多臂聚乙二醇修飾劑的新用途及其在修飾門冬酰胺酶中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了多臂聚乙二醇修飾劑的新用途及其在修飾門冬酰胺酶中的應用。本發明提供的多臂PEG修飾劑可用于加強多亞基蛋白的亞基間作用力，使多亞基蛋白保持聚合的形式，從而增加多聚體蛋白的穩定性，增強或保持多亞基蛋白的生物活性，同時減少各亞基解聚后抗原位點暴露的幾率，降低免疫原性。此外，本發明中制備的PEG修飾后的門冬酰胺酶和市售的PEG化門冬酰胺酶產品“培門冬酶”相比，具有低免疫原性，高活性、高穩定性，PEG不會脫落等優點，更適用于抗腫瘤藥物的制備。
【專利說明】多臂聚乙二醇修飾劑的新用途及其在修飾門冬酰胺酶中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及多臂聚乙二醇修飾劑的新用途及其在修飾門冬酰胺酶中的應用。
【背景技術】
[0002]聚乙二醇(PEG)是一種線性、在溶液中可自由卷曲的不帶電荷的聚合物，具有無毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它來共價修飾蛋白質，可以增加蛋白質的體內循環半衰期和減小其抗原性，增加蛋白質的溶解性并會改變蛋白質在人體內的生物學分布。自 1977 年 Abuchowski，Davis(J.B1l.Chem.1977, 252:3578-3581.)等人首次報道用 PEG修飾蛋白質以來，PEG修飾技術在生物醫學和生物【技術領域】得到了廣泛的應用，PEG已經被廣泛地應用于蛋白質，多肽類藥物的修飾研究。目前蛋白質PEG化技術已經成為降低蛋白質生物藥物的免疫原性，以及改善其藥代動力學/藥效學性質最有效的方法之一，且已通過FDA認證可用于藥物、食品和化妝品。
[0003]在大多數情況下，與未修飾的原蛋白相比，聚乙二醇化的蛋白藥物的活性會降低，一般修飾后的蛋白活性僅有原蛋白的30%-40%，甚至更低。例如Schering-Plough公司的PEG-1ntron,是用分子量為5000的PEG修飾干擾素，修飾后其活性只有原蛋白的8%。此外，一般隨著PEG分子量的增大，修飾后的蛋白質活性降低更明顯。例如用分子量為20KDa、30KDa、40KDa的PEG修飾促紅細胞生成素(EPO)后，活性隨著PEG分子量的增大而顯著減小(Yin-jue Wang, journal of controlled release, 2010 (145): 306-313)。Bailon 等米用分支型40kDa PEG修飾Interferon- a -2a,所得單修飾物獲得較長的循環半衰期，但是僅僅保留了 7% 的體外活性(Bailon P, B1conjugate Chem.，2001，12:195-202.)。
[0004]聚乙二醇修飾技術經歷了幾十年的發展，目前雖然已經比較成熟。但并不能找出一種通用的聚乙二醇修飾劑以及修飾方法來對所有的蛋白藥物進行修飾。蛋白的結構以及所用PEG的分子量、形狀以及修飾的位點等對聚乙二醇化的蛋白質的生物活性以及藥效有很大的影響。對于特定藥物的修飾，聚乙二醇修飾劑是影響修飾產物理化性質、體內外生物活性、藥代動力學、藥效學以及修飾產物臨床表現最重要的因素。因此，修飾劑的選擇(修飾劑種類、分子量大小)以及修飾反應的控制在聚乙二醇修飾技術中占有重要地位。蛋白質結構的解析并不能準確預測天然蛋白質的藥代動力學行為，而在蛋白偶聯上PEG以后由于引入了許多新的變量如分子量、修飾劑種類等，對于PEG偶聯物的藥代動力學行為預測變得更加不可能。為此，針對不同的蛋白質藥物，需要通過選擇不同種類以及不同分子量的修飾劑，并通過理化性質檢測、動物實驗評價等確定最佳方案。
[0005] 多亞基蛋白質(寡聚或多聚亞基蛋白質)指的是由兩個以上彼此獨立的亞基通過分子之間相互作用結合在一起的聚合體。其中，每個亞基一般由一條肽鏈組成，但也有兩條以上肽鏈經二硫鍵相連組成。每個亞基自身折疊成一定的空間構型，不同亞基之間依靠疏水作用、氫鍵、離子鍵與作用力聚集在一起，形成蛋白質的四級結構，亞基之間相互作用構成有生物化學活性的整體。在自然界中，這種多亞基蛋白質在整個蛋白質家族中為數不少。例如，堿性磷酸酶由二個亞基構成，每個亞基分子量約為28KDa,整個分子的分子量約為56KDa ;人腫瘤壞死因子就是三個亞基構成，每個亞基分子量約為17KDa，整個分子的分子量約為51KDa;L-門冬酰胺酶的活性形式為4個亞基組成的同源四聚體結構，每一亞基由326個氨基酸組成，整個蛋白分子的分子量約為140KDa ；Hp尿素酶單體由A、B兩個亞單位組成，呈六聚體，A、B兩個亞單體的分子量分別為30KDa和64KDa左右，其比例為1:1。多亞基蛋白質的生物學活性常常與其聚集體的結構有關。人腫瘤壞死因子TNF-α三聚體的生物學活性最高，是每個亞基單獨存在時活性的8倍。而L-門冬酰胺酶只有在4個亞基組成的同源四聚體結構才能具有相應的生物學活性。另一方面，多亞基類蛋白解聚后不僅其活性一般會有顯著降低，且作為藥物在體內降解后，容易暴露出更多抗原表位，引起免疫反應，從而降低藥效，引起副反應。因此，保持多亞基蛋白的生物學活性的重點在于如何防止亞基的解聚。
[0006]具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白(通常被稱為L-天冬酰胺酶，L-門冬酰胺酶，或門冬酰胺酶)可以有效的治療兒童或成人中的急性淋巴細胞白血病(ALL)。最近幾年，含有L-天冬酰胺酶的藥物已經用于聯合化療方案來治療NK/T細胞淋巴瘤，并取得了較好的治療效果。NK/T細胞淋巴瘤是中特殊類型的非霍奇金淋巴瘤，多見于亞洲和拉丁美洲，我國發病率相對較高。根據腫瘤發生部門，NK/T細胞淋巴瘤可分為鼻型NK/T細胞淋巴瘤和非鼻型NK/T細胞淋巴瘤。另外L-天冬酰胺酶還被用于治療何杰金氏病，急性骨髓白血病，急性骨髓單核細胞白血病，慢性淋巴細胞白血病，淋巴肉瘤，網狀細胞肉瘤和黑素肉瘤(Kotzia and labrou, J.B1technol.127 (2007) 657-669)。L-門冬酰胺酶的活性形式為 4個亞基組成的同源四聚體結構，每一亞基由326個氨基酸組成。L-天冬酰胺酶最初從若干生物體中純化，包括大腸桿菌(E.coli)和軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)。在哺乳動物中，僅在豚鼠(Cav1idea超科)和某些闊鼻猴(New World monkey)中發現略高于痕量的L-天門冬酰胺酶。但是，由于它來源于外源生物，對人而言是一種外源蛋白，有較強的免疫原性，臨床上常見進行性免疫反應和全身性過敏反應，而限制了其臨床應用。(張麗娜，宮道華.江蘇醫藥.左旋門冬酰胺酶治療小兒急性淋巴細胞性白血病的毒副反應.2005，31 (5):392;王寧玲，劉芝璋等.左旋門冬酰胺酶治療兒童白血病的毒副作用及防治.中國小兒血液，2005，10 (3):133)。
[0007]目前針對L-門冬酰胺酶的聚乙二醇修飾研究已有很多。國外利用聚乙二醇修飾的L-門冬酰胺酶的產品Oncaspar (Enzon inc)早在1994年就已上市，并在2006年起被批準作為兒童和成人的ALL的一線療法。但是Oncaspar使用的PEG是琥拍酰亞胺琥拍酸酯(SS-PEG)，這種PEG含有對酶的水解敏感的、或者在微堿性PH值時不穩定的酯鍵(美國專利號4670417)。這些性質顯著降低了體外和體內的穩定性并且副作用也較大。而國內目前上市的PEG修飾的L-門冬酰胺酶只有恒瑞公司的“培門冬酶”，它是Oncaspar的仿制藥，也存在著PEG容易降解脫落的問題。
[0008]國內相關的已授權的專利主要有兩個，分別是連云港新陽醫藥有限公司的“聚乙二醇修飾門冬酰胺酶的制備方法”(申請號02149328.6)，和上海醫藥工業研究院的“聚乙二醇修飾的L-門冬酰胺酶”(申請號200610027026.0)。其中連云港新陽醫藥有限公司的專利中所采用的修飾方法是兩步反應法，首先用分子量較小的PEG修飾劑進行修飾，然后再用分子量較大的PEG修飾劑進行二次修飾。這種修飾方法步驟繁多，而且修飾產物的均一性難以控制，純化方法復雜。而上海醫藥工業研究院的專利中使用的PEG修飾劑與門冬酰胺酶結合后不易水解，但修飾后活性損失較大，保留了原蛋白60%的活性。國外的阿利茲第二藥物公司最近也申請了關于PEG修飾L-門冬酰胺酶的專利。這個專利中所使用的PEG修飾劑也是較常用的隨機修飾氨基的修飾劑，修飾的L-門冬酰胺酶是歐文氏菌來源的。另外國內外也有多篇PEG修飾L-門冬酰胺酶的論文發表，用的都是常規的單甲氧基PEG修飾劑。所有的這些專利和文章中PEG修飾后的L-門冬酰胺酶和未修飾的原蛋白比較，免疫原性有了降低，但依然存在有免疫原性的問題。并且，這些專利和文章也都沒有涉及解決多亞基蛋白質的亞基解聚的問題。
【發明內容】
[0009]為了克服現有技術中的上述技術問題，本發明的目的之一是提供多臂聚乙二醇修飾劑在修飾多亞基蛋白中的應用。
[0010]所述聚乙二醇修飾劑優選與多亞基蛋白質的氨基偶聯。
[0011]優選的，本發明使用的聚乙二醇修飾劑為醛基活化的或酯活化的四至八臂聚乙二醇修飾劑。優選為四臂聚乙二醇修飾劑。
[0012]更優選的，本發明使用的多臂聚乙二醇修飾劑的結構式分別如式(I)或式(II)所示:
[0013]
【權利要求】
1.多臂PEG在修飾多亞基蛋白中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述的多臂PEG選自以下任意一種結構所示的PEG:
其中n選自I到2000整數值，k為I或2，m選自2_16之間的整數，p選自1_4之間的整數，多臂PEG的分子量在I~10kDa之間。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述的η選自2-500之間的整數值，優選為25-100之間的整數；所述的k為1，m為4，ρ為2 ;多臂PEG的分子量在I~40kDa之間，優選為5~1kDa0
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述的多臂PEG為醛基活化的或酯活化的多臂聚乙二醇衍生物；其中酯活化的聚乙二醇衍生物選自4臂聚乙二醇琥珀酰亞胺乙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯中的任意一種；醛基活化的聚乙二醇衍生物選自4臂聚乙二醇丙醛、4臂聚乙二醇丁醛、4臂聚乙二醇乙醛、4臂聚乙二醇戊醛中的任意一種，優選4臂聚乙二醇丙醛。
5.根據權利要求1~4中任一項所述的應用，其特征在于所述的多亞基蛋白選自堿性磷酸酶、門冬酰胺酶或尿素酶中的任意一種。
6.一種利用多臂PEG修飾多亞基蛋白的方法，其特征在于包含以下步驟； (O需要修飾的蛋白和PEG修飾劑按比例混合后在緩沖液中進行修飾反應； (2)修飾反應結束后用離子交換層析去除掉修飾產物中未與蛋白發生反應的PEG修飾劑； (3)用凝膠過濾層析對修飾產物進行純化，收集目的修飾產物； 其中所述的PEG修飾劑選自以下任意一種結構所示的PEG:
其中n選自I到2000整數值，k為I或2，m選自2_16之間的整數，p選自1_4之間的整數，多臂PEG的分子量在I~10kDa之間。
7.根據權利要 求6所述的方法，其特征在于所述的η選自2-500之間的整數值，優選為25-100之間的整數；所述的k為1，m為4，ρ為2 ;多臂PEG的分子量在I~40kDa之間，優選為5~1kDa0
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述的多臂PEG為醛基活化的或酯活化的多臂聚乙二醇衍生物；其中酯活化的聚乙二醇衍生物選自4臂聚乙二醇琥珀酰亞胺乙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯中的任意一種，優選4臂聚乙二醇琥珀酰亞胺乙酸酯；醛基活化的聚乙二醇衍生物選自4臂聚乙二醇丙醛、4臂聚乙二醇丁醛、4臂聚乙二醇乙醛、4臂聚乙二醇戊醛中的任意一種，優選4臂聚乙二醇丙醛。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述的多亞基蛋白選自堿性磷酸酶、門冬酰胺酶或尿素酶中的任意一種。
10.多臂PEG修飾的多亞基蛋白。
11.根據權利要求10所述的多臂PEG修飾的多亞基蛋白，其特征在于所述的多臂PEG修飾的多亞基蛋白按照權利要求6~9中任一項所述的方法獲得。
12.根據權利要求10所述的多臂PEG修飾的多亞基蛋白，其特征在于所述的多臂PEG修飾的多亞基蛋白為多臂PEG修飾的門冬酰胺酶。
13.根據權利要求10所述的多臂PEG修飾的多亞基蛋白，其特征在于所述的多臂PEG修飾劑選自以下任意一種結構所示的PEG:
其中n選自I到2000整數值，k為I或2，m選自2_16之間的整數，p選自1_4之間的整數，多臂PEG的分子量在I~10kDa之間。
14.一種藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物含有如權利要求12所述的多臂PEG修飾的門冬酰胺酶和藥學上可接受的輔料；所述的藥物組合物的劑型優選凍干粉針制劑。
15.權利要求12所述的多臂PEG修飾的門冬酰胺酶或權利要求14所述的藥物組合物在制備治療腫瘤的藥物中的應用。
16.權利要求12所述的多臂PEG修飾的門冬酰胺酶或權利要求14所述的藥物組合物在制備治療急性白血病的藥物中的應用。
【文檔編號】A61K47/48GK104046600SQ201310745273
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年12月30日 優先權日:2013年12月30日
【發明者】馬永, 王俊, 吳鼎龍, 邱晶, 徐春林, 陳晨, 王耀方 申請人:江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司, 常州京森生物醫藥研究所有限公司