滇南木姜子提取物及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種滇南木姜子的新用途——滇南木姜子提取物在制備預防和治療肺部腫瘤藥物或保健品中的應用。本發明還提供了滇南木姜子提取物的制備方法。研究表明，滇南木姜子提取物能夠激活Nrf2信號通路，促進抗氧化和II相解毒酶的表達，增加細胞內谷胱甘肽水平，增強細胞內還原能力，降低細胞內活性氧水平，并能夠抑制致癌物砷和活性氧H2O2引起的細胞毒性。因此，可將其制備成相應的口服制劑和注射劑，并用于肺部腫瘤的預防和治療。
【專利說明】滇南木姜子提取物及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及滇南木姜子提取物，及其制備方法，以及其在制備治療或預防肺部腫瘤的藥物或保健品中的應用。
【背景技術】
[0002]隨著社會的發展，人類生活水平和醫療環境的改善，人類壽命得到了顯著的延長，但經濟高速發展的同時，機動車保有量增加，尾氣排放導致環境污染嚴重，引起肺部腫瘤的發病率持續增高，嚴重威脅人類健康。在尚無有效藥物實現對惡性腫瘤有效治療的前提下，研發具有預防作用的藥物和保健品，防止疾病的早期形成和發生成為有效的應對方法。
[0003]核轉錄因子Nrf2(Nuclear factor-erythroid2~related factor2)是調節細胞氧化還原平衡的重要轉錄因子，通過與抗氧化酶和II相解毒酶啟動子區域抗氧化反應原件(ARE)結合調控細胞氧化還原平衡，其目標基因包括編碼GST、UGT、y GCS, NQOl的II相解毒酶，及GCUHO-1等內源性抗氧化蛋白。當機體暴露于親電性異物、化學致癌物、內源性氧化劑等對機體有損傷作用的物質下，Nrf2便會被激活并通過上調抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保護機體免受毒物的損傷(Lau et al.，Pharmacol.Res.，2008，58，262-270)。因此，通過激活Nrf2信號通路，增強機體自身清除毒物和致癌物的能力，能夠預防炎癥、腫瘤、神經退行性等疾病的發生。
[0004]在氧化應激狀態下，面對內源性和外源性毒物對機體的侵害,利用外源性Nrf2激動劑上調機體Nrf2水平，能夠增強機體自身防御能力，預防內源性活性氧、外源性致癌物等毒物對機體的損傷，對于預防惡性腫瘤的發生具有重要意義(Magesh et al.,Med.Res.Rev.，2012，32，4，687-726)。激活Nrf2信號通路，能夠上調II相解毒酶水平，清除致癌物或降低其毒性，抑制致癌物誘導的DNA損傷、基因突變，通過上調Nrf2表達，能夠增加細胞內谷胱甘肽水平，增強抗氧化酶活性，清除細胞內活性氧，抑制細胞脂質過氧化，從而預防惡性腫瘤的發生。因此，具有Nrf2激動作用的單體化合物、植物提取物等能夠有效預防惡性腫瘤的發生率。
[0005]滇南木姜子(Litsea garrettii)為常綠喬木,高4至12米。小枝褐色,纖細,初時有淡黃色柔毛，后漸變無毛。頂芽卵圓形，外被黃褐色短柔毛。主產我國南部及西南部；生于海拔750~2000米的灌叢或闊葉林中。
【發明內容】
[0006]針對上述現有技術，本發明公開了滇南木姜子提取物，及其制備方法，以及新用途——滇南木姜子提取物在制備治療或預防肺部腫瘤的藥物或保健品中的應用。
[0007]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0008]本發明的發明人通過研究發現，滇南木姜子提取物能夠激活Nrf2信號通路，并能保護正常肺支氣管表皮細胞抵抗致癌物砷和活性氧雙氧水產生的細胞毒性，因此，可以以滇南木姜子提取物為原料制備預防腫瘤的保健品，也可以制備治療腫瘤的藥物(經查閱文獻，迄今為止未見有滇南木姜子提取物激活Nrf2信號通路的報道，亦未見滇南木姜子用于腫瘤預防和治療的報道)。
[0009]具體應用時，可以以滇南木姜子提取物為原料，添加醫學上可接受的輔料，制成膠囊劑(包括軟膠囊)、片劑、散劑、顆粒、口服液、酒劑、丸劑、微丸劑、合劑、酊劑等劑型，優選顆粒劑、膠囊劑、片劑；或者將滇南木姜子提取物進一步純化制成注射制劑。也可以將滇南木姜子提取物與其它對肺部腫瘤有治療或預防作用的藥物混合，再添加或不添加醫學上可接受的輔料，制成膠囊劑(包括軟膠囊)、片劑、散劑、顆粒、口服液、酒劑、丸劑、微丸劑、合劑、酊劑、注射劑等劑型。
[0010]所述滇南木姜子提取物，是通過以下方法制備得到的:
[0011]將滇南木姜子提地上部分粉碎，用O~95%乙醇(體積百分數)回流提取I~8次，每次溶劑用量為藥材重量的I~20倍，每次提取時間為0.5~10小時；合并提取液，過濾，回收乙醇，進行濃縮、干燥，即得滇南木姜子提取物。
[0012]優選的，用30~90%乙醇回流提取2~4次，每次溶劑的用量為藥材重量的3~7倍,每次提取時間為2~4小時。
[0013]所述滇南木姜子提取物，可以用于制備治療或預防肺部腫瘤的藥物或保健品。
[0014]本發明的發明人完成了滇南木姜子提取物對Nrf2信號激活作用，及對致癌物砷和活性氧雙氧水引起的細胞毒性的保護作用的研究。結果表明，上述滇南木姜子提取物能夠在蛋白水平激活Nrf2，增加Nrf2及其下游基因NQOl和GCS的表達，通過增加細胞內谷胱甘肽的水平增強正常肺支氣管細胞還原能力。發明人還發現滇南木姜子提取物能夠抑制致癌物砷和活性氧雙氧水誘導的細胞毒性，表現出抑制細胞癌變的能力。下面介紹滇南木姜子提取物對Nrf2信號通路的激活作用，及對致癌物砷和活性氧雙氧水引起的細胞毒性的作用:
[0015]采用能夠穩定表達含ARE依賴的熒光素酶質粒的MDA-MB-231-Luc細胞系，評價了滇南木姜子提取物對Nrf2轉錄的作用，結果表明滇南木姜子提取物具有激活Nrf2信號通路的作用(圖1)。
[0016]選擇人乳腺癌MDA-MB-231細胞作為檢測細胞，評價滇南木姜子提取物對Nrf2信號通路的作用。蛋白質印跡分析結果表明，滇南木姜子提取物對能夠上調Nrf2蛋白的表達，并能促進下游抗氧化和II相解毒酶蛋白NQOl和YGCS的表達(圖2)。
[0017]選擇人正常肺上皮Beas_2B細胞，檢測了滇南木姜子提取物對細胞內谷胱甘肽水平的調節作用。結果顯示，滇南木姜子提取物能夠劑量依賴性的增加細胞內谷胱甘肽水平(圖3)，增強細胞內還原能力和清除活性氧能力。
[0018]選擇致癌物砷誘導的細胞毒性模型，評價滇南木姜子提取物對人正常肺上皮Beas-2B細胞的保護作用。經滇南木姜子提取物對處理后，細胞生存率顯著高于未加藥處理組，證明滇南木姜子提取物能夠抑制三價砷誘導的細胞毒性(圖4)，表明滇南木姜子提取物可用于肺部腫瘤的預防和治療。
[0019]選擇活性氧H2O2誘導的細胞毒性模型，評價滇南木姜子提取物對人正常肺上皮Beas-2B細胞的保護作用。結果表明滇南木姜子提取物能夠抑制H2O2產生的毒性，提高細胞生存率(圖5)。腫瘤的發生多與活性氧產生的毒性密切相關，該結果證明滇南木姜子提取物可用于肺部腫瘤的預防和治療。【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1:ARE依賴的熒光素酶報告試驗表明滇南木姜子提取物對能夠激活Nrf2信號通路，圖中的滇南木姜子提取物濃度單位為μ g/mL,蘿卜硫素2.5 μ M為陽性對照。
[0021]圖2:蛋白質印跡分析表明滇南木姜子提取物能夠在蛋白水平激活Nrf2其下游基因，圖中的滇南木姜子提取物濃度單位為μ g/mL,蘿卜硫素2.5 μ M為陽性對照。
[0022]圖3:滇南木姜子提取物能夠增加細胞內谷胱甘肽水平，圖中蘿卜硫素2.5μ M為陽性對照，其中滇南木姜子提取物濃度分別為:30 μ g/mL, 60 μ g/mL, 90 μ g/mL。
[0023]圖4:滇南木姜子提取物能夠降低砷(As)誘導的細胞毒性(*p〈0.05)，圖中滇南木姜子提取物濃度為60 μ g/mL。
[0024]圖5:滇南木姜子提取物能夠降低雙氧水(H2O2)誘導的細胞毒性(*p〈0.05)，圖中滇南木姜子提取物濃度為60 μ g/mL。
【具體實施方式】
[0025]下面結合實施例對本發明作進一步的說明，下述實施例僅為說明之目的，并非用于限制本發明。
[0026]實施例1:滇南木姜子提取物對Nrf 2信號通路的激活作用
[0027]方法:(I)滇南木姜子提取物的制備
[0028]滇南木姜子地上部 分200g，粉碎，75%乙醇800mL，提取2次，每次I小時，合并提取液，濃縮干燥即得，用于活性評價。
[0029](2)人乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞系的培養
[0030]人乳腺癌細胞MDA-MB-231購自美國模式培養物集存庫(ATCC)，采用含10%胎牛血清(FBS)、2mMHEPES和6ng/mL胰島素的MEM培養基，置于37°C，5%C02培養箱中培養。
[0031](3) ARE依賴的熒光素酶報告試驗
[0032]將MDA-MB-231-Luc細胞接種于96孔板上，24小時后加入不同濃度的待測化合物，處理16小時，采用細胞裂解液[0.1M磷酸鉀和ImM 二硫蘇糖醇]裂解細胞，用檢測液(25mM雙甘氨肽，15mM硫酸鎂，500 μ MATP, 250 μ M熒光素和250 μ M輔酶Α)，測定熒光強度。
[0033]結果:如圖1所示，滇南木姜子提取物能夠顯著增強ARE依賴的熒光素酶活性，在90 μ g/mL濃度下，強度是空白對照組的4倍，陽性對照藥物蘿卜硫素(2.5μΜ)是空白對照組的2倍。上述結果表明，滇南木姜子提取物能夠誘導Nrf2信號通路，對人體具有保護作用。
[0034]實施例2:滇南木姜子提取物能夠上調Nrf2及以下游基因蛋白水平的表達
[0035]方法:蛋白質印跡分析(Western blot)檢測細胞中蛋白水平的變化
[0036]將MDA-MB-231細胞接種于直徑35mm培養皿中，培養至密度達到70%~80%后，加入不同濃度的滇南木姜子提取物(滇南木姜子提取物為實施例1制備)處理16h，PBS洗滌2次，加入細胞裂解液(50 μ g/ml抑肽酶，0.5mM苯甲基磺酰氟，ImM正釩酸鈉，IOmM氟化鈉，ΙΟπιΜβ -磷酸甘油)，收集蛋白并采用Bradford法測定蛋白濃度。各取樣品蛋白(100 μ g)上樣，SDS-PAGE分離蛋白組分并采用電轉移法將蛋白條帶轉移至硝酸纖維素薄膜上。薄膜經TBS配制5%的脫脂奶粉溶液室溫封閉Ih后，分別與各待測蛋白抗體4°C孵育過夜。經TBS洗滌后分別加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗孵育Ih后，用增強型ECL化學發光進行蛋白分析。
[0037]結果:如圖2所示，細胞經滇南木姜子提取物處理16h后，Nrf2及其下游抗氧化和II相解毒酶蛋白NQOl和Y GCS蛋白水平呈現劑量依賴性增加，證實滇南木姜子提取物能夠在蛋白水平上激活Nrf2信號通路。
[0038]實施例3:滇南木姜子提取物增加細胞內谷胱甘肽水平
[0039]方法:(I)人正常肺上皮細胞Beas_2B細胞的培養
[0040]人正常肺上皮細胞Beas_2B購自美國模式培養物集存庫(ATCC)，采用F12培養基，并向其中加入10%胎牛血清(FBS)，5%谷氨酰胺，置于37°C，5%C02培養箱中培養。
[0041](2)細胞內谷胱甘肽含量的測定
[0042]將Beas_2B細胞接種于直徑35mm培養皿中，培養至密度達到70%~80%后，加入不同濃度的滇南木姜子提取物(滇南木姜子提取物為實施例1制備)處理24小時，PBS洗滌2次，加入0.5mL50mM磷酸鈉和ImMEDTA緩沖液收細胞，超聲lmin，1000Og離心15分鐘，取上清液，按照谷胱甘肽測定試劑盒說明書操作，412nm測定吸光度并計算谷胱甘肽含量。
[0043]結果:如圖3所示，滇南木姜子提取物能夠顯著增加細胞內谷胱甘肽水平，增強細胞內還原能力。
[0044]實施例4:滇南木姜子提取物能夠抑制三價砷對人肺支氣管上皮Beas_2B細胞的
毒性
[0045]方法:MTT法測定化合物對砷(As)誘導的細胞毒性的保護作用
[0046]將Beas_2B細胞接種于`96孔板上，加入不同濃度待測提取物處理16小時，然后加入不同濃度的砷和待測濃度提取物(植物提取物為實施例1制備)處理24小時，加入MTT3小時后，590nm測定吸光度并計算細胞生存率。
[0047]結果:如圖4所示，采用滇南木姜子提取物預處理細胞16小時，然后加入20 μ M、40 μ M的砷和滇南木姜子提取物處理細胞24小時，結果表明滇南木姜子提取物對Beas-2B細胞具有保護作用，能夠抑制砷誘導的細胞毒性。滇南木姜子提取物處理組的細胞生存率明顯高于未加藥物處理組。結果證明，滇南木姜子提取物能夠抑制致癌物砷誘導的毒性，能夠用于肺部腫瘤的預防和治療。
[0048]實施例5:滇南木姜子提取物能夠抑制活性氧雙氧水(H2O2)對人肺支氣管上皮Beas_2B細胞的毒性
[0049]方法同實施例4。
[0050]結果:圖5所示，采用相應濃度滇南木姜子提取物預處理細胞16小時，然后加入100 μ Μ、200 μ M的H2O2和相應濃度滇南木姜子提取物處理細胞24小時，結果表明滇南木姜子提取物對Beas_2B細胞具有保護作用，能夠抑制H2O2誘導的細胞毒性。滇南木姜子提取物處理組的細胞生存率明顯高于未加藥物處理組。結果證明，滇南木姜子提取物能夠抑制活性氧H2O2產生的細胞毒性，能夠用于肺部腫瘤的預防和治療。
[0051]實施例6:滇南木姜子提取物的制備
[0052]滇南木姜子地上部分5kg，粉碎，用藥材重量的4倍的80%乙醇回流提取3次，每次提取時間為3小時，合并提取液，過濾，回收乙醇，減壓干燥，即得滇南木姜子提取物360g,收率為 7.2%ο[0053]實施例7:片劑的制備
[0054]滇南木姜子提取物(實施例6制備)30g，加入玉米淀粉40g，糊精20g，充分混勻，制顆粒，干燥，整粒，加適量滑石粉，壓片，即得。
[0055]實施例8:膠囊劑的制備
[0056]滇南木姜子提取物(實施例8制備)30g，加入淀粉30g、糊精15g，微晶纖維素10g，充分混勻，制顆粒，干燥，整粒，加`入適量硬脂酸鎂，裝膠囊，即得。
【權利要求】
1.滇南木姜子提取物在制備預防和治療肺部腫瘤的藥物或保健品中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:具體應用時，以滇南木姜子提取物為原料，添加醫學上可接受的輔料，制成膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、口服液、酒劑、丸劑、微丸劑、合劑或酊劑；或者將滇南木姜子提取物純化制成注射制劑；或者:將滇南木姜子提取物與其它對肺部腫瘤具有治療或預防作用的藥物混合，再添加或不添加醫學上可接受的輔料，制成膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、口服液、酒劑、丸劑、微丸劑、合劑、酊劑或注射劑；所述滇南木姜子提取物為該植物地上部分的提取物。
3.一種滇南木姜子提取物，其特征在于:是通過以下方法制備得到的:將滇南木姜子地上部分粉碎，用O~95%乙醇回流提取I~8次，每次溶劑用量為藥材重量的I~20倍，每次提取時間為0.5~10小時；合并提取液，過濾，回收乙醇，進行濃縮、干燥，即得滇南木姜子提取物。
4.權利要求3所述的滇南木姜子提取物在制備預防和治療肺部腫瘤藥物或保健品中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于:具體應用時，以滇南木姜子提取物為原料，添加醫學上可接受的輔料，制成膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、口服液、酒劑、丸劑、微丸劑、合劑或酊劑；或者將滇南木姜子提取物純化制成注射制劑；或者:將滇南木姜子提取物與其它對肺部腫瘤具有治療或預防作用的藥物混合，再添加或不添加醫學上可接受的輔料，制成膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、口服液、酒劑、丸劑、微丸劑、合劑、酊劑或注射劑。
【文檔編號】A61K36/54GK103550293SQ201310545697
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月6日 優先權日:2013年11月6日
【發明者】李國輝, 沈濤, 任冬梅, 王小寧 申請人:濟南市婦幼保健院