促紅細胞生成素載藥納米粒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及醫藥領域，尤其是指促紅細胞生成素載藥納米粒及其應用。具體是分別用殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束和聚乙二醇（PEG）修飾的脂質納米粒為載體，通過靜電作用，使載體與在水溶液中呈負電的人促紅細胞生成素erythropoietin(hEPO)結合，形成載藥納米粒。促紅細胞生成素載藥納米粒用于制備治療腦缺血損傷藥物中的應用及促紅細胞生成素的鼻腔給藥制劑本發明克服了目前實驗和臨床試驗中采用了腦室給藥或高劑量的EPO來治療腦缺血的缺陷。而且可以達到治療效果。
【專利說明】促紅細胞生成素載藥納米粒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫藥領域，尤其是指促紅細胞生成素載藥納米粒及其應用。具體是分別用殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束和聚乙二醇(PEG)修飾的脂質納米粒為載體，通過靜電作用，使載體與在水溶液中呈負電的人促紅細胞生成素erythropoietin (hEPO)結合,形成載藥納米粒，用于鼻粘膜給藥治療腦缺血的應用。
【背景技術】
[0002]腦缺血是發病率、致殘率和死亡率最高的常見病之一，嚴重危害人類健康。由于其病理生理機制極為復雜，涉及興奮性神經毒性、氧化損傷、炎癥反應、Ca2+超載、滲透效應等多元機制，近年的研究表明促紅細胞生成素(EPO)在預實驗中得出有希望的結果，引起研究者廣泛關注和深層次的思考。[0003]促紅細胞生成素(EPO)最初主要由肝臟產生，出生后逐漸轉向腎臟產生的一種糖蛋白，其分子量為34KDa。最初認為EPO主要通過抑制凋亡和刺激紅系主細胞的分化與增殖來調節紅細胞的生成。最近研究表明，EPO受體(EPOR)廣泛地表達于各種細胞與組織，包括神經元、膠質細胞和腦內毛細管內皮細胞。EPO和EPOR在嚙鼠類、靈長類和人類的神經系統都有功能性地表達，并在發育的過程中有明顯地變化，提示其在神經發育中有重要作用。此外，EPO和EPOR在腦缺血、缺氧和貧血時的表達增加，提示其可能也是一種內源性的神經保護劑。細胞和整體動物實驗表明，EPO對腦缺血、缺氧等誘導的興奮性損傷都有保護作用。我們前期的結果同樣證明EPO在整體和細胞上都有保護神經元興奮性損傷作用。這些結果表明，EPO可能為臨床腦缺血的治療提供了一條新的思路。
[0004]但是，由于EPO是一種多肽類物質，很難直接進入血腦屏障。雖然在腦缺血時，血腦屏障的通透性可能增加，也有認為EPO可通過受體介導的主動轉運進入腦內，但是一系列研究表明，進入腦內的EPO只有1%左右。因此，實驗和臨床試驗中不得不采用了腦室給藥或高劑量的EPO來治療腦缺血。但是，腦室給藥方案在臨床應用的不現實性及高劑量的EPO往往不可避免地產生促紅細胞生成等副作用。此外，也有觀點認為外周給予高劑量EPO可能同時促進腫瘤的生長。最近，高劑量的重組EPO治療腦缺血在美國進入臨床一期試驗，但是由于其外周等副作用，面臨著停止進一步試驗的危險。因此，為了安全、有效、非侵入性地使EPO進入腦內，提高其藥用潛能，全世界各研究小組嘗試了許多方法。但目前為止還沒有有效地提高EPO的腦內效能同時解決EPO的外周副作用問題。
【發明內容】
[0005]為了解決以上問題，本發明提供了一種容易進入血腦屏障的促紅細胞生成素載藥納米粒。
[0006]促紅細胞生成素載藥納米粒，包括用殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束或聚乙二醇修飾的納米粒和通過靜電作用與納米粒結合的促紅細胞生成素。
[0007]進一步的，用殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束修飾的納米粒，所述促紅細胞生成素與載體的質量之比為10-20% ;納米粒的粒徑為200-270nm，包封率在43-87%之間。
[0008]進一步的，用聚乙二醇修飾的脂質納米粒，所述促紅細胞生成素與載體的質量之比為1% ;所述納米粒的粒徑為171.3±0.71nm，所述納米粒的表面電位為7.8±0.28mV。
[0009]另外，本發明還提供了促紅細胞生成素載藥納米粒的制備方法，具體方法為:首先，選用殼聚糖-硬脂酸在水中自聚集形成“核-殼”結構膠團，然后，通過靜電作用，使帶正電的“核-殼”結構膠團與在水溶液中呈負電的促紅細胞生成素結合，形成促紅細胞生成素載藥納米粒；或者，首先以單硬脂酸甘油酯、硬脂胺、PEG(2000)為原料，采用溶劑擴散法制備SLN，然后，通過靜電作用，在水溶液中呈負電的促紅細胞生成素與帶正電的SLN結合，形成促紅細胞生成素載藥納米粒。
[0010]本發明還提供了促紅細胞生成素載藥納米粒用于制備治療腦缺血損傷藥物中的應用。 [0011]本發明又提供了促紅細胞生成素的鼻腔給藥制劑，包括結合有促紅細胞生成素的納米粒，所述制劑通過鼻腔將促紅細胞生成素靶向到腦部。
[0012]進一步的，所述納米粒為促紅細胞生成素通過靜電作用與用殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束或聚乙二醇修飾的納米粒結合形成的促紅細胞生成素載藥納米粒。
[0013]進一步的，所述劑型為納米粒溶液。
[0014]進一步的,促紅細胞生成素有效濃度為1000iu/ml。
[0015]進一步的，每次鼻腔給藥劑量為10_20iu/kg。
[0016]最近，腦靶向給藥系統概念的提出，采用微粒給藥系統，如脂質體、納米粒、微乳可以通過鼻腔給于神經生長因子可經嗅神經-嗅球-嗅束通路，最終到達大腦深部及腦脊液中，從而起到營養和保護CNS的作用，它將有效地解決CNS疾病的外周給藥的矛盾。另外，鼻腔給藥具有生物利用度高。同時，也適用于由于各種原因而無法口服給藥的患者。與注射給藥相比，鼻腔給藥使用方便，可自行用藥，對機體損傷輕或無，患者依從性好，無纖毛毒性及刺激性的藥物制劑適于長期給藥，并可減少傳染性疾病的傳播。根據以上設想，我們通過EPO鼻腔給藥系統的構建，EPO經鼻內給藥，經鼻粘膜上皮細胞吸收，通過嗅覺通路進入中樞，以達到體內外周給藥治療腦缺血的目的，避免了將EPO可能帶來的不安全性和臨床難以應用等問題，并且極大地提高了經濟效益。這將是使其臨床應用更具可行性和經濟性，從而建立治療腦缺血的新方法和手段。另外，EPO鼻腔給藥系統的設計思路不僅對腦缺血有潛在的治療如景，也將為多妝類藥物在中樞等各種疾病的治療研究中提供新的思路。
[0017]為提高脂溶性藥物的腦部利用度，本發明采用微粒給藥系統，如脂質體、納米粒、微乳后再鼻腔給藥。本專利分別用殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束和聚乙二醇修飾的脂質納米粒為載體，通過靜電作用，使載體與在水溶液中呈負電的人促紅細胞生成素erythropoietin (hEPO)結合,形成載藥納米粒,制成鼻粘膜給藥劑型，用于治療腦缺血。
[0018]本發明采用殼聚糖-硬脂酸聚合物作為EPO載體鼻粘膜給藥腦靶向治療腦缺血:選用殼聚糖-硬脂酸(CSO-SA)為原料，其在水中自聚集形成“核-殼”結構膠團，具有良好的穿透細胞膜能力和較低的細胞毒性。通過靜電作用，使帶正電的CSO-SA膠團與在水溶液中呈負電的人促紅細胞生成素erythropoietin (hEPO)結合,形成載藥納米粒。用異硫氰酸突光素FITC標記CS0-SA，追蹤腦內分布。微粒粒度及表面電位分析儀測定FITC標記CSO-SA載藥前后的粒徑和電位變化。選用在SD大鼠作為模型動物，鼻粘膜給藥后，勻漿法測定給藥0.5h和Ih后腦組織的載體濃度。另外，選用SD大鼠局灶性腦缺血模型，鼻粘膜給藥后，觀察腦梗死體積及神經功能評分。
[0019]本發明采用PEG修飾脂質納米粒作為EPO載體鼻粘膜給藥腦靶向治療腦缺血:用異硫氰酸熒光標記硬脂胺(0DA-FITC)，以單硬脂酸甘油酯(MS)、硬脂胺(0DA-FITC)、PEG(2000)為原料，采用溶劑擴散法制備SLN。通過靜電作用，在水溶液中呈負電的人促紅細胞生成素erythropoietin (hEPO)與帶正電的SLN結合,形成載藥納米粒。微粒粒度及表面電位分析儀測定FITC標記SLN的粒徑。用ELISA試劑盒法考察SLN與EPO水解條件。選用SD大鼠作為模型，將FITC標記PEG-SLN鼻粘膜給藥，用乙腈提取ODA-FITC追蹤SLN的腦內分布。另外，選用SD大鼠局灶性腦缺血模型，鼻粘膜給藥后，觀察腦梗死體積及神經功能評分。 [0020]本發明克服了目前實驗和臨床試驗中采用了腦室給藥或高劑量的EPO來治療腦缺血的缺陷。而且可以達到治療效果。
[0021]具體實施方法
[0022]下面結合具體實施例進一步闡述本發明，應理解，以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的保護范圍。
[0023]下列實施例中所用方法如無特別說明，均為常規方法。以下實施例中所需要的材料或試劑，如無特殊說明均為市場購得。實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是一種實驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，不應成為對本發明生物材料來源的限制。
[0024]所述百分比濃度若無特別說明均為質量/體積(W/V)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度。
[0025]殼聚糖、硬脂酸、聚乙二醇2000等試劑購自上海國藥集團化學試劑有限公司，分析純。
[0026]EPO原液由沈陽三生制藥股份有限公司提供，濃度為30000iu/ml。
[0027]實施例1:殼聚糖-硬脂酸聚合物作為EPO載體的鼻腔給藥制劑的鼻粘膜給藥腦革巴向治療腦缺血
[0028](一)實驗方法
[0029]1.1EPO載藥納米粒溶液的制備
[0030]取EPO原液，用蒸餾水稀釋濃度大約至1000IU/ml (相當于0.0082mg/ml)，磁力攪拌下加入不同體積的0.082mg/ml CSO-SA溶液，使EPO/載體質量比分別為10%、15%、20%。室溫攪拌5min，即得不同載藥量的CS0-SA/EP0載藥納米粒溶液，分別記作CS0_SA/10%，，CSO-SA/15%, CS0-SA/20%。
[0031]1.2包封率的測定
[0032]取CS0-SA/EP0載藥納米粒溶液若干體積，至于超濾離心管(Microcon YM-10,MWC010, 000，Millipore C0.，USA)。10，OOOrpm 離心 5min，超濾液用樣品稀釋液稀釋 5000倍。按以下公式計算包封率和載藥量。包封率=(脂質體中包封的藥物/脂質體中藥物總量)X 100%。用ELISA試劑盒法測定EPO含量。
[0033]1.3CS0-SA/EP0 體外釋放度
[0034]如L I制備CS0-SA/EP0載藥納米粒溶液，使EP0/CS0-SA為20% (w/w)。取上述溶液IOOy I于過濾管中，加入ΡΗ7.4的PBS400y 1，37°C振蕩，定時取樣。超濾離心條件為1000Orpm, IOmin0并補加新鮮PBS。用ELISA試劑盒測定EPO的含量。
[0035]1.4標記載體
[0036]配制10mg/ml的CSO-SA載體溶液2ml，按質量比20:1 (載體/FITC)加入4mg/ml的FITC溶液lml,攪拌反應過夜。透析12h,每Ih換一次水。定容至4ml,得5mg/ml的載體溶液，記作FITC-CS0-SA。1.5組織提取方法回收率
[0037]取0.25g左右的腦組織，使樣品處理后的終濃度分別為0.01 μ g/ml,0.048 μ g/ml,0.16 μ g/ml,并用PBS溶液補充至g*5ml,勻衆。離心(15000rpm, 15min),取上清液0.8ml,加入乙臆 1.2ml, 37。C 孵育 30min,離心(15000rpm, 15min)。取上清液 1.5ml,吹干，加入水0.3ml，混勻，離心(15000rpm，15min)，取上清液測定熒光值A。用PBS溶液配制
0.01 μ g/ml，0.048 μ g/ml，0.16 μ g/ml的載體溶液作為標準溶液，測得熒光為B。
[0038]
【權利要求】
1.促紅細胞生成素載藥納米粒，包括用殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束或聚乙二醇修飾的納米粒和通過靜電作用與納米粒結合的促紅細胞生成素。
2.根據權利要求1所述的促紅細胞生成素載藥納米粒，其特征在于:用殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束修飾的納米粒，所述促紅細胞生成素與載體的質量之比為10-20% ;納米粒的粒徑為200-270nm，包封率在43-87%之間。
3.根據權利要求1所述的促紅細胞生成素載藥納米粒，其特征在于:用聚乙二醇修飾的脂質納米粒，所述促紅細胞生成素與載體的質量之比為1% ;所述納米粒的粒徑為171.3±0.71nm，所述納米粒的表面電位為7.8±0.28mV。
4.根據權利要求1所述的促紅細胞生成素載藥納米粒的制備方法，其特征在于:具體方法為:首先，選用殼聚糖-硬脂酸在水中自聚集形成“核-殼”結構膠團，然后，通過靜電作用，使帶正電的“核-殼”結構膠團與在水溶液中呈負電的促紅細胞生成素結合，形成促紅細胞生成素載藥納米粒；或者，首先以單硬脂酸甘油酯、硬脂胺、PEG(2000)為原料，采用溶劑擴散法制備SLN，然后，通過靜電作用，在水溶液中呈負電的促紅細胞生成素與帶正電的SLN結合，形成促紅細胞生成素載藥納米粒。
5.促紅細胞生成素載藥納米粒用于制備治療腦缺血損傷藥物中的應用。
6.促紅細胞生成素的鼻腔給藥制劑，其特征在于:包括結合有促紅細胞生成素的納米粒，所述制劑通過鼻腔將促紅細胞生成素靶向到腦部。
7.根據權利要求6所述的促紅細胞生成素的鼻腔給藥制劑，其特征在于:所述納米粒為促紅細胞生成素通過靜電作用與用殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束或聚乙二醇修飾的納米粒結合形成的促紅細胞生成素載藥納米粒。
8.根據權利要求6或7所述的促紅細胞生成素的鼻腔給藥制劑，其特征在于:所述劑型為納米粒溶液。
9.根據權利要求6所述的促紅細胞生成素的鼻腔給藥制劑，其特征在于:促紅細胞生成素有效濃度為1000iu/ml。
10.根據權利要求9所述的促紅細胞生成素的鼻腔給藥制劑，其特征在于:每次鼻腔給藥劑量為10-20iu/kg。
【文檔編號】A61K47/34GK103638527SQ201310654097
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月5日 優先權日:2013年12月5日
【發明者】戴海斌, 徐慧敏, 胡薇薇 申請人:浙江大學