功能化視網膜色素上皮細胞移植片的制備方法
【專利摘要】本發明提供一種功能化視網膜色素上皮細胞移植片的制備方法，以納米仿生Bruch’s膜作為視網膜色素上皮細胞載體，將視網膜色素上皮細胞接種到所述納米仿生Bruch’s膜上，在低血清、低糖培養條件下復合培養，構建得到所述功能化視網膜色素上皮細胞移植片；其中，所述納米仿生Bruch’s膜是將原料柞蠶絲素蛋白、聚己內酯、明膠溶于有機溶劑中形成靜電紡絲溶液，利用靜電紡絲法對前述靜電紡絲溶液進行靜電紡絲所制得的超薄多孔的柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠復合納米纖維膜。本發明制備方法得到的功能化RPE細胞移植片能有效避免傳統方法出現的移植后RPE細胞易死亡、細胞極性錯亂等問題，可廣泛應用于細胞移植中。
【專利說明】功能化視網膜色素上皮細胞移植片的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及再生醫學組織工程領域，特別涉及一種功能化視網膜色素上皮細胞移植片的制備方法。
【背景技術】[0002]年齡相關性黃斑變性(AMD)是世界范圍內50歲以上常見的致盲疾病。其主要病因在于視網膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium, RPE)的結構或功能的異常而最終引起視網膜光感受器細胞的凋亡進而導致神經視網膜發生不可逆的變性。隨著我國老齡化程度的增加，該類疾病導致的不可治性失明正成為當前國民經濟建設和社會發展的重大負擔。然而目前對此病的大部分治療(ant1-VEGF藥物等)均是針對并發癥的措施，針對疾病晚期患者以及萎縮性(干性)AMD等毫無干預方法。
[0003]進行RPE移植是有望攻克難治性AMD的最有效途徑之一。國內外多個課題組的研究結果證實將RPE細胞注射至視網膜色素變性動物或者患者的視網膜下腔后，能明顯改善視功能(Schwartz, Steven D.，et al.The Lancet, 2012, 379 (9817):713-720 ；Li, Y,et al.Molecular Medicine, 2012,18:1312-9 ；Carr, A.J.，et al.PLoS ONE,2009,4(12):e8152 ;)。將RPE細胞懸液移植到視網膜下腔后，細胞極易發生流失、凋亡、生長錯位且極難維持細胞的極性。體內RPE是由RPE細胞在Bruch’ s膜上彼此緊密連接形成的極性細胞單層組織。Bruch’s膜為RPE細胞提供生長的微環境并對RPE細胞功能的發揮起著非常重要的作用。已有研研究將人RPE細胞種植在聚氨酯、聚乳酸、聚羥基丁酸戊酯等人工合成材料及膠原、蠶絲素蛋白等天然生物材料制備的膜上構建RPE細胞移植片(Binder, S., etal.British Journal of Ophthalmology, 2011,95 (4):441-2)。盡管人工合成材料具有良好的可塑性及力學特性，但細胞親和力不夠，而天然生物材料富含細胞識別信號分子，但是力學性能不佳，均難滿足臨床應用。此外，要形成功能化的RPE細胞移植片，需要較長的時間，然而這些膜是否能夠長時間支持RPE細胞功能的形成及是否會引起炎癥相關基因的表達等問題在已有的研究中很少涉及。
【發明內容】
[0004]本發明克服現有技術的缺陷，提出了一種功能化視網膜色素上皮細胞移植片的制備方法，以靜電紡絲法制得的超薄多孔柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠復合納米纖維仿生Bruch’s膜作為移植載體，將RPE細胞種植在該膜上，復合培養構建得到功能化RPE細胞移植片。本發明以納米仿生Bruch’ s膜作為視網膜色素上皮細胞載體，將視網膜色素上皮細胞接種到所述納米仿生Bruch’ s膜上,在低血清、低糖培養條件下復合培養,構建得到所述功能化視網膜色素上皮細胞移植片。
[0005]本發明中，進一步地，功能化視網膜色素上皮細胞移植片可根據需要裁剪成
0.5-4mm2大小的移植單元。
[0006]本發明中，獲得所述納米仿生Bruch’s膜的方法為:將原料柞蠶絲素蛋白、聚己內酯、明膠溶于有機溶劑中形成靜電紡絲溶液，利用靜電紡絲法對前述靜電紡絲溶液進行靜電紡絲所制得的超薄的、多孔的、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠復合納米纖維膜。其中，原料柞蠶絲素蛋白、聚己內酯、明膠的質量為比1-5%: 65-85%: 10-30%。
[0007]本發明中，制備所述納米仿生Bruch’ s膜的方法為:
[0008]①.將柞蠶絲脫膠，再經溶解、透析、純化和冷凍干燥后得到純的柞蠶絲素蛋白；
[0009]②.取柞蠶絲素蛋白、聚己內酯、明膠，溶解于有機溶劑中，室溫下，磁力攪拌器上攪拌過夜。得到柞蠶絲素蛋白:聚己內酯:明膠(質量百分比為1-5: 65-85: 10-30)電紡液；優選地，柞蠶絲素蛋白、聚己內酯、明膠在所述靜電紡絲溶液中的質量比為5%: 85%: 10%。
[0010]③.所述原料柞蠶絲素蛋白、聚己內酯、明膠三種原料的質量總和與所述有機溶劑的體積比為10% -30%。優選地，柞蠶絲素蛋白、聚己內酯、明膠三種原料的質量總和與所述有機溶劑的體積比為25%。
[0011]④.將2中電紡液裝入注射器中，裝上0.6-1.2的鈍性針頭，調整針頭到接收器的距離10-20cm，調節電壓在10-30KV，紡絲液擠出速度控制在0.5_3mL/h ；
[0012]⑤.在靜電場中制備納米仿生Bruch’ s膜；
[0013]⑥.獲得的所述納米仿生Bruch’ s膜置于通風廚或恒溫鼓風干燥箱中1_4小時，使殘留的有機試劑完全揮發，得到所述超薄多孔柞蠶絲素蛋白/`聚己內酯/明膠復合納米纖維仿生Bruch’s膜。該納米仿生Bruch’s膜纖維直徑可控制在50_500nm,纖維膜中的孔徑可在100-4000nm范圍內調節，膜厚度2-200 μ m ；
[0014]本發明中，所述納米仿生Bruch’ s膜在接種視網膜色素上皮細胞之前的預處理為:將所述納米仿生Bruch’ s膜置入6孔板中，加入75%乙醇浸泡，然后除去乙醇，緩沖液浸泡后晾干；具體步驟包括:
[0015]①納米仿生Bruch’ s膜置入6孔板中，加入75%乙醇浸泡30_120min后；
[0016]②吸除乙醇，超凈臺上待乙醇完全揮發；
[0017]③加入PBS或HBSS緩沖液浸泡納米仿生Bruch’ s膜2次；
[0018]④超凈臺上晾干后用于細胞接種。
[0019]本發明中，所述接種RPE細胞到視網膜色素上皮細胞載體上的方法為:所述視網膜色素上皮細胞體外培養(DMEM/F12+10% +1%青鏈霉素)至細胞融合后，以0.05%胰蛋白酶-EDTA消化，取密度為I X IOVmL的視網膜色素上皮細胞懸液400 μ L至所述納米仿生Bruch’ s膜的表面，將所述視網膜色素上皮細胞懸液涂布均勻，移至二氧化碳培養箱中培養；補加培養基(DMEM/F12+10%胎牛血清+1%青鏈霉素)繼續培養；待所述視網膜色素上皮細胞融合成單層時，更換低糖低血清培養基繼續培養。
[0020]本發明中，視網膜色素上皮細胞為原代分離或各種干細胞分化來的視網膜色素上皮細胞或經基因修飾的視網膜色素上皮細胞。所述干細胞是胚胎干細胞、誘導多能干細胞、各種成體干細胞、以及采用治療性克隆技術制備的干細胞等。
[0021 ] 本發明中，所述低糖低血清培養基為在含lg/L葡萄糖和110mg/L丙酮酸鈉的DMEM基礎培養基中添加I %胎牛血清與I %青鏈霉素，每周換液2次。
[0022]本發明還提供一種功能化視網膜色素上皮細胞移植片，其包括:納米仿生Bruch’s膜、以及接種在所述納米仿生Bruch’s膜上的視網膜色素上皮細胞；其中，所述納米仿生Bruch’ s膜作為視網膜色素上皮細胞載體。其中，所述功能化視網膜色素上皮細胞移植片是按本發明方法制備得到的。
[0023]本發明采用具有生物活性的超薄、多孔的柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠復合納米纖維仿生Bruch’ s膜作為RPE細胞移植載體。該移植載體采用富含RGD細胞識別模序的柞蠶絲素蛋白與力學性能優異的聚己內酯，同時共混富含親水基團的明膠，實現了材料間優勢互補，克服了傳統單獨人工材料或天然材料的不足缺陷，使得制備的仿生膜既有很好的細胞親和性，同時具有很好的力學性能。此外，應用靜電紡絲技術，仿生天然RPE細胞生存的細胞外基質三維網狀、多孔結構(Bruch’s膜)，既利于營養物質、化學信號分子的傳遞，同時也利于細胞代謝廢物的排出。
[0024]本發明制備方法是一種將人視網膜色素上皮細胞與仿生超薄多孔柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠復合納米纖維膜復合培養，體外構建功能化視網膜色素上皮移植單層的方法。
[0025]本發明功能化RPE細胞移植片中，作為載體的仿生Bruch’ s膜不僅能支持RPE細胞的粘附、增殖，不引起明顯的炎癥反應，而且能促進RPE細胞微觀結構及形貌的形成，神經營養因子的極性分泌及對豬視網膜光感受器外節的吞噬。本發明功能化RPE細胞移植片能有效避免傳統僅僅移植RPE細胞懸液后RPE細胞易死亡，細胞極性錯亂等問題，為RPE細胞的移植提供了新的思路。
[0026]本發明功能化視網膜色素上皮細胞移植片，在植入經典視網膜變性動物模型一RCS大鼠視網膜下腔間隙2周后，不引起免疫排斥反應，且發現移植片上RPE細胞仍大量存活，細胞呈單層極性分布。與傳統的僅僅注射RPE細胞懸液到視網膜下腔(2周后細胞大量減少，細胞分布雜亂)表明采用功能化RPE移植片治療視網膜色素變性疾病上顯著優于傳統的RPE細胞懸液移 植。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1表示RPE細胞分別在各納米仿生Bruch’ s膜及細胞培養板上的粘附能力，其中，A表示RPE細胞種植在細胞培養板(TCP)上；B表示RPE細胞種植在聚己內酯納米仿生Bruch’ s膜上；C表示RPE細胞種植于昨蠶絲素/聚己內酯復合納米仿生Bruch’ s膜上；D表示RPE細胞種植于柞蠶絲素/聚己內酯/明膠復合納米仿生Bruch’ s膜上。
[0028]圖2表示RPE細胞分別在各納米仿生Bruch’ s膜及TCP上的增殖能力比較。
[0029]圖3表示RPE細胞分別與各納米仿生Bruch’s膜復合培養2周后的色素上皮衍生因子(PEDF)的極性分泌。
[0030]圖4表示RPE細胞分別與各納米仿生Bruch’s膜復合培養2周后RPE重要基因表達。
[0031]圖5表示RPE細胞分別與各納米仿生Bruch’s膜復合培養2周后炎癥相關因子表達。
[0032]圖6表示BV-2細胞分別與各納米仿生Bruch’s膜復合培養24小時后炎癥因子表
達差異。
[0033]圖7表示RPE細胞與柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜復合培養4周后SEM圖。A表示RPE細胞微觀形貌，細胞間形成緊密連接(3000倍)；B表示RPE細胞上表面微絨毛顯微結構(10000倍)
[0034]圖8表示RPE細胞分別與柞蠶絲素/聚己內酯/明膠復合納米仿生Bruch’s膜復合培養4周后吞噬豬光感受器細胞外節的能力。其中，A.RPE細胞在TCP上；B.RPE細胞在柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜上。其中，淺灰色為細胞核，白色為吞噬的 FITC-ROS。
[0035]圖9RPE細胞與柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜(B)及TCP (A)復合培養4周后免疫熒光染色觀察ZO-1表達。
【具體實施方式】
[0036]結合以下具體實施例和附圖，對本發明作進一步的詳細說明，本發明的保護內容不局限于以下實施例。在不背離發明構思的精神和范圍下，本領域技術人員能夠想到的變化和優點都被包括在本發明中，并且以所附的權利要求書為保護范圍。實施本發明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發明沒有特別限制內容。基于實施例對本發明進行更詳細的說明，但這些實施例并不對本發明造成任何限定。
[0037]實施例1制備超薄多孔柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠復合納米纖維仿生Bruch’ s膜制備方法包括以下步驟:
[0038]1.柞蠶絲處理:將柞蠶絲脫膠，再經溶解、透析、純化和冷凍干燥后得到純的柞蠶絲素蛋白；
[0039]2.配制電紡溶液:稱取柞蠶絲素蛋白0.125g，聚己內酯2.125g，明膠0.25g于50mL錐形瓶中，加入10mL98%的甲酸溶液，室溫下，磁力攪拌過夜，得靜電紡絲溶液；
[0040]3.電紡過程:將電紡液裝入注射器中，注射器配置直徑0.6mm的鈍性針頭，在電壓12-20kv，收集距離10-20cm，擠出速度l_5mL/h的條件下電紡；優選電壓18kv，收集距離15cm,擠出速度2mL/h ；
[0041]4.后期處理:電紡完成后，將電紡膜放置在通風櫥中1-4小時，待殘余有機溶劑完全揮發；
[0042]5.得到超薄多孔柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠復合納米纖維仿生Bruch’s膜。
[0043]此外，稱取2.5g聚己內酯，按照上述1-4的方法，制備超薄多孔聚己內酯納米纖維仿生Bruch’ s膜。
[0044]此外，稱取0.125g柞蠶絲素蛋白，2.375g聚己內酯，按照上述1_4的方法，制備超薄多孔柞蠶絲素蛋白/聚己內酯復合納米纖維仿生Bruch’ s膜。
[0045]實施例2本發明中的納米仿生Bruch’s膜預處理；細胞種植、培養；以及本發明功能化視網膜色素上皮細胞移植片的制備
[0046]進一步研究實施例1制備得到的納米仿生Bruch’s膜作為RPE細胞移植載體。在與細胞復合培養前必須對其進行消毒等預處理。此外，對細胞種植密度、方式及細胞培養條件等因素也進行了優化。
[0047]1、上述實施例1制得的超薄多孔納米仿生Bruch’s膜的消毒等使用前預處理:將超薄多孔納米仿生Bruch’ s膜裁剪成2X2cm2大小的膜片，并將其放入培養皿中。75%乙醇浸泡30-120min后，吸除乙醇，超凈臺上待乙醇完全揮發，加入PBS或HBSS緩沖液浸泡兩次。
[0048]2、細胞種植:RPE細胞經胰蛋白酶消化，計數，以I X 106/mL密度接種RPE細胞400 μ L至上述超薄多孔納米仿生Bruch’ s膜表面，將細胞懸液涂布均勻，小心移至二氧化碳培養箱中培養4小時。
[0049]3、增加培養基:4小時后，補加培養基l_2mL，繼續培養；
[0050]5、低血清培養:待細胞長滿膜表面、細胞間形成緊密鏈接后，去原培養基，換成低血清、低糖培養基(血清濃度I %，葡萄糖濃度lg/L，110mg/L的丙酮酸鈉)，待其形成緊密連接后，細胞呈多邊形(Z0-1染色陽性，圖9)，并表現出典型的體內RPE細胞功能(神經營養因子極性分泌(圖3)、吞噬光感受器外節(圖8)等)后，即得到本發明功能化視網膜色素上皮細胞移植片。
[0051]實施例3本發明中RPE細胞在各納米仿生Bruch’ s膜上的粘附能力評價
[0052]按照如下步驟研究各納米仿生Bruch’ s膜對細胞粘附能力的影響，如圖1所示。
[0053]1.按照實施例2中的步驟2，3，4操作，將RPE細胞接種到各納米仿生Bruch’s膜(分別為聚己內酯納米仿生Bruch’s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯納米仿生Bruch’s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜)及對照TCP上，24小時后去培養基，PBS或HBSS洗滌4次，去除未粘附的細胞；
[0054]2.倒置顯微鏡下觀察細胞粘附，如圖1所示，其中，A表示RPE細胞種植在TCP上，B表示RPE細胞種植在聚己內酯納米仿生Bruch’ s膜上，C表示RPE細胞種植于柞蠶絲素蛋白/聚己內酯納米仿生Bruch’ s膜上，D表示RPE細胞種植于柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜上。實驗結果表明，與細胞培養板、聚己內酯膜、或柞蠶絲素蛋白/聚己內酯納米仿生Bruch’ s膜比較，本發明功能化視網膜色素上皮細胞移植片中RPE細胞接種在柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜上的粘附能力明顯較強。
[0055]實施例4本發明中RPE細胞在各納米仿生Bruch’ s膜的增殖能力評價
[0056]RPE細胞種植到各納米仿生Bruch’ s膜上后能否在迅速促進細胞增殖至關重要，按照如下方法對RPE細胞分別在各納米仿生Bruch’ s膜(分別為聚己內酯納米仿生Bruch’s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯納米仿生Bruch’s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜)及細胞培養板(TCP)上的增殖能力進行了評價。
[0057]1.將上述各納米仿生Bruch’ s膜裁剪成直徑6mm大小的圓形小片，置入96孔板的孔中，按照實施例2中步驟I所描述的方法進行消毒；
[0058]2.分別在上述各納米仿生Bruch’ s膜上種植RPE細胞，密度為I X IO VmL,每孔100 μ L細胞懸液，隔天換液。
[0059]3.細胞在上述各納米仿生Bruch’s膜上培養7天，每隔一天采用WST-1細胞增殖檢測試劑盒對細胞增殖能力進行評價，實驗結果如圖2所示，顯示RPE細胞在聚己內酯納米仿生Bruch’ s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯納米仿生Bruch’ s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜均能生長、增殖。實驗結果表明，本發明功能化視網膜色素上皮細胞移植片中RPE細胞在柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠復合納米仿生Bruch’s膜上的增殖速率顯著高于其他仿生Bruch’ s膜及細胞培養板(TCP)。
[0060]實施例5本發明中RPE細胞與各納米仿生Bruch’ s膜復合培養2周后色素上皮衍生因子(PEDF)的極性分泌[0061]天然RPE細胞位于Bruch’ s膜上排列成單層，且能極性分泌色素上皮衍生因子(PEDF)，本實施例對RPE細胞在不同仿生膜上復合培養后是否能極性分泌PEDF進行檢測:
[0062]1.仿生膜處理:將各納米仿生Bruch’s膜(聚己內酯納米仿生Bruch’s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯納米仿生Bruch’s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜)裁剪成直徑與24孔板孔徑大小一致的圓形小片，置入24孔的Transwell板上室底部，按照實施例2中步驟I所描述的方法進行消毒；
[0063]2.細胞種植:分別以IX 105/mL密度接種RPE細胞400 μ L至上述各納米仿生Bruch’ s膜表面及組織培養板中，將細胞懸液涂布均勻，小心移至二氧化碳培養箱中培養4小時；
[0064]3.更換培養基:吸除原培養基，在Transwell上室中加入低血清、低糖培養基100 μ L，下室加入600 μ L培養基，每三天更換培養基一次；
[0065]4.復合培養2周后，分別回收上、下室培養基，采用色素上皮衍生因子(PEDF)ELISA檢測試劑盒分別對上、下室PEDF濃度進行檢測。實驗結果如圖3所示，RPE細胞分別在柞蠶絲素蛋白/聚己內酯納米仿生Bruch’ s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜培養2周后均能極性分泌PEDF因子，且上室顯著高于下室。而將RPE細胞分別與聚己內酯納米仿生Bruch’ s膜、組織培養板復合培養2周后，上下室PEDF濃度沒有顯著差異，即未能極性分泌PEDF因子。實驗表明，本發明功能化視網膜色素上皮細胞移植片中，RPE細胞種植在柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜上培養后極性分泌PEDF因子的效果顯著。
[0066]實施例6本發 明中RPE細胞與各納米仿生Bruch’ s膜復合培養2周后，RPE細胞
重要基因表達
[0067]仿生Bruch’ s膜能否支持RPE細胞重要基因的正常表達直接關系到該仿生Bruch’ s膜能否用于后期的移植。本實施例對不同仿生膜(聚己內酯納米仿生Bruch’ s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯納米仿生Bruch’s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜)及TCP對RPE細胞重要基因表達的影響進行檢測，以TCP為對照組，步驟如下:
[0068]1.仿生膜處理:分別將上述各仿生膜裁剪成直徑與6孔板孔徑大小一致的圓形小片，置入六孔板底部，按照實施例2中步驟I所描述的方法進行消毒；
[0069]2.細胞種植:分別以IX IOfVmL密度接種RPE細胞400 μ L至上述各納米仿生Bruch’ s膜表面，將細胞懸液涂布均勻，小心移至二氧化碳培養箱中培養4小時；
[0070]3.更換培養基:吸除原培養基，在每個板孔中加入低血清、低糖培養基2mL，每3天更換培養基一次；
[0071]4.去原培養基，PBS洗滌2次，0.05% EDTA-胰蛋白酶溶液消化細胞，收集細胞；
[0072]5.加入Trizol，將細胞裂解，提取總RNA;
[0073]6.利用cDNA合成試劑盒合成第一鏈，利用RT-PCR技術比較RPE細胞在各組仿生膜及TCP上復合培養后的RPE重要基因及炎癥相關基因表達；
[0074]實驗結果如圖4所示,表明RPE細胞分別在聚己內酯納米仿生Bruch’s膜、昨蠶絲素蛋白/聚己內酯納米仿生Bruch’s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜上復合培養2周后均能正常表達其重要基因。實驗表明，本發明功能化視網膜色素上皮細胞移植片中，RPE細胞種植在柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜上培養后能正常表達其重要基因。
[0075]實施例7本發明中RPE細胞及BV-2細胞(小膠質細胞)與仿生Bruch’s膜復合培后，炎癥因子的表達
[0076]目前報道的多數細胞移植載體均未涉及是否能引起炎癥因子表達量的顯著增加，而這一點關系到后面移植實驗成敗。本實施例將RPE細胞及在炎癥反應中其重要作用的小膠質細胞(BV-2細胞)與不同仿生Bruch’s膜(聚己內酯納米仿生Bruch’s膜、昨蠶絲素蛋白/聚己內酯納米仿生Bruch’ s膜、昨蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜)及TCP復合培養，RT-PCR和Real Time PCR等方法檢測炎癥因子的表達:
[0077]1.仿生膜處理:分別將上述各仿生膜裁剪成直徑與6孔板孔徑大小一致的圓形小片，置入六孔板底部，按照實施例2中步驟I所描述的方法進行消毒；
[0078]2.細胞種植:分別以I X IOVmL密度接種RPE細胞或BV-2細胞400 μ L至上述與不同仿生Bruch’s膜(聚己內酯納米仿生Bruch’s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯納米仿生Bruch’s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜)及TCP復合培養，將細胞懸液涂布均勻，小心移至二氧化碳培養箱中培養4小時；
[0079]3.更換培養基:吸除原培養基，在每個板孔中加入正常細胞培養基(含10%血清，
4.5g/L的葡萄糖)2mL，37°C的二氧化碳培養箱中過夜；
[0080]4.培養24小時后，去原培養基，PBS洗滌2次，0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液消化BV-2細胞，收集BV-2細胞；
[0081]5.培養2周后，去原培養基，PBS洗滌2次，0.05% 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液消化RPE細胞，收集RPE細胞；
[0082]6.加入Trizol，將細胞裂解，提取總RNA;
[0083]7.利用cDNA合成試劑盒合成第一鏈，利用RT-PCR技術比較RPE細胞在各組仿生膜及TCP上復合培養后炎癥相關基因表達；
[0084]8.利用cDNA合成試劑盒合成第一鏈，利用Real-Time PCR技術比較BV-2細胞在各組仿生膜及對照組(TCP)上復合培養24小時后的炎癥相關基因(CCL-20，IL_6，IL-12，TNF- a，MCP-1)表達；
[0085]實驗結果如圖5所示，表明RPE細胞在聚己內酯納米仿生Bruch’s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯納米仿生Bruch’s膜、昨蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜上復合培養2周后均不引起RPE細胞炎癥因子表達量的增加。
[0086]如圖6所示，實驗結果表明BV-2細胞在聚己內酯納米仿生Bruch’ s膜、柞蠶絲素蛋白/聚己內酯納米仿生Bruch’s膜、昨蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜上復合培養24小時后炎癥因子的表達量并未發生顯著改變，和對照組類似。此外，TNF-a基因的表達量有所下調。實驗結果表明，本發明功能化視網膜色素上皮細胞移植片中RPE細胞在柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜上復合培養后，炎癥因子的表達量并未發生顯著改變。
[0087]實施例8本發明中RPE細胞與柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜復合培養4周后掃描電子顯微鏡(SEM)觀察細胞形貌
[0088]RPE細胞在體內Bruch’ s膜上緊密排列成單細胞層，細胞上表面有微絨毛等超微結構。本實施例將RPE細胞與柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜復合培養后觀察是否能形成體內RPE細胞的超微結構，步驟如下:
[0089]1.按照實施例2中步驟將RPE細胞與柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch, s膜復合后，低血清、低糖培養基培養4周；
[0090]2.吸除原培養基，PBS洗滌RPE細胞-仿生Bruch’ s膜復合體4次；
[0091]3.4°C預冷的2.5%戊二醛溶液中固定4小時(4°C冰箱中進行)；
[0092]4.吸除固定液，PBS洗滌2次；
[0093]5.采用二氧化碳超臨界方法對RPE細胞-仿生Bruch’s膜復合體進行干燥處理；
[0094]6.利用真空噴鍍設備對RPE細胞-仿生Bruch’ s膜復合體表面進行噴金處理；
[0095]掃描電子顯微鏡下觀察，結果如圖7所示，RPE細胞在柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜上融合成單層，細胞呈典型的多邊形貌，細胞間形成緊密連接，細胞的上表面出現微絨毛結構。圖7中，圖A表示RPE細胞與柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜復合培養4周后掃描電子顯微鏡圖(X3000);圖B表示RPE細胞與柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜復合培養4周后掃描電子顯微鏡圖(X 10000)。
[0096]實施例9本發明中RPE細胞與柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜復合培養4周后吞噬豬光感受器細胞外節的能力評價
[0097]RPE細胞在體內Bruch’ s膜上緊密排列成單細胞層，吞噬功能是RPE細胞重要的生理功能，RPE細胞能吞噬脫落的光感受器細胞外節盤膜，這對光感受器細胞外節的更新及維持正常的視覺功能至關重要。本實施`例按照以下步驟評價RPE細胞在柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜上復合培養后吞噬功能。
[0098]1.按實施例2中步驟分別將RPE細胞與柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜及TCP復合后，低血清、低糖培養基培養4周；
[0099]2.屠宰場獲取新鮮豬眼球，分離視網膜光感受器細胞外節(ROS)，利用異硫氰酸熒光素(FITC)標記外節，得到FITC-ROS ；
[0100]3.將FITC-ROS于柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠復合納米仿生Bruch’s膜及組織培養板上的細胞37°C的二氧化碳培養箱中孵育4小時；
[0101]4.為了去除未被RPE細胞吞噬FITC-ROS的假陽性干擾，加入0.2%的臺盼藍溶液(PBS配置)孵育lOmin，淬滅未被吞噬的FITC-ROS ；
[0102]5.采用DAPI對細胞核進行染色；
[0103]6.倒置熒光顯微鏡下觀察RPE細胞對FITC-ROS的吞噬情況。
[0104]實驗結果如圖8所示，RPE細胞在柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜上，表明本發明中RPE細胞在柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠復合納米仿生Bruch’ s膜上培養2周后能吞噬FITC-ROS (圖8B)，且與RPE細胞在TCP上(圖8A)比較，吞噬效果較好。
[0105]實施例10本發明中RPE細胞與柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜復合培養4周后ZO-1蛋白免疫熒光染色
[0106]天然RPE細胞之間形成緊密連接，細胞表達ZO-1蛋白，細胞呈多邊形。本實施例檢測RPE細胞與納米仿生Bruch’ s膜復合培養四周后ZO-1表達，及細胞形貌。[0107]1.按實施例2中步驟分別將RPE細胞與柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜及TCP復合后，低血清、低糖培養基培養4周；
[0108]2.去培養基，PBS或HBSS緩沖液洗滌3次，每次5min ；
[0109]3.4%多聚甲醛固定30min，去多聚甲醛，PBS或HBSS緩沖液洗滌3次，每次5min ；
[0110]4.0.1% Triton X_100(PBS 稀釋)處理1Omin ;
[0111]5.5%山羊血清37°C封閉1h;添加抗ZO-1抗體，4°C孵育過夜；
[0112]6.PBS洗滌3次，每次5min ;加TRITC標記的熒光二抗，37°C孵育2小時；
[0113]7.PBS洗滌3次，每次5min，封片劑封片。
[0114]8.熒光倒置顯微鏡下觀察；
[0115]9.結果如圖9所示，RPE細胞在柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’s膜(圖B)及TCP上(圖A)復合培養4周后均形成緊密連接，細胞呈多邊形，ZO-1陽性表達。與TCP相比，RPE細胞在柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠納米仿生Bruch’ s膜上排列更為緊密，細胞多邊形貌更為規則。
[0116]實施例11功能化RPE細胞移植片移植治療視網膜色素變性疾病動物模型研究
[0117]1.按照實施例2中所述制備功能化人RPE細胞移植片，根據實驗需要進行裁剪，本實驗中采用2mmX2mm大小的RPE細胞移植片。
[0118]2.取5只30天齡的RCS大鼠(天然視網膜色素變性動物模型)經氯胺酮(60mg/kg)麻醉，1%硫酸阿托品散瞳，0.5%地卡因局部麻醉鼠眼。行外路法經平坦部作三切口玻璃體切割，在每只大鼠的顳上方網膜下注射生理鹽水，形成局部視網膜脫離，采用植入器將功能化的RPE細胞移植片植入RCS大鼠視網膜下間隙，對照眼采用傳統的RPE細胞懸液注入RCS大鼠視網膜下間隙，其他操作與實驗組一致。術后結膜下注射地塞米松注射液，持續1周。
[0119]3.植入后2周，對大鼠實施安樂死，取眼球在4%多聚甲醛中固定過夜，PBS中浸泡兩次，每次5分鐘，30%蔗糖脫水48小時。
[0120]4.0CT包埋，進行冰凍切片。
[0121]5.進行HE染色，病理分析。
[0122]6.結果顯示，移植片周圍未出現明顯的毒性反應及排斥反應。
[0123]7.利用抗人細胞的抗體(Ant1-Nuclei Antibody)對切片進行免疫染色,發現移植片上RPE細胞仍大量存活，細胞呈單層極性分布；但對照眼陽性細胞大量減少，且分布不均，RPE細胞未表現出明顯的極性。該結果顯示，采用功能化RPE移植片治療視網膜色素變性疾病上顯著優于傳統的RPE細胞懸液移植。
【權利要求】
1.一種功能化視網膜色素上皮細胞移植片的制備方法，其特征在于，以納米仿生Bruch’ s膜作為視網膜色素上皮細胞載體，將視網膜色素上皮細胞接種到所述納米仿生Bruch’ s膜上，在低血清、低糖培養條件下復合培養，構建得到所述功能化視網膜色素上皮細胞移植片；其中，所述納米仿生Bruch’ s膜是將原料柞蠶絲素蛋白、聚己內酯、明膠溶于有機溶劑中形成靜電紡絲溶液，利用靜電紡絲法對前述靜電紡絲溶液進行靜電紡絲所制得的超薄多孔的柞蠶絲素蛋白/聚己內酯/明膠復合納米纖維膜。
2.如權利要求1中所述的制備方法，其特征在于，所述功能化視網膜色素上皮細胞移植片可根據需要裁剪成0.5-4mm2大小的移植單元。
3.如權利要求1中所述的制備方法，其特征在于，所述接種的方法為:所述視網膜色素上皮細胞體外培養至細胞融合后，以0.05%胰蛋白酶-EDTA消化，取密度為I X 106/mL的視網膜色素上皮細胞懸液400 μ L至所述納米仿生Bruch’s膜的表面，將所述視網膜色素上皮細胞懸液涂布均勻，移至二氧化碳培養箱中培養；補加培養基繼續培養；待所述視網膜色素上皮細胞融合成單層時，更換低糖低血清培養基繼續培養。
4.如權利要求1中所述的制備方法，其特征在于，所述柞蠶絲素蛋白、聚己內酯、明膠的質量為比 1-5%: 65-85%: 10-30% ο
5.如權利要求1中所述的制備方法，其特征在于，在接種視網膜色素上皮細胞之前，所述納米仿生Bruch’s膜的預處理為:將所述納米仿生Bruch’s膜置入細胞培養板或細胞培養皿中，加入75%乙醇浸泡，然后除去乙醇，PBS或HBSS緩沖液浸泡后晾干。
6.如權利要求1中所述的制備方法，其特征在于，所述視網膜色素上皮細胞為原代分離的或干細胞分化的或經基因修飾的視網膜色素上皮細胞。
7.如權利要求1中所述的制備方法，其特征在于，所述低糖低血清培養基為在含lg/L葡萄糖和110mg/L丙酮酸鈉的DMEM基礎培養基中添加1%胎牛血清與1%青鏈霉素。
8.一種功能化視網膜色素上d皮細胞移植片，其特征在于，其包括:納米仿生Bruch’ s膜、以及種植在所述納米仿生Bruch’ s膜上的視網膜色素上皮細胞；其中，所述納米仿生Bruch’ s膜作為視網膜色素上皮細胞的載體。
9.一種按權利要求1中所述方法制備得到的功能化視網膜色素上皮細胞移植片。
【文檔編號】A61L27/22GK103656742SQ201310631831
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年11月29日
【發明者】金子兵, 向萍, 李敏, 項略 申請人:溫州醫科大學, 福建師范大學