一種蛞蝓的提取方法及其抗肺癌應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種蛞蝓的提取方法及其抗肺癌應用。包括（1）將蛞蝓真空凍干，加入純化水然后進行水浴攪拌，向其中加入高濃度乙醇溶液，攪拌均勻至乙醇濃度為60-70%，靜置，然后固液分離；（2）采用無機陶瓷膜系統對步驟（1）所得的液體進行澄清截留，得到蛞蝓總清液；（3）對步驟（2）所得的蛞蝓總清液再經反滲透膜濃縮；（4）對步驟（3）所得的超濾液進行濃縮干燥，得到的水溶性蛞蝓粉。本發明所得的蛞蝓粉的分子量集中在20000到3000之間，具有顯著的抑癌作用，腫瘤抑制率高于華蟾素，接近于環磷酰胺。本發明的水溶性蛞蝓粉用于治療肺癌，高效且低毒。
【專利說明】一種蛞蝓的提取方法及其抗肺癌應用
【技術領域】
[0001]本發明蛞蝓【技術領域】，具體地說，涉及一種蛞蝓的提取方法及其抗肺癌應用。
【背景技術】
[0002]近半個世紀以來，肺癌的發病率及死亡率均在逐年增加，到20世紀末肺癌已占惡性腫瘤死亡的首位。根據世界衛生組織(WHO)定期公布的資料顯示，肺癌的發病率和死亡率在世界各國均呈明顯上升的趨勢，尤其在工業發達的國家。各種污染，如車輛尾氣、抽煙也是引發肺癌的誘因。在許多發達國家里肺癌已是最常見的惡性腫瘤了，在男性常見惡性腫瘤里，肺癌位列第一，在女性常見惡性腫瘤里，肺癌位列第二。28個發達國家公布的調查統計資料顯示肺癌已成為惡性腫瘤中最常見的死亡原因。在肺癌中非小細胞肺癌(Non-SmallCell Lung Cancer，NSCLC)約占85%_90%，而非小細胞肺癌中以肺腺癌為主(約占40%)。內科治療、外科治療，以及放射治療是目前在臨床上應用較多、療效較確切的肺癌治療方法。此外還有免疫治療、介入治療等。藥物方面，不管是化學藥一廣譜抗癌藥，如環磷酰胺(CTX)、順鉬等，還是中藥，如長春堿類，它們的選擇性低、毒性大。就確診肺癌患者的實際情況而言，患者或需同時接受多種藥物、治療方法，又或不能接受任何一種毒性大的藥物、損傷性治療方法，這都會影響患者的生存成本和生活質量。
[0003]故采用高效的制藥方法，制備高效、毒性低的抗癌藥物成為醫藥研究者熱衷的課題。
[0004]蛞蝓，一種對肺癌的抑制有特異性、毒性低的中藥，對小細胞肺癌和肺腺癌，及中晚期不能放療和化療的肺癌患者均有針對性。但因目前對蛞蝓物質基礎研究仍缺乏，故采用切割分子量段的手段來分離富集當中的有效物質。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種蛞蝓的提取方法及其抗肺癌應用。
[0006]為實現上述目的，本發明采取了以下技術方案:
[0007]本發明據蛞蝓特點，利用無機陶瓷膜和反滲透膜的特點，利用組合膜分離系統，選擇性富集目標分子量段的蛞蝓成分，具體提取方法如下:
[0008]一種蛞蝓的提取方法，包括如下步驟:
[0009](I)、將蛞蝓真空凍干，加入純化水然后進行水浴攪拌，向其中加入高濃度乙醇溶液，攪拌均勻至乙醇濃度為60-70%，靜置，然后固液分離；
[0010](2)、采用無機陶瓷膜系統對步驟(1)所得的液體進行澄清截留，得到蛞蝓總清液，所述的無機陶瓷膜的孔徑為50nm-800nm，所述的無機陶瓷膜系統分離的頻率33.35-38.05Hz，進膜壓力 1.5-1.9bar,出膜壓力 1-1.25bar ；
[0011](3)、對步驟(2)所得的蛞蝓總清液再經反滲透膜濃縮，所述的反滲透膜濾過的頻率δΟΗζ，進膜壓力22_28bar，出膜壓力22_26bar ；[0012]( 4 )、對步驟(3 )所得的超濾液進行濃縮干燥，得到的水溶性蛞蝓粉。
[0013]在上述提取方法中，所述的蛞蝓是高突足襞蛞蝓全蟲(Vaginulus alteFerussac，1821)，隸屬軟體動物門、腹足綱、肺螺亞綱、柄眼目、足襞蛞蝓科、足襞蛞蝓屬。
[0014]在上述提取方法中，所述的蛞蝓是新鮮采集的或真空凍干的或冷凍的或超微粉碎的。
[0015]在上述提取方法中，所述的純化水重量不低于蛞蝓重量的20倍。
[0016]在上述提取方法中，步驟(1)所述高濃度乙醇溶液的乙醇濃度為體積百分數75%以上。
[0017]在上述提取方法中，步驟(1)所述固液分離方式為抽濾、離心分離或其它物理分離方式。
[0018]在上述提取方法中，步驟(1)所述水浴攪拌的溫度是50°C，靜置溫度是30°C。
[0019]在上述提取方法中，步驟(4)所述濃縮的方式為真空旋轉濃縮或其它可控溫度的濃縮方式；所述干燥方式為真空冷凍干燥、噴霧干燥或其它物理干燥方式。
[0020]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
[0021]1、本發明根據膜分離原理和技術，得到水溶性蛞蝓粉。所得的水溶性蛞蝓粉的分子量集中在20000到3000之間。經采用理化鑒別、薄層鑒別、紫外-可見分光光度法、分子量檢測等方法研究，認為當中存在物質可能是蛋白質、多肽、多糖、氨基酸、生物堿成分。凸顯該分子量段蛞蝓粉混合物的作用效果，拓寬了蛞蝓藥材的應用范圍；
[0022]2、本發明采用人源肺腺癌細胞株A549裸小鼠移植瘤模型，對蛞蝓進行了抗肺癌試驗。結果發現，分子量集中在20000到3000之間的蛞蝓粉混合物具有顯著的抑癌作用，腫瘤抑制率高于華蟾素，接近于環磷酰胺。本發明的水溶性蛞蝓粉用于治療肺癌，高效且低毒。
[0023]3、本發明所采用的膜分離技術適用范圍廣，無相變過程，節能，無污染，不引入雜質，操作簡單，集濃縮、分離、除雜于一體，所得產品純度高，穩定性好，尤其適合熱敏性物質。所得的水溶性蛞蝓粉混合物與適當的輔料混合，可制成噴霧劑、膠囊劑，片劑，丸劑，凍干粉針劑和水針劑等，擴大臨床候選抗肺癌藥物種類和蛞蝓粉的應用范圍。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為蛞蝓粉樣品HKY對人源肺腺癌A549裸小鼠移植瘤的抑制作用。
【具體實施方式】
[0025]以下通過實施例來進一步闡述本發明。需說明，本發明要求保護的包括但不限于以下實施例。
[0026]實施例1:
[0027]蛞蝓真空凍干，加入純化水于50°C水浴攪拌4小時，向其中加入85%乙醇，攪拌均勻至乙醇濃度為60-70%。于30°C下靜置24小時后，離心分離固體物。離心液經50nm無機陶瓷膜分離截留得到蛞蝓總清液(無機陶瓷膜系統分離的頻率33.35Hz，進膜壓力1.5bar,出膜壓力lbar)。蛞蝓總清液再經反滲透膜濃縮(反滲透膜濾過的頻率50Hz，進膜壓力28bar，出膜壓力26bar)，收集超濾濃縮液， 真空旋轉濃縮后，真空冷凍干燥，即得到水溶性蛞蝓粉混合物，以鮮蛞蝓重量計算，得率0.3%。
[0028]把已干燥的蛞蝓粉末按0.3g量直接裝進膠囊殼里即得成品蛞蝓粉樣品HKY。
[0029]實施例2:
[0030]蛞蝓真空凍干，加入純化水于50°C水浴攪拌4小時，向其中加入95%乙醇，攪拌均勻至乙醇濃度為60-70%。于30°C下靜置24小時后，離心分離固體物。離心液經500nm無機陶瓷膜分離截留得到蛞蝓總清液(無機陶瓷膜系統分離的頻率38.05Hz，進膜壓力1.9bar,出膜壓力1.25bar)。蛞蝓總清液再經反滲透膜濃縮(反滲透膜濾過的頻率50Hz，進膜壓力22bar，出膜壓力22bar)，收集超濾濃縮液，真空旋轉濃縮后，真空冷凍干燥，即得到水溶性蛞蝓粉混合物，以鮮蛞蝓重量計算，得率0.1%。
[0031]把已干燥的蛞蝓粉末按0.3g量直接裝進膠囊殼里即得成品。[0032]實施例3實施例1的活性實驗
[0033]下面通過藥效學試驗闡述蛞蝓粉樣品HKY (實施例1)在治療肺癌方面的效果。
[0034](一)、實驗材料及分組
[0035]實驗動物:來源、種系、品系:SPF級BALB/c裸小鼠。
[0036]日齡:28_35日。
[0037]性別:雌雄各半。
[0038]人癌細胞株:肺腺癌A549，由中山大學實驗動物中心細胞庫提供。
[0039]移植瘤:人源肺腺癌A549細胞株接種于腋皮下而建立。細胞接種量6管，每管數量約為1X107。接種形成移植瘤后再在裸小鼠體內傳3代后使用。
[0040]實驗藥物:HKY，每天灌胃一次，廣州白云山漢方現代藥業有限公司提供；陽性對照藥為環磷酰胺，每兩天灌胃一次，華蟾素，每天灌胃一次；陰性對照為生理鹽水，每天灌胃一次。
[0041 ] 實驗分組:陰性對照組(生理鹽水)；HKY低劑量組(528mg/kg) ；HKY高劑量組(1056mg/kg), HKY低劑量+華蟾素組((528mg+624mg) /kg)；陽性對照組環磷酰胺(CTX)30mg/kg,華蟾素 624mg/kg。
[0042]( 二)實驗方法
[0043]取生長旺盛期的瘤組織剪切成1.5_3左右，在無菌條件下，接種于裸小鼠右側腋窩皮下。裸小鼠移植瘤用游標卡尺測量移植瘤直徑，待腫瘤生長至100-300mm3后將動物隨機分組。根據預試驗結果，HKY低劑量組(528mg/kg) ；HKY高劑量組(1056mg/kg)，HKY低劑量+華蟾素組((528mg+624mg)/kg),每天灌胃一次,連續21天；CTX30mg/kg,每兩天灌胃一次，連續10天；華蟾素624mg/kg，每天灌胃一次，連續21天。陰性對照組同時給等量生理鹽水，每天灌胃一次。使用測量瘤徑的方法，動態觀察被試物抗腫瘤的效應。腫瘤直徑的測量次數為每周2次，每次測量同時還需稱鼠重。計算相對腫瘤增殖率。第21天稱重，頸椎脫臼處死裸小鼠，連同包膜完整剝出腫瘤組積，稱瘤重，計算各組平均瘤重，計算腫瘤抑制率。
[0044]抗腫瘤活性評價方法:
[0045]( I)相對腫瘤增殖率T/C (%)，計算公式如下:
【權利要求】
1.一種蛞蝓的提取方法，其特征在于包括如下步驟: (1)、將蛞蝓真空凍干，加入純化水然后進行水浴攪拌，向其中加入高濃度乙醇溶液，攪拌均勻至乙醇濃度為60-70%，靜置，然后固液分離； (2)、采用無機陶瓷膜系統對步驟(1)所得的液體進行澄清截留，得到蛞蝓總清液，所述的無機陶瓷膜的孔徑為50nm-800nm，所述的無機陶瓷膜系統分離的頻率33.35-38.05Hz，進膜壓力1.5-1.9bar，出膜壓力1-1.25bar ； (3)、對步驟(2)所得的蛞蝓總清液再經反滲透膜濃縮，所述的反滲透膜濾過的頻率50Hz，進膜壓力22_28bar，出膜壓力22_26bar ； (4)、對步驟(3)所得的超濾液進行濃縮干燥，得到的水溶性蛞蝓粉。
2.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所得的水溶性蛞蝓粉混合物分子量集中在20000到3000之間。
3.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的蛞蝓是高突足襞蛞蝓全蟲；所述的蛞蝓是新鮮采集的或真空凍干的或冷凍的或超微粉碎的。
4.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的純化水重量不低于蛞蝓重量的20倍。
5.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(1)所述高濃度乙醇溶液的乙醇濃度為體積百分數75%以上。
6.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(1)所述固液分離方式為抽濾或離心分離。
7.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(4)所述濃縮的方式為真空旋轉濃縮，干燥方式為真空冷凍干燥或噴霧干燥。
8.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，步驟(1)所述水浴攪拌的溫度是50°C，靜置溫度是30°C。
9.權利要求1所述提取方法所得水溶性蛞蝓粉在制備抗肺癌藥物中的應用。
10.一種抗肺癌藥物的組合物，其特征在于，由權利要求1所得水溶性蛞蝓粉及藥學上可接受的輔料組成。
【文檔編號】A61K35/56GK103610699SQ201310656631
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月6日 優先權日:2013年12月6日
【發明者】蔣兆健, 謝金魁, 劉潔瑜, 羅愛勤, 張聰琪, 李菁, 葛發歡 申請人:廣州白云山漢方現代藥業有限公司