一種協同抑癌的前列腺癌藥物組合物的制作方法
【專利摘要】目前學術界關于黃酮對腫瘤起促進還是抑制作用尚存在爭議，本發明公開了黃酮與雙氫睪酮在治療前列腺癌中的協同作用，即當存在體內正常濃度的雙氫睪酮時，黃酮才能正常發揮抑癌作用，本發明涉及生物工程【技術領域】。本發明通過體外雙報告技術、MTT技術以及Western?Blot檢測技術，證明黃酮與體內激素雙氫睪酮存在顯著的協同抑癌作用。黃酮和雙氫睪酮協同活化雌激素受體（ERβ）形成二聚體特異結合到p21WAF1/Cip1的啟動子上，上調p21蛋白表達，顯著影響細胞周期，促進前列腺癌細胞凋亡。因此，我們的發明提供了一種黃酮與雙氫睪酮協同治療前列腺癌的新型手段和分子機制。
【專利說明】一種協同抑癌的前列腺癌藥物組合物
【技術領域】
[0001]本發明公開了黃酮(Flavone)與雙氫睪酮(DHT)在治療前列腺癌中的協同作用，即當存在體內正常濃度的雙氫睪酮時，黃酮才能正常發揮抑癌作用，抑制前列腺癌增殖，并促進前列腺癌凋亡。本發明涉及生物工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]前列腺癌是嚴重威脅全世界男性健康的惡性腫瘤，為老年人疾病，研究表明環境和飲食因素是影響前列腺癌發生發展的重要因素。在亞洲國家，其發病率和死亡率明顯低于西方國家。相比西方國家，亞洲飲食中更多黃酮類物質的攝入引起了世界研究者的廣泛關注。
[0003]黃酮是類黃酮類植物雌激素的一種，關于黃酮對癌癥的作用學術界有兩種看法:有報道表明黃酮對包括前列腺癌在內的多種腫瘤具有顯著的預防作用，但也有報道顯示黃酮對包括前列腺癌在內的多種腫瘤細胞增殖呈現促進作用。
[0004]值得一提的是，前列腺癌是一種增齡性疾病，發病率隨著年齡增長而逐漸升高，而且前列腺癌是一種潛伏癌，80歲以上人群中可達40%，可能是由于年齡增加，體內雙氫睪酮水平下降導致，但雙氫睪酮與前列腺癌相關性及其分子機制尚不明確。前列腺癌早期治療采用摘除睪丸并給以雄激素拮抗劑的去勢治療，但是多數術后前列腺癌患者會病情復發，復發的原因和分子機制尚不明確，提示了雄激素可能的抗癌作用。
[0005]我們的研究發現黃酮與雙氫睪酮在治療前列腺癌中起協同作用，共同存在時發揮抑制前列腺癌的保護作用；且只有存在正常濃度的雙氫睪酮時，黃酮才能正常發揮對前列腺癌的抑癌作用，二者缺一不可。
【發明內容】
[0006]本發明公開了黃酮(Flavone)與雙氫睪酮(DHT)在治療前列腺癌中的協同作用，即當存在體內正常濃度的雙氫睪酮時，黃酮才能正常發揮抑癌作用，抑制前列腺癌增殖，并促進前列腺癌凋亡。
[0007]首先，以細胞周期重要調控基因P21WAF1MP1啟動子的轉錄活性為檢測指標，我們發現黃酮和雙氫睪酮具有激活p21WAF1/apl轉錄的協同作用。進一步，我們發現過表達ERβ放大這種協同效應，而ERa或AR沒有明顯作用。通過基因ERP過表達和基因沉默實驗，我們證明黃酮和雙氫睪酮協同活p21WAF1/eipl轉錄效應是通過ERi3的分子靶點實現的。蛋白質表達檢測表明，過表達ERi3顯著上調了 P21WAF1/Gipl的表達，而基因敲除ERi3則逆轉了這個作用。以上結果證明了黃酮和雙氫睪酮激活p21WAF1/eipl啟動子是通過ERP實現的。
[0008]通過MTT試驗，證明黃酮和雙氫睪酮協同抑制了前列腺癌DU145細胞的增殖，而且這種抑制作用可以被ERi3過表達所增強，被ERi3-shRNA所逆轉。采用碘化丙叮檢測細胞周期證明了黃酮和雙氫睪酮協同時，細胞出現亞Gl期細胞凋亡峰，細胞凋亡可以被ERβ過表達所增強，被ERi3-shRNA所逆轉。同時黃酮與雙氫睪酮的共刺激抑制了細胞增殖指標BcL2、PCNA的蛋白表達，促進了細胞凋亡指標CaSpaSe3活化型的發生，這種作用可被ERi1-ShRNA所逆轉。以上結果證明黃酮與雙氫睪酮激活ERi3后顯著抑制細胞增殖，并促進細胞凋亡。
[0009]本發明提供了一種治療前列腺癌的新型手段和分子機制，即黃酮與雙氫睪酮通過協同效應激活ERβ，上調細胞周期調控相關基因p21WAF1/eip1，實現前列腺癌中的治療作用。
【具體實施方式】:
[0010]p21ffAF1/Cipl是一種細胞周期蛋白(CyciinS)依賴激酶(CDKS)的抑制蛋白(CKI)，是調控細胞周期的基因。當DNA損傷和細胞衰老時，p53增多并誘導p21WAF1/eipl轉錄，p21WAF1/Cipl與相應的CDK-Cyclin復合物結合，抑制其蛋白激酶的激活，阻滯細胞周期的運行。目前p21ffAF1/Cipl的激活已經成為抗腫瘤藥物發現的重要分子靶點。
[0011]首先，利用p21WAFVapl激活的啟動子熒光素酶雙報告基因檢測系統，我們分別
比較了三種不同類黃酮分子-大豆苷元(daidzein)、染料木黃素(genistein)和黃酮
(flavone)，與雙氫睪酮(DHT河能激活p21WAF1/Gipl啟動子的協同作用。如圖1所示，以不加藥組為對照，我們發現單獨加入各激素時P21WAF1/eipl啟動子沒有被激活，但在黃酮和雙氫睪酮共刺激作用下，DU145細胞內的P21WAF1/Gipl啟動子則被顯著激活，而大豆苷元和染料木黃素沒有這種顯著的協同作用(圖1)。因此，該結果說明了黃酮和雙氫睪酮具有激活p21WAF1/Cipl啟動子的顯著協同作用且具有特異性。
[0012]接下來，為了證明 黃酮和雙氫睪酮的這種顯著的協同作用是通過哪種激素受體實現的，我們在DU145細胞里分別過表達了雌激素受體β (ERi3)，雌激素受體a (ERa)或雄激素受體(AR-WT)。如圖2所示，以加入vector組為對照，只有過表達ERP時黃酮和雙氫睪酮協同激活p21WAF1/eipl啟動子的作用被顯著放大，而過表達ERa或AR則削弱了這種協同作用。進一步采用基因干涉實驗沉默ER β后，我們發現ERi3不表達顯著逆轉了黃酮和雙氫睪酮對p21WAF1/eipl啟動子的激活作用(圖3)。蛋白質表達檢測表明，過表達ERi3顯著上調了 p21WAF1/eipl的表達，而基因敲除ERP則逆轉了這個作用(圖4)。以上實驗結果表明，黃酮和雙氫睪酮協同激活P21WAF1/eipl啟動子是通過ERi3實現的。
[0013]因為雄激素非依賴型前列腺癌細胞系DU145內僅表達ERi3，我們在DU145空細胞內加入黃酮和雙氫睪酮之后，分別在加藥當天、加藥第2天、第4天以及加藥第6天，檢測各組活細胞數目。我們發現，不加藥、只加入雙氫睪酮或只加入黃酮時細胞不斷增殖，但是黃酮和雙氫睪酮同時加入時從加藥第二天起就出現顯著的細胞增殖抑制現象(圖5)。因此說明，黃酮和雙氫睪酮協同作用顯著抑制細胞增殖。
[0014]通過過表達和基因沉默實驗，我們證明黃酮和雙氫睪酮協同抑癌效應是通過ERi3的分子靶點實現的。過表達ERi3時，黃酮和雙氫睪酮協同作用顯著抑制細胞增殖的作用被增強，而基因沉默ERi3則逆轉了這種作用(圖6)。說明黃酮和雙氫睪酮協同激活ERi3抑制細胞增殖。
[0015]采用碘化丙啶檢測細胞周期實驗進一步檢測了黃酮和雙氫睪酮對前列腺癌凋亡誘導的協同效應。我們發現，不加藥組、只加入雙氫睪酮組或只加入黃酮組，前列腺癌DU145細胞不出現凋亡峰，但是黃酮和雙氫睪酮同時加入時，細胞出現明顯的亞Gl期細胞凋亡峰(7.22%)，且過表達ERβ促使細胞凋亡峰面積增大(12.26%)，而基因沉默ERβ后細胞凋亡峰消失(圖7)。細胞周期檢測實驗的結果證實并確認了黃酮和雙氫睪酮協同激活ERi3促進前列腺癌細胞凋亡。
[0016]以上結果證明黃酮和雙氫睪酮通過ERi3協同抑制前列腺癌細胞增殖并促進前列腺癌細胞凋亡。最后，我們檢測了細胞增殖指標BcL2、PCNA以及細胞凋亡指標CaSpaSe3的表達情況。我們發現，在黃酮和雙氫睪酮的共同刺激下，細胞增殖標志物BcL2和PCNA的表達顯著降低，細胞凋亡標志物CaSpaSe3出現活化型，而基因沉默ERβ逆轉了這種作用(圖8)。
[0017]我們的研究發現黃酮與雙氫睪酮在治療前列腺癌中起協同作用，共同起保護作用，當存在體內正常濃度的雙氫睪酮時，黃酮才能正常發揮抑癌作用，二者缺一不可。黃酮和雙氫睪酮協同活化ERi3 二聚體，活化的ERi3 二聚體特異結合到P21WAF1/Gipl的啟動子上，上調p21WAF1/eipl蛋白表達，顯著影響細胞周期，促進前列腺癌細胞凋亡。因此，我們的發明提供了治療前列腺癌的新型分子機制，即黃酮與雙氫睪酮在治療前列腺癌中的協同作用，其中雌激素受體ERP為協同作用的靶點、細胞周期調控相關基因p21WAF1/eipl為協同作用的靶基因，我們的發明為前列腺癌的治療提供了新型分子靶向和新思路。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0018]圖1顯示黃酮和雙氫睪酮協同激活DU145細胞內P21WAF1/Gipl啟動子；
[0019]圖2顯示黃酮和雙氫睪酮通過ERβ協同激活DU145細胞內p21WAFlMpl啟動子；
[0020]圖3顯示基因沉默ERi3逆轉黃酮和雙氫睪酮對于DU145細胞內P21WAF1/Gipl的激活；
[0021]圖4顯示基因沉默ERi3降低黃酮和雙氫睪酮作用下DU145細胞內p21WAFVapl的表達；
[0022]圖5顯示黃酮和雙氫睪酮顯著協同抑制DU145細胞增殖；
[0023]圖6顯示黃酮和雙氫睪酮通過ER β抑制DU145細胞增殖；
[0024]圖7為碘化丙叮檢測細胞周期；
[0025]圖8為Western blot檢測細胞增殖指標BcL2和PCNA以及凋亡指標活化型caspase3。
【權利要求】
1.一種協同抑癌的藥物組合物，所述組合物包括:黃酮(Flavone)和雙氫睪酮(DHT)。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，黃酮(Flavone)和雙氫睪酮(DHT)在治療前列腺癌中的協同效應。
3.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中所述黃酮與雙氫睪酮發揮協同作用的靶點為 ER3。
4.根據權利要求1所述的藥物組合物，其中所述黃酮與雙氫睪酮發揮協同作用的靶基因為 p21WAF1/Cip1。
5.權利要求1所述的藥物組`合物在預防或治療前列腺癌中的應用。
【文檔編號】A61K31/5685GK103877098SQ201410003979
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年1月3日 優先權日:2014年1月3日
【發明者】李曉萌, 劉舒, 許瑩 申請人:東北師范大學