一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法及其用途
【專利摘要】本發明涉及一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法及其用途，包括以下步驟：A：甲醇提取；B：石油醚萃取；C：正丁醇萃取；D：硅膠柱分離：將第三步得到的正丁醇萃取物浸膏取75g用甲醇溶解，上硅膠柱，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，洗脫速度2～8mL/min；得棕黑色浸膏；E：Sephadex?LH-20柱色譜純化：棕黑色浸膏用甲醇溶解，Sephadex?LH-20柱色譜純化，CH2Cl2-甲醇梯度洗脫，洗脫速度2～8mL/min，得猴腿蹄蓋蕨多酚。本發明所涉猴腿蹄蓋蕨活性多酚提取方法提取率為12.29%，純度達到95%～99.9%，具有抗D-半乳糖致小鼠衰老作用。
【專利說明】一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法及其用途，屬于天然藥物領域。【背景技術】
[0002]隨著人口老齡化時代的來臨，衰老和老年性疾病已成為威脅人類健康的突出問題，人們對防治衰老、延年益壽有著迫切的要求，抗衰老藥物的開發和應用是解決這一問題的重要途徑。許多天然活性分子具有抗衰延壽作用，如番茄紅素、白藜蘆醇及茶多酚，已在醫藥、化妝品及食品等行業得到廣泛應用。天然抗衰老活性物質向人們展示了廣闊的應用前景。
[0003]猴腿蹄蓋蕨(Athyriummultidentatum(Doll.)Ching)系蹄蓋藏科(Athyriaceae)植物，又名多齒蹄蓋藏、猴腿菜、猴腿兒，是一種多年生蕨類植物，其拳狀嫩葉和根狀莖可食用，味道鮮美，風味獨特，是長白山地區一種重要的山野菜。猴腿蹄蓋蕨不僅可以食用，也可藥用，是一類重要的“藥、食兩用”蕨類植物。《中華本草》記載猴腿蹄蓋蕨味微苦、性涼，去須根莖入藥，煎服，具有清熱解毒、殺蟲之功效，主治蟲積腹痛，同時可預防流感、麻疹。其營養成分和藥用功效與蕨菜相當。經常食用可治療高血壓、頭暈、子宮出血、關節炎等癥。此外，猴腿蹄蓋蕨中含有豐富的賴氨酸，能促進骨骼發育和牙齒的形成，抑制病毒性感染等，對嬰幼兒、孕婦營養的補充有很大意義。
[0004]植物多酚是一類廣泛存在于植物體內的多元酚類化合物，具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多種功效，被人們譽為人類健康的“第7營養素”。文獻檢索尚未發現猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法及應用的論文及專利報道。王曉林，鐘方麗，薛健飛探索了猴腿蹄蓋蕨總多酚的超聲提取工藝條件(猴腿蹄蓋蕨總多酚的超聲提取工藝研究[J].廣東農業科學2013，13 =98-100, 119)，文獻中總多酚的提取采用65%乙醇在微沸狀態下超聲提取，多酚提取率為169.27mg/g，該方法提取的總多酚中含有大量雜質，多酚純度不高，同時加熱提取可能破壞活性多酚的結構。該文獻并未提到猴腿蹄蓋蕨活性多酚的化學組成和生物活性。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的制備方法。發明人采用溶劑冷浸，硅膠及Sephadex LH-20柱色譜純化的方法制備猴腿蹄蓋蕨水溶性多酚。利用該方法制備的猴腿蹄蓋蕨活性多酚純度可達90%以上，質量穩定可控。藥理學實驗表明本發明中制備的猴腿蹄蓋蕨活性多酚具有抗D-半乳糖致小鼠衰老作用。解決了現有猴腿蹄蓋蕨活性多酚提取過程中純度低、質量不可控、生物活性不明確等問題，填補了猴腿蹄蓋蕨活性多酚研究的空白。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為:
[0007]文獻調查顯示，猴腿蹄蓋蕨根莖為主要用藥部位。預實驗結果顯示，猴腿蹄蓋蕨根莖多酚含量較高，本發明以猴腿蹄蓋蕨根莖為材料提取多酚。[0008]一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法，包括以下步驟:
[0009]( I)猴腿蹄蓋蕨粗提物的制備:
[0010]A:甲醇提取:將猴腿蹄蓋蕨根莖粉碎，用甲醇室溫浸泡，過濾，合并濾液，濃縮，得甲醇提取物浸膏；
[0011]B:石油醚萃取:將得到的甲醇提取物浸膏用蒸餾水溶解，得到甲醇提取物浸膏溶液，然后用石油醚萃取，除去脂溶性成分，得到水溶液；
[0012]C:正丁醇萃取:將得到的水溶液用水飽和的正丁醇萃取，濃縮，得正丁醇萃取物
浸膏；
[0013](2)猴腿蹄蓋蕨活性多酚的純化:
[0014]D:硅膠柱分離:將得到的正丁醇萃取物浸膏取75g用甲醇溶解，上硅膠柱，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，洗脫速度2~8mL/min ;洗脫液依次為:石油醚/乙酸乙酯體積比為15~1:1的洗脫液20-30L、乙酸乙酯洗脫液10-15L、乙酸乙酯/甲醇體積比為15~6:1的洗脫液6-8L和乙酸乙酯/甲醇體積比為5:1的洗脫液6-8L，乙酸乙酯/甲醇體積比為1:1的洗脫液8-10L;收集乙酸乙酯洗脫液和乙酸乙酯/甲醇體積比為5:1的洗脫液，合并，減壓濃縮，得棕黑色浸膏；
[0015]E: Sephadex LH-20柱色譜純化:棕黑色浸膏用甲醇溶解,Sephadex LH-20柱色譜純化，CH2Cl2-甲醇梯度洗脫，洗脫速度2~8mL/min，洗脫液依次為:CH2C12洗脫液3-5L、CH2Cl2/甲醇體積比為15~1:1的洗脫液15-20L和甲醇洗脫液7-10L，收集甲醇洗脫液，濃縮，得猴腿蹄蓋蕨活性多酚。
[0016]進一步，本發明的一種優選方案:所述的甲醇提取具體為:稱取猴腿蹄蓋蕨粉碎根莖，按1:5~1:8料液比加入甲醇，室溫浸泡2~3次，I~3個月/次，期間時常攪動，過濾，合并濾液，濃縮，得到甲醇提取物浸膏。采用1:5~1:8料液比加入甲醇，室溫浸泡2~3次，I~3個月/次，采取這樣的提取方法一方面可以提高產率，另一方面可以降低提取成本。
[0017]進一步，本發明的一種優選方案:所述的甲醇提取物浸膏溶液的濃度為70_90mg/
mLo
[0018]進一步，本發明的一種優選方案:所述的石油醚萃取采用三次萃取，具體為第一次用甲醇提取物浸膏溶液體積1/3的石油醚，第二次用甲醇提取物浸膏溶液體積1/4的石油醚，第三次用甲醇提取物浸膏溶液體積1/6的石油醚。采用三次萃取，可以有效的提高產品純度，降低生產成本。
[0019]進一步，本發明的一種優選方案:所述的正丁醇萃取采用三次萃取，具體為第一次用甲醇提取物浸膏溶液體積1/3的正丁醇萃取，第二次用甲醇提取物浸膏溶液體積1/4的正丁醇萃取，第三次用甲醇提取物浸膏溶液體積1/6的正丁醇萃取。
[0020]進一步，本發明的一種優選方案:所述的濃縮采用真空濃縮，真空度0.1~0.08MPa，溫度為40~75°C。采用真空濃縮可以提高產品活性，提高產品收率。
[0021]另外本發明提供了一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的用途:猴腿蹄蓋蕨活性多酚在抗衰老藥物中的應用。
[0022]本發明的有益效果:
[0023]本發明的猴腿蹄蓋蕨活性多酚提取方法提取率為12.29%，純度達到95%~99.9%，所得猴腿蹄蓋蕨活性多酚為棕黑色固體，可在避光條件下室溫保存，其保存期不少于24個月。猴腿蹄蓋蕨活性多酚能溶于純水、正丁醇和甲醇，不溶于石油醚或乙醚，猴腿蹄蓋蕨活性多酹屬于無毒物。
[0024]本發明制備的猴腿蹄蓋蕨活性多酚在抗衰老有用途上的效劑量范圍為10~70mg/kg/d (D-半乳糖致衰老小鼠)。本文所用的術語“有效量”指治療劑治療、緩解或預防目標疾病或狀況的量，或是表現出可檢測的治療或預防效果的量。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型、健康狀況、病癥的性質和程度。因此，預先指定準確的有效量是沒用的。
[0025]為了本發明的目的，有效劑量為給予個體10~70mg/kg/d(D_半乳糖致衰老小鼠)的本發明猴腿蹄蓋蕨活性多酚。
[0026]本發明的猴腿蹄蓋蕨活性多酚，可將其直接給予對象。
[0027]藥理學實驗證明本發明的猴腿蹄蓋蕨活性多酚可以顯著抑制小鼠腦組織海馬區細胞凋亡，提高小鼠臟器指數，提高小鼠血清總超氧化物歧化酶(T-S0D)、肝臟組織過氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力，降低肝臟脂質過氧化產物丙二醛(MDA)含量。本發明的猴腿蹄蓋蕨活性多酚具有抗D-半乳糖致小鼠衰老作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1為本發明所制備的猴腿蹄蓋蕨活性多酚的紅外(IR)譜圖；
[0029]圖2為沒食子酸酸標準曲線；
[0030]圖3為腦組織切片HE染色圖。
【具體實施方式】
[0031]下面將結合本附圖和實施例，對本發的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0032]實施例1
[0033]一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法，包括以下步驟:
[0034]( I)猴腿蹄蓋蕨粗提物的制備:
[0035]A:甲醇提取:將5kg猴腿蹄蓋蕨根莖粉碎，按照1:6的料液比加入30kg甲醇，室溫浸泡2次，2個月/次，期間時常攪動，過濾，合并濾液，濃縮，所述的濃縮采用真空濃縮，真空度0.1MPa，溫度40°C，得190g甲醇提取物浸膏，產率3.8% ；
[0036]B:石油醚萃取:將得到的甲醇提取物浸膏用2.4L蒸餾水溶解，得到79mg/mL的甲醇提取物浸膏溶液，然后用1.8L石油醚萃取,石油醚萃取采用三次萃取,具體為800mL/第一次，600mL/第二次，400mL/第三次，除去脂溶性成分，得到水溶液；
[0037]C:正丁醇萃取:將得到的水溶液用1.8L水飽和的正丁醇萃取，正丁醇萃取采用三次萃取，具體為800mL/第一次，600mL/第二次，400mL/第三次，采用真空濃縮，真空度0.1MPa，溫度為60V，得94g正丁醇萃取物浸膏，產率49.47%。
[0038](2)猴腿蹄蓋蕨活性多酚的純化:[0039]D:硅膠柱分離:將得到的正丁醇萃取物浸膏取75g用甲醇溶解，上硅膠柱，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，洗脫速度6mL/min ;洗脫液依次石油醚/乙酸乙酯體積比為5:1的洗脫液13L，石油醚/乙酸乙酯體積比為1:1的洗脫液12L，乙酸乙酯洗脫液10.65L，乙酸乙酯/甲醇體積比為10:1的洗脫液6.075L;乙酸乙酯/甲醇體積比為5:1的洗脫液7.5L，乙酸乙酯/甲醇體積比為1:1的洗脫液8L，收集乙酸乙酯洗和乙酸乙酯/甲醇體積比為5:1的洗脫組分，合并，濃縮，所述的濃縮采用真空濃縮，真空度0.1MPa，溫度為45°C，得到20.75g棕黑色浸膏，產率為27.67% ；
[0040]E: Sephadex LH-20柱色譜純化:將棕黑色浸膏20.75g用7mL甲醇溶解,SephadexLH-20柱色譜純化，洗脫流速3mL/min，CH2Cl2和甲醇梯度洗脫，具體為=CH2Cl2洗脫液
3.25L ；CH2Cl2/甲醇體積比為15:1的洗脫液7.85L ；CH2Cl2/甲醇體積比為4:1的洗脫液
7.05L,甲醇洗脫液7.6L ;收集甲醇洗脫組分，濃縮。所述的濃縮采用真空濃縮，真空度0.09MPa，溫度45。。，得2.55g棕黑色固體，產率12.29%。
[0041]實施例2
[0042]一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法，包括以下步驟:
[0043]( I)猴腿蹄蓋蕨粗提物的制備:
[0044]A:甲醇提取:將5kg猴腿蹄蓋蕨根莖粉碎，按照1:5的料液比加入25kg甲醇，室溫浸泡3次，I個月/次，期間時常攪動，過濾，合并濾液，濃縮，所述的濃縮采用真空濃縮，真空度0.08MPa，溫度45。。，得187g甲醇提取物浸膏，產率3.74% ；
[0045]B:石油醚萃取:將得到的甲醇提取物浸膏用2.64L蒸餾水溶解，得到71mg/mL的甲醇提取物浸膏溶液，然后用1.98L石油醚萃取,石油醚萃取采用三次萃取,具體為880mL/第一次，660mL/第二次，440mL/第三次，除去脂溶性成分，得到水溶液；
[0046]C:正丁醇萃取:將得到的水溶液用1.98L水飽和的正丁醇萃取，正丁醇萃取采用三次萃取，具體為880mL/第一次，660mL/第二次，440mL/第三次，采用真空濃縮，真空度
0.09MPa，溫度為60°C，得93g正丁醇萃取物浸膏，產率49.43%。猴腿蹄蓋蕨活性多酚的純化的步驟與實施例1相同，得到20.6g棕黑色浸膏，產率為27.46%, 2.51g棕黑色固體，產率
12.18%。
[0047]實施例3
[0048]一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法，包括以下步驟:
[0049]( I)猴腿蹄蓋蕨粗提物的制備:
[0050]A:甲醇提取:將5kg猴腿蹄蓋蕨根莖粉碎，按照1:8的料液比加入40kg甲醇，室溫浸泡2次，2個月/次，期間時常攪動，過濾，合并濾液，濃縮，所述的濃縮采用真空濃縮，真空度0.09MPa，溫度50°C，得191g甲醇提取物浸膏，產率3.82% ；
[0051]B:石油醚萃取:將得到的甲醇提取物浸膏用2.1L蒸餾水溶解，得到91mg/mL的甲醇提取物浸膏溶液，然后用1.575L石油醚萃取,石油醚萃取采用三次萃取,具體為700mL/第一次，525mL/第二次，350mL/第三次，除去脂溶性成分，得到水溶液；
[0052]C:正丁醇萃取:將得到的水溶液用1.575L水飽和的正丁醇萃取，正丁醇萃取采用三次萃取，具體為700mL/第一次，525mL/第二次，350mL/第三次，采用真空濃縮，真空度
0.1MPa,溫度為65°C，得95.5g正丁醇萃取物浸膏，產率50%。猴腿蹄蓋蕨活性多酚的純化步驟與實施例1相同，得到20.4g棕黑色浸膏，產率為27.2%, 2.52g棕黑色固體，產率12.35%。[0053]實施例4
[0054]一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法，包括以下步驟:
[0055](I)猴腿蹄蓋蕨粗提物的制備與實施例2相同，
[0056](2)猴腿蹄蓋蕨活性多酚的純化:
[0057]D:硅膠柱分離:將得到的正丁醇萃取物浸膏取75g用甲醇溶解，上硅膠柱，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，洗脫速度2mL/min ;洗脫液依次石油醚/乙酸乙酯體積比為5:1的洗脫液10L，石油醚/乙酸乙酯體積比為1:1的洗脫液10L，乙酸乙酯洗脫液10L，乙酸乙酯/甲醇體積比為10:1的洗脫液6L ;乙酸乙酯/甲醇體積比為5:1的洗脫液8L，乙酸乙酯/甲醇體積比為1:1的洗脫液9L，收集乙酸乙酯洗和乙酸乙酯/甲醇體積比為5:1的洗脫組分，合并，濃縮，所述的濃縮采用真空濃縮，真空度0.08MPa,溫度為50°C，得到20g棕黑色浸膏，產率為26.67% ；
[0058]E =Sephadex LH-20柱色譜純化:將棕黑色浸膏20g用7mL甲醇溶解，SephadexLH-20柱色譜純化，洗脫流速2mL/min，CH2Cl2和甲醇梯度洗脫，具體為=CH2Cl2洗脫液3L ；CH2Cl2/甲醇體積比為15:1的洗脫液7.85L ；CH2Cl2/甲醇體積比為4:1的洗脫液7.05L,甲醇洗脫液7.6L ;收集甲醇洗脫組分，濃縮。所述的濃縮采用真空濃縮，真空度
0.09MPa，溫度50。。，得2.5g棕黑色固體，產率12.5%。
[0059]實施例5
[0060]一種猴腿蹄蓋蕨 活性多酚的提取方法，包括以下步驟:
[0061](I)猴腿蹄蓋蕨粗提物的制備與實施例3相同，
[0062](2)猴腿蹄蓋蕨活性多酚的純化:
[0063]D:硅膠柱分離:將得到的正丁醇萃取物浸膏取75g用甲醇溶解，上硅膠柱，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，洗脫速度4mL/min ;洗脫液依次石油醚/乙酸乙酯體積比為5:1的洗脫液16L，石油醚/乙酸乙酯體積比為1:1的洗脫液14L，乙酸乙酯洗脫液12L，乙酸乙酯/甲醇體積比為10:1的洗脫液8L ;乙酸乙酯/甲醇體積比為5:1的洗脫液6L，乙酸乙酯/甲醇體積比為1:1的洗脫液10L，收集乙酸乙酯洗和乙酸乙酯/甲醇體積比為5:1的洗脫組分，合并，濃縮，所述的濃縮采用真空濃縮，真空度0.09MPa，溫度為60°C，得到20.3g棕黑色浸膏，產率為26.67% ；
[0064]E:Sephadex LH-20柱色譜純化:將棕黑色浸膏20.3g用7mL甲醇溶解，SephadexLH-20柱色譜純化，洗脫流速6mL/min，CH2Cl2和甲醇梯度洗脫，具體為=CH2Cl2洗脫液5L ；CH2Cl2/甲醇體積比為15:1的洗脫液7L ；CH2C12/甲醇體積比為4:1的洗脫液7L，甲醇洗脫液IOL ;收集甲醇洗脫組分，真空濃縮，真空度0.08MPa，溫度50°C，得2.49g棕黑色固體，產率 12.26%ο
[0065]猴腿蹄蓋蕨活性多酚質量控制
[0066]本發明中的猴腿蹄蓋蕨活性多酚主要通過顯色反應和IR譜圖及含量測定進行質量控制，測定方法描述如下。
[0067]1、猴腿蹄蓋蕨活性多酚顯色反應
[0068]分別取本發明實施例1-5制備的棕黑色固體10mg，用25mL蒸餾水溶解，取ImL該溶液分別進行多酚類物質顯色反應:實施例1-5所制備的棕黑色固體均與明膠-NaCl溶液反應產生白色沉淀，與1%三氯化鐵反應呈藍黑色。棕黑色固體多酚類物質顯色反應呈陽性，說明棕黑色固體是猴腿蹄蓋蕨活性多酚。
[0069]2、猴腿蹄蓋蕨活性多酚IR譜圖測定
[0070]本發明實施例1制備的猴腿蹄蓋蕨活性多酚紅外譜圖測定采用KBr壓片法。IR譜圖見圖1。IR譜圖中 1610.56,1521.48,1448.54,1111.00 和 767.67cm_1 處有 5 個明顯的多酚類成分特征峰。IR譜圖進一步明確本發明實施例1中制備的棕黑色固體為猴腿蹄蓋蕨活性多?K其它實施例的IR譜圖與實施例1的相同，不再提供。
[0071]3、猴腿蹄蓋蕨活性多酚含量測定
[0072]猴腿蹄蓋蕨活性多酚含量采用福林酚試劑比色法測定，具體方法描述如下。
[0073](I)對照品溶液的配制及標準曲線繪制
[0074]精密稱取沒食子酸(上海融禾醫藥科技有限公司)10mg，置于25mL容量瓶中，蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻。精密移取沒食子酸對照品溶液0、0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6、
0.7mL，分別置于IOmL具塞刻度試管中，依次加入0.2mL福林酚試劑，混勻，振蕩lmin，0.2mL新鮮配制的10%Na2C03,振蕩30s,最后蒸懼水定容至5mL,搖勻,放置20min。以OmL管為參比，760nm波長處比色，測定系列沒食子酸對照品溶液吸光度值。測定標準曲線見圖2。以吸光度對沒食子酸濃度(μ g/mL)進行線性回歸，得回歸方程Y=0.065X-0.0084，r=0.9945。線性范圍4~28yg/mL。
[0075](2)樣品多酚含量測定
[0076]精密稱取本發明實施例中制備的棕黑色固體10mg，用蒸餾水溶解并定容至10mL，得濃度為lOmg/mL的樣品溶液。精密移取樣品溶液0.05mL，按標準曲線繪制項下方法，自置于IOmL具塞刻度試管中起，至用蒸餾水定容至5mL，760nm波長處比色，依法測定吸光度值，根據回歸方程計算本發明的猴腿蹄蓋蕨活性多酚含量，實施例1-5的猴腿蹄蓋蕨活性多酚含量依次為 99.5%, 99.6%, 99.8%, 99.9% 和 99.8%。
[0077]猴腿蹄蓋蕨活性多酚抗D-半乳糖致小鼠衰老作用
[0078]1、實驗材料
[0079](I)實驗藥品
[0080]D-半乳糖:取0.4g D-半乳糖用0.9%生理鹽水溶解并定容至20mL，濃度為20mg/
mLo
[0081]維生素E:取維生素E丸(3.8mg維生素E/丸)刺破膠囊后，擠出內容物，加入蒸餾水，配成5mg/mL的溶液,用時搖勻。
[0082]多酚:本實驗使用的猴腿蹄蓋蕨活性多酚是按實施例1所示方法制備的，多酚含量為99.5%，該多酚用蒸餾水溶解，配成5mg/mL的溶液，現用現配。
[0083](2)實驗動物
[0084]昆明種小鼠(30周齡)，清潔級，體重50±2g，25°C恒溫恒濕條件下飼養，明暗周期12h，自由飲水給食。
[0085]2、小鼠衰老模型的建立
[0086]( I)動物模型建立
[0087]小鼠適應性飼養3天，除空白組外，其余均按100mg/kg/d劑量腹腔注射D-半乳糖50天，腦組織切片HE染色觀察，與空白組相比較，小鼠腦組織海馬區結構異常，細胞顯著變性壞死視為造模成功。[0088](2)動物分組及給藥
[0089]小鼠隨機分為6組:空白對照組、D-半乳糖組、維生素E組、多酚低劑量組、多酚高劑量組，各組雌雄各半，分籠飼養。
[0090]維生素E組及多酚組腹腔注射D-半乳糖16天后，在腹腔注射D-半乳糖的同時，每日I次灌胃給藥，分別為維生素E組25mg/kg，多酚低劑量組30mg/kg，多酚高劑量組60mg/kg，連續灌胃給藥34天。D-半乳糖組腹腔注射D-半乳糖100mg/kg，空白對照組腹腔注射等體積生理鹽水，16天后D-半乳糖組及空白對照組分別灌胃等體積蒸餾水。
[0091]各組動物均根據當日體重給藥。
[0092]( 3 )動物標本采集
[0093]小鼠于末次給藥12h后，摘眼球取血，低溫離心(3000r/min，4°C，IOmin)，分離血清，放入1.5mL EP管中，-20°C冰箱保存，以待相關生化指標測定。小鼠取完血后，立即脫臼處死，快速摘取心臟、肝臟和腦組織，分別用生理鹽水沖凈血液，吸干水分，稱重，按公式計算臟器指數。
[0094]臟器指數(mg/g) =臟器質量(mg)/個體質量(g)
[0095]分別取空白對照組、D-半乳糖組、多酚低劑量組、多酚高劑量組小鼠的腦組織，放入10%甲醛溶液中，腦組織切片HE染色觀察海馬區細胞形態學變化。小鼠肝臟精密稱重并盡快剪碎，與冷生理鹽水按1:9體積比混合,冰浴條件下機械勻衆5~6min, 3000r/min低溫離心lOmin，分離上清液，制備10%的肝組織勻漿。
[0096]采用紫外可見分光光度計按照各試劑盒說明書測定肝組織谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活力及丙二醛(MDA)含量。肝組織蛋白含量采用蛋白定量測試盒測定。血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力采用黃嘌呤氧化酶法測定。
[0097](4)實驗結果采用SPSS11.0統計分析軟件進行統計分析，實驗數據均以(;±S)
表示，組間比較用t檢驗法。
[0098]3、實驗結果
[0099]( I)腦組織切片HE染色觀察
[0100]小鼠腦組織切片HE染色結果如圖3所示。腦組織切片HE染色結果顯示正常組小鼠腦組織切片海馬區細胞數目正常，形態結構完整清晰，細胞排列整齊，層次清楚。模型組切片海馬區結構模糊，細胞數目減少，細胞體積減小而且表面扭曲不平，細胞核呈固縮狀，染色后呈棕褐色，說明有部分細胞變性壞死。HE染色結果顯示D-半乳糖致小鼠衰老模型成功建立。多酚低劑量組和高劑量組海馬區細胞變性壞死均減輕，細胞形態正常，結構清晰。猴腿蹄蓋蕨活性多酚可以顯著減少D-半乳糖致小鼠腦組織海馬區細胞凋亡，具有抗衰老作用。
[0101](2)臟器指數
[0102]小鼠給藥前后臟器指數實驗結果列于表1中。
[0103]表1小鼠臟器指數(X ± s’ η = 10)
[0104]
【權利要求】
1.一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)猴腿蹄蓋蕨粗提物的制備: A:甲醇提取:將猴腿蹄蓋蕨根莖粉碎，用甲醇室溫浸泡，過濾，合并濾液，濃縮，得甲醇提取物浸膏； B:石油醚萃取:將得到的甲醇提取物浸膏用蒸餾水溶解，得到甲醇提取物浸膏溶液，然后用石油醚萃取，除去脂溶性成分，得到水溶液； C:正丁醇萃取:將得到的水溶液用水飽和的正丁醇萃取，濃縮，得正丁醇萃取物浸膏； (2)猴腿蹄蓋蕨活性多酚的純化: D:硅膠柱分離:將得到的正丁醇萃取物浸膏取75g，用甲醇溶解，上硅膠柱，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，洗脫速度2~8mL/min ;洗脫液依次為:石油醚/乙酸乙酯體積比為15~1:1的洗脫液20~30L、乙酸乙酯洗脫液10~15L、乙酸乙酯/甲醇體積比為15~6:1的洗脫液6~8L和乙酸乙酯/甲醇體積比為5:1的洗脫液6~8L，乙酸乙酯/甲醇體積比為1:1的洗脫液8~IOL ;收集乙酸乙酯洗脫液和乙酸乙酯/甲醇體積比為5:1的洗脫液，合并，減壓濃縮，得棕黑色浸膏； E =Sephadex LH-20柱色譜純化:將棕黑色浸膏用甲醇溶解，S^)hadex LH-20柱色譜純化，CH2Cl2-甲醇梯度洗脫，洗脫速度2~8mL/min，洗脫液依次為=CH2Cl2洗脫液3~5L、CH2Cl2/甲醇體積比為15~1:1的洗脫液15~20L和甲醇洗脫液7~10L，收集甲醇洗脫液，濃縮，得猴腿蹄蓋蕨活性 多酚。
2.根據權利要求1所述的一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法，其特征在于:所述的甲醇提取具體為:稱取猴腿蹄蓋蕨粉碎根莖，按1:5~1:8料液比加入甲醇，室溫浸泡2~3次，I~3個月/次，期間時常攪動，過濾，合并濾液，濃縮，得到甲醇提取物浸膏。
3.根據權利要求1所述的一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法，其特征在于:所述的甲醇提取物浸膏溶液的濃度為70-90mg/mL。
4.根據權利要求1所述的一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法，其特征在于:所述的石油醚萃取采用三次萃取，具體為第一次用甲醇提取物浸膏溶液體積1/3的石油醚，第二次用甲醇提取物浸膏溶液體積1/4的石油醚，第三次用甲醇提取物浸膏溶液體積1/6的石油醚。
5.根據權利要求1所述的一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法，其特征在于:所述的正丁醇萃取采用三次萃取，具體為第一次用甲醇提取物浸膏溶液體積1/3的正丁醇萃取，第二次用甲醇提取物浸膏溶液體積1/4的正丁醇萃取，第三次用甲醇提取物浸膏溶液體積1/6的正丁醇萃取。
6.根據權利要求1所述的一種猴腿蹄蓋蕨活性多酚的提取方法，其特征在于:所述的濃縮采用真空濃縮，真空度0.1~0.08MPa，溫度為40~75V。
7.權利要求1-6任一項所制備的猴腿蹄蓋蕨活性多酚在制備治療抗衰老藥物中的應用。
【文檔編號】A61K36/11GK103784483SQ201410024972
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月20日 優先權日:2014年1月20日
【發明者】盛繼文 申請人:濰坊醫學院