嵌合凝血因子的制作方法

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嵌合凝血因子的制作方法
【專利摘要】本發明提供了包含可激活凝血因子和增強子部分的嵌合凝血因子。所述可激活凝血因子使所述嵌合凝血因子在凝固部位被激活。所述增強子部分可另外提高所述嵌合凝血因子的促凝活性。通過與提高所述嵌合凝血因子的藥代動力學性質的半衰期延長劑融合，可進一步改善所述嵌合凝血因子。本發明還包括制備和使用這些嵌合凝血因子的方法。
【專利說明】嵌合凝血因子
[0001] 發明背景
[0002] 通過因損傷而暴露于血管壁的組織因子與因子Vila之間形成復合物介導外源凝血途徑的引發。然后這種復合物將因子IX和X轉化為其活性形式（因子IXa和Xa)。因子Xa在攜帶組織因子的細胞上將有限量的凝血酶原轉化為凝血酶。然后這種所得凝血酶能夠擴散遠離攜帶組織因子的細胞并活化血小板及因子V和VIII，產生因子Va和Villa。凝固散播期間，通過活化血小板表面的因子IXa(與因子Villa復合）生成因子Xa。與輔因子Va復合的因子Xa將凝血酶原活化為凝血酶，引起凝血酶大量形成。級聯在凝血酶將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白時達到頂點，這導致纖維蛋白凝塊形成。因子VII和組織因子是引發凝血的關鍵作用因子。
[0003] 因子VII是在血液中作為非催化活性型單鏈酶原循環的血漿糖蛋白。雖然單鏈因子VII可由多種體外因子轉化為雙鏈因子Vila，但是因子Xa是因子VII的重要生理活化齊U。酶原因子VII向活化雙鏈分子的轉化通過裂解連接氨基酸位置152處的精氨酸殘基和氨基酸位置153處的Ile殘基的肽鍵發生。在組織因子、磷脂和鈣離子的存在下，雙鏈因子 Vila激活因子X或因子IX。因子Vila被認為是通過在攜帶TF的細胞表面作用并且產生初始量的凝血酶的凝血級聯生理引發劑，然后初始量的凝血酶擴散到血小板以將其激活并為凝血酶生成的散播期做準備。在治療上，重組FVIIa通過激活活化血小板表面的因子X 起作用，凝固散播期間引起凝血酶大量生成不需要FIXa或FVIIla。因為FVIIa對血小板的親和力相對較低，所以在超生理水平服用重組FVIIa。認為這個過程不依賴于組織因子。
[0004] 因子X也呈包含由Arg-Lys-Arg三肽連接的輕鏈和重鏈的單鏈多肽合成。然后通過裂解兩個（或更多個）內部肽鍵將單鏈分子轉化為輕鏈和重鏈。在血漿中，這些雙鏈由二硫鍵連接在一起，形成因子X。活化因子X，因子Xa，參與最后共同途徑，由此凝血酶原轉化為凝血酶，凝血酶依次將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白。
[0005] 已經向患者施用凝血因子一段時間以提高止血。重組DNA技術的出現已經顯著提高了對有凝血障礙的患者的治療，允許研發安全相容的蛋白質治療劑。例如，重組活化因子 VII已經廣泛用于治療大出血，例如在有血友病A或B、凝固因子XI或VII缺乏、血小板功能缺陷、血小板減少癥或血管性血友病（von Willebrand's disease)的患者中出現的大出血。
[0006] 雖然這種重組分子有效，但是需要將治療劑定位到凝固部位，藥代動力學性質提高、清除率降低、工藝性提高、促凝性降低或活性增強或具有一種以上這些特征的改進形式。
[0007] 發明概述
[0008] 本發明提供了一種嵌合蛋白，包含（i)可激活凝血因子（Ac)，（ii)增強子部分 (Em)，和（iii)所述可激活凝血因子和增強子部分之間的任選接頭部分（L或LI)。所述可激活凝血因子和所述增強子部分相互連接或締合，但是未化學交聯。所述嵌合蛋白可用式 Ac-L-Em或Em-L-Ac表示，其中Ac包含所述可激活凝血因子；L包含所述任選接頭部分；并且Em包含所述增強子部分。
[0009] 在一個實施方案中，所述可激活凝血因子包含含重鏈（HC)和輕鏈（LC)及插入所述HC和LC之間的蛋白酶裂解位點的凝血因子酶原。所述凝血因子酶原可為FVII蛋白（例如，FVII、其功能片段、衍生物或變體）或FX蛋白（FX、其功能片段、衍生物或變體）。本發明的實施方案包括進一步包含插入所述蛋白酶裂解位點和所述HC之間的自切除部分（例如，PABC)的嵌合蛋白。插入HC和LC之間的所述蛋白酶裂解位點可由選自凝血酶（因子 IIa)、因子XIa、因子Xlla、激肽釋放酶、因子Vila、因子IXa、因子Xa或其任何組合的蛋白酶裂解，其中所述蛋白酶裂解位點并非自然存在于所述凝血因子酶原中。
[0010] 在另一實施方案中，增強子部分包含凝血輔因子、促凝血肽或抗原結合部分。凝血輔因子的實例包括但不限于組織因子、其片段（例如，可溶性組織因子）、變體或衍生物或 FVa、其片段、變體或衍生物。抗原結合部分的非限制性實例包括能夠與所述FVII蛋白或FX 蛋白結合并分別增強FVII或FX的活性的抗體或其抗原結合片段。
[0011] 在一些實施方案中，嵌合蛋白進一步包含與可激活凝血因子、接頭部分或增強子部分連接的異源部分（Het)(例如，半衰期延長劑）。半衰期延長劑的非限制性實例包括免疫球蛋白恒定區或其一部分（例如，Fc部分或FcRn結合伴侶）、白蛋白、轉鐵蛋白、白蛋白結合部分、PAS序列、XTEN序列、HES序列、人絨毛膜促性腺激素 C端肽（CTP)的P亞基、聚乙二醇（PEG)、羥乙基淀粉（HES)、白蛋白結合小分子或其任何組合。免疫球蛋白恒定區或其一部分可包含Fc部分或FcRn結合伴侶。
[0012] 在其它實施方案中，嵌合蛋白包含第一異源部分（Hetl)和第二異源部分（Het2)。 Hetl和Het2的任一個或二者可包含半衰期延長劑，例如免疫球蛋白恒定區或其一部分（例如，Fc部分或FcRn結合伴侶）、白蛋白、轉鐵蛋白、白蛋白結合部分、PAS序列、XTEN序列、 JES序列、人絨毛膜促性腺激素 C端肽（CTP)的P亞基、聚乙二醇（PEG)、羥乙基淀粉（HES)、白蛋白結合小分子或其任何組合。任選地，在某些實施方案中，第一異源部分經由第一任選接頭（LI)與可激活凝血因子連接，并且第二異源部分經由第二接頭（L2)與增強子部分連接。嵌合蛋白可只包含一個接頭（LI或L2)或兩個接頭。
[0013] 還有其它實施方案中，嵌合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中所述第一多肽鏈包含所述可激活凝血因子（Ac)并且所述第二多肽鏈包含所述增強子部分（Em)，其中所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈相互締合。例如，第一多肽鏈包含所述可激活凝血因子 (Ac)、所述第一異源部分（Hetl)和所述第一任選接頭部分（LI)，并且所述第二多肽包含所述增強子部分（Em)、所述第二異源部分（Het2)和所述第二任選接頭部分（L2)，其中所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈相互締合。
[0014] 還有其它實施方案中，嵌合蛋白具有選自以下的結構：
[0015] (a) Ac經由所述接頭部分與Hetl連接，并且Em與Het2連接；
[0016] (b)Ac經由所述第一接頭部分與Hetl連接，并且Em經由所述第二接頭部分與 Het2連接；
[0017] (C)Ac與Hetl連接，并且Em經由所述接頭部分與Het2連接；
[0018] (d) Ac與Hetl連接，并且Em與Het2連接；
[0019] (e) Em經由所述接頭部分與Hetl連接；并且Ac與Het2連接；
[0020] (f)Em經由所述第一接頭部分與Hetl連接，并且Ac經由所述第二接頭部分與 Het2連接；
[0021] (g)Em與Hetl連接，并且Ac經由所述接頭部分與Het2連接；或，
[0022] (h) Em與Hetl連接，并且Ac與Het2連接。
[0023] 還有其它實施方案中，包含兩條多肽鏈的嵌合蛋白可包含：
[0024] (a)所述第一多肽包含式Ac-Ll-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式 Em-Het2表示的結構；
[0025] (b)所述第一多肽包含式Ac-Ll-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式 Em-L2_Het2表示的結構；
[0026] (c)所述第一多肽包含式Ac-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式Em_Het2 表示的結構；
[0027] (d)所述第一多肽包含式Ac-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式 Em-Ll_Het2表示的結構；
[0028] (e)所述第一多肽包含式Em-L2-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式 Ac-Ll-Het2表示的結構；
[0029] (f)所述第一多肽包含式Em-Ll-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式 Ac_Het2表示的結構；
[0030] (g)所述第一多肽包含式Em-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式Ac-Het2 表示的結構；和，
[0031] (h)所述第一多肽包含式Em-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式 Ac-Ll-Het2表示的結構；
[0032] 其中所述兩條多肽鏈的Hetl和Het2形成二硫鍵。
[0033] 在一些實施方案中，嵌合蛋白為單條多肽鏈。例如，嵌合蛋白可進一步包含連接增強子部分和與可激活凝血因子連接的第一異源部分或可激活凝血因子和與增強子部分連接的第二異源部分的scFc接頭（X)。單鏈嵌合蛋白的實例可包含選自以下的式：
[0034] (I) Ac-Hetl_X_Em_Het2 ；
[0035] (2) Ac-Hetl_X_Em_L2_Het2 ；
[0036] (3) Ac-Ll-Hetl_X_Em_Het2 ；
[0037] (4) Ac-Ll-Hetl_X_Em_L2 _Het2 ；
[0038] (5) Het2_Em_X_Hetl_Ac ；
[0039] (6) Het2_L2_Em_X_Hetl_Ac ；
[0040] (7) Het2-Em-X_HetI-Ll-Ac ;或
[0041 ] (8) Het2_L2_Em_X_HetI-Ll -Ac,
[0042] 其中（a)Ac為所述可激活凝血因子，（b)Ll為所述第一任選接頭部分；（c)Hetl為所述第一異源部分；（d) X為所述scFc接頭；(e) Em為所述增強子部分；(f) L2為所述任選第二接頭部分；（g)Het2為所述第二異源部分；并且（h)(-)為肽鍵或一個或多個氨基酸。在一個實施方案中，scFc接頭為可加工接頭（cscFc)，其包含至少一個胞內加工位點。可加工接頭可由選自酵母Kex2、PCSKl、PCSK2、PCSK3、PCSK4、PCSK5、PCSK6或PCSK7或其任何組合的一種或多種胞內加工酶加工成兩條或更多條肽鏈。在一個實施方案中，胞內加工位點由 PCSK5加工。
[0043] 在一些實施方案中，嵌合蛋白經多聚唾液酸化、聚乙二醇化、糖基化、羥乙基化、 Y-羧基化或其任何組合。
[0044] 還包括編碼所述嵌合蛋白或其補體的核酸分子，包含第一核苷酸序列（NAl)和第二核苷酸序列（NA2)的一組核酸分子，其中NAl編碼所述雙鏈嵌合蛋白或其補體的第一多肽，并且NA2編碼所述雙鏈嵌合蛋白或其補體的第二多肽，載體包含所述核酸分子或核酸分子組，或宿主細胞包含所述載體或載體組。
[0045] 本發明還涉及包含所述嵌合蛋白、所述核酸分子、所述載體和所述宿主細胞的藥物組合物并且涉及在有需要的受試者中治療、改善或預防出血性疾病或病癥的方法，包括向所述受試者施用有效量的嵌合蛋白、核酸分子或核酸分子組、載體或載體組、宿主細胞或藥物組合物。可用所述組合物治療或預防的出血性疾病或病癥選自關節積血、肌肉流血、口腔流血、出血、肌肉出血、口腔出血、創傷、創傷性頭癬、胃腸道出血、顱內出血、腹腔內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽后隙出血、腹膜后間隙出血和髂腰肌鞘出血。本發明的組合物也可用于在哺乳動物受試者中治療、改善或預防凝固因子缺乏，包括向所述受試者施用有效量的嵌合蛋白、核酸分子或核酸分子組、載體或載體組、宿主細胞或藥物組合物，其中所述凝固因子選自FVII、FVIIa、FVIII、FIX或FXI。
[0046] 在一個特定實施方案中，所述嵌合蛋白或組合物用于在旁路療法中治療、改善或預防出血性疾病或病癥。在所述旁路療法中，所述受試者已經發展或可能易于發展對因子 VIII的抑制劑。
[0047] 本發明還包括生成嵌合蛋白的方法，包括表達編碼包含scFc接頭的所述單鏈嵌合蛋白的核苷酸序列，其中所述scFc接頭由胞內加工酶在胞內裂解。由于胞內加工位點的加工，由核苷酸序列生成的嵌合蛋白將包含兩條多肽鏈。
[0048] 附圖簡述
[0049] 圖1說明了包含凝血酶可激活或FXIa-可激活凝血因子和增強子部分（有時稱為 "活性增強部分"）的示例性嵌合蛋白（例如，嵌合凝血因子）的示意圖。圖IA示出了具有 FX的任選激活肽的FVII或FX輕鏈，與凝固級聯蛋白酶裂解位點（例如，凝血酶裂解位點或 FXIa裂解位點）連接，所述裂解位點進一步與FVII或FX重鏈連接。然后FVII或FX重鏈經由接頭與增強子部分連接。當圖IA中的構建體作為酶原（非活性形式）服用時，施用后 (激活之前）所述構建體抗蛋白酶抑制劑。如圖IB所示，當在損傷部位激活凝血因子時，凝血因子可展現出由增強子部分刺激的高活性。
[0050] 圖2說明了包含凝血酶可激活分子和增強子部分的嵌合FVII蛋白的示意圖。圖 2A示出了與凝血酶裂解位點連接的FVII輕鏈，凝血酶裂解位點進一步與FVII重鏈連接。然后FVII重鏈經由接頭與增強子部分連接，產生非活性和酶原形式。給動物服用時，這種酶原抗循環中的蛋白酶抑制劑并且可在損傷部位轉化為活性形式（圖2B)。凝血因子的活性可受增強子部分刺激。增強子部分的實例包括可溶性組織因子（sTF)、促凝血肽和抗體片段。
[0051] 圖3說明了包含凝血酶可激活FVII分子、作為增強子部分的sTF分子和顯示為用于半衰期延長的Fc部分的異源部分（Het)的分子的示意圖。圖3A中的構建體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中第一多肽鏈按N端到C端順序包含FVII輕鏈、凝血酶裂解位點、 FVII重鏈、第一接頭和第一 Fc部分（Hetl)并且第二多肽鏈在N端到C端方向上包含sTF、第二接頭和第二Fe部分（Het2)。第一接頭和第二接頭可以相同或不同。第一 Fe部分和第二Fe部分可以相同或不同。服用圖3A中的構建體（即，酶原（非活性形式））時，施用后 (激活之前）所述構建體抗蛋白酶抑制劑。如圖3B所示，當在損傷部位由凝血酶激活凝血因子時，凝血因子可展現出由增強子部分刺激的高活性。
[0052] 圖4示出了生成圖4B(類似于圖3A)中的構建體的示意圖。圖4A(左側構建體）按N端到C端順序示出了編碼FVII輕鏈、凝血酶裂解位點（ALRPR(SEQ ID N0:1))、FVII重鏈、第一接頭、第一Fe部分（Hetl)、第一胞內加工位點（例如，RRRR(SEQ ID N0:2))、第二接頭、第二胞內加工位點（例如，RKRRKR(SEQ ID N0:3))、sTF、第三接頭和第二Fe部分（Het2) 的單一多肽序列。可在宿主細胞中表達編碼所述單一多肽序列的核苷酸序列（FVII1-133)，并且所述單一多肽序列經受胞內加工，以致第一胞內加工位點和第二胞內加工位點由前肽肽鏈內切酶，例如PCSK5裂解。因此插入第一胞內加工位點和第二胞內加工位點之間的第二接頭可由PCSK5去除。圖4B示出了最終構建體，通過加工去除接頭后，其可能含有在裂解后保留的胞內加工位點的一部分。這個剩余接頭部分可包含一系列約1個至約10個，1 個至約4個氨基酸。圖4C示出了在所示非還原條件或還原條件下，凝血酶可激活FVII-Fc/ sTF-Fc嵌合蛋白的SDS-PAGE。
[0053] 圖5示出了在還原條件下凝血酶可激活FVII-Fc/sTF-Fc二聚體（FVII-133)的 SDS-PAGE分析。第二條帶（即，洗脫物）顯示出純化凝血酶可激活FVII-Fc/sTF-Fc二聚體。
[0054] 圖6示出了為測試FVII-133和FVIIaFc的活性，通過凝血酶生成測定產生的數據。無或有組織因子（TF)的FVII-133的活性分別用圓形（?）和正方形（)示出。無或有TF的FVIIaFc的活性分別用三角形（▲)或菱形（?)示出。y軸顯示凝血酶的毫微摩爾（nM)，而X軸顯示時間。構建體FVIIaFc由兩條多肽鏈組成，第一條鏈由與第一 Fe區連接的活化FVII (FVIIa)組成，而第二條鏈由Fe區組成。
[0055] 圖7示出了為測試FVII-133和FVIIaFc的活性，用小鼠血友病B血液通過ROTEM 測定產生的數據。圖7A和7B示出了 FVII-133凝血時間和a角。圖7C和7D分別示出了 FVIIaFc和媒介物的凝血時間和a角。
[0056] 圖8A-C示出了在人類血友病A血液中通過ROTEM測定測量的FVII活性。將 FVII-133、FVII-184和FVIIa摻入來自血友病A供體的檸檬酸化人血中。圖4中示出了 FVII-133的結構。FVII-184是FVII-133的突變形式并且由于凝血酶裂解所必需的Arg 殘基突變為Ala，對凝血酶激活不敏感。其它方面FVIII-184與FVII-133相同。測量 FVII-133 (三角形）、FVII-184(正方形）和FVIIa (圓形）的凝血時間（CT)、凝血形成時間 (CFT)和a角。血友病A供體的基線凝血時間以菱形（?)示出。圖8A、8B和8C分別示出了凝血時間、凝血形成時間和a角的結果圖。FVIIa用作FVIIa活性的對照。
[0057] 圖9示出了通過活體外ROTEM測定，在血友病B小鼠中的FVII-133活體外功效。對從經尾靜脈注射分別服用了媒介物、FVIIa和FVII-133的小鼠采集的血液測量凝血時間 (CT)。
[0058] 圖10A-B示出了根據施用所述蛋白質后的時間，FVII和FVII/ATIII復合物的血漿水平。血友病B小鼠靜脈施用了 FVII-133、rFVIIaFc或rFVIIa。在不同時間點采集血漿樣品，并且通過ELISA測量FVII抗原水平（圖10A)和FVII-133/ATIII或rFVIIFc-ATIII 復合物（圖10B)。通過2房室分析，使用Phoenix6程序生成FVII-133(虛線，圓形）和 FVIIaFc (實線，三角形）的PK性質，包括平均滯留時間（MRT)。
[0059] 圖11示出了在血友病A人血中通過ROTEM測定測量的體外凝血時間。測量具有與FVII-133相同結構的FVII-212的凝血活性。將蛋白質摻入檸檬酸化血友病A人血中。用鈣引發凝血并且用ROTEM機器在NATEM程序下記錄凝血時間。X軸以nM顯示rFVIIa或 FVII-212的濃度，而y軸顯示凝血時間。
[0060] 圖12示出了在通過腔靜脈放血采集的小鼠血友病A血液中，通過ROTEM測定測量的體外凝血時間。將蛋白質摻入檸檬酸化小鼠血友病A血液中。用鈣引發凝血并且用ROTCM 機器在NATEM程序下記錄凝血時間。X軸以nM顯示摻入rFVIIa和FVII-212的濃度，而y 軸顯示凝血時間。
[0061] 圖13示出了在血友病A小鼠中的活體外功效。在血友病A小鼠中按lOnmol/kg施用FVII-212 (三角形）。在給藥后的不同時間，用檸檬酸鹽和玉米胰蛋白酶抑制劑（CTI)作為抗凝劑經由腔靜脈采血，并且用ROTEM分析儀在NATEM程序下測量凝血活性。rFVIIa (圓形）用作對照。X軸顯示蛋白質施用后的時間（h)，而y軸顯示凝血時間。
[0062] 圖14示出了在血友病A小鼠中rFVIIa(圓形）、FVII-212(正方形）和rFVII/ ATIII(三角形）的藥代動力學性質。按時間（X軸）繪制蛋白質的濃度（y軸）。
[0063] 圖15示出了使用色酶t-PA底物激活凝血酶之前和之后測量的FVII-212的酰胺分解活性。將具有凝血酶的FVII-212表示為倒三角形（從上到下的第一條線）。將rFVIIa 表示為圓形（從上到下的第二條線）。將FVII-212和凝血酶表示為第三和第四條線（底部線）。
[0064] 圖16A示出了本發明蛋白酶可激活的促凝血化合物的一般構造。Het2、Pep2、Hetl 和L獨立地為任選組分。P印1和P印2為多肽，其中至少一個為凝血因子或促凝血肽。Hetl 和Het為異源部分。L為接頭。附加接頭可連接不冋部分；例如，接頭可位于Pep2和Hetl 之間（如圖所示）。可在其它部分例如多肽或異源部分的N端插入附加蛋白酶可裂解底物和自切除間隔基團。圖中顯示這種基團任選插入P印2的N端。圖16B為本發明包含蛋白酶可裂解底物（AalAa2Aa3Aa4)、自切除間隔和目標蛋白（P0I;例如凝血因子或促凝血肽）的示例性促凝血化合物的示意圖；說明在可裂解底物經蛋白水解裂解和1，6自發片段化后，所述化合物片段化并且釋放目標肽或蛋白質。
[0065] 圖17為本發明包含外在位點結合肽（M)的替代示例性蛋白酶可激活的促凝血化合物的示意圖。圖中說明在可裂解底物（AalAa2Aa3Aa4)經蛋白水解裂解和1，6自發片段化后，釋放目標肽或蛋白質（P0I ;例如凝血因子或促凝血肽）及外在位點結合肽。
[0066] 圖18示出了用14nM凝血酶處理后，對應FXa凝血因子重鏈N端6個氨基酸殘基的肽IVGGQE從不同促凝血化合物（化合物1、2和3)的釋放動力學。
[0067] 圖19示出了用I. 4nM凝血酶處理后，對應FXa凝血因子重鏈N端6個氨基酸殘基的肽IVGGQE從不同促凝血化合物（化合物1、4、5和6)的釋放動力學。
[0068] 圖20示出了為產生活化因子（FVIIa)，對因子VII的自然加工。
[0069] 圖21為本發明包含FVIIa凝血因子的示例性促凝血化合物的示意圖。
[0070] 圖22A-B示出了可裂解多肽FVII-186(圖22A)可經前蛋白轉化酶（例如PACE) 加工成經加工的可裂解多肽（圖22B)的流程圖。圖22A示出了包含FVIILC(FVII輕鏈）_前蛋白轉化酶的前蛋白轉化酶加工位點（例如，PACE加工位點，例如2X(RKR) (SEQ ID N0:3))-接頭 I-SUMO-截短 FVIIHC(N 端沒有 IVGGKV(SEQ ID N0:60)的 FVII 重鏈）-接頭2-Fc區2-接頭3-Fc區2的可裂解多肽。圖22B示出了已經受PACE加工的可裂解多肽。經加工的可裂解多肽包含兩條多肽鏈，第一條鏈包含與前蛋白轉化酶加工位點連接的 FVIILC并且第二條鏈包含接頭1-SUM0-截短FVIIHC(N端沒有IVGGKV(SEQ ID N0:60)的 FVII重鏈）-接頭2-Fc區1-接頭3-Fc區2。圖22C展示了非還原（條帶1)或還原（條帶2) SDS-PAGE，顯示了以上構建體和鏈。（-)表示肽鍵。
[0071] 圖23A-C示出了⑴FVI1-186被SUMO蛋白酶裂解（圖23B)和（ii)其與硫酯肽融合（圖23C)的流程圖。圖23A與圖22B中的構建體相同。圖23B顯示，F VII-186被SUMO 蛋白酶裂解后，所得裂解多肽構建體包含兩條鏈，第一條鏈包含FVIILC和前蛋白轉化酶位點而第二條鏈包含截短FVIIHC (N端沒有IVGGKV (SEQ ID NO: 60)的FVII重鏈）-接頭2-Fc 區1-接頭3-Fc區2。第一條鏈和第二條鏈通過二硫鍵結合。圖23C顯示，圖23B中的裂解多肽構建體與硫酯肽（D-Phe-Pip-Arg-PABC-IVGGKV-COSBn)連接后，所得構建體包含兩條多肽鏈，第一條鏈包含FVIILC和前蛋白轉化酶加工位點而第二條鏈包含凝血酶裂解位點4￥1111(：$￥11重鏈）-接頭24(3區1-接頭34(3區2〇^-?￥11-186)。圖230示出了指示所述構建體和鏈的還原SDS-PAGE :條帶1示出了標記物；條帶2示出了 FVII-186 ;條帶 3示出了 FVII-186與SUMO蛋白酶反應；條帶3示出了 FVII-186與SUMO蛋白酶反應并且與陽性對照肽偶聯；并且條帶5示出了 FVII-186與SUMO蛋白酶反應并且與PABC肽偶聯。 (_)表不膚鍵。
[0072] 圖24示出了凝血酶激活TA-FVII-186后的FVIIa顯色測定。X軸表示時間（min)，而Y軸表示對FVIIa活性的吸光度（A405)測量。（X)顯示凝血酶和水蛭素的混合物的 FVIIa活性。（□)表示FVII-186、凝血酶和水蛭素的混合物的FVIIa活性。（〇）表示 TA-FVII-186、凝血酶和水蛭素的混合物的FVIIa活性。
[0073] 發明詳述
[0074] 本發明涉及包含可激活凝血因子和增強子部分的嵌合蛋白。本發明至少部分基于對增強凝血因子功效、藥代動力學性質和/或工藝性的新方式的研發。可激活凝血因子呈可在凝固部位激活的形式。對于在旁路療中使用，外源凝血因子只有在呈活化形式給予時才有效。然而，這種活化凝血因子通過內源途徑（例如，抗凝血酶III、TFPI)迅速滅活，導致其快速清除并且在循環中的有效半衰期短。給予較高劑量未解決這個問題，因為可導致血栓形成效應。因此，在一個實施方案中，本發明關于包含與增強子部分融合或締合的可激活凝血因子的活性增強型嵌合蛋白構建體。"可激活"凝血因子包含凝血因子酶原的重鏈和輕鏈及插入重鏈和輕鏈之間的異源蛋白酶裂解位點（即，在凝血因子酶原中非自然存在）。這些分子作為增強型酶原融合蛋白循環并且由于沒有滅活，半衰期比其活化配對物長，但是由于重鏈和輕鏈受在凝血部位激活或定位的蛋白酶裂解，可在凝血部位容易地激活。并入增強子部分也可提高其促凝血活性。
[0075] 附圖和序列表中說明了本發明的示例性構建體。在一個實施方案中，本發明關于具有圖中提出的結構的多肽。在另一實施方案中，本發明關于具有所附序列表中提出的序列的多肽或編碼這種多肽的核酸分子。在一個實施方案中，本發明關于具有所附序列表中提出的序列的多肽的成熟形式。應理解，這些構建體及其編碼核酸分子可在受試者中用于提商止血。
[0076] 為了提供對說明書和權利要求的清晰理解，下面提供了以下定義。
[0077] I?定義
[0078] 如本文所使用，術語"蛋白質"或"多肽"指兩種或更多種天然氨基酸或非天然氨基酸的聚合物。
[0079] 術語"氨基酸"包括丙氨酸（Ala或A)、精氨酸（Arg或R)、天冬酰胺（Asn或N)、天冬氨酸（Asp或D)、半胱氨酸（Cys或C)、谷氨酰胺（Gln或Q)、谷氨酸（Glu或E)、甘氨酸（Gly或G)、組氨酸（His或H)、異亮氨酸（lie或I)、亮氨酸（Leu或L)、賴氨酸（Lys或 K)、甲硫氨酸（Met或M)、苯丙氨酸（Phe或F)、脯氨酸（Pro或P)、絲氨酸（Ser或S)、蘇氨酸（Thr或T)、色氨酸（Trp或W)、酪氨酸（Tyr或Y)和纈氨酸（Val或V)。非傳統氨基酸也在本發明范圍內并且包括正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸和其它氨基酸殘基類似物，例如Ellman等Meth. Enzym. 202:301-336(1991)中描述的氨基酸殘基類似物。為生成這種非自然存在的氨基酸殘基，可使用Noren等Science 244:182 (1989)和Ellman等（同上）的程序。簡言之，這些程序牽涉化學活化帶非自然存在的氨基酸殘基的抑制基因 tRNA，接著體外轉錄和翻譯RNA。非傳統氨基酸的引入也可使用本領域已知的肽化學法完成。如本文所使用，術語"極性氨基酸"包括具有零凈電荷，但是在其側鏈的不同部分（例如M、F、 W、S、Y、N、Q、C)具有非零局部電荷的氨基酸。這些氨基酸可參與疏水相互作用和靜電相互作用。如本文所使用，術語"帶電氨基酸"包括在其側鏈（例如R、K、H、E、D)上可具有非零凈電荷的氨基酸。這些氨基酸可參與疏水相互作用和靜電相互作用。
[0080] "氨基酸取代"指預定氨基酸序列（起始多肽的氨基酸序列）中至少一個現有氨基酸殘基經第二不同"置換"氨基酸殘基置換。"氨基酸插入"指在預定氨基酸序列中并入至少一個附加氨基酸。雖然插入通常將由一個或兩個氨基酸殘基的插入組成，但是可產生當前較大的"肽插入"，例如約3個至約5個或甚至多達約10、15或20個氨基酸殘基的插入。如以上所公開那樣，插入的殘基可能是自然存在或非自然存在的。"氨基酸缺失"指從預定氨基酸序列去除至少一個氨基酸殘基。
[0081] 多肽可為單體或多聚體。例如，在一個實施方案中，本發明的蛋白質為二聚體。本發明的二聚多肽可能包含兩條多肽鏈或可能由一條多肽鏈組成（例如，在ScFc分子的情況下）。在一個實施方案中，本發明的二聚體為同型二聚體，包含兩個相同單體亞基或多肽 (例如，兩個相同的Fc部分或兩個相同的生物活性部分）。在另一實施方案中，本發明的二聚體為雜二聚體，包含兩個不同單體亞基或多肽（例如，包含兩個不同凝血因子或其一部分或僅一個凝血因子）。見，例如，以引用的方式并入的美國專利7404956。
[0082] 如本文所使用，術語"肽接頭"、"接頭"或"接頭部分"指連接多肽鏈線性氨基酸序列中兩個結構域的肽或多肽序列（例如，合成肽或多肽序列）。在一個實施方案中，由編碼直接或間接連接構成所述構建體的兩個Fc部分的肽接頭的核酸分子編碼本發明的多肽。本文將這些接頭稱為"scFc接頭"并且scFc接頭插入包含scFc接頭的多肽的兩個Fc部分之間。如果scFc接頭連續地連接線性多肽序列中的兩個Fc部分，則為"直接"連接。相反，scFc接頭可將第一 Fc部分連接到結合部分，結合部分依次與第二Fc部分連接，從而形成間接連接。這些scFc接頭允許形成單鏈基因構建體。在一個實施方案中，多肽還包含胞內加工位點，其導致scFc接頭（cscFc接頭）被加工，并且在一個實施方案中，大體上被切除（例如，細胞加工期間）。因此，所得經加工的多肽是包含至少兩條氨基酸鏈并且大體上缺乏外來接頭氨基酸序列的二聚體分子。在一些實施方案中，切除全部或絕大部分接頭，而在一些實施方案中，可保留裂解位點的一部分，例如RRRR裂解位點的4個精氨酸。在另一實施方案中，接頭或肽接頭通常不可能裂解；然而在某些實施方案中，這種裂解可能是可取的。附圖中示出了接頭的示例性位置。接頭可位于可激活凝血因子、增強部分和/或異源部分之間，例如在這些部分的N或C端。在一個實施方案中，在加工期間去除了這些接頭。 [0083] 可激活凝血因子中可能存在的第三類接頭本文稱為"可裂解接頭"，其包含在凝血因子中非自然存在的異源蛋白酶裂解位點（例如，因子XIa或凝血酶裂解位點）并且可能在裂解位點的N端或C端或兩側包括附加接頭。附圖中示出了這種位點的示例性位置并且包括（例如）凝血因子酶原重鏈和凝血因子酶原輕鏈之間的位置。在另一實施方案中，這種接頭可進一步包含自切除部分。例如，在一個實施方案中，與可裂解接頭連接的自切除部分可能與凝血因子重鏈的N端融合。在這種情況下，可裂解接頭可在裂解位點N端包括附加接頭，但是需要在裂解位點的C端與凝血因子重鏈的氨基末端直接融合。
[0084] 如本文所使用，術語" gly-ser肽接頭"指由甘氨酸和絲氨酸殘基組成的肽。示例性gly/ser肽接頭包含氨基酸序列（Gly4Ser)n. (SEQ ID N0:4)。另一示例性gly/ser肽接頭包含氨基酸序列S(Gly4Ser)n(SEQ ID N0:5)，其中n為相同或大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、25、30、35、40、46、50、55、60、70、80、90 或 100 的整數。
[0085] 在一個實施方案中，n = 1。在一個實施方案中，n = 2。在另一實施方案中，n = 3。在另一實施方案中，n = 4。在另一實施方案中，n = 5。再一實施方案中，n = 6。在另一實施方案中，n = 7。再一實施方案中，n = 8。在另一實施方案中，n = 9。再一實施方案中，n= 10。另一示例性gly/ser肽接頭包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n(SEQ ID N0:5)。在一個實施方案中，n = 1。在一個實施方案中，n = 2。在一個優選實施方案中，n = 3。在另一實施方案中，n = 4。在另一實施方案中，n = 5。再一實施方案中，n = 6。
[0086] 本發明多肽或蛋白質的"衍生物"是已經改變以致表現出在天然多肽或蛋白質上不存在的附加特征的多肽或蛋白質。"衍生物"還包括含20種標準氨基酸的一種或多種自然存在的氨基酸衍生物的肽。"源自"指定多肽或蛋白質的多肽或氨基酸序列指多肽的起源。在一個實施方案中，源自特定序列的多肽或氨基酸序列具有與所述序列或其一部分基本上相同的氨基酸序列，其中所述部分由至少約10至約20個氨基酸，至少約20至約30個氨基酸，或至少約30至約50個氨基酸組成，或其可為本領域的普通技術人員另外鑒定為起源于所述序列。
[0087] 為另一肽的"變體"的多肽可能相對于起始多肽具有一個或多個突變，例如一個或多個氨基酸殘基已經由另一氨基酸殘基取代或具有一個或多個氨基酸殘基插入或缺失。在一個實施方案中，多肽包含非自然存在的氨基酸序列。這種變體與起始多肽的序列同一性或相似性必定小于100%。在另一實施方案中，變體將具有與起始多肽的氨基酸序列約 75 %到小于100 %的氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列，例如，在變體分子的整個長度上,從約80 %到小于100 %，從約85 %到小于100 %，從約90 %到小于100 % (例如，91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)和從約95%到小于100%。在一個實施方案中，在起始多肽序列及其衍生的序列之間存在一個氨基酸差異。本文將關于該序列的同一性或相似性定義為比對序列并且必要時引入空位以達到最高序列同一性百分比后，候選序列中與原始氨基酸殘基相同的氨基酸殘基（即，相同殘基）的百分比。
[0088] 術語"片段"在提到本發明的多肽和蛋白質時包括保持參考多肽或蛋白質的至少一些性質的任何多肽或蛋白質。多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。
[0089] 在一個實施方案中，本發明的多肽包含源自人蛋白質序列的氨基酸序列（例如，至少一個凝血因子或Fc部分或結構域）。然而，多肽可能包含來自另一哺乳動物物種的一種或多種氨基酸。例如，凝血因子、Fc結構域或增強部分可源自非人類物種并且包括在主題多肽中。可選地，在源自非人類物種的多肽中可能存在一種或多種氨基酸。在一個特定實施方案中，本發明的多肽沒有免疫原性。
[0090] 本領域的普通技術人員還將理解，可改變本發明的多肽，以致它們在來自于其來源的自然存在的或天然多肽的氨基酸序列上改變，同時保持天然多肽的所需活性。例如，可產生在"非必需"氨基酸殘基處導致保守性取代或變化的核苷酸或氨基酸取代。可通過向免疫球蛋白的核苷酸序列中引入一個或多個核苷酸取代、添加或缺失，產生編碼源自免疫球蛋白的多肽（例如，Fc結構域、部分或抗原結合位點）的非天然變體的分離核酸分子，以便向編碼的蛋白質中引入一個或多個氨基酸取代、添加或缺失。也可通過標準技術，例如定點誘變和PCR介導的誘變引入突變。
[0091] 本發明的多肽可在一個或多個氨基酸殘基處，例如在必需或非必需氨基酸殘基處包含保守性氨基酸取代。"保守性氨基酸取代"是氨基酸殘基經具有相似側鏈的氨基酸殘基置換的氨基酸取代。本領域已經定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基家族，包括堿性側鏈 (例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、酸性側鏈（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、不帶電的極性側鏈 (例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非極性側鏈（例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、3 -支化側鏈（例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和芳香族側鏈（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。因此，多肽中的非必需氨基酸殘基可經來自同一側鏈家族的另一氨基酸殘基置換。在另一實施方案中，一串氨基酸可經結構相似，在側鏈家族成員的順序和/或組成上不同的一串置換。可選地，在另一實施方案中，可沿著整個或部分編碼序列，例如通過飽和誘變隨機引入突變，并且可將所得突變體引入本發明的多肽中并且篩選其與所需靶標結合的能力。
[0092] 在多肽的情況下，"線性序列"或"序列"是多肽中氨基到羧基端方向上的氨基酸順序，其中序列上相互鄰近的殘基在多肽的一級結構中連續。
[0093] 如本文所使用，術語"經連接"、"經融合"或"融合"指經由肽鍵（例如，基因融合）、化學偶聯或其它方式連接。例如，可連接分子或部分的一種方式采用經由肽鍵連接所述分子或部分的肽接頭。術語"基因上融合"、"基因上連接"或"基因融合"可交換使用并且指兩個或多個蛋白質、多肽或其片段經由其單獨肽骨架，通過編碼那些蛋白質、多肽或片段的單個多核苷酸分子的基因表達共線、共價連接或結合。這種基因融合導致單個連續基因序列表達。優選基因融合在框內，即兩個或更多個開放閱讀框（ORF)以保持原ORF的正確閱讀框的方式融合形成更長的連續0RF。因此，所得重組融合蛋白是含有與原ORF編碼的多肽相對應的兩個或更多個蛋白質片段的單一多肽（所述片段在自然界中通常不這樣連接）。在這種情況下，單一多肽在加工期間經裂解產生包含兩條多肽鏈的二聚體分子。
[0094] 如本文所使用，術語"締合"指第一條氨基酸鏈和第二條氨基酸鏈之間形成的共價或非共價鍵。在一個實施方案中，術語"與…締合"意指共價非肽鍵或非共價鍵。在另一實施方案中，術語"與…締合"指未經化學交聯的共價非肽鍵或非共價鍵。在一些實施方案中，這種締合用冒號，即（:）表示。在另一實施方案中，其意指除肽鍵外的共價鍵。例如，氨基酸半胱氨酸包含硫醇基，可與第二半胱氨酸殘基上的硫醇基形成二硫鍵或橋。在大部分自然存在的IgG分子中，CHl和CL區通過一個二硫鍵締合并且兩條重鏈在對應于使用Kabat 編號系統的239和242的位置（位置226或229, EU編號系統），通過兩個二硫鍵締合。共價鍵的實例包括但不限于肽鍵、金屬鍵、氫鍵、二硫鍵、。鍵、n鍵、S鍵、糖苷鍵、不可知鍵、彎鍵、偶極鍵、反向鍵、雙鍵、三鍵、四重鍵、五重鍵、六重鍵、共軛、超共軛、芳香性、哈普托數或反鍵作用。非共價鍵的非限制性實例包括離子鍵（例如陽離子n鍵或鹽鍵）、金屬鍵、氫鍵（例如，雙氫鍵、雙氫配合物、低壘氫鍵或對稱氫鍵）、范德華力（van der Walls force)、倫敦分散力（London dispersion force)、機械鍵、齒鍵、親金作用、插入、堆集、熵力或化學極性。
[0095] 如本文所使用，術語"化學交聯"指通過氨基酸酸性側鏈之間的共價鍵，直接地或經由接頭例如肽接頭連接。化學交聯不包括二聚Fc區的Fc部分之間的分子內或分子間的二硫鍵，或可激活凝血因子的氨基酸與增強子部分的氨基酸之間的非工程化二硫鍵。通常添加交聯劑，例如異型雙功能交聯劑，就會發生化學交聯。化學交聯的實例包括化學連接光-Ile、光-Met和光-Leu的一個或多個光反應鍵。見Suchanek等，（2005)Nature methods, 2:261-267。
[0096] 如本文所使用，術語"Fc區"定義為與天然免疫球蛋白的Fe區相對應的多肽部分，即通過其兩條重鏈各自的Fc結構域的二聚締合形成。天然Fc區為同型二聚體并且包含兩條多肽鏈。相反，如本文所使用，術語"基因融合Fc區"或"單鏈Fc區"（scFc區）指由單條多肽鏈內基因上連接（即，單條連續基因序列中編碼）的Fc結構域構成的合成二聚Fc 區。
[0097] 如本文所使用，術語"Fc結構域"指單條免疫球蛋白重鏈就在木瓜蛋白酶裂解位點上游的鉸鏈區（即，IgG中的殘基216,將重鏈恒定區的第一個殘基視為114)開始并且在抗體C端結束的部分。相應地，完整Fc結構域包含至少一個鉸鏈結構域、CH2結構域和CH3 結構域。
[0098] 如本文所使用，術語"Fc結構域部分"或"Fc部分"包括Fc結構域的或源自Fc結構域的氨基酸序列。在某些實施方案中，Fc部分包含以下至少一個：鉸鏈（例如，上、中和/ 或下鉸鏈區）結構域、CH2結構域、CH3結構域、CH4結構域或其變體、一部分或片段。在其它實施方案中，Fc部分包含完整Fc結構域（即，鉸鏈結構域、CH2結構域和CH3結構域）。在一個實施方案中，Fc部分包含與CH3結構域（或其一部分）融合的鉸鏈結構域（或其一部分）。在另一實施方案中，Fc部分包含與CH3結構域（或其一部分）融合的CH2結構域 (或其一部分）。在另一實施方案中，Fc部分由CH3結構域或其一部分組成。在另一實施方案中，Fc部分由鉸鏈結構域（或其一部分）和CH3結構域（或其一部分）組成。在另一實施方案中，Fc部分由CH2結構域（或其一部分）和CH3結構域組成。在另一實施方案中， Fc部分由鉸鏈結構域（或其一部分）和CH2結構域（或其一部分）組成。在一個實施方案中，Fc部分至少缺乏CH2結構域的一部分（例如，整個或部分CH2結構域）。
[0099] 如本文所使用，術語"半衰期"指特定多肽在體內的生物半衰期。半衰期可用向受試者施用的一半量從循環和/或動物體內其它組織中清除所需要的時間表示。當根據時間作給定多肽的清除曲線時，曲線通常為雙相，快速相和較長￠-相。相通常表示施用的嵌合多肽在血管內和血管外間隙之間的平衡并且部分由多肽的尺寸決定。￠-相通常表示多肽在血管內間隙的分解代謝。因此，在一個特定實施方案中，如本文所使用的術語半衰期指P _相多肽的半衰期。人源性抗體的典型P _相半衰期為21天。
[0100] 如本文所使用，術語"半衰期延長劑"指增加蛋白質的體內半衰期的異源部分。可通過本領域技術人員已知的任何方法，例如FVII活性水平測定法測定本發明嵌合凝血因子的體內半衰期。在某些實施方案中，半衰期延長劑可包含非多肽部分例如聚乙二醇 (PEG)、羥乙基淀粉（HES)、多聚唾液酸或這些要素的任何衍生物、變體或組合的附著位點。
[0101] 如本文所使用，術語"部分"指嵌合多肽的組成部分或構成部分。
[0102] 如本文所使用，術語"增強子部分"指能夠增強凝血因子的促凝血活性的分子、其片段、衍生物或變體或多肽組分。在一個實施方案中，本發明的嵌合凝血因子包含（例如）通過起輔因子的作用，增強多肽活性的"增強子部分"。這種部分可為（例如）凝血輔因子，例如可溶性組織因子（STF)或因子Va蛋白，但是不包括靶向部分，例如血小板靶向部分。在另一實施方案中，增強子部分與可激活凝血因子相互作用，從而增加凝血因子的促凝血活性。增強子部分可與構建體基因融合，與構建體化學偶聯或經由接頭與構建體連接。例如，增強子部分可通過在增強子部分與構建體的可激活凝血因子之間形成鍵附著于本發明的構建體，其中增強子部分包含第一官能團并且可激活凝血因子包含第二官能團，并且其中第一和第二官能團能夠相互反應形成化學鍵。下面更加詳細地描述了示例性增強子部分。
[0103] 如本文所使用，術語"自切除部分"指可以包括在可裂解接頭內以增強其功能的分子。在一個實施方案中，自切除部分插入凝血因子酶原的重鏈與蛋白酶裂解位點之間。這種自切除部分的優點在于，蛋白酶裂解位點的可裂解性不受第一部分末端氨基酸殘基的負面影響。例如，在美國專利7, 375, 078和美國專利7, 754, 681中公開了示例性自切除部分，其以引用的方式整體并入本文。
[0104] 如本文所使用，術語"異源部分"指并非與嵌合蛋白的組分，例如可激活凝血因子、接頭部分或增強子部分一起自然存在和/或與嵌合蛋白的組分連接或締合的部分。在一個實施方案中，異源部分能夠延長可激活凝血因子的半衰期。在另一實施方案中，異源部分增大了可激活或活化凝血因子的流體動力學半徑。在其它實施方案中，異源部分提高了凝血因子的一種或多種藥代動力學性質，未明顯影響其生物活性或功能（例如，其促凝血活性）。還有其它實施方案中，異源部分為非多肽部分，例如肽或多肽與非多肽部分的化學修飾或組合。還有其它實施方案中，異源部分為多肽。在一些實施方案中，嵌合凝血因子通過接頭與異源部分連接或接合。異源多肽部分的非限制性實例包括免疫球蛋白恒定區或其一部分、白蛋白或或其片段、白蛋白結合部分、PAS序列、HAP序列、轉鐵蛋白或其片段、人絨毛膜促性腺激素 C端肽（CTP)的P亞基、白蛋白結合小分子、XTEN序列或其兩種或更多種組合。異源非多肽部分的非限制性實例包括聚乙二醇（PEG)、多聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或其任何組合。示例性異源部分包括（例如）FcRn結合部分（例如，與FcRn結合的完整Fc區或其部分）、單鏈Fc區（ScFc區，例如US 2008/0260738、WO 2008/012543或 W02008/1439545中所述）、可加工scFc區（包含如本文所述的cscFc區）。
[0105] 在一個實施方案中，用于本發明構建體中的增強子部分包含抗體變體。術語"抗體變體"或"經修飾抗體"包括在自然界中不存在并且如本文所述，具有與自然衍生抗體有至少一個氨基酸或氨基酸修飾不同的氨基酸序列或氨基酸側鏈化學結構的抗體。如本文所使用，術語"抗體變體"包括經改變，以致其并非自然存在的抗體合成形式，例如包含至少兩個重鏈部分，但并非兩條完整重鏈的抗體（例如，結構域缺失抗體或微型抗體）；經改變以與兩種或更多種抗原或與單個抗原上的不同表位結合的抗體多特異性形式（例如，雙特異性、三特異性等）；與scFv分子接合的重鏈分子；單鏈抗體；雙鏈抗體；三鏈抗體；和效應子功能改變的抗體等。
[0106] 如本文所使用，術語"Gla結構域"指維生素 K依賴性蛋白，例如凝血酶原、凝固因子VII、IX和X、蛋白質C、S和Z中存在的保守膜結合基序。這些蛋白質對于翻譯后合成 g-羧基谷氨酸，這些蛋白質N端Gla結構域中集簇的氨基酸，需要微生物K。所述結構域中存在的所有谷氨酸殘基為潛在羧化位點并且其中許多因此通過羧化而修飾。在鈣離子的存在下，Gla結構域與包括磷脂酰絲氨酸的磷脂膜相互作用。Gla結構域還在與FVIIa輔因子 (組織因子（TF))的結合中起作用。與TF復合，FVIIa的Gla結構域載有7個Ca2+離子，在細胞膜方向上突出3條疏水性側鏈以與細胞表面的磷脂相互作用，并且與TF的C端結構域顯著接觸。
[0107] 如本文所使用，術語"scFv分子"包括由一個輕鏈可變結構域（VL)或其部分和一個重鏈可變結構域（VH)或其部分組成的結合分子，其中每個可變結構域（或其部分）源自相同或不同抗體。scFv分子優選包含插入VH結構域和VL結構域之間的scFv接頭。 scFv分子在本領域中已知并且例如在美國專利5, 892, 019、Ho等1989. Gene 77:51 ;Bird 等 1988Science 242:423 ;Pantoliano 等 1991. Biochemistry 30:10117 ;Milenic 等 199L Cancer Research 51:6363 ;Takkinen 等 1991. Protein Engineering 4:837 中有描述。 [0108] 如本文所使用，術語"scFv接頭"指在scFv的VL和VH結構域之間插入的部分。 scFv接頭優選維持scFv分子呈抗原結合構象。在一個實施方案中，scFv接頭包含或由scFv 接頭肽組成。在某些實施方案中，scFv接頭肽包含或由gly-ser肽接頭組成。在其它實施方案中，scFv接頭包含二硫鍵。
[0109] 術語"糖基化"指一種或多種碳水化合物與多肽的共價連接。通常，糖基化是可以在細胞的胞內環境或來自其中的提取物中發生的翻譯后事件。術語糖基化包括（例如） N-連接的糖基化（其中一個或多個糖與天冬酰胺殘基連接）和/或0-連接的糖基化（其中一個或多個糖與具有羥基的氨基酸殘基（例如絲氨酸或蘇氨酸）連接）。在一個實施方案中，本發明的分子經糖基化。在另一實施方案中，本發明的分子未糖基化。再一實施方案中，本發明的分子與野生型Fc區中的糖基化相比，糖基化減少。
[0110] 如本文所使用，術語"二硫鍵"包括兩個硫原子之間形成的共價鍵。氨基酸半胱氨酸包含硫醇基，可與第二硫醇基形成二硫鍵或橋。在大部分自然存在的IgG分子中，CHl和 CL區通過天然二硫鍵連接并且兩條重鏈在對應于使用Kabat編號系統的239和242的位置 (位置226或229, EU編號系統），通過兩個天然二硫鍵連接。
[0111] 術語"載體"或"表達載體"在本文中用于指根據本發明用作在細胞中引入和表達所需多核苷酸的媒介物的載體。正如本領域技術人員所知，可容易地從質粒、噬菌體、病毒或逆轉錄病毒選擇這種載體。一般而言，與本發明相容的載體將包含選擇標記、促進所需基因的克隆和進入和/或在真核或原核細胞中復制的能力的適當限制位點。
[0112] 可采用許多表達載體系統生成本發明的嵌合凝血因子。例如，一類載體利用源自動物病毒例如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、逆轉錄病毒（RSV、 MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。另外，可通過引入允許選擇經轉染宿主細胞的一個或多個標記選擇已經將所述DNA整合到其染色體中的細胞。所述標記可為營養缺陷型宿主提供原營養、生物殺滅劑抗性（例如，抗生素）或對重金屬例如銅的抗性。可選標記基因可與要表達的DNA序列直接連接，或通過共轉化引入同一細胞中。在一個實施方案中，可采用誘導型表達系統。對于mRNA的最優合成，可能還需要附加元件。這些元件可包括信號序列、剪接信號以及轉錄啟動子、增強子和終止信號。在一個實施方案中，分泌信號，例如幾種表征清楚的細菌前導肽的任一種（例如，pelB、phoA或ompA)可在框內與本發明多肽的N端融合以獲得多肽的最優分泌。（Lei等（1988)，Nature，331:543;Better等（1988) Science, 240:1041 ;Mullinax 等（1990). PNAS，87:8095)。
[0113] 術語"宿主細胞"指已經用使用重組DNA技術構建的并且編碼至少一個異源基因的載體轉化的細胞。在從重組宿主中分離蛋白質的工藝的描述中，除非另外明確說明，術語"細胞"和"細胞培養物"可交換用于指蛋白質來源。換言之，從"細胞"回收蛋白質可意指從離心全細胞或從含有培養基和懸浮細胞的細胞培養物。用于蛋白質表達的宿主細胞系最優選為哺乳動物來源；認為本領域的技術人員有能力優先確定最適合要在其中表達的所需基因產物的特定宿主細胞系。示例性宿主細胞系包括但不限于DG44和DUXBll (中國倉鼠卵巢系，DHFR-)、HELA(人宮頸癌）、CVI(猴腎系）、COS(帶SV40T抗原的CVI的衍生物）、R1610 (中國倉鼠成纖維細胞）、BALBC/3T3 (小鼠成纖維細胞）、PerC6細胞）、 HAK (倉鼠腎系）、SP2/0 (小鼠骨髓瘤）、P3x63-Ag3. 653 (小鼠骨髓瘤）、BFA-lclBPT (牛內皮細胞）、RAJI (人淋巴細胞）和293 (人腎）。宿主細胞系通常可由商業服務，美國模式培養物保藏所或由出版文獻獲得。也可在非哺乳動物細胞例如細菌或酵母或植物細胞中表達本發明的多肽。在這點上，應認識到各種單細胞非哺乳動物微生物例如細菌也可轉化；即，能夠在培養或發酵中生長的微生物。對轉化敏感的細菌包括腸桿菌科成員，例如大腸桿菌（Escherichia coli)或沙門氏菌（Salmonella)菌株；芽胞桿菌科，例如枯草桿菌 (Bacillus subtilis);肺炎球菌（Pneumococcus);鏈球菌（Streptococcus)和流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae)。應進一步認識到，在細菌中表達時，多肽通常成為包涵體的一部分。所述多肽必須分離、純化，然后組裝成功能性分子。
[0114] 除原核生物外，也可使用真核微生物。雖然許多其它菌株普遍可用，包括畢赤酵母（Pichia pastoris)，但是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)或常見面包酵母是真核微生物中最常用的。為了在酵母中表達，常用質粒YRp7,例如（Stinchcomb 等（1979)，Nature,282:39 ;Kingsman 等（1979)，Gene,7:141; Tsc hemper等（1980)，Gene, 10:157)。這種質粒已經含有為沒有能力在色氨酸中生長的酵母突變菌株，例如ATCC No. 44076或PEP4-1提供了選擇標記的TRPl基因 (Jones，（1977)，Genetics，85:12)。作為酵母宿主細胞基因組特征的trpl損傷的存在則提供了通過在色氨酸缺乏時的生長檢測轉化的有效環境。
[0115] 如本文所使用，術語"內源"指分子（例如核酸和/或蛋白質分子）自然地存在于細胞中。相反，術語"外源"或"異源"指這種分子不常出現在特定環境中，例如細胞或多肽中。例如，可將外源或異源分子引入細胞并且只有在操縱細胞，例如通過轉染或其它形式的基因工程后存在，或異源氨基酸可存在于它并非自然存在于其中的蛋白質中。
[0116] 如本文所使用，術語"裂解位點"或"蛋白酶裂解位點"指蛋白酶所識別的位點。在一個實施方案中，多肽具有在凝血級聯期間激活的蛋白酶所裂解的蛋白酶裂解位點，以致這種位點的裂解在凝塊形成部位發生。這種示例性位點包括（例如）凝血酶、因子 XIa或因子Xa識別的位點。示例性FXIa裂解位點包括（例如）TQSFNDFTR(SEQ ID N0:6) 和SVSQTSKLTR(SEQ ID N0:7)。示例性凝血酶裂解位點包括（例如）DFLAEGGGVR(SEQ ID NO: 8)、ITKIKPR (SEQ ID NO :9)、LVPRG (SEQ ID NO :10)和 ALRPR (SEQ ID NO :1)。下面詳細地描述了其它蛋白酶裂解位點。
[0117] 如本文所使用，術語"加工位點"或"胞內加工位點"指多肽中是在多肽翻譯后起作用的酶的靶標的一類酶促裂解位點。在一個實施方案中，這種酶在從高爾基內腔轉運到反式高爾基隔室期間起作用。細胞內加工酶在蛋白質從細胞分泌之前裂解多肽。這種加工位點的實例包括（例如）肽鏈內切酶的PACE/弗林蛋白酶（furin)(其中PACE是配對堿性氨基酸裂解酶的首字母縮寫）家族。這些酶定位于高爾基膜并裂解序列基序Arg-[任何殘基(Lys或Arg)-Arg的羧基末端一側的蛋白質。如本文所使用，酶的"弗林蛋白酶"家族中包括（例如）弗林蛋白酶、酵母Kex2、PCSKl (也稱為PCl/Pc3)、PCSK2 (也稱為 PC2)、PCSK3 (也稱為弗林蛋白酶或PACE)、PCSK4 (也稱為PC4)、PCSK5 (也稱為PC5或PC6)、 PCSK6 (也稱為PACE4)或PCSK7 (也稱為PC7/LPC、PC8或SPC7)。在本領域中已知其它加工位點。
[0118] 在包括一個以上加工或裂解位點的構建體中，應理解這種位點可能相同或不同。
[0119] 體外生成允許擴大規模以生成大量本發明的所需改變多肽。本領域中已知在組織培養條件下進行哺乳動物細胞培養的技術并且包括（例如）在氣升式反應器或連續攪拌釜式反應器中的均勻懸浮培養或（例如）在空心纖維、微膠囊中，在瓊脂糖微珠或陶瓷管殼中的固定化或包埋細胞培養。如果必要和/或需要，可通過傳統色譜法，例如凝膠過濾、離子交換色譜法、疏水性相互作用色譜法（HIC)、在DEAE-纖維素上的色譜法或親和色譜法純化多肽溶液。
[0120] 如本文所使用，短語"將受益于施用多肽的受試者"或"有需要的受試者"包括將受益于施用本發明的多肽，例如提高止血的受試者，例如哺乳動物受試者。在一個實施方案中，受試者包括但不限于已經發展FVIII抑制劑并因此需要旁路療法的個體。在另一實施方案中，受試者還包括尚未發展FVIII抑制劑，但是有發展FVIII抑制劑的傾向的個體。受試者可為成人或未成年人（例如，12歲以下）。
[0121] 如本文所使用，"嵌合蛋白"或"融合蛋白"指由源自第一來源的第一氨基酸序列與源自第二來源的第二氨基酸序列共價或非共價鍵合構成的任何蛋白質，其中第一和第二來源不相同。不相同的第一來源和第二來源可包括兩個不同生物實體或來自同一生物實體的兩種不同蛋白質或生物實體和非生物實體。嵌合蛋白可包括（例如）源自至少2個不同生物來源的蛋白質。生物來源可包括任何非合成生成的核酸或氨基酸序列（例如，如本文進一步描述的基因組或cDNA序列、質粒或病毒載體、天然病毒粒子或以上任一種的突變體或類似物）。合成來源可包括經化學生成而不是通過生物系統生成（例如氨基酸序列的固相合成）的蛋白質或核酸序列。嵌合蛋白還可包括源自至少2個不同合成來源的蛋白質或源自至少一個生物來源和至少一個合成來源的蛋白質。嵌合蛋白也可包含源自第一來源的第一氨基酸序列，其與源自任何來源的核酸或源自任何來源的有機或無機小分子共價或非共價連接。嵌合蛋白可包含介于第一和第二氨基酸序列之間或介于第一氨基酸序列和核酸之間，或介于第一氨基酸序列和有機或無機小分子之間的接頭分子。
[0122] 如本文所使用，術語"凝血因子"指自然存在或重組生成的防止或減少受試者出血事件持續時間的分子或其類似物。換言之，指具有促凝活性，即負責將纖維蛋白原轉化為不溶性纖維蛋白網，引起血液凝固或凝結的分子。"可激活凝血因子"是呈非活性形式（即，呈其酶原形式），能夠轉化為活性形式的凝血因子。
[0123] 如本文所使用，凝血活性指參與在形成纖維蛋白凝塊時達到頂點的一連串生化反應和/或降低出血或出血事件的嚴重程度、持續時間或頻率的能力。
[0124] 如本文所使用，止血指阻止或減緩流血或出血；或阻止或減緩血流通過血管或身體部位。
[0125] 如本文所使用，止血障礙指由于形成纖維蛋白凝塊的能力受損或不能形成纖維蛋白凝塊，特征在于自發或因創傷而傾向于出血的基因遺傳或獲得性病狀。
[0126] 這種病癥的實例包括血友病。3種主要形式為血友病A(因子VIII缺乏）、血友病 B (因子IX缺乏或"克雷司馬斯病（Christmas disease) "）和血友病C (因子XI缺乏，輕微出血傾向）、血管性血友病（Von Willebrand disease)、因子Xi缺乏（PTA缺乏）、因子XII 缺乏、纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII的缺乏或結構異常，巨血小板綜合征（Bernard-Soulier syndrome)是GPIb缺陷或缺乏。vWF的受體GPIb可能有缺陷并且導致缺乏初級凝塊形成（初級止血）和出血傾向增加，和格蘭茨曼-尼耶格利二氏血小板機能不全（血小板無力癥（Glanzmann thrombasthenia))。在肝功能衰竭（急性和慢性形式）中，肝臟的凝固因子生成不足；這可能增加出血危險。
[0127] 本發明的嵌合分子預防性使用。如本文所使用，術語"預防性治療"指出血事件之前施用分子。在一個實施方案中，需要一般止血劑的受試者正在接受或即將接受手術。本發明的嵌合蛋白可在手術之前或之后作為預防劑施用。本發明的嵌合蛋白可在手術期間或之后施用以控制急性出血事件。手術可包括但不限于肝臟移植、肝切除術或干細胞移植。
[0128] 按需治療包括對出血事件、關節積血、肌肉流血、口腔流血、出血、肌肉出血、口腔出血、創傷、創傷性頭癬（頭部創傷）、胃腸道出血、顱內出血、腹腔內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽后隙出血、腹膜后間隙出血或髂腰肌鞘出血的治療。受試者可能需要手術預防、圍術期管理或手術治療。這種手術包括（例如）小手術、大手術、拔牙、扁桃體切除術、腹股溝疝切開術、滑膜切除術、全膝關節置換術、開顱術、骨縫術、創傷手術、顱內手術、腹腔內手術、胸內手術或關節置換手術。
[0129] 如本文所使用，術語"急性出血"指不管根本原因如何的出血事件。例如，受試者可能有創傷、尿毒癥、遺傳性出血性疾病（例如，因子VII缺乏）、血小板異常或由于發展抗體對凝血因子的抗性。
[0130] 如本文所使用，治療（treat)、治療（treatment)、治療（treating)指（例如）降低疾病或病狀的嚴重程度；減少病程持續時間；改善與疾病或病狀相關的一種或多種癥狀；對有疾病或病狀的受試者提供有益效果，不一定治愈所述疾病或病狀，預防與疾病或病狀相關的一種或多種癥狀。
[0131] 如本文所使用，術語"固相肽合成"指固定在固體表面的多肽分子的體外合成。 SPPS的一般原理是偶聯-洗滌-去保護-洗滌重復循環之一。固相附著肽的N端游離胺與單個N-保護的氨基酸單元偶聯。然后使該單元去保護，露出另一氨基酸可附于其上的新 N 端胺。最初在 Merrifield 等，"Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide〃. J. Am. Chem. Soc. 85 (14) : 2149 - 2154 (1963)中描述了固相膚合成。例如，如〃Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical Approach", W. C. Chan, P. D. White 編輯，Oxford University Press, New York 2000及其參考文獻中所述，使用固相肽合成，合成本公開的化合物。固相肽合成包括合成包含天然氨基酸、非天然氨基酸（包括D-氨基酸）的多肽、肽/蛋白質骨架修飾和肽與非肽部分偶聯。
[0132] II.嵌合蛋白
[0133] 本發明涉及包含可激活凝血因子和增強子部分的嵌合蛋白。嵌合蛋白中的可激活凝血因子呈非活性形式（即酶原）施用并且在體內施用后，例如在損傷部位，經蛋白酶激活。可激活凝血因子一經激活，與激活的凝血因子締合或連接的增強子部分就可通過在凝血途徑中起伴侶的作用，增強凝血因子的活性。因此，也可將本發明的嵌合蛋白描述為增強型或改良酶原或增強型或改良酶原融合蛋白（例如，FVII增強型酶原融合蛋白或FX增強型酶原融合蛋白）。用于嵌合蛋白的可激活凝血因子的實例包括但不限于如下面部分（A) 中描述的因子VII或因子X。
[0134] 通過使增強子部分（例如，凝血輔因子（例如，組織因子））接近可激活凝血因子進一步改良可激活凝血因子。因此，當凝血因子裂解為雜二聚體時，增強子部分可與凝血因子雜二聚體相互作用并且可誘導構象變化以增強促凝血活性。用于本發明的增強子部分的實例包括但不限于凝血輔因子、促凝血肽或如下面部分（B)中描述的抗原結合部分。在一些實施方案中，增強子部分與凝血因子相互作用，未將凝血因子裂解成雜二聚體。
[0135] 雖然輕鏈從凝血因子的重鏈裂解產生凝血因子的雙鏈活化形式，但是當重鏈的N 端未完全裂解時，凝血因子可能仍然呈酶原樣蛋白質存在。本發明的一個實施方案包括包含含輕鏈和重鏈的雜二聚體酶原樣蛋白質的嵌合蛋白，其中重鏈的N端與蛋白酶裂解位點連接。在損傷部位蛋白酶裂解位點的裂解可激活體內凝血因子。
[0136] 在一個實施方案中，嵌合蛋白中的可激活凝血因子通過共價鍵，例如肽鍵、二硫鍵、金屬鍵、氫鍵、二硫鍵、〇鍵、n鍵、S鍵、糖苷鍵、不可知鍵、彎鍵、偶極鍵、Ji反向鍵、雙鍵、三鍵、四重鍵、五重鍵、六重鍵、共軛、超共軛、芳香性、哈普托數或反鍵作用與增強子部分連接。在另一實施方案中，可激活凝血因子和增強子部分之間的連接為非共價相互作用，例如離子相互作用、疏水性相互作用、親水性相互作用、范德華相互作用或氫鍵。在一些實施方案中，可激活凝血因子和增強子部分之間的連接為共價鍵或非共價鍵，但不是化學交聯，例如光反應性鍵。在一個特定實施方案中，可激活凝血因子和增強子部分之間的連接為-硫鍵。
[0137] 一方面，包含可激活凝血因子和增強子部分的嵌合蛋白進一步包含一個或多個接頭部分。例如，嵌合蛋白可包含式Ac-L-Em或Em-L-Ac，其中Ac為可激活凝血因子，L為接頭部分，并且Em為增強子部分。在一個實施方案中，接頭部分可為肽接頭。下面在部分（D) 中描述了肽接頭的非限制性實例。在另一實施方案中，接頭部分為低復雜度多肽，例如XTEN 序列。用于嵌合蛋白的接頭部分包含至少約5個、至少約10個、至少約20個、至少約30個、至少約40個、至少約50個、至少約60個、至少約70個、至少約80個、至少約90個、至少約 100個、至少約110個、至少約120個氨基酸、至少約150個氨基酸、至少約200個氨基酸、至少約500個氨基酸、至少約1000個氨基酸或至少約2000個氨基酸。
[0138] 另一方面，本發明的嵌合蛋白包含可激活凝血因子、增強子部分和一個或多個異源部分（本文有時表示為Het、Hetl或Het2)。異源部分可包含異源多肽部分、非多肽部分或二者。異源多肽部分可選自免疫球蛋白恒定區或其部分、白蛋白或其片段、衍生物或變體、白蛋白結合部分、白蛋白結合小分子、PAS序列、XTEN序列、HAP序列、轉鐵蛋白或其片段、衍生物或變體或其任何組合。在其它實施方案中，異源部分為免疫球蛋白恒定區或其部分，例如Fc部分。還有其它實施方案中，非多肽部分選自聚乙二醇（PEG)、多聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或其任何組合。異源部分可連接到活化凝血因子（輕鏈、重鏈或二者）的N端或C端或插入活化凝血因子（輕鏈、重鏈或二者）內兩個氨基酸之間或連接到增強部分的N端或C端或插入增強部分內兩個氨基酸之間。下面在部分（C)中描述了異源部分的實例。
[0139] 在一些實施方案中，嵌合蛋白包含兩個或更多個異源部分。包含兩個或更多個異源部分的嵌合蛋白可具有單條多肽鏈、兩條多肽鏈、三條多肽鏈或更多。例如，嵌合蛋白可包含式 Ac-Hetl-Em_Het2、Het2-Em-Hetl_Ac、Ac-Em-Hetl_Het2、Het2-Hetl-Em_Ac、 Hetl-Het2-Ac_Em、 Em-Ac-Het2_Hetl、 Hetl-Em-Het2_Ac、 Ac-Hetl-Em_Het2、 Em-Het2-Ac_Hetl、Hetl-Ac-Het2_Em、Het2-Ac-Hetl_Em 和 Em-Hetl-Ac_Het2 表不的單鏈，其中Ac為可激活凝血因子，Hetl為第一異源部分，Em為增強子部分，Het2為第二異源部分，并且（_)為肽鍵或一個或多個氨基酸。
[0140] 包含兩條多肽鏈的嵌合蛋白可用式Ac-Hetl :Em_Het2、Het 1-Ac: Het2_Em、 Ac-Hetl :Het2_Em或Hetl-Ac:Em_Het2表示，其中中Ac為可激活凝血因子，Em為增強子部分，Hetl為第一異源部分（例如，第一 Fc部分），Het2為第二異源部分（例如，第二Fc部分），（_)為肽鍵或一個或多個氨基酸，并且（:）為兩條多肽鏈（例如，Ac-Hetl和Em-Het2) 之間的締合。如本文提出的締合（:）表示共價鍵或非共價鍵，例如至少一個非肽鍵。在一個實施方案中，締合即（:）為共價鍵。在另一實施方案中，締合即（:）為非共價鍵，例如離子相互作用、疏水性相互作用、親水性相互作用、范德華相互作用、氫鍵。在其它實施方案中， (:)為非肽共價鍵。還有其它實施方案中，（:）為肽鍵。還有其它實施方案中，本文提出的式中的（:）表示兩個序列之間的物理或化學締合，但非化學交聯，其中第一序列的一部分接近第二序列，以致在激活第一序列和第二序列的任一個或二者后，第一序列和第二序列相互作用。
[0141] 本文提出的式僅為本發明構建體的非限制性實例。從N端（左）到C端（右）示出了多肽式的定向。例如，式Ac-Hetl指式NH2-Ac-Hetl-C00H。另外，除非另外指出，（:）可為兩條多肽鏈之間通過第一條鏈任一部分與第二條鏈任一部分之間的共價鍵或非共價鍵的締合或相互作用。例如，式Ac-Hetl :Em-Het2具有兩條多肽鏈，第一條鏈為Ac-Hetl而第二條鏈為Em-Het2,其中第一條鏈中的Ac與第二條鏈中的Em相互作用或締合和/或第一條鏈中的Hetl與第二條鏈中的Het2相互作用或締合。在一些實施方案中，（:）指共價、非肽鍵或非共價鍵。
[0142] 再一方面，本發明的嵌合蛋白包含可激活凝血因子、增強子部分、一個或多個接頭部分和一個或多個異源部分。在一個實施方案中，嵌合蛋白包含可激活凝血因子（Ac)、增強子部分（Em)、一個接頭部分（L)和一個異源部分（Het)，其中所述組分相互連接或締合。可用式 Ac-L-Het:Em、Het-L-Ac:Em、Em-L-Het:Ac、Het-L-Em:Ac、Ac-L-Het-Em 或 Em-Het-L-Ac 表示所述嵌合蛋白。在另一實施方案中，嵌合蛋白包含可激活凝血因子（Ac)、增強子部分（Em)、兩個接頭部分（LI和L2)和一個異源部分（Het)。可用式Ac-Ll-Het-L2-Em和 Em-L2-Het-Ll-Ac表示所述嵌合蛋白。在其它實施方案中，嵌合蛋白包含可激活凝血因子 (Ac)、增強子部分（Em)、兩個接頭部分（LI和L2)和兩個異源部分（Hetl和Het2)，其中所述組分相互連接或締合。可用式Ac-Ll-Hetl:Em-L2_Het2、Hetl-L2-Ac:Em-L2_Het2或 Het 1-L2-Ac: Het2-L2-Em表示所述嵌合蛋白，其中Ac包含、基本上由或由可激活凝血因子組成，Ll包含、基本上由或由第一任選接頭部分例如第一接頭組成，Hetl包含、基本上由或由第一異源部分（例如，第一 Fc部分）組成，Em包含、基本上由或由增強子部分組成，L2包含、基本上由或由第二任選接頭部分例如第二接頭組成，Het2包含、基本上由或由第一異源部分（例如，第二Fc部分）組成，㈠包含、基本上由或由肽鍵或一個或多個氨基酸組成；并且（:）為Ac-Ll-Hetl與Em-L2-Het2之間的締合。如本文提出的締合（:）表示共價鍵或非共價鍵，例如至少一個非肽鍵。在一個實施方案中，締合即（:）為共價鍵。在一個特定實施方案中，締合（:）為Hetl和Het2之間的二硫鍵。在另一實施方案中，締合即（:）為非共價相互作用，例如離子相互作用、疏水性相互作用、親水性相互作用、范德華相互作用、氫鍵。在其它實施方案中，（:）為非肽共價鍵。還有其它實施方案中，（:）為肽鍵。還有其它實施方案中，本文提出的式中的（:）表示兩個序列之間的物理或化學締合，但非化學交聯，其中第一序列的一部分接近第二序列，以致在激活第一序列和第二序列的任一個或二者后，第一序列和第二序列相互作用。
[0143] 在某些方面，本發明的嵌合蛋白包含第一條多肽鏈和第二條多肽鏈，其中第一條多肽鏈包含可激活凝血因子而第二條多肽鏈包含增強子部分，其中第一條多肽鏈和第二條多肽鏈相互連接或締合。嵌合蛋白可進一步包含含第一異源部分Hetl (例如，第一 Fc部分 (例如Fl))和第二異源部分Het2(例如，第二Fc部分（例如F2))的二聚體異源部分區域，其中第一異源部分在第一條多肽鏈中而第二異源部分在第二條多肽鏈中。例如，嵌合蛋白可包含選自以下的結構：
[0144] (a) Ac經由所述接頭部分與Hetl連接，并且Em與Het2連接；
[0145] (b)Ac經由所述第一接頭部分與Hetl連接，并且Em經由所述第二接頭部分與 Het2連接；
[0146] (C)Ac與Hetl連接，并且Em經由所述接頭部分與Het2連接；
[0147] (d) Ac與Hetl連接，并且Em與Het2連接；
[0148] (e) Em經由所述接頭部分與Hetl連接；并且Ac與Het2連接；
[0149] (f)Em經由所述第一接頭部分與Hetl連接，并且Ac經由所述第二接頭部分與 Het2連接；
[0150] (g)Em與Hetl連接，并且Ac經由所述接頭部分與Het2連接；或，
[0151] (h) Em與Het 1連接，并且Ac與Het2連接，其中Het 1和Het2形成二硫鍵。
[0152] 包含兩個多肽的嵌合蛋白也可表示如下：
[0153] (a)所述第一多肽包含式Ac-Ll-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式 Em-Het2表示的結構；
[0154] (b)所述第一多肽包含式Ac-Ll-Hetl表不的結構，并且所述第二多肽包含式 Em-L2_Het2表示的結構；
[0155] (c)所述第一多肽包含式Ac-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式 Em-L2_Het2表示的結構；
[0156] (d)所述第一多肽包含式Ac-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式 Em-Ll_Het2表示的結構；
[0157] (e)所述第一多肽包含式Em-L2-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式 Ac-Ll-Het2表示的結構；
[0158] (f)所述第一多肽包含式Em-Ll-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式 Ac_Het2表示的結構；
[0159] (g)所述第一多肽包含式Em-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式 Ac-Ll-Het2表示的結構；和，
[0160] (h)所述第一多肽包含式Em-Hetl表不的結構，并且所述第二多肽包含式Ac_Het2 表示的結構；
[0161] 其中所述兩條多肽鏈的Hetl和Het2形成二硫鍵。
[0162] 還有其它方面，嵌合蛋白包含可激活凝血因子（Ac)、增強子部分（Em)、三個接頭部分（LI、L2和X)和兩個異源部分（Hetl和Het2)，其中所述組分相互連接。嵌合蛋白可包含選自Ac-Hetl-X-Em-Het2或Het2-Em-X-Hetl-Ac的式，其中Ac為可激活凝血因子， Hetl為第一異源部分，X為scFc接頭，Em為增強子部分，并且Het2為第二異源部分。嵌合蛋白也可包含一個或多個接頭部分。例如，嵌合蛋白可包含選自Ac-Ll-Hetl-X-Em-Het2、 Ac_Hetl_X_Em_L2_Het2、Ac _Ll_Hetl_X_Em_L2 _Het2、Het2_Em_X_Hetl_Ll _Ac、 Het2_L2_Em_X_Hetl_Ac 或 Het2_L2_Em_X_Hetl_Ll _Ac 的式，其中 Ac 為可激活凝血因子，LI 為第一任選接頭部分，Hetl為第一異源部分，X為scFc接頭，Em為增強子部分，L2為第二任選接頭部分，并且Het2為第二異源部分。
[0163] 在一個實施方案中，任一個或兩個異源部分（Hetl和Het2)為相同或不同的異源多肽部分。在另一實施方案中，Hetl和Het2中任一個或兩個為非多肽部分。在其它實施方案中，任一個或兩個異源部分（Hetl和Het2)可為半衰期延長劑。半衰期延長劑的實例包括但不限于免疫球蛋白恒定區或其一部分、白蛋白、轉鐵蛋白、白蛋白結合部分、PAS序列、 JES序列、人絨毛膜促性腺激素 C端肽（CTP)的P亞基、聚乙二醇（PEG)、XTEN序列、羥乙基淀粉0ES)、白蛋白結合小分子、血管性血友病因子或其片段、衍生物或變體，或其任何組合。下面在部分（C)中示出了異源部分的實例。
[0164] 在另一實施方案中，第一和第二異源部分（Hetl和Het2)通過肽鍵或接頭（例如， scFc接頭（有時也表示為"X")）相互連接或通過共價或非共價鍵，例如二硫鍵締合。例如， scFc接頭可連接第一 Fc部分和第二Fc部分，從而形成二聚Fc區。scFc接頭可進一步包含使得能夠在宿主細胞中表達時加工嵌合蛋白的胞內加工位點。下面在部分（C. 3)中示出了 scFc接頭的實例。
[0165] 下面描述了嵌合蛋白的每種組分。
[0166] A?可激活凝血因子
[0167] 1 ?凝血因子
[0168] 具體而言，本發明關于因子VII和X的改良形式。這些因子全部在結構上的相關之處在于，各自輕鏈的氨基末端不易受并入附加部分影響。類似地，這3種凝血因子重鏈的氨基酸末端不易受并入附加部分影響，可裂解部分，即經由裂解位點連接的部分或由裂解位點組成的部分除外。基于這些共有性質設計了本發明的嵌合凝血因子構建體并應理解，雖然常常示出因子VII以說明本發明的示例性實施方案，但是可使用因子VII或X產生主題構建體。例如，本領域的技術人員將理解，可用FX部分取代本發明構建體的FVII部分以產生這些凝血因子其中之一的增強形式。
[0169] 指定用于旁路療法的凝血因子在呈活化形式給予時有效，因為外源凝血因子常常未經足夠動力學活化為有效。然而，它們也可通過內源途徑（例如，通過抗凝血酶III或 TFPI)快速滅活，導致活性形式清除和短的有效半衰期。為了防止由內源性酶快速滅活和清除，將本發明的嵌合凝血因子構建為"可激活"形式。這種可激活構建體作為半衰期更長的增強型酶原循環，但在必要時，可在凝血部位容易地裂解。
[0170] 附圖中提出了本發明的示例性嵌合凝血因子構建體。用于本發明的嵌合凝血因子呈非活性形式表達，隨后呈非活性形式施用，然后在體內施用后激活。因子VII和X的非活性形式為單鏈酶原。因子VII和X的活性形式由二聚體分子構成，其中重鏈和輕鏈通過共價鍵，例如二硫鍵連接。
[0171] 可激活凝血因子包含與蛋白酶裂解位點連接的凝血因子酶原輕鏈，所述輕鏈進一步與凝血因子酶原的重鏈連接。凝血因子酶原的輕鏈或重鏈可包括分別保持了凝血因子酶原輕鏈或重鏈的功能的片段、變體、衍生物或類似物。
[0172] 在一個實施方案中，本發明的凝血因子為因子VII的成熟形式或其變體。因子 VII (FVII、F7 ;也稱為因子7、凝固因子VII、血清因子VII、血清凝血酶原轉化加速因子、 SPCA、轉化加速因子前體和依他凝血素 a)是為凝血級聯的一部分的絲氨酸蛋白酶。FVII 包括Gla結構域、兩個EGF結構域（EGF-1和EGF-2)和絲氨酸蛋白酶結構域（或肽酶Sl結構域），所述絲氨酸蛋白酶結構域在絲氨酸蛋白酶的肽酶Sl家族所有成員中高度保守，例如胰凝乳蛋白酶。FVII呈單鏈酶原（即，可激活FVII)和完全活化雙鏈形式存在。
[0173] 如本文所使用，術語"FVII蛋白"包括野生型FVII、成熟FVII、全長FVII、FVII的功能片段、其變體或衍生物。示例性FVII變體包括比活性增加的變體，例如通過增加其酶活性（Kcat或Km)增加 FVII活性的突變。本領域已經描述了這種變體并且包括（例如）在 Persson 等 2001. PNAS 98:13583 ;Petrovan and Ruf. 2001. J. Biol. Chem. 276:6616; Persson 等 2001J. Biol. Chem. 276:29195 ;Soejima 等 2001. J. Biol. Chem. 276:17229; Soejima等2002. J. Biol. Chem. 247:49027中描述的分子的突變形式。在一個實施方案中， FVII的變體形式包括突變。示例性突變包括V158D-E296V-M298Q。在另一實施方案中， FVII的變體形式包括來自胰蛋白酶170-環的氨基酸EASYPGK置換來自FVII成熟序列的氨基酸608-619〇^05服￥6〇5?1對應170-環）。？^的高比活性變體在本領域中也已知。例如，Simioni 等（2009N. E.Journal of Medicine 361:1671)描述了 R338L 突變。Chang 等 (1988JBC 273:12089)和Pierri 等（2009Human Gene Therapy 20:479)描述了 R338A突變。在本領域中已知其它突變并且包括例如Zogg和Brandstetter. 2009Structure 17:1669 ; Sichler 等 2003. J. Biol. Chem. 278:4121 ;和 Sturzebecher 等 1997. FEBS Lett 412:295 中描述的突變。這些參考文獻的內容以引用的方式并入本文。序列表中公開了示例性FVII 氨基酸和核苷酸序列，分別作為SEQ ID N0:44和45的一部分。
[0174] 當裂解FVII酶原或FX酶原的重鏈的緊靠上游時發生因子VII或因子X激活。例如，當裂解FVII重鏈第一殘基緊靠上游即Ile-153時，激活FVII。
[0175] 在一個實施方案中，本發明的凝血因子為因子X的成熟形式。因子X是分子量為 58. 5kDa的維生素 K依賴性糖蛋白，其作為酶原從肝細胞分泌到血漿中。最初因子X作為具有總計由488個氨基酸組成的信號肽的前肽原生成。信號肽在輸出到內質網期間由信號肽酶裂解掉，在成熟N端鏈的N端的前11個谷氨酸殘基處發生Y羧化后，裂解掉前肽序列。進一步加工步驟通過在Argl82和Serl83之間的裂解發生。該加工步驟還附隨導致三肽 Argl80-Lysl81-Argl82缺失。所得分泌因子X酶原由139個氨基酸（M，16,200)的N端輕鏈和306個氨基酸（M，42, 000)的C端重鏈組成，其經由Cysl72和Cys342之間的二硫橋共價連接。更多翻譯后加工步驟包括Aspl03的.￠.-羥基化以及N-和0-型羰基化。
[0176] 表 L
[0177]
【權利要求】
1. 一種嵌合蛋白，包含（i)可激活凝血因子（Ac)，（ii)增強子部分（Em)，和（iii)所述可激活凝血因子和增強子部分之間的任選接頭部分（L或L1)。
2. 根據權利要求1所述的嵌合蛋白，其中所述可激活凝血因子和所述增強子部分相互連接或締合，但是未化學交聯。
3. 根據權利要求1或2所述的嵌合蛋白，包含式Ac-L-Em或Em-L-Ac表示的結構，其中 Ac包含所述可激活凝血因子；其中L包含所述任選接頭部分；并且其中Em包含所述增強子部分。
4. 根據權利要求1-3中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述可激活凝血因子包含含重鏈 (HC)和輕鏈（LC)及插入所述HC和所述LC之間的蛋白酶裂解位點的凝血因子酶原。
5. 根據權利要求1-4中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述增強子部分包含凝血輔因子、促凝血肽或抗原結合部分。
6. 根據權利要求4或5所述的嵌合蛋白，其中所述凝血因子酶原為FVII蛋白或FX蛋白。
7. 根據權利要求5或6所述的嵌合蛋白，其中所述促凝血肽是合成的。
8. 根據權利要求5或6所述的嵌合蛋白，其中所述促凝血肽包含（a)含式dLASYC2的氨基酸序列其中 L為L-亮氨酸； A為L-丙氨酸； S為L-絲氨酸； Y為L-酪氨酸； L、A、S和Y中的一個或兩個經獨立地選自D-和L-氨基酸的置換氨基酸任選置換；一個附加氨基酸任選插入式（I)介于C1和C2之間的任何地方；并且 C1和C2獨立地選自具有側鏈的氨基酸，其中C1和C2的側鏈連接形成環；或 (b) (a)的氨基酸序列的逆向、反向或逆-反向變體。
9. 根據權利要求4-6中任一項所述的嵌合蛋白，其中： (a) 所述凝血因子酶原包含FVII蛋白，并且所述凝血輔因子包含組織因子蛋白；或 (b) 所述凝血因子酶原包含FX蛋白，并且所述凝血輔因子包含FVa蛋白。
10. 根據權利要求9所述的嵌合蛋白，其中所述組織因子蛋白為可溶性組織因子 (sTF)。
11. 根據權利要求5-10中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述抗原結合部分包含能夠與所述FVII蛋白或FX蛋白結合并分別增強所述FVII蛋白或FX蛋白的活性的抗體或其抗原結合片段。
12. 根據權利要求11所述的嵌合蛋白，進一步包含插入所述蛋白酶裂解位點和所述HC 之間的自切除部分。
13. 根據權利要求4-12中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述蛋白酶裂解位點被選自凝血酶（因子Ila)、因子XIa、因子Xlla、激肽釋放酶、因子Vila、因子IXa和因子Xa的蛋白酶裂解，其中所述蛋白酶裂解位點并非自然存在于所述凝血因子酶原中。
14. 根據權利要求12或13所述的嵌合蛋白，其中所述自切除部分包含對氨基芐基氨基甲酸酯（PABC)、對氨基芐基醚（PABE)、對氨基芐基碳酸酯。
15. 根據權利要求1-14中任一項所述的嵌合蛋白，進一步包含異源部分（Het)。
16. 根據權利要求15所述的嵌合蛋白，其中所述異源部分（Het)為半衰期延長劑。
17. 根據權利要求16所述的嵌合蛋白，其中所述半衰期延長劑包含免疫球蛋白恒定區或其一部分、白蛋白、轉鐵蛋白、白蛋白結合部分、PAS序列、HES序列、人絨毛膜促性腺激素 C端肽（CTP)的0亞基、聚乙二醇（PEG)、羥乙基淀粉（HES)、白蛋白結合小分子或其任何組合。
18. 根據權利要求16所述的嵌合蛋白，其中所述免疫球蛋白恒定區或其一部分包含Fc 部分或FcRn結合伴侶。
19. 根據權利要求1-18中任一項所述的嵌合蛋白，進一步包含第二異源部分（Het2)，并且任選包含與所述第一接頭部分（L或L1)相同或不同的第二接頭部分（L2)。
20. 根據權利要求19所述的嵌合蛋白，其中所述第二異源部分（Het2)包含半衰期延長劑。
21. 根據權利要求20所述的嵌合蛋白，其中所述半衰期延長劑包含免疫球蛋白恒定區或其一部分、白蛋白、轉鐵蛋白、白蛋白結合部分、PAS序列、HES序列、人絨毛膜促性腺激素 C端肽（CTP)的0亞基、聚乙二醇（PEG)、羥乙基淀粉（HES)、白蛋白結合小分子或其任何組合。
22. 根據權利要求21所述的嵌合蛋白，其中所述免疫球蛋白恒定區或其一部分包含Fc 部分或FcRn結合伴侶。
23. 根據權利要求1-22中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中所述第一多肽鏈包含所述可激活凝血因子（Ac)并且所述第二多肽鏈包含所述增強子部分（Em)，其中所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈相互締合。
24. 根據權利要求19-22中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中所述第一多肽鏈包含所述可激活凝血因子（Ac)、所述第一異源部分 (Hetl)和所述第一任選接頭部分（L1)，并且所述第二多肽包含所述增強子部分（Em)、所述第二異源部分（Het2)和所述第二任選接頭部分（L2)，其中所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈相互締合。
25. 根據權利要求24所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白具有選自以下的結構： (a) Ac經由所述接頭部分與Hetl連接，并且Em與Het2連接； (b) Ac經由所述第一接頭部分與Hetl連接，并且Em經由所述第二接頭部分與Het2連接； (c) Ac與Hetl連接，并且Em經由所述接頭部分與Het2連接； (d) Ac與Hetl連接，并且Em與Het2連接； (e) Em經由所述接頭部分與Hetl連接；并且Ac與Het2連接； (f) Em經由所述第一接頭部分與Hetl連接，并且Ac經由所述第二接頭部分與Het2連接； (g) Em與Hetl連接，并且Ac經由所述接頭部分與Het2連接；和， (h) Em與Het 1連接，并且Ac與Het2連接。
26. 根據權利要求25所述的嵌合蛋白，其包含兩條多肽，其中： (a) 所述第一多肽包含式Ac-Ll-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式Em-Het2 表示的結構； (b) 所述第一多肽包含式Ac-Ll-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式 Em-L2_Het2表示的結構； (c) 所述第一多肽包含式Ac-Hetl表不的結構，并且所述第二多肽包含式Em_Het2表不的結構； (d) 所述第一多肽包含式Ac-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式Em-Ll-Het2 表示的結構； (e) 所述第一多肽包含式Em-Ll-Het2表示的結構，并且所述第二多肽包含式Ac-Hetl 表示的結構； (f) 所述第一多肽包含式Em-L2-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式 Ac-Ll-Het2表示的結構； (g) 所述第一多肽包含式Em-Hetl表示的結構，并且所述第二多肽包含式Ac-Ll-Het2 表示的結構；和， (h) 所述第一多肽包含式Em-Hetl表不的結構，并且所述第二多肽包含式Ac_Het2表不的結構；其中所述兩條多肽鏈的Hetl和Het2形成二硫鍵。
27. 根據權利要求1-26中任一項所述的嵌合蛋白，包含至少一個接頭部分。
28. 根據權利要求18-27中任一項所述的嵌合蛋白，包含兩個接頭部分。
29. 根據權利要求28所述的嵌合蛋白，其中所述兩個接頭部分相同。
30. 根據權利要求28所述的嵌合蛋白，其中所述兩個接頭部分不同。
31. 根據權利要求27-30中任一項所述的嵌合蛋白，其中至少一個接頭部分具有包含約10個至約50個氨基酸的氨基酸序列。
32. 根據權利要求31所述的嵌合蛋白，其中所述至少一個接頭部分具有包含約20個至約30個氨基酸的氨基酸序列。
33. 根據權利要求1-32中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述接頭部分包含gly/ser肽。
34. 根據權利要求33所述的嵌合蛋白，其中所述gly/ser肽包含式（Gly4Ser)n* Ser(Gly4Ser)n的氨基酸序列，其中n為選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的正整數。
35. 根據權利要求34所述的嵌合蛋白，其中所述（Gly4Ser)n肽包含選自（Gly4Ser) 6、 Ser(Gly4Ser)6、（Gly4Ser)4 和 Ser(Gly4Ser)4?的氨基酸序列。
36. 根據權利要求35所述的嵌合蛋白，其中所述（61745從)11肽為（GlyJeiOJt
37. 根據權利要求1-22中任一項所述的嵌合蛋白，其為單條多肽鏈。
38. 根據權利要求37所述的嵌合蛋白，進一步包含連接所述增強子部分和所述第一異源部分或所述可激活凝血因子和所述第二異源部分的scFc接頭（X)。
39. 根據權利要求38所述的嵌合蛋白，包含選自以下的式： (1) Ac_Hetl_X_Em_Het2 ； (2) Ac-Hetl-X-Em-L2-Het2 ； (3) Ac_Ll_Hetl_X_Em_Het2 ； (4) Ac_Ll_Hetl_X_Em_L2 _Het2 ； (5) Het2-Em-X-Hetl-Ac ； (6) Het2-L2-Em-X-Hetl-Ac ； (7) Het2_Em_X_Hetl_Ll_Ac ;和 (8) Het2-L2-Em-X-Hetl-Ll-Ac, 其中 (a) Ac為所述可激活凝血因子， (b) L1為所述第一任選接頭部分； (c) Hetl為所述第一異源部分； (d) X為所述scFc接頭； (e) Em為所述增強子部分； (f) L2為所述任選第二接頭部分； (g) Het2為所述第二異源部分；并且 (h) (_)為肽鍵或一個或多個氨基酸。
40. 根據權利要求39所述的嵌合蛋白，其中Hetl或Het2中的每個均為半衰期延長劑。
41. 根據權利要求40所述的嵌合蛋白，其中Hetl和Het2為Fc部分或FcRn結合部分，其中Hetl和E2相同或不同。
42. 根據權利要求39-41中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述scFc接頭為可加工接頭 (cscFc)〇
43. 根據權利要求42所述的嵌合蛋白，其中所述cscFc接頭包含至少一個胞內加工位點。
44. 根據權利要求42或43所述的嵌合蛋白，其中所述cscFc接頭包含可被相同或不同胞內加工酶識別的兩個胞內加工位點。
45. 根據權利要求44所述的嵌合蛋白，其中所述胞內加工位點被選自酵母Kex2、 PCSK1、PCSK2、PCSK3、PCSK4、PCSK5、PCSK6 或 PCSK7 的胞內加工酶識別。
46. 根據權利要求44或45所述的嵌合蛋白，其中所述至少一個胞內加工位點由PCSK5 加工。
47. 根據權利要求44或45所述的嵌合蛋白，其中所述兩個胞內加工位點的每一個均由 PCSK5加工。
48. 根據權利要求47所述的嵌合蛋白，其中所述兩個胞內加工位點相同。
49. 根據權利要求47所述的嵌合蛋白，其中所述兩個胞內加工位點不同。
50. 根據權利要求43-49中任一項所述的嵌合蛋白，其中由所述胞內加工酶加工的所述胞內加工位點包含氨基酸序列R-X_[R/K]-R，其中X可為任何氨基酸，并且[R/K]指示所述氨基酸可為R或K。
51. 根據權利要求50所述的嵌合蛋白，其中所述PCSK5酶裂解位點的每一個獨立地包含序列 RRRR(SEQ ID NO:2)或（RKR)n(SEQ ID 勵:3)，其中11為2。
52. 根據權利要求51所述的嵌合蛋白，其中在所述cscFc接頭C末端的所述PCSK5酶裂解位點包含序列RRRR(SEQ ID NO:2)并且在所述cscFc接頭N末端的所述PCSK5酶裂解位點包含序列（RKR)2(SEQ ID NO:3)。
53. 根據權利要求38-52中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述scFc接頭的長度為約10 個至約50個氨基酸。
54. 根據權利要求38-52中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述scFc接頭的長度為約20 個至約30個氨基酸。
55. 根據權利要求38-52中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述scFc接頭包含gly/ser 肽。
56. 根據權利要求55所述的嵌合蛋白，其中所述gly/ser肽包含式（Gly4Ser)n* Ser(Gly4Ser)n的氨基酸序列，其中n為選自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的正整數。
57. 根據權利要求55所述的嵌合蛋白，其中所述（Gly4Ser)n肽包含選自（Gly4Ser) 6、 Ser(Gly4Ser)6、（Gly4Ser)4 和 Ser(Gly4Ser)4?的氨基酸序列。
58. 根據權利要求57所述的嵌合蛋白，其中所述（Gly4Ser)n肽為（Gly4Ser) 6肽。
59. 根據權利要求4-58中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述凝血因子酶原為FVII蛋白。
60. 根據權利要求59所述的嵌合蛋白，其中所述FVII蛋白為因子VII的高比活性變體。
61. 根據權利要求4-58中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述凝血因子酶原為FX蛋白。
62. 根據權利要求61所述的嵌合蛋白，其中所述FX蛋白為因子X的高比活性變體。
63. 根據權利要求1-62中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述可激活凝血因子在體內激活。
64. 根據權利要求4-63中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述蛋白酶裂解位點為凝血酶裂解位點。
65. 根據權利要求64所述的嵌合蛋白，其中所述凝血酶裂解位點包含選自 TQSFNDFTR(SEQ ID NO:6)、SVSQTSKLTR(SEQ ID NO:7)、TTKIKPR(SEQ ID NO:9)、LVPRG(SEQ ID N0:10)和 ALRPR(SEQ ID NO:l)的氨基酸序列。
66. 根據權利要求4-65中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述蛋白酶裂解位點為FXIa裂解位點。
67. 根據權利要求66所述的嵌合蛋白，其中所述FXIa裂解位點包含KLTR(SEQ ID NO:13)或 DFTR(SEQ ID N0:14)的氨基酸序列。
68. 根據權利要求4-67中任一項所述的嵌合蛋白，其中在所述凝血因子酶原的輕鏈與所述蛋白酶裂解位點之間插入胞內加工位點。
69. 根據權利要求68所述的嵌合蛋白，其中所述胞內加工位點由選自酵母Kex2、 PCSK1、PCSK2、PCSK3、PCSK4、PCSK5、PCSK6 和 PCSK7 的胞內加工酶裂解。
70. 根據權利要求69所述的嵌合蛋白，其中所述胞內加工酶為PCSK5。
71. 根據權利要求12-70中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述自切除部分包含芳香環。
72. 根據權利要求71所述的嵌合蛋白，其中所述芳香環選自芐基、肉桂基、萘基和聯苯基。
73. 根據權利要求71或72所述的嵌合蛋白，其中所述芳香環為雜環。
74. 根據權利要求71-73中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述芳香環包含至少一個取代基。
75. 根據權利要求74所述的嵌合蛋白，其中所述至少一個取代基選自F、Cl、I、Br、OH、 N02、NH2、N03+、NHCOCH3、N (CH3) 2、NHCOCF3,、烷基、齒代烷基、c「c8烷基良羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯或磺酸酯。
76. 根據權利要求75所述的嵌合蛋白，其中所述芳族基團中至少一個C經N、0或C-札取代，其中札獨立地選自F、C1、1、81~、011、勵2、順2、勵3+、順(：001 3、叭013)2、順(1^卩3，、烷基、鹵代烷基、CfC8烷基鹵、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯或磺酸酯。
77. 根據權利要求10-76中任一項所述的嵌合蛋白，其中所述可溶性TF包含與成熟TF 肽的氨基酸 1-219(即，SEQ ID NO:15 的氨基酸 33-251)至少 80%、85%、90%、95%、96%、 97 %、98 %、99 %或100 %相同的氨基酸序列。
78. 根據權利要求18-87中任一項所述的嵌合蛋白，進一步包含至少一個附加異源部分。
79. 根據權利要求1-78中任一項所述的嵌合蛋白，其經多聚唾液酸化、聚乙二醇化、糖基化、羥乙基化、羧基化或其任何組合。
80. -種核酸分子，其編碼根據權利要求1-79中任一項所述的嵌合蛋白或其補體。
81. -組核酸分子，包含第一核苷酸序列（NA1)和第二核苷酸序列（NA2)，其中NA1編碼根據權利要求23-37和59-79中任一項所述的嵌合蛋白或其補體的第一多肽，并且NA2 編碼根據權利要求23-37和59-79中任一項所述的嵌合蛋白或其補體的第二多肽。
82. -種載體，其包含根據權利要求80或81所述的核酸分子或其補體。
83. -組載體，其包含第一載體（VI)和第二載體（V2)，其中VI包含根據權利要求81 所述的NA1或其補體并且V2包含根據權利要求81所述的NA2或其補體。
84. 根據權利要求82或83所述的載體或載體組，進一步包含編碼加工所述嵌合蛋白中至少一個胞內加工位點的胞內加工酶的核苷酸序列或其補體。
85. -種宿主細胞，其包含根據權利要求82-84中任一項所述的載體。
86. 根據權利要求85所述的宿主細胞，其為HEK293細胞、BHK細胞或CHO細胞。
87. -種生成嵌合蛋白的方法，包括培養根據權利要求85或86所述的宿主細胞并且從培養基中回收所述嵌合蛋白。
88. -種藥物組合物，其包含根據權利要求1-79中任一項所述的嵌合蛋白、根據權利要求80或81所述的核酸分子或核酸分子組、根據權利要求82-84中任一項所述的載體或載體組和藥學上可接受的載體。
89. -種在有需要的受試者中治療、改善或預防出血性疾病或病癥的方法，包括向所述受試者施用有效量的根據權利要求1-79中任一項所述的嵌合蛋白、根據權利要求80或81 所述的核酸分子或核酸分子組、根據權利要求82-84中任一項所述的載體或載體組、根據權利要求85或86中任一項所述的宿主細胞或根據權利要求85所述的藥物組合物。
90. 根據權利要求89所述的方法，其中所述出血性疾病或病癥由凝血障礙引起。
91. 根據權利要求90所述的方法，其中所述凝血障礙為血友病A或血友病B。
92. 根據權利要求89-91中任一項所述的方法，其中所述出血性疾病或病癥選自關節積血、肌肉流血、口腔流血、出血、肌肉出血、口腔出血、創傷、創傷性頭癬、胃腸道出血、顱內出血、腹腔內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽后隙出血、腹膜后間隙出血和髂腰肌鞘出血。
93. -種在有需要的受試者中治療、改善或預防凝固因子缺乏的方法，包括向所述受試者施用有效量的根據權利要求1-79中任一項所述的嵌合蛋白、根據權利要求80或81所述的核酸分子或核酸分子組、根據權利要求82-84中任一項所述的載體或載體組、根據權利要求85或86中任一項所述的宿主細胞或根據權利要求88所述的藥物組合物，其中所述凝固因子選自卩￥11、卩￥11&、卩￥111、卩1父和卩父1。
94. 根據權利要求89-93中任一項所述的方法，其中所述治療、改善或預防為旁路療法。
95. 根據權利要求89-94中任一項所述的方法，其中所述受試者已經發展或易于發展對因子VIII的抑制劑。
96. 根據權利要求89-95中任一項所述的方法，其中所述受試者為人類受試者。
97. 根據權利要求1-79中任一項所述的嵌合蛋白、根據權利要求80或81所述的核酸分子或核酸分子組、根據權利要求82-84中任一項所述的載體或載體組、根據權利要求85 或86所述的宿主細胞或根據權利要求88所述的藥物組合物，用于治療、改善或預防有凝血障礙的受試者。
98. 根據權利要求1-79中任一項所述的嵌合蛋白、根據權利要求80或81所述的核酸分子或核酸分子組、根據權利要求82-84中任一項所述的載體或載體組、根據權利要求85 或86所述的宿主細胞或根據權利要求88所述的藥物組合物用于生產治療、預防或改善凝血障礙的藥劑的用途。
99. 一種制備根據權利要求1-79中任一項所述的嵌合蛋白的方法，所述方法包括使用固相肽合成。
100. 根據權利要求99所述的方法，包括使用正交固相肽合成。
101. -種嵌合蛋白，包含式Ac-Ll-Em表示的從氨基末端到羧基末端的線性結構，其中 Ac為蛋白酶可激活的FVII凝血因子，Em為可溶性組織因子，并且L1為包含連接Ac的羧基末端和Em的氨基末端的gly/ser肽的接頭部分；其中所述蛋白酶可激活的FVII凝血因子 Ac包含輕鏈（LC)和重鏈（HC)及插入所述LC的羧基末端和所述HC的氨基末端之間的凝血酶裂解位點。
102. -種包含兩條多肽的嵌合蛋白，所述第一多肽具有式Ac-Ll-Hetl表不的從氨基末端到羧基末端的線性結構，而所述第二多肽具有式Em-L2-Het2表示的從氨基末端到羧基末端的線性結構，其中： (a) Ac為蛋白酶可激活的FVII凝血因子； (b) Hetl為二聚Fc區的Fc部分；并且 (c) L1為包含連接Ac的羧基末端和Hetl的氨基末端的gly/ser肽的接頭部分； (d) Em為可溶性組織因子； (e) Het2為二聚Fc區的Fc部分；并且， (f) L2為包含連接Het2的氨基末端和Em的羧基末端的gly/ser肽的接頭部分；其中所述Hetl和Het2部分形成二聚Fc區；并且，其中所述蛋白酶可激活的FVII凝血因子Ac包含輕鏈（LC)和重鏈（HC)及插入所述LC 的羧基末端和所述HC的氨基末端之間的凝血酶裂解位點。
103. -種嵌合蛋白，包含式Ac-Ll-Hetl-X-Em-L2-Het2表示的從氨基末端到羧基末端的線性結構，其中： (a) Ac為蛋白酶可激活的FVII凝血因子； (b) Hetl為二聚Fc區的Fc部分； (c) Ll為包含連接Ac的羧基末端和Hetl的氨基末端的gly/ser肽的接頭部分； (d) X為連接Hetl的羧基末端和Em的氨基末端的可裂解scFc接頭； (e) Em為可溶性組織因子； (f) L2為包含連接Em的羧基末端和Het2的氨基末端的gly/ser肽的接頭部分；和 (g) Het2為二聚Fc區的Fc部分；其中所述Hetl和Het2部分形成二聚Fc區；其中所述蛋白酶可激活的FVII凝血因子Ac包含輕鏈（LC)和重鏈（HC)及插入所述LC 的羧基末端和所述HC的氨基末端之間的凝血酶裂解位點；并且其中所述cscFc可裂解接頭包含兩側為兩個PCSK5酶裂解位點的gly/ser肽，所述酶裂解位點為包含序列RRRR(SEQ ID N0:2)的氨基末端位點和包含序列（RKR)2(SEQ ID NO:3)的羧基末端位點。
104. -種生成嵌合蛋白的方法，包括表達編碼根據權利要求38-79中任一項所述的嵌合蛋白的核苷酸序列，其中所述scFc接頭由胞內加工酶在胞內裂解。
105. 根據權利要求104所述的方法，進一步純化所述嵌合蛋白。
106. 根據權利要求105所述的方法，其中所述嵌合蛋白具有兩條相互共價締合的多肽鏈。
【文檔編號】A61K38/36GK104427995SQ201380036553
【公開日】2015年3月18日申請日期:2013年6月7日優先權日:2012年6月8日
【發明者】喬·薩拉斯, 埃琳娜·基思塔諾娃, 洪吳鵬, 亞當·R·梅若, 羅伯特·彼得斯申請人:比奧根艾迪克Ma公司

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