期，caspase抑制腦室下區神經前體細胞的增殖，
[0123]其中，A:腦中風后14天，假手術組小鼠和對照劑或caspase-3抑制劑Z-DEVD-fmk處理的小鼠腦室下區的BrdU免疫染色的代表性照片，DEVD, Z-DEVD-fmk,標尺，50 μ m ;
[0124]B:腦中風后14天，假手術組小鼠和對照劑或caspase-3抑制劑Z-DEVD-fmk處理的小鼠腦室下區BrdU和DCX雙染的代表性照片，DEVD, Z-DEVD-fmk，標尺，50 μ m (左側)，10 μ m (右側)；
[0125]C:定量測定每組的BrdU陽性細胞數。數值表示為平均值土標準差(每組n=6)，*P<0.05 ；
[0126]D:定量測定每組的BrdU和DCX共標的細胞數，數值表示為平均值土標準差
[0127]每組η=6，*Ρ〈0.05。
[0128]圖5.Caspase-3調節體外培養的腦室下區神經前體細胞的自我更新能力，未見引起神經前體細胞的死亡，
[0129]其中，
[0130]A:顯示從腦中風后7天缺血大腦中分離和培養腦室下區神經前體細胞的步驟；
[0131]Biffesternblot顯示增殖條件的神經球中caspase-3的表達情況,標示的時間點為神經球在增殖培養基中培育的時間，在加入Z-DEVD-fmk3天后，caspase-3的表達明顯減少，Cas-3, caspase-3; DEVD, Z-DEVD-fmk ；
[0132]C:免疫細胞化學染色顯示神經球中的caspase-3表達，細胞核采用DAPI染色，標尺,50 μ m(小標尺，5 μ m)；
[0133]D:神經球中caspase-3和TUNEL的雙標染色。，箭頭指不TUNEL和caspase-3雙陽性的細胞，標尺，15 μ m(小標尺，2.5 μ m)；
[0134]E:TUNEL陽性和陰性細胞在caspase-3陽性細胞中所占的百分比，數值表示為平均值土標準差(每組n=15)，數據來自三次獨立的實驗；
[0135]F:對照劑或Z-DEVD-fmk處理7天后，代表的神經球流式細胞儀AnnexinV/PI染色的圖片；
[0136]G:流式細胞儀定量顯示在對照劑和Z-DEVD-fmk處理的神經球中凋亡發生的頻率沒有實質差別，。數值表示為平均值土標準差(每組η=ιο)，數據來自于三次獨立的實驗；
[0137]H:對照劑或Z-DEVD-fmk處理7天后，神經球的代表性照片，標尺，100 μ m ；
[0138]1:Z-DEVD-fmk抑制caspase-3活性7天增加二代神經球的數量，數值表示為平均值土標準差(每組n=10)，數據來自于三次獨立的實驗，。*P〈0.05。
[0139]圖6.Akt磷酸化介導caspase-3對神經前體細胞增殖的作用，
[0140]其中，A:腦中風后12天，Z-DEVD-fmk(DEVD)抑制caspase-3對腦室下區Akt磷酸化的作用，其中的Z-DEVD-fmk對磷酸化ERK (pERK)，磷酸化JNK (pJNK)和磷酸化p38(p-p38)信號沒有影響；
[0141]B:定量測定磷酸化Akt，磷酸化ERK(pERK)，磷酸化JNK(pJNK)和磷酸化p38的表達水平，數值表示為平均值土標準差(每組n=6)，*P〈0.05。；
[0142]C，D: LY294002 (LY)消除Z-DEVD-fmk對神經前體細胞自我更新的影響，標尺，100 μ m，數值表示為平均值土標準差(每組n=8)，數據來自于三次獨立的實驗，*P〈0.05。
[0143]圖7.腦中風后抑制caspase-3活性促進大腦皮層神經元的再生并改善神經功能的恢復，
[0144]其中，A:實驗設計示意圖，在腦中風前10天埋入套管，在腦中風后第3，6，9，和12天每天兩次經側腦室(1.c.V.)注射Z-DEVD-fmk(DEVD),在腦中風后第5到13天每天兩次由腹腔(1.P.)注射BrdU，在第14天或42天時處死小鼠，dMCAO,遠端大腦中動脈閉塞；
[0145]B:第42天時損傷側大腦皮層BrdU免疫染色的代表照片，標尺，50 μ m ；
[0146]C:第42天時損傷側大腦皮層BrdU陽性神經元免疫染色的代表照片，標尺，20 μ m(左側)，10 μ m (左側)；
[0147]D, E:第42天時腦室下區BrdU標記的細胞明顯減少，Z-DEVD-fmk抑制 caspase-3活性增加42天時損傷側大腦皮層BrdU的陽性細胞數，和BrdU陽性的神經元數目；數值表示為平均值土標準差(每組n=6), *P〈0.05 ；
[0148]F，G: Z-DEVD-fmk對腦中風42天時小鼠運動活性的影響，數值表示為平均值土標準差(每組 η=7)，*Ρ〈0.05 ；
[0149]H, 1: Z-DEVD-fmk對小鼠運動缺失的影響，在腦中風后不同的時間點測定小鼠前肢和后肢的錯步數，數值表示為平均值土標準差，假手術組n=6，其它各組n=10，*P〈0.05。
[0150]圖8顯示了，
[0151]A:腦中風后第3天時，給予caspase-3抑制劑Z-DEVD-fmk減少第6天時腦室下區caspase的表達水平，數據來自于三次獨立的實驗；
[0152]B:腦中風后24小時，caspase-3 (cas,箭頭)在缺血區的表達增加；
[0153]C:缺血區域充斥著大量的TUNEL陽性死亡細胞，標尺，20 μ m ;
[0154]D:腦中風后24時，caspase-3在缺血區的細胞核和細胞漿中都有表達；
[0155]E:在腦中風后14天，H&E染色的對照劑或caspase抑制劑Z-DEVD-fmk處理的小鼠代表性的腦片照片；
[0156]F:腦梗死體積的定量測定，數值表示為平均值土標準差(每組n=6)。

【具體實施方式】
[0157]實施例1
[0158]1、材料和方法
[0159](I)材料
[0160]①試劑和抗體
[0161]5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)，多聚甲醛，蔗糖，二甲基亞砜，層黏連蛋白，LY294002 (購自 Sigma-Aldrich), Dulbecco， smodifiedEagle’ s 培養基(DMEM)/F-12培養基，鏈霉素，L-谷氨酰胺，B27添加劑，表皮生長因子和成纖維細胞生長因子，購自Invitrogen)；
[0162]氟甲基酮，RIPA裂解緩沖液，化學發光溶液，Fluoro-JadeB (購自MerckMillipore)；
[0163]AnnexinV-FITC 凋亡檢測試劑盒(購自 BDB1sciences), BCAprotein assay,購自ThermoScientific ；Vectashield, 4’ , 6_ 二脈基 _2_ 苯基Π引噪(DAPI),蘇木素，親和素生物素過氧化物酶復合物(VectastainEliteABCkit)，二氨基聯苯胺(DAB)及MOM免疫檢測試劑盒，購自 VectorLaboratories ；
[0164]蛋白酶抑制劑cocktails，原位細胞死亡檢測試劑盒(熒光素)和原位細胞死亡檢測試盒(P0D),購自 RocheDiagnostics ；
[0165]實驗中所采用的一級抗體包括:兔抗cleavedcaspase-3 (9661)，兔抗cleavedcaspase-7 (8438),兔抗 cleavedcaspase—8 (8592),兔抗 phospho-ERKl/2 (9101),兔抗 phospho-JNK (9251)，兔抗-phospho_p38 (9211)，兔抗 phospho-Akt (4060)，兔抗Akt (9272),兔抗 β -actin (4970)(上述抗體均購自 CellSignalingTechnology),大鼠抗BrdU (ab6326, Abeam),兔抗 cleavedcaspase-3 (abl3847, Abeam),羊抗 doublecortin (DCX)(sc-8066, SantaCruzB1technology),小鼠抗 neuronalnuclei(NeuN, MAB377, MerckMillipore),小鼠抗 glialfibriIlaryacidicprotein (GFAP, MAB360, Merck Millipore)；
[0166]二級抗體包括:AlexaFluor594_連接的驢抗兔IgG,驢抗羊IgG和驢抗小鼠IgG,AlexaFluor488-連接的驢抗大鼠IgG,驢抗羊IgG,均購自Invitrogen ;生物素標記的驢抗大鼠二級抗體購自 Jackson ImmunoResearch Laboratories ；
[0167]②腦中風模型
[0168]實驗計劃得到復旦大學上海醫學院動物關愛和使用委員會的批準；實驗采用8到10周齡的C57BL/6成年雄性小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司；參照文獻報道，通過電凝右側大腦中動脈(MCA)遠端部分制作局部皮層腦中風模型；已有文獻證明局部皮層腦中風刺激海馬齒狀回的神經再生；將小鼠用水合氯醛麻醉后(360毫克每千克體重)，分離出MCA，電凝和剪斷MCA的遠端，立即用血管夾將右側頸總動脈結扎15分鐘(為了得到重復性較好的皮層梗死，本實驗夾閉小鼠的同側頸總動脈)；采用體溫維持儀(WorldPrecis1nInstruments)將小鼠體溫保持在37°C ±0.5°C范圍內，假手術組不結扎或電凝MCA及頸總動脈；
[0169]取6片冠狀動脈切片(20 μ m)進行H&E染色后測量腦梗死的大小；梗死采用NIHImageJ軟件分析測定，并表示為對側半腦的百分比；
[0170](2)方法
[0171]①fcdU標記
[0172]在腦中風或假手術后，每天兩次、持續兩天(如第6、7天或第12、13天)腹腔注射BrdU(50mg/kg體重)，在隨后的一天處死小鼠；在腦中風后第5到13天每天兩次經腹腔注射BrdU (50mg/kg體重)，在第14天或第42天處死小鼠；
[0173]②注射Caspase-3抑制劑
[0174]水合氯醛麻醉小鼠(360mg/kg體重)后，采用標準的立體定位技術，將26G無菌鋼針套管按照如下坐標插入側腦室:前囟后0.2_，旁開0.9mm,深1_ ;采用牙科粉和螺絲釘將套管固定在頭骨上，再用配套的小帽封閉；
[0175]小鼠在手術后恢復適應10天后接受腦腦中風造模；Caspase-3抑制劑Z-DEVD-fmk首先溶于DMSO后，進一步使用PBS稀釋(pH7.40);參照報道，每天兩次經腦室注入Z-DEVD-fmk (240ng溶于2 μ 11.8%DMS0)或對照劑(1.8%DMS0)，一周注射兩次持續兩周(在腦中風后第3、6、9、12天注射)；經檢測，結果顯示，與對照劑處理的小鼠相比，在腦中風后第3天注射Z-DEVD-fmk的小鼠在第6天時腦室下區的caspase-3水平顯著降低(支持數據Fig.1A);已有報道腦中風后早期給予Z-DEVD-fmk會減少梗死大小，因此，為排除caspase-3抑制劑起神經保護作用的可能性,在腦中風后第3天開始注射Z-DEVD-fmk ；
[0176]③行為學測試
[0177]在腦中風后第42天，在27.3X27.3X40厘米的箱子中測量小鼠的運動活力(MedAssociates Inc.);箱子中有三組16條紅外光束隊列，間距2.9厘米；在測試中,將小鼠放在箱子的正中間，讓其自由運動30分鐘；通過攝像頭記錄小鼠在30分鐘內的運動情況，采用S0D-811分析軟件(Med Associates Inc.)分析數據；運動能力通過小鼠運動的總距離以及小鼠穿過紅外線光束的次數評價；
[0178]在腦中風造模前及造模后第1、3、7、14、28、42天，采用橫木行走測試(beamwalking test)來測量小鼠的運動缺失；將小鼠放在橫木(直徑12毫米，長1.2米，高45厘米)的一端，通過錄像記錄小鼠通過橫木時四肢的使用情況；記錄下總的運動步數及前肢和后肢錯步的次數，計算10分鐘內錯步數占總步數的百分比；任何一個爪子從橫木表面滑開被認為是錯步；
[0179]④免疫組織化學
[0180]將小鼠依次用冰冷的PBS和4%PFA經心臟灌注；大腦經30%蔗糖4°C過夜處理后，冷凍切片機(Leica Microsystems Inc.)切20微米厚的冠狀切片；采用已報道的方法進行免疫組化染色；在BrdU染色時，所有的腦切片都先經過2N鹽酸處理30分鐘，以斷開DNA雙鏈；在免疫熒光染色中，腦切片分別用AleXaFluor594或Alexa Fluor488標記的二抗染色；細胞核用DAPI染色；在免疫過氧化酶染色時，腦切片經親和素抗生素過氧化酶復合物孵育，生物素標記二抗處理后，用DAB酶作用物顯色，再采用蘇木素復染；用奧林巴斯BX51顯微鏡和奧林巴斯FV1，000共聚焦顯微鏡拍照后，使用OlympusFVlO-ASW軟件對共定位進行重現和判定；
[0181]⑤TUNEL 染色
[0182]根據產品說明書采用原位細胞死檢測試劑盒(熒光素或P0D)做TUNEL (末端脫氧核苷酸轉移酶脫氧尿苷三磷酸切口末端標記)染色；腦切片經通透性處理，斷裂的DNA雙鏈用鏈霉素辣根過氧化物酶標記，用DAB或異硫氰酸熒光素顯色；
[0183]⑥DNA凝膠電泳
[0184]小鼠經冰冷的PBS灌注后，取腦保存于-80°C ;參照已報道的方法，從腦組織中分離DNA ;大腦樣本經勻漿后，在裂解液中(lOmmol/LTrisHCl, PH8.0, 0.lmol/LEDTA, 0.5%十二燒基硫酸鈉，50ug/mL RNaseA) 37°C消化I小時。樣本加入等量的phenol/chloroform/amyl (25:24:1)進行萃取，然后加入蛋白酶K (0.lmg/mL) 55°C反應3小時；DNA小球加入70%的乙醇后，再溶解于50 μ LTris-EDTA液中；將DNA加到含溴化乙錠的2%瓊脂糖膠上電泳，紫外顯影；缺血后第3天從梗死區分離到的DNA呈現清晰的DNA階梯狀分布，用作陽性對昭.>、、、?
[0185]⑦Fluoro-JadeB 染色
[0186]將小鼠依次用冰冷的PBS和4%PFA灌注；大腦先在4°C中經4%PFA固定，再經過30%蔗糖4°C過夜處理；大腦冰凍切片(20 μ m)依次經100%乙醇和70%乙醇脫水，0.06%的高錳酸鉀中孵育10分鐘，經雙蒸水洗，置0.0004%Fluoro-Jade B染液(溶于0.1%的乙酸)中孵育15分鐘；腦片經水洗，脫水，二甲苯中透明，用OlympusFVlOOO共聚焦顯微鏡拍照；
[0187]⑧細胞計數
[0188]腦室下區，海馬齒狀回，及皮層梗死邊緣的BrdU陽性細胞數、caspase-3陽性細胞數及TUNEL陽性細胞數的定量檢測，使用20倍物鏡明視野拍照；數據表示為每個腦片的DAB陽性細胞數；新生的未成熟神經元的定量，使用熒光顯微鏡在40倍物鏡下拍取BrdU和DCX雙染的照片進行細胞計數；采用40倍物鏡下拍攝的照片，計數缺血側皮層新生的神經元；計數整個缺血側皮層BrdU與NeuN或GFAP共標的陽性細胞數，用于新生NeuN或GFAP的定量，數據表示為每張腦切片共標的細胞數；對于每一只小鼠，腦室下區部分取三張腦片(間隔0.6mm)，海馬齒狀回部分取四張腦片(間隔Imm)進行分析；采用ImageJ軟件進行統計測量被分析的區域，并計數分析區域的陽性細胞數；
[0189]⑨神經球培養和免疫細胞化學
[0190]根據已有的報道，分離腦中風7天后缺血側半球腦室下區的細胞；消化后，按照10，000cells/ml的濃度，將細胞含有1%青霉素加鏈霉素(10，000U/ml)，2mML_谷氨酰胺，2%B27supplement, 20ng/ml表皮生長因子和20ng/ml成纖維細胞生長因子的DMEM/F-12培養基中培養；細胞在含5%C02高濕度的37°C恒溫箱中培養；機械分離原代神經球后，接種到含生長因子的DMEM/F-12培養基的96孔板(每孔1，OOOcells)中；接種后將Z-DEVD-fmk (25 μ Μ)或LY294002 (25 μ Μ)加到培養基中；培養至第7天時，計數神經球的數量;
[0191]caspase-3免疫染色時,神經球經多聚賴氨酸和層粘連蛋白包被后轉移至載玻片上，經4%PFA固定，用10%的驢血清封閉后，加入兔抗caspase-3抗體4°C孵育過夜；清洗三次后，加AlexaFluor594驢抗兔IgG室溫反應30分鐘,使用Vectashield封片；采用原位細胞死亡檢測試劑盒(熒光素)進行TUNEL染色檢測凋亡；
[0192]⑩流式細胞術
[0193]收集神經球輕，按照使用說明書用AnnexinV-FITC和Propidium1dide (PI)(Annexin V-FITC apoptosis detect1n kit)標記 100，000 個細胞，通過 Epics AltraFACScan Flow Cytometer (BeckmanCoulter)檢測細胞存活狀態；數據通過 EXP032V1.2 軟件(Beckman Coulter)進行分析；
[0194](3)分析
[0195]① Western blot 分析
[0196]分離腦中風后第12天的缺血側大腦半球的腦室下區，使用含有蛋白酶抑制劑cocktails的RIPA裂解液提取腦室下區或神經球中的蛋白；離心后，通過BCA蛋白分析法測定蛋白濃度；等量的蛋白樣本分別加到8%，10%和12%Tris-甘氨酸凝膠上電泳，轉移到PVDF膜上；膜用5%的脫脂牛奶(脫脂奶粉溶于含0.1%吐溫20的TBS)封閉，一抗孵育，力口入辣根過氧化物酶結合的二抗后，然后通過B1-1mage Analysis System(B1-Rad)掃描光密度進行定量；
[0197]②數據分析
[0198]數值用平均值土標準差來表示；在經過Bonferroni ’ s多重比較檢測后，采用單因素方差分析進行數據處理；兩組比較時，采用未配對雙尾Student t檢驗或Mann WhitneyU檢驗，P〈0.05為有統計學差異；
[0199]2、結果
[0200](I)腦中風后神經干細胞和細胞死的時間、空間分布情況
[0201]腦中風刺激腦室下區和海馬齒狀回區的神經再生反應，梗死周邊的皮層區對腦中風后腦功能的恢復起關鍵作用；
[0202]測定腦中風小鼠神經再生區域和梗死周邊皮層區域的神經再生現象和細胞死亡的情況；在腦室下區、海馬齒狀回及梗死周邊的皮層區，結果顯示，BrdU的免疫反應活性在腦中風3天后急劇增加，在7天時達到最高峰，并且一直持續到第14天(如圖1A，IB所示)，該結果與以前的報道基本一致，此外，在腦中風后I到14天，僅僅在腦室下區和海馬齒狀回檢測到少量的TUNEL陽性死亡細胞(如圖1C，ID所示)；在梗死周邊皮層區，腦中風后I到3天的TUNEL陽性細胞數目顯著增加，但在7到14天回到基礎值(如圖1C，ID所述);上述結果表明，缺血大腦中神經再生和細胞死亡展現著不同的時間和空間模式，并且在損傷側大腦皮層區神經再生比細胞死亡持續的時間更長；
[0203](2)在腦中風恢復期caspase-3在神經再生區的表達明顯上升
[0204]實驗結果顯示，在腦中風后24小時缺血區的caspase-3表達明顯上升(如圖1B所示)，上述區域可見廣泛的TUNEL陽性細胞分布(如圖1C所示)；通過免疫組化染色，發現caspase-3在細胞核和胞漿中都有表達(如圖1D所示);相反，在腦中風后7到14天，觀察到與假手術組相比，腦室下區(如圖2A所示)和海馬齒狀回(如圖2B所示)該兩個神經再生區內caspase-3的表達顯著增加；定量分析結果表明，隨著腦中風時程的進展，增殖的神經前體細胞中的caspase-3也同步大量增加(如圖2C和圖1B所示)，但是死亡的細胞卻沒有同步增加(如圖2C和圖1D所示)；上述數據表明，在腦中風的恢復期，caspase-3可能與其在急性期所起的作用不同；
[0205]首先，確定caspase-3的細胞定位；Caspase_3與BrdU或DCX雙染發現，caspase-3在腦室下區(如圖3A，3B所示)和海馬齒狀回(如圖3C，3D所示)區的BrdU陽性新生細胞和DCX陽性的神經前體細胞中都有表達，表明上述caspase-3陽性細胞是增殖的神經前體細胞；另外，在上述區域檢測到沒有caspase-7和caspase-8 ；
[0206]其次，采用抗caspase-3抗體和斷裂DNA標記物(TUNEL )進行雙染，結果顯示，caspase-3陽性細胞并不呈現TUNEL陽性(如圖3E，3F所示)，caspase-3陽性細胞的核為非固縮(如圖3G，3H所示)；此外，采用DNA凝膠電泳檢測(如圖31所示)或采用甲酚紫(如圖3J所示)、Fluoro-JadeB(如圖3K所示)染色檢測組織學特征，結果顯示，腦室下區和海馬齒狀回區既無DNA損傷也無神經元損傷的組織學特征；結果表明，在腦中風恢復期，神經再生區域增殖的神經前體細胞激活caspase-3但與凋亡無關；
[0207](3)腦中風后抑制caspase-3活性促進神經前體細胞的增殖
[0208]檢測caspase-3的延遲上調是否參與腦中風后的神經再生過程；從腦中風后第3天開始往小鼠側腦室注入caspase-3抑制劑Z-DEVD-fmk或對照劑，在第14天時檢測小鼠；為確定caspase-3對小鼠長期的行為學及組織學結果的影響，采用小鼠永久性遠端大腦中動脈閉塞腦中風模型(采用該種皮層腦中風模型是因其造成的腦中風后死亡率更低)，模型總的死亡率不超過10% ;結果顯示，在14天時Z-DEVD-fmk處理組和對照組的小鼠缺血損傷程度沒有顯著性差異(如圖1E，IF所示);結果表明，caspase-3抑制對神經再生的影響不是在減少腦梗死損傷之后產生；與對照組比較，Z-DEVD-fmk處理組的小鼠腦室下區的BrdU陽性細胞數和BrdU陽性的神經前體細胞分別增加45.8%(如圖4A，4C所示)和34.3%(如圖4B, 4D所示)；
[0209]檢測caspase-3是否會間接影響神經前體細胞的存活；檢測腦中風后14天時Z-DEVD-fmk處理組和對照組腦室下區的細胞死亡情況，結果顯示，Z-DEVD-fmk對14天的TUNEL陽性細胞數沒有影響(Z-DEVD-fmk處理組，2.00 ±0.89 ；對照組，
1.50 ± 1.22; P=0.34, n=6)；
[0210]綜上所述，上述數據表明，caspase-3在腦中風后對神經前體細胞的增殖起著重要的作用；
[0211](4) Caspase限制體外培養神經前體細胞的自我更新
[0212]選取腦中風后第七天小鼠缺血側腦室下區的神經球進行體外培養(如圖5A所示)，在神經球形成階段，觀察到caspase-3在神經球中的表達(如圖5B所示)，免疫細胞化學染色也進一步確認上述現象；實驗結果還顯示，87.3%的caspase-3陽性細胞為TUNEL陰性(如圖5D, 5E所示)，表明神經球中表達的caspase-3可能不參與細胞的凋亡過程；
[0213]采用caspase-3抑制劑Z-DEVD-fmk處理培養的神經球，盡管該處理明顯抑制了 caspase-3的表達(如圖5B所示)，但沒有觀察到Z-DEVD-fmk處理組和對照組神經球凋亡率有實質的差異(如圖5F，5G所示)；此外，對TUNEL陽性的神經前體細胞計數顯示Z-DEVD-fmk處理沒有改變細胞的死亡率(Z-DEVD-fmk處理組和對照組TUNEL陽性細胞百分率:1.92±0.04 比 1.86±0.03;n=15)；
[0214]分離出原代神經球，檢驗caspase-3對二代神經球形成的影響，結果顯示，Z-DEVD-fmk處理雖然對神經球的直徑和BrdU陽性率都沒有影響，但Z-DEVD-fmk處理能夠產生更多的二代神經球(如圖5H, 51所示);結果表明，caspase-3不是神經前體細胞死亡的執行因子，caspase-3參與調節神經前體細胞的自我更新；
[0215](5) Akt憐酸化介導caspase-3的作用
[0216]監測腦中風后12天Z-DEVD-fmk處理小鼠的腦室下區caspase-3已知底物的表達水平，結果顯示，Z-DEVD-fmk沒有改變磷酸化ERK、磷酸化JNK和磷酸化p38的水平，但顯著增加了磷酸化Akt的水平(如圖6A，6B所示);結果表明，在腦中風期，抑制caspase-3的活性可能通過調節磷酸化Akt促進神經前體細胞的增殖；進一步，表明神經球的培養基中預先加入Akt抑制劑LY294002后，Z-DEVD-fmk對神經前體細胞自我更新的調節能力明顯降低；
[0217]上述結果表明，腦中風后caspase-3對神經前體細胞增殖的調節作用可能通過磷酸化Akt途徑；
[0218](6)抑制caSpaSe3活性促進神經元再生和腦中風后神經功能的重塑
[0219]采用對照劑或Z-DEVD-fmk處理小鼠，并在腦中風后14天和42天檢測其大腦，結果如圖7A顯示，在腦中風后42天而不是14天時對照劑和Z-DEVD-fmk處理的小鼠腦室下區BrdU陽性細胞數均減少(如圖7D和圖4C所示)，表明神經前體細胞已經從腦室下區遷移到缺血半球受損區；與對照組相比，Z-DEVD-fmk處理組42天時大腦皮層的BrdU陽性細胞數明顯增加(如圖7B，7D所示)，表明抑制caspase-3促進腦中風后新生細胞的遷移；所述Z-DEVD-fmk沒有改變BrdU和GFAP陽性的細胞數目(BrdU和GFAP雙陽性細胞數，Z-DEVD-fmk 處理組與對照劑組:104.61 ±38.71 比 85.56 ±15.28; P=0.29，n=6)，但其顯著增加了損傷皮層區域BrdU和NeuN雙陽性的細胞數目(如圖7C，7E所示)；結果表明，抑制caspase-3能夠促進神經元細胞的再生；抑制caspase-3提高了腦中風后小鼠的運動活性(如圖7F，7G所示)；
[0220]采用beam-walking實驗檢測小鼠的運動缺失,結果顯示,在腦中風后一天時所有小鼠呈現相似的功能缺失，且Z-DEVD-fmk處理組和對照組小鼠在功能缺失方面沒有顯著差異(如圖7H，71所示)；與對照組比較，Z-DEVD-fmk處理組的小鼠在腦中風后14天時前肢錯步數顯著減少，在28天時后肢的錯步數顯著減少；3、本實驗的結果表明，所述caspase-3在腦中風恢復期起著非凋亡的作用；caSpaSe-3限制體外培養的缺血腦室下區的神經前體細胞的自身更新，采用小鼠腦中風模型，發現在神經再生區caspase-3的局部上調對于神經前體細胞的增殖、遷移和成熟具有重要的影響；進一步，結果表明，抑制caspase-3的活性可改善腦中風后的功能恢復(如圖7J所示)；上述結果還表明caspase-3是調控腦中風后神經再生的一種關鍵要素；
[0221]所述Caspase-3在發育過程對神經元凋亡起主要作用，并被認定是腦缺血、腦外傷、脊髓損傷和腦出血后細胞死亡的關鍵調節因子(但是，也有證據顯示caspase-3在細胞增殖和分化中起非凋亡的作用；現有幾種證據表明caspase-3在中樞神經系統中起著不同的非凋亡作用)；所述Caspase-3在鼠類大腦有絲分裂期和有絲分裂期后的細胞中有表達，且有證據證實caspase-3激活的細胞能從神經再生區遷移到嗅球；Caspase_3可能對突觸可塑性和軸突導向有幫助(目前，也有關于caspase-3能夠促進秀麗隱桿線蟲受損軸突再生的報道；大量的研究表明，caspase-3在發育及成年神經系統中扮演著非凋亡的良性作用)；
[0222]本實驗的結果表明，caspase-3表達的增加與腦中風誘導的神經前體細胞的增加時間基本一致，在增殖的神經前體細胞中caspase-3的表達與腦中風后細胞的凋亡過程無關(但是，當前至少有一項研究證明在阿爾茲海默病中caspase-3會引起軸突損傷和增加認知障礙);
[0223]本實驗的結果進一步證明，抑制caspase-3的活性不但增加神經前體細胞的增殖，也促進再生的神經元的增殖；上述結果與caspase-3缺失會增加皮層神經元密度的發現相符；本實驗沒有檢測到caspase-3抑制劑對梗死大小有影響,但是觀察到caspase-3抑制劑對神經功能恢復起重要的作用；因此，抑制caspase-3引起的神經元再生是導致神經功能恢復的主要原因；
[0224]此外，所述絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt為一種細胞生存信號，是凋亡過程中已知的caspase-3祀點；Akt也已被證明在腦中風后的神經前體細胞增殖中起關鍵作用；清除PTEN，一種PI3K-AKT信號通路中的負調節因子會導致持續的神經前體細胞自我更新；本實驗的數據表明，Akt失活介導了 caspase-3對神經前體細胞增殖的作用(如圖7J所示)；進一步，證明caspase-3的作用與ERK, JNK或p38通路無關；然而，除Akt通路外，多種其它的caspase-3底物也會參與caspase-3的作用；
[0225]本發明的實驗結果顯示，在腦中風的恢復期，caspase-3在腦室下區和海馬齒狀回的新生神經前體細胞中的表達明顯增加，然而上述神經前體細胞卻沒有表現出凋亡的跡象；提取缺血小鼠的腦室下區和海馬齒狀回的神經前體細胞進行體外培養，觀察到caspase-3限制神經前體細胞的自我更新能力，但并不引起細胞的凋亡；所述caspase-3通過降低Akt的磷酸化對神經再生進行調控；結果表明，使用caspase-3抑制劑抑制其活性能夠顯著促進腦室下區的神經前體細胞的增殖和遷移，從而促進神經元的再生和腦中風后的神經功能恢復；抑制caspase-3對急性腦中風具有保護作用，caspase-3可成為治療腦中風的藥物新靶點。
【權利要求】
1.Caspase-3抑制劑在制備促進腦中風后神經再生的制劑中的用途。
2.Caspase-3抑制劑在制備促進腦中風后神經功能重塑制劑中的用途。
3.按權利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的Caspase-3抑制劑選自Caspase-3 抑制劑 Z-DEVD-fmk。
4.按權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的caspase-3抑制劑抑制Caspase-3其活性，促進腦室下區的神經前體細胞的增殖和遷移，促進神經元的再生和腦中風后的神經功能恢復。
【文檔編號】A61K45/00GK104415333SQ201310371351
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月22日 優先權日:2013年8月22日
【發明者】范文英, 趙冰樵, 戴義琴, 朱西民, 徐昊辰, 蔡萍 申請人:復旦大學