一種不含抗性標記的豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其用途
【專利摘要】本發明公開了一種不含抗性標記的豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其用途，還公開了一株用于制備該疫苗的不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型三基因缺失株，屬于細菌基因工程【技術領域】。本發明公開的不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型三基因缺失株APPΔclpPΔapxⅡCΔfur，是采用定向同源重組技術將胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus?pleuropeumoniae，APP）中的蛋白酶ClpP、ApxⅡ毒素激活因子ApxⅡC和鐵吸收調節蛋白Fur的編碼基因滅活得到的菌株，破壞了ClpP、ApxⅡC和Fur蛋白的表達。本發明得到的三基因缺失株比親本株毒力小，毒力降低100倍以上，對動物安全；免疫豬后可以對APP不同血清型強毒菌株攻擊提供良好保護力，保護率均在80%以上，可以作為弱毒活疫苗用于豬傳染性胸膜肺炎的免疫預防。
【專利說明】一種不含抗性標記的豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種不含抗性標記的豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其用途，特別涉及由一種不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌ClpP蛋白酶、Apx II C和Fur三基因缺失株制備得到的豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其在防治豬傳染性胸膜肺炎中的用途，屬于細菌基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]豬傳染性胸膜肺炎(porcinecontagious pleuropneumonia, PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一種高度傳染性、致死性的呼吸道傳染病。目前該病已在世界各國廣泛流行，造成巨大的經濟損失，成為國際公認的危害現代化養豬業的重要傳染病之一。隨著我國現代養殖業規模化、集約化的發展，本病的發生呈爆發趨勢，有的豬場的陽性率已達到70%以上，嚴重阻礙了我國養豬業的健康發展。
[0003]根據APP表面莢膜(CPS)和脂多糖(LPS)抗原性的不同，可將APP分為15個血清型，血清I型又分為Ia和Ib兩個亞型，血清5型又分為5a和5b兩個亞型。目前在我國已發現并分離到血清型1、2、3、4、5、7、8和15等多種血清型，主要流行的血清型為1、3、5和7 型。
[0004]Apx毒素是APP最主要的毒力因子。目前在APP所有的15個血清型中共發現了 4 種Apx毒素，分別為Apx 1、Apx I1、Apx III和Apx IV。APP不同的血清型產生不同的Apx毒素，其中血清7型含有Apx II和Apx IV。
[0005]Apx毒素操縱子的典型結構含有完整的CABD基因；其中，A基因編碼Apx毒素結構蛋白，開始合成時沒有毒素活性，C基因編碼Apx毒素激活蛋白，負責對結構蛋白進行乙酰化激活，形成ApxC-ApxA復合體，毒素活性隨之產生。B基因和D基因的編碼蛋白形成跨膜通道，負責Apx毒素的轉運和分泌。Apx I和Apx III操縱子有完整的CABD基因，而Apx II操縱子缺少B基因和D基因，其產物由Apx I的BD基因編碼產物負責轉運分泌到細胞外。本發明缺失的ApxIIC是ApxIIA毒素的激活蛋白，該基因缺失后ApxII毒素將失去毒性，突變株的毒力大大下降。
[0006]生物被膜(Biofilm)是在生物體內和非生物體表面集聚生長的由細菌及其產生的多糖蛋白復合物所形成的固定細菌群落，它是病原菌持續感染、產生耐藥性和免疫逃逸的重要原因之一。APP長期潛伏于豬體內常常引起持續性感染，近年來獲得的許多臨床分離株具有多重耐藥性，并且較普遍地能形成生物被膜，被認為在APP致病過程中發揮重要作用。
[0007]生物被膜的產生是一個高度復雜的、由多種基因調控的動態過程，這些基因涉及到細菌的黏附、新陳代謝、群體感應(quorum sensing)和應激反應(stress response)等。 近年來對病原菌應激反應與感染性疾病的研究發現，ClpP蛋白酶這一應激蛋白是一種十分重要的毒力因子，它是ATP依賴的絲氨酸蛋白酶，調節著細菌對環境各種壓力的適應(如熱休克、營養缺陷、氧化應激等)，維持細菌的形態和毒力，使其在各種環境下得到保護。研究發現該基因的插入突變或缺失通常會降低細菌對不良因素的承受能力，菌體生長被破壞，存活力下降，并影響生物被膜形成，造成毒力減弱。本發明將ClpP蛋白酶基因缺失，使突變株毒力減弱。
[0008]鐵是細菌生長的必需元素，通常由于動物機體內的游離態Fe離子很少，不能滿足細菌生長的需求。為了適應體內這種低Fe離子濃度下的生存條件，使得細菌產生了各種機制以攝取足夠的鐵。其中鐵吸收調節蛋白Fur是影響細菌鐵吸收的一個重要調控蛋白，調控著許多轉鐵蛋白的表達，進而影響細菌的生存和致病力，是重要毒力因子。研究還發現該基因的插入突變或缺失通常會降低細菌在宿主動物定殖力。目前雖然僅探索了少數病原菌Fur蛋白的功能，但在揭示致病機理和疫苗研究中已經顯示出極為重要的研究價值和疫苗應用前景。本發明將Fur調控蛋白基因缺失，使突變株毒力進一步減弱。
[0009]目前應用的全菌滅活疫苗和亞單位疫苗能夠減輕同源血清型感染引起的臨床癥狀并降低死亡率，但不能阻止肺部病變和慢性感染，對異源血清型的感染也不能提供很好的交叉保護，而自然感染或試驗感染能夠誘導對任何異源血清型的保護。因此，高效的弱毒疫苗的研制開發將是解決當前胸膜肺炎疫苗不足的一種可行方法。
[0010]鑒于上述背景，構建我國流行的APP血清7型clpP、apx II C和fur三基因缺失株，研究其遺傳特性、生長特性、毒力、對動物的安全性和保護效力等生物學特性，為豬傳染性胸膜肺炎的防治、其它呼吸道傳染病的疫苗研究奠定重要的基礎。
【發明內容】
[0011]本發明的目的之一在于獲得一種不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌clpP、apx II C和fur三基因缺失株。
[0012]本發明提供的一種不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株，是將豬胸膜肺炎放線桿菌的ClpP蛋白酶、Apx II毒素激活因子Apx II C和鐵吸收調節蛋白Fur的編碼基因滅活后得到的缺失突變株。
[0013]在本發明中，優選的，所述豬胸膜肺炎放線桿菌為APP血清7型菌株，更優選為APP血清7型CVCC265株。
[0014]在本發明中，優選的，所述蛋白酶ClpP的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述Apx II毒素激活因子Apx II C的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，所述鐵吸收調節蛋白Fur的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0015]在本發明中，優選的，所述的基因缺失株為APP Λ clpP Λ apx II CAfur，分類命名為胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP),保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為=CGMCC N0.7930，保藏時間為2013年7月16日。
[0016]本發明的目的之二在于提供一種構建所述的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株的方法，其特征在于缺失株是通過將DNA片段Δ clpP、Δ apx II C以及Δ fur導入所述豬胸膜肺炎放線桿菌 血清7型菌株經同源重組實現的；
[0017]其中，所述DNA片段Λ clpP從上游至下游依次為上同源臂clpPS和下同源臂clpPX:所述上同源臂clpPS和下同源臂clpPX能與所述豬胸膜肺炎放線桿菌中的ClpP蛋白酶編碼基因的上游序列和下游序列發生同源重組、滅活所述ClpP蛋白酶的編碼基因，得到clpP單基因缺失株APP AclpP ；
[0018]其中，所述DNA片段Aapx II C從上游至下游依次為上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX，所述上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX能與所述豬胸膜肺炎放線桿菌中的Apx II C蛋白編碼基因的上游序列和下游序列發生同源重組、滅活所述Apx II C蛋白的編碼基因，進一步得到clpP和apx II C雙基因缺失株APP Λ clpP Λ apx II C ；
[0019]其中，所述DNA片段Λ fur從上游至下游依次為上同源臂furS和下同源臂furX，所述上同源臂furS和下同源臂furX能與所述豬胸膜肺炎放線桿菌中的Fur蛋白編碼基因的上游序列和下游序列發生同源重組、滅活所述Fur蛋白的編碼基因，更進一步的得到clpP、apx II C 和 fur 三基因缺失株 APP Δ clpP Δ apx II C Δ fur。
[0020]在本發明的具體實施例中，所述ClpP蛋白酶的編碼基因如SEQ ID N0.1所示，所述的Apx II C蛋白的編碼基因如SEQ ID N0.3所示，所述的Fur蛋白的編碼基因如SEQ IDN0.5所示。
[0021]本發明的目的之三在于提供所述的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株在制備豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗中的應用。
[0022]本發明的目的之四在于提供一種豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗，其活性成分為本發明所述的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株。
[0023]在本發明的一個具體實施例中，本發明的一種不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株是通過以下技術方案來實現的:
[0024]本發明的一種不含抗性標記豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型clpP、apx II C和fur三基因缺失突變菌株APP AclpP Λ apx II C Λ fur，衍生于中國獸藥監察所購買的豬胸膜肺炎放線桿菌CVCC265株，將其基因組上的clpP基因缺失了 491bp，滅活clpP基因，使ClpP蛋白酶不表達，獲得單基因缺失突變菌株；再將其基因組上的apx II C基因缺失了 270bp，滅活apx II C基因，使Apx II C蛋白不表達，獲得雙基因缺失突變菌株；隨后又將其基因組上的fur基因缺失了 349bp，滅活fur基因，使Fur蛋白不表達，獲得三基因缺失突變株。
[0025]本發明的基本構建方法是:
[0026]1、首先以豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型(簡稱APP7，下同)CVCC265株為起始材料，以PCR的方法從CVCC265的基因組中擴增出clpP基因的上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX，采用重疊延伸PCR方法拼接clpP基因的上、下同源臂，擴增Λ clpP基因片段，此片段缺失了 clpP基因的491bp的序列片段。而后把這個經改造的AclpP序列克隆至載體PUC18，最終成為同源重組載體(自殺性質粒)pUCAclpP。采用電轉化的方法把自殺性質粒pUCAclpP轉化到APP7CVCC265株中，由于同源重組載體(自殺性質粒)不能在APP菌中自主復制，因此轉入受體菌細胞內的超螺旋的自殺質粒便會被線性化。因自殺質粒上含有受體菌基因的同源序列，它便會插入受菌體CVCC265的染色體中，接著線性化的質粒與clpP基因發生置換，也就是通常所說的單交換同源重組事件的發生。只有置換到CVCC265染色體上被線性化的自殺質粒才能隨著染色體的復制而存在。把受體菌涂布在含有篩選標記的TSA平板上，PCR篩選出單交換子。由于單交換是整個載體序列(含篩選藥物抗性基因)都置換到染色體上，因此，我們必須進一步篩選目的基因整合到染色體上同時又刪除載體序列的雙交換子。將獲得的同源重組單交換子經液體培養后，涂布于無抗性的TSA平板上，挑取單菌落進行PCR篩選陽性同源重組雙交換子，即clpP單基因缺失株APP Δ clpP。
[0027]2、然后，以PCR的方法從CVCC265的基因組中擴增出apx II C基因的上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX,采用重疊延伸PCR方法拼接apx II C基因的上、下同源臂，擴增Aapx II C基因片段，此片段缺失了 apx II C基因的270bp的序列片段。而后把這個經改造的Aapx II C序列克隆至載體pUC18，最終成為同源重組載體(自殺性質粒)PUC Δ apx II C，再按照I的方法，以獲得的clpP單基因缺失株APP Δ clpP為起始材料，進一步缺失apx II C基因，獲得clpP和apx II C雙基因缺失株APP AclpP Δ apx II C。
[0028]3、最后，以PCR的方法從CVCC265的基因組中擴增出fur基因的上同源臂furS和下同源臂furX，采用重疊延伸PCR方法拼接fur基因的上、下同源臂，擴增Λ fur基因片段，此片段缺失了 fur基因的349bp的序列片段。而后把這個經改造的Λ fur序列克隆至載體PUC18，最終成為同源重組載體(自殺性質粒)pUC Λ fur，再按照I的方法，以獲得的clpP和apx II C雙基因缺失株APP Λ clpP Λ apx II C為起始材料，進一步缺失fur基因，獲得clpP、apx II C 和 fur 三基因缺失株 APP Δ clpP Δ apx II C Δ fur。
[0029]本發明提供的所述的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株APP Δ clpP Δ apx II C Λ fur比親本株CVCC265株毒力下降達100倍以上，對試驗小鼠和本動物豬具有良好的安全性。以所述的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株APP AclpP Aapx II C Λ fur免疫動物后，用強毒力的7型和5型菌株進行攻毒，結果表明APP Δ clpP Δ apx II CA fur能對小鼠和豬提供良好的保護效力。
[0030]本發明的主要優點是:
[0031]1、本發明所用的材料為豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型CVCC265株，購自于中國獸藥監察所，APP血清7型菌株是目前我國流行并嚴重導致豬發病的優勢血清型。因此，今后以該菌株構建的clpP、apx II C和fur三基因缺失突變菌株為基礎研制的疫苗會具有很強的針對性，有廣闊的市場應用前景。
[0032]2、本發明豬胸膜肺炎放線`桿菌血清7型clpP、apx II C和fur三基因缺失突變菌株不含任何抗性標記，完全符合我國疫苗生物安全要求。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1為豬胸膜肺炎放線桿菌重組自殺質粒pUC Δ clpP的構建流程圖；
[0034]圖2為豬胸膜肺炎放線桿菌重組自殺質粒pUC Δ apx II C的構建流程圖；
[0035]圖3為豬胸膜肺炎放線桿菌重組自殺質粒pUC Δ fur的構建流程圖；
[0036]圖4為上同源臂clpPS和下同源臂clpPX的PCR擴增結果；
[0037]圖中 1:clpPS (1200bp) ;2:clpPX (1249bp) ;M:DL2000DNA Marker
[0038]圖5為Λ clpP基因的PCR拼接結果；
[0039]圖中 1:八。1?卩基因(244沘？);M:DL15000DNA Marker
[0040]圖6為重組自殺質粒pUC Δ clpP的PCR鑒定結果；
[0041]圖中 1-3: AclpP;M:DL15000DNA Marker
[0042]圖7為APP Λ clpP單交換株的PCR鑒定結果；
[0043]圖中1-3:單交換株；M:DL2000DNA Marker
[0044]圖8為APP AclpP缺失株的PCR鑒定結果；[0045]圖中M:DL2000DNA Marker; 8號為篩選的clpP單基因缺失株
[0046]圖9為APP Λ clpP缺失株的遺傳穩定性實驗結果；
[0047] 圖中1-10:第 1-10 代缺失株；M:DL2000DNA Marker
[0048]圖10為上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX的PCR擴增結果；
[0049]圖中 1: apx II CS (1412bp) ; 2: apx II CX (1443bp) ;M:DL5000DNA Marker
[0050]圖11為Λ apx II C基因的PCR拼接結果；
[0051]圖中 1: Aapx II C 基因(2855bp) ;M:DL5000DNA Marker
[0052]圖12為重組自殺質粒pUC Δ apx II C的PCR鑒定結果；
[0053]圖中 1-5: Aapx II C;M:DL5000DNA Marker
[0054]圖13為APP Δ clpP Δ apx II C單交換株的PCR鑒定結果；
[0055]圖中1-5:單交換株；M:Dl2OOODNA Marker
[0056]圖14為APP Δ clpP Δ apx II C雙基因缺失株的PCR鑒定結果；
[0057]圖中M:DL2000DNA Marker; I號和5號為篩選的clpP和apx II C雙基因缺失株
[0058]圖15為APP Δ clpP Δ apx II C雙基因缺失株的遺傳穩定性實驗結果；
[0059]圖中1-10:第 1-10 代缺失株；M:DL2000DNA Marker
[0060]圖16為上同源臂furS和下同源臂furX的PCR擴增結果；
[0061]圖中 1: furS (1387bp) ; 2: furX (1405bp) ;M:DL2000DNA Marker
[0062]圖17為Λ fur基因的PCR拼接結果；
[0063]圖中 1: Afur 基因(2792bp) ;M:DL5000DNA Marker
[0064]圖18為重組自殺質粒pUC Δ fur的PCR鑒定結果；
[0065]圖中 1-2: Δ fur; M: DL5000DNA Marker
[0066]圖19為APP Δ clpP Δ apx II CA fur單交換株的PCR鑒定結果；
[0067]圖中1-4:單交換株；M:Dl2OOODNA Marker
[0068]圖20為APP Δ clpP Δ apx II CA fur三基因缺失株的PCR鑒定結果；
[0069]圖中M:DL2000DNA Marker; 5號為篩選的cIpP、apx II C和fur三基因缺失株
[0070]圖21為APP Δ clpP Δ apx II CA fur三基因缺失株的遺傳穩定性實驗結果；
[0071]圖中1-10:第 1-10 代缺失株；M:DL2000DNA Marker
[0072]圖22為APP Λ clpP Λ apx II C Λ fur三基因缺失株和親本株攻毒后的肺部病變。【具體實施方式】
[0073]下面結合具體實例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0074]本發明實施例中所涉及的材料:
[0075]菌種:APP血清7型CVCC265株購買自中國獸藥監察所
[0076]載體和試劑:pUC18質粒、Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司。
[0077]實施例1APP血清7型clpP單基因缺失突變株的構建
[0078]1.1重組自殺載體pUC Δ clpP的構建[0079]豬胸膜肺炎放線桿菌重組自殺質粒pUC Λ clpP的構建流程圖如圖1所示。
[0080]1.1.1ClpP蛋白酶基因上、下同源臂的引物設計和PCR擴增
[0081]根據已報道的ΑΡΡ7型ΑΡ76株序列(參照GenBank登錄號為CP001091.1的基因序列)設計兩對引物，分別擴增clpP基因的上同源臂clpPS和下同源臂clpPX，擴增片段大小分別為1200bp和1249bp，上同源臂clpPS和下同源臂clpPX的PCR擴增結果如圖4所示。上同源臂上游引物5’端設計EcoR I酶切位點，下同源臂下游引物5’端設計BamH I酶切位點。上述引物均由北京華大基因公司合成。
[0082]擴增上同源臂的引物序列如下:
[0083]clpSF: 5’ -CGGAATTC (EcoR I ) GGGGCGTTACTGGATGC-3’
[0084]clpSR:5，-CCATCGCTTCCGCCTTTGGAGGTTTGC-3，
[0085]擴增下同源臂的引物序列如下:
[0086]cIpXF: 5 ’ -TCCAAAGGCGGAAGCGATGGAATACGGTC-3，
[0087]clpXR:5，-CGGGATCC(BamH I )TTCTCTGCTTTAAGTGTCGGC-3，
[0088]以APP血清7型CVCC265株基因組DNA為模板分別擴增clpP基因上、下同源臂:PCR擴增反應體系為50μ L，其中模板DNAlOng，上、下游引物各I μ M，dNTP200 μ Μ, 10 X TaqbufferlOy L, Ex Taq DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)0 PCR 反應程序為:95 °C 預變性 5min，94°C 60s, 55°C 60s, 72°C 90s, 30個循環，72°C IOmin0 PCR產物經凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收。
[0089]1.1.2重疊延伸PCR方法擴增Λ clpP基因片段
[0090]以上、下同源臂的PCR回收產物為模板，采用重疊延伸PCR方法拼接clpP基因的上、下同源臂，擴增八(:1妒基因片段，引物(31的1?5’端下劃線部分的堿基與引物clpXF斜粗體部分的堿基反向互補，引物clpXF5’端下劃線部分的堿基與引物clpSR斜粗體部分的堿基反向互補。PCR擴增反應體系為50yL，其中模板DNAlOng，上、下游引物各I μ M，dNTP200yM, IOXTaq bufferlO μ L, Ex Taq DNA聚合酶 2U(TaKaRa)。PCR 反應程序為:95°C預變性 5min，94°C 60s, 55°C 90s, 72V 150s, 30 個循環，72°C IOmin0 PCR 產物經凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收，然后用EcoR I和BamH I進行酶切，用膠回收試劑盒回收，Λ clpP基因的PCR拼接結果如圖5所示。
[0091]1.1.3重組自殺質粒pUCAclpP的構建
[0092]將純化的Λ clpP基因片段用T4DNA連接酶(TaKaRa)與經EcoR I和BamH I雙酶切消化的PUC18載體相連接，16°C連接24h，熱激轉化入大腸桿菌DH5 α感受態細胞，經菌落PCR鑒定為陽性的克隆進行增菌并利用堿裂解法小量提取質粒，經酶切鑒定的陽性質粒命名為pUC AclpP,對克隆的Λ clpP基因進行PCR及測序鑒定，重組自殺質粒pUC Δ clpP的PCR鑒定結果如圖6所示。
[0093]1.2APP血清7型clpP基因缺失突變株的構建
[0094]將構建的重組自殺質粒pUC Δ clpP電轉化進入APP血清7型CVCC265，在10ug/mLAmp抗性平板上篩選單交換株陽性菌落，并在clpP上、下同源臂內部設計引物，進行PCR鑒定，野生株能擴增獲得858bp片段，缺失株能擴增獲得367bp片段，單交換株能同時擴增獲得858bp和367bp片段，APP Λ clpP單交換株的PCR鑒定結果如圖7所示。上述引物均由北京華大基因公司合成。[0095]引物序列如下:
[0096]clpJDF:5， -CGTGGTGTCGCTTGAAACTC-3，
[0097]clpJDR:5， -AATTAGACCGTATTCCATCGC-3，[0098]將單交換株陽性單菌落在不含Amp抗性的TSB (1%的煙酰胺腺嘌吟二核昔酸和10%的馬血清)培養增殖后，涂布于無抗性的TSA平板，挑取單菌落，進行PCR鑒定，野生株能擴增獲得858bp片段，缺失株僅能擴增獲得367bp片段，APP △ clpP缺失株的PCR鑒定結果如圖8所示，該陽性克隆命名為APP Λ clpP。
[0099]將本發明制備的clpP基因缺失突變菌株APP Λ clpP在TSB培養基連續傳代10次，用PCR鑒定，若每一代的突變菌株都能擴增出367bp片段，表明本發明的突變菌株是能夠穩定遺傳的；若擴增出858bp片段，表明本發明的突變菌株是不能穩定遺傳的。結果如圖9所示，表明本發明制備的clpP基因缺失突變菌株能夠穩定遺傳。
[0100]實施例2APP血清7型clpP和apx II C雙基因缺失突變株的構建
[0101]2.1重組自殺載體pUC Aapx II C的構建
[0102]豬胸膜肺炎放線桿菌重組自殺質粒pUC Δ apx II C的構建流程圖如圖2所示。
[0103]2.1.1apx II C基因上、下同源臂的引物設計和PCR擴增
[0104]根據已報道的APP7型AP76株序列(參照GenBank登錄號為CP001091.1的基因序列)設計兩對引物，分別擴增apx II C基因的上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX,擴增片段大小分別為1412bp和1443bp,上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX的PCR擴增結果如圖10所示。上同源臂上游引物5’端設計EcoR I酶切位點，下同源臂下游引物5’端設計BamH I酶切位點。上述引物均由北京華大基因公司合成。
[0105]擴增上同源臂的引物序列如下:
[0106]II CSF:5，-CGGAATTC(EcoR)ATGACAACACCAATGATTGATTTAC-3’
[0107]II CSR:5 ’ -AATCCCCGAAAGCATCATCCCTCCCATTC-3，
[0108]擴增下同源臂的引物序列如下:
[0109]II CXF:5 ’ -GGATGATGCTTTCGGGGATTCATCTCTATTG-3，
[0110]II CXR:5 ’ -CGGGATCC(BamH)GTTGTAATAAGTCCCGTAACACCAG-3 ’
[0111]以APP血清7型CVCC265株基因組DNA為模板分別擴增apx II C基因上、下同源臂:PCR擴增反應體系為5(^1^，其中模板0嫩101^，上、下游引物各ΙμΜ，dNTP200 μ Μ,IOXTaq bufferlO μ L, Ex Taq DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)0 PCR 反應程序為:95 °C 預變性5min，94°C 60s, 55°C 60s, 72°C 90s, 30 個循環，72°C IOmin0 PCR 產物經凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收。
[0112]2.1.2重疊延伸PCR方法擴增Aapx II C基因片段
[0113]以上、下同源臂的PCR回收產物為模板，采用重疊延伸PCR方法拼接apx II C基因的上、下同源臂，擴增Aapx II C基因片段，Aapx II C基因的PCR拼接結果如圖11所示。引物II CSR5’端下劃線部分的堿基與引物II CXF斜粗體部分的堿基反向互補，引物II CXF5’端下劃線部分的堿基與引物II C SR斜粗體部分的堿基反向互補。PCR擴增反應體系為50 μ L，其中模板 DNAlOng，上、下游引物各 ΙμΜ，dNTP200 μ Μ, 10 X Taq bufferlO μ L, Ex Taq DNA聚合酶 2U(TaKaRa)ο PCR 反應程序為:95°C預變性 5min，94°C 60s, 55°C 90s, 72°C 150s, 30個循環，72°C IOmin0 PCR產物經凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收，然后用EcoR I和BamHI進行酶切，用膠回收試劑盒回收。
[0114]2.1.3重組自殺質粒pUC Δ apx II C的構建
[0115]將純化的Aapx II C基因片段用T4DNA連接酶(TaKaRa)與經EcoR I和BamH I雙酶切消化的PUC18載體相連接，16°C連接24h，熱激轉化入大腸桿菌DH5 α感受態細胞，經菌落PCR鑒定為陽性的克隆進行增菌并利用堿裂解法小量提取質粒，經酶切鑒定的陽性質粒命名為pUCAapx II C，對克隆的Aapx II C基因進行PCR以及測序鑒定，重組自殺質粒pUC Δ apx II C的PCR鑒定結果如圖12所示。
[0116]2.2APP血清7型clpP和apx II C雙基因缺失突變株的構建
[0117]將構建的重組自殺質粒pUC Λ apx II C電轉化進入實施例1中構建好的APP AclpP,在10ug/mL Amp抗性平板上篩選單交換株陽性菌落,并在apx II C上、下同源臂內部設計引物，進行PCR鑒定，clpP單基因缺失株能擴增獲得564bp片段，clpP和apx II C雙基因缺失株能擴增獲得294bp片段，單交換株能同時擴增獲得564bp和294bp片段，APP AclpP Aapx II C單交換株的PCR鑒定結果如圖13所示。上述引物均由北京華大基因公司合成。
[0118]引物序列如下:
[0119]II CJDF: 5，-GAAGAGCCATTACCCAACAAC-3，
[0120]II CJDR:5，-ATACAATAGAGATGAATCCCCG-3’
[0121]將單交換株陽性單菌落在不含Amp抗性的TSB (1%的煙酰胺腺嘌吟二核昔酸和10%的馬血清)培養增殖后，涂布于無抗性的TSA平板，挑取單菌落，進行PCR鑒定，ClpP單基因缺失株能擴增獲得564bp片段，clpP和apx II C雙基因缺失株僅能擴增獲得294bp片段，APP Λ clpP Λ apx II C雙基因缺失株的PCR鑒定結果如圖14所示，該陽性克隆命名為APP Δ cIpP Δ apx II C。`
[0122]將本發明制備的clpP和apx II C雙基因缺失突變菌株APP Λ clpP Λ apx II C在TSB培養基連續傳代10次，用PCR鑒定，若每一代的突變菌株都能擴增出294bp片段，表明本發明的突變菌株是能夠穩定遺傳的；若擴增出564bp片段，表明本發明的突變菌株是不能穩定遺傳的。結果如圖15所示，表明本發明制備的clpP和apx II C雙基因缺失突變菌株能夠穩定遺傳。
[0123]實施例3APP血清7型clpP、apx II C和fur三基因缺失突變株的構建
[0124]3.1重組自殺載體pUC Δ fur的構建
[0125]豬胸膜肺炎放線桿菌重組自殺質粒pUC Λ fur的構建流程圖如圖3所示。
[0126]3.1.1fur基因上、下同源臂的引物設計和PCR擴增
[0127]根據已報道的APP7型AP76株序列(參照GenBank登錄號為CP001091.1的基因序列)設計兩對引物，分別擴增fur基因的上同源臂furS和下同源臂furX，擴增片段大小分別為1412bp和1443bp，上同源臂furS和下同源臂furX的PCR擴增結果如圖16所示。上同源臂上游引物5’端設計EcoR I酶切位點，下同源臂下游引物5’端設計BamH I酶切位點。上述引物均由北京華大基因公司合成。
[0128]擴增上同源臂的引物序列如下:
[0129]furSF: 5，-CGGAATTC (EcoR) TTAGCCGTGATGGTGGTG-3 ’
[0130]furSR: 5，-TTTCATGCATTTTCTTCAGACATAACTTG-3，[0131]擴增下同源臂的引物序列如下:
[0132]furXF: 5，~AAGAAAATGCATGAAATTAGCGACGCACAG~3，
[0133]furXR: 5，-CGGGATCC (BamH) GTTTAGGCTCGCCTTTGC-3，
[0134]以APP血清7型CVCC265株基因組DNA為模板分別擴增fur基因上、下同源臂:PCR擴增反應體系為50yL，其中模板DNAlOng，上、下游引物各ΙμΜ，dNTP200 μ Μ, 10 X TaqbufferlO μ L, Ex Taq DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)0 PCR 反應程序為:95 °C 預變性 5min，94°C 60s, 55°C 60s, 72°C 90s, 30個循環，72°C IOmin0 PCR產物經凝膠電泳后用膠回收試劑
盒回收。
[0135]3.1.2重疊延伸PCR方法擴增Λ fur基因片段
[0136]以上、下同源臂的PCR回收產物為模板，采用重疊延伸PCR方法拼接fur基因的上、下同源臂，擴增Afur基因片段，Afur基因的PCR拼接結果如圖17所示。引物furSR5’端下劃線部分的堿基與引物furXF斜粗體部分的堿基反向互補，引物furXF5’端下劃線部分的堿基與引物fur SR斜 粗體部分的堿基反向互補。PCR擴增反應體系為50 μ L，其中模板 DNAlOng，上、下游引物各 ΙμΜ，dNTP200 μ Μ, 10 X Taq bufferlO μ L, Ex Taq DNA 聚合酶2U (TaKaRa)0 PCR 反應程序為:95°C預變性 5min，94°C 60s, 55°C 90s, 72°C 150s, 30 個循環，72°C lOmin。PCR產物經凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收，然后用EcoR I和BamH I進行酶切，用膠回收試劑盒回收。
[0137]3.1.3重組自殺質粒pUC Afur的構建
[0138]將純化的Λ fur基因片段用T4DNA連接酶(TaKaRa)與經EcoR I和BamH I雙酶切消化的PUC18載體相連接，16°C連接24h，熱激轉化入大腸桿菌DH5 α感受態細胞，經菌落PCR鑒定為陽性的克隆進行增菌并利用堿裂解法小量提取質粒，經酶切鑒定的陽性質粒命名為pUC Δ fur,對克隆的Λ fur基因進行PCR以及測序鑒定，重組自殺質粒pUC Δ fur的PCR鑒定結果如圖18所示。
[0139]3.2APP血清7型clpP、apx II C和fur三基因缺失突變株的構建
[0140]將構建的重組自殺質粒pUC Λ fur電轉化進入實施例2中構建好的APP Δ cIpP Δ apx II C,在10ug/mL Amp抗性平板上篩選單交換株陽性菌落,并在fur上、下同源臂內部設計引物，進行PCR鑒定，clpP和apx II C雙基因缺失株能擴增獲得897bp片段，clpP, apx II C和fur三基因缺失株能擴增獲得548bp片段，單交換株能同時擴增獲得897bp和548bp片段，APP AclpP Aapx II C Λ fur三基因缺失株的PCR鑒定結果如圖19所示。上述引物均由北京華大基因公司合成。
[0141]引物序列如下:
[0142]furJDF:5’ -GACATTGGCCGACGGAAG-3’
[0143]furJDR: 5，-GCCAATCACGAAAGCAACG-3 ’
[0144]將單交換株陽性單菌落在不含Amp抗性的TSB(1%的煙酰胺腺嘌吟二核昔酸和10%的馬血清)培養增殖后，涂布于無抗性的TSA平板，挑取單菌落，進行PCR鑒定，ClpP和apx II C雙基因缺失株能擴增獲得897bp片段，clpP、apx II C和fur三基因缺失株僅能擴增獲得548bp片段，APP Λ clpP Λ apx II C Λ fur三基因缺失株的PCR鑒定結果如圖20所示，該陽性克隆命名為APP Λ clpP Λ apx II C Λ fur，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC N0.7930。[0145]將本發明制備的clpP、apx II C和fur三基因突變菌株APP Λ clpP Λ apx II CAfur在TSB培養基連續傳代10次，用PCR鑒定，若每一代的突變菌株都能擴增出548bp片段，表明本發明的突變菌株是能夠穩定遺傳的；若擴增出897bp片段，表明本發明的突變菌株是不能穩定遺傳的。結果如圖21所示,表明本發明制備的clpP、apx II C和fur三基因缺失突變菌株能夠穩定遺傳。
[0146]實施例4APP Δ clpP Δ apx II CA fur突變株的毒力鑒定和安全性評價
[0147]試驗動物:4-6周齡SPF級Balb/C雌鼠，8-9周齡APP血清陰性健康豬，均購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心。
[0148]4.1對小鼠的毒力鑒定和安全性評價試驗
[0149]將小鼠隨機分為二組，每組60只。具體接種方案如下:
[0150]第一組(試驗組):接種實施例3制備的APP Δ clpP Δ apx II C Afur,稀釋為表1中所列6個濃度(CFU)，每個濃度10只小鼠，每只小鼠腹腔接種劑量0.1ml0
[0151]第二組(對照組):接種豬胸膜肺炎放線桿菌CVCC265，稀釋為表1中所列6個濃度(CFU)，每個濃度10只小鼠，每只小鼠腹腔接種劑量0.1ml0
[0152]小鼠存活情況見表1。結果表明，APP Λ clpP Λ apx II C Λ fur對小鼠的毒力與野生株CVCC265相比下降了 100倍以上。
[0153]表1
[0154]
【權利要求】
1.一種不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株，其特征在于該菌株缺失了蛋白酶ClpP、Apx II毒素激活因子Apx II C和鐵吸收調節蛋白Fur的編碼基因。
2.如權利要求1所述的不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株，其特征在于所述豬胸膜肺炎放線桿菌為豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型菌株。
3.如權利要求2所述的不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株，其特征在于所述豬胸膜肺炎放線桿菌為豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型CVCC265株。
4.如權利要求1所述的不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株，其特征在于:所述蛋白酶ClpP的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述Apx II毒素激活因子Apx IIC 的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，所述鐵吸收調節蛋白Fur的氨基酸序列如SEQ ID N0.6 所示。
5.如權利要求1-4任一項所述的不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株， 其特征在于:所述的基因缺失株為APP A clpP A apx II C A fur,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC N0.7930。
6.權利要求1-5中任一項所述的不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株在制備預防豬傳染性胸膜肺炎疫苗中的應用。
7.一種不含抗性標記的豬傳染性胸膜肺炎弱毒活疫苗，其活性成分為權利要求1-5中任一項所述的不含抗性標記的豬胸膜肺炎放線桿菌三基因缺失株。
【文檔編號】A61K39/02GK103555645SQ201310469680
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月10日 優先權日:2013年10月10日
【發明者】王春來, 謝芳, 李剛, 張艷禾 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所