Irf9在支架及內膜剝脫術后再狹窄中的功能及其抑制劑的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種IRF9在支架及內膜剝脫術后再狹窄中的功能及其抑制劑的應用，屬于基因的功能與應用領域。本發明以IRF9基因敲除小鼠和野生型C57小鼠為實驗對象，通過血管損傷模型，進行了小鼠內膜新生、血管壁細胞增殖水平和平滑肌細胞表型的檢測，結果表明與野生型C57小鼠對比，IRF9基因敲除小鼠表現出抑制內膜新生及細胞增殖。這提示一種IRF9基因在支架及內膜剝脫術后再狹窄中的功能，主要體現在IRF9基因具有促進內膜新生及細胞增殖的功能。針對IRF9的上述功能，IRF9可作為藥物靶標用于篩選治療血管狹窄疾病的藥物，IRF9的抑制劑可用于制備治療支架及內膜剝脫術后再狹窄的藥物。
【專利說明】IRF9在支架及內膜剝脫術后再狹窄中的功能及其抑制劑的應用
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬于基因的功能與應用領域，涉及一種IRF9在支架及內膜剝脫術后再狹窄中的功能及其抑制劑的應用。
【背景技術】
[0003]在目前中國，隨著飲食結構的變化和人口的老齡化進程，動脈粥樣硬化閉塞性病變呈現逐年增高的趨勢并成為我們國家主要的致死原因之一。目前對這類疾病尚無根治辦法，血管外科的治療手段包括球囊擴張、支架置入及動脈旁路等方式，但是血管重建后再狹窄極大地影響了治療效果。有關血管再狹窄的研究已進行了多年，但是迄今為止還沒有明確。已有研究表明，在損傷形成的過程中，新生內膜及中膜組織過度增生以及同時伴隨的細胞外基質形成，是造成再狹窄的主要病理基礎。生理狀態下，血管內皮細胞(vascularendothelialcell, EC)可以產生多種促進與抑制血管平滑肌細胞(vascular smoothmuscel cell，VSMC)生長的物質，且兩者保持動態平衡，維持VSMC處于相對靜化狀態。促進VSMC生長的物質主要有血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF),內皮素(endomthelin,ET),和血管緊張素U (angiotonin II,Ang II )等，而抑制VSMC增殖的物質主要有批氮(nitrogen monoxidum, NO),前列腺環素(prostacyclin, PG12)等。在血管內皮損傷后，促進VSMC增殖的生長因子增多而抑制VSMC增殖的因子減少，這種動態平衡被打破，導致VSMC大量的增殖。
[0004]血管的內膜新生是血管在各種損傷因素刺激下發生的病理改變，是多種心血管系統疾病共有的病理過程。血管壁中的平滑肌細胞在這個過程中起著重要的作用，它的增殖、凋亡和表型改變在內膜增生的過程中扮演著重要的角色。血管損傷后，血管平滑肌細胞由中膜向內膜遷移，平滑肌細胞的增殖凋亡失平衡，表型由收縮型向合成型轉變，血管壁不適重塑，從而引起內膜增生。近年來，對于內膜增生過程中信號傳導通路的研究越來越引起人們的關注。
[0005]對這類疾病目前尚無根治方法，血管外科的主要治療手段是閉塞段血管重建，包括球囊擴張、支架置入以及動脈旁路手術等，但是血管重建后再狹窄的發生率較高(30%~60%)，極大地影響了治療效果，迄今為止血管重建后再狹窄依然是一個臨床難題。
[0006]IRF9 (interferon regulatory factor 9, IRF9)又稱為 P48、ISGF3 y(IFN-stimulated gene factor 3 y ) ?目前有IRF-9的研究主要集中在抗病毒，IRF-9和HBV (乙型肝炎病毒)干擾素刺激應答元件樣結構域結合后，其表達迅速上調可以增強IFN-a誘導的HBV mRNA水平的顯著抑制。最近有報道，小鼠在IRF9基因敲除(Knockout，K0)后，表現為增加小腸粘液和淋巴結里的T細胞及中性粒細胞數目，這提示IRF9與炎癥有著密切聯系。
【發明內容】
[0007]為解決上述現有技術的缺陷和不足，本發明的目的在于提供一種IRF9及其抑制劑在制備治療支架及內膜剝脫術后再狹窄藥物中的應用。
[0008]本發明的目的通過下述技術方案實現:
本發明以野生型C57小鼠與IRF9基因敲除小鼠(IRF9-K0小鼠)為實驗對象，通過頸動脈導絲損傷模型誘導獲得小鼠血管損傷模型(vascular injury, VI),進行了血管損傷模型(VI)小鼠內膜新生測定、血管壁細胞增殖水平的檢測和平滑肌細胞表型的檢測的研究，結果表明:與野生型C57小鼠對比，IRF9基因敲除小鼠表現出內膜新生及細胞增殖明顯低于WT小鼠；IRF9基因敲除可以抑制細胞增殖核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)和細胞周期蛋白(Cyclin Dl)的表達，可抑制平滑肌細胞的增殖和內膜增生；IRF9基因敲除可以促進平滑肌細胞分化特異性抗原(Smoothelin)、平滑肌肌動蛋白(SmoothMuscle Actin, SMA)和平滑肌 22 a (smooth muscle 22 alpha, SM22 a )的表達,抑制骨橋蛋白(osteopontin,0PN)的表達,可抑制平滑肌細胞由收縮型向合成型的表型轉換,從而抑制內膜增生。上述結果提示IRF9基因敲除會改善血管再狹窄的發生，IRF9基因能夠促進支架及內膜剝脫術后再狹窄的發生。
[0009]一種IRF9基因的新功能，具體體現在IRF9具有在支架及內膜剝脫術后再狹窄中促進內膜新生及細胞增殖的功能。
[0010]針對IRF9具有促進內膜新生及細胞增殖的功能，提供IRF9作為藥物靶標在篩選治療血管狹窄疾病的藥物中的應用。
[0011]針對IRF9具有促進內膜新生及細胞增殖的功能，提供IRF9作為藥物靶標在篩選治療支架后再狹窄的藥物中的應用。
[0012]針對IRF9具有促進內膜新生及細胞增殖的功能，提供IRF9作為藥物靶標在篩選治療內膜剝脫術后再狹窄的藥物中的應用。
[0013]針對IRF9具有促進內膜新生及細胞增殖的功能，提供IRF9的抑制劑在制備治療血管狹窄疾病的藥物中的應用。
[0014]一種治療血管狹窄疾病的藥物，包含IRF9的抑制劑。
[0015]針對IRF9的上述功能，提供IRF9的抑制劑在制備治療支架后再狹窄的藥物中的應用。
[0016]一種治療支架后再狹窄的藥物，包含IRF9的抑制劑。
[0017]針對IRF9的上述功能，提供IRF9的抑制劑在制備治療內膜剝脫術后再狹窄的藥物中的應用。
[0018]一種治療內膜剝脫術后再狹窄的藥物，包含IRF9的抑制劑。
[0019]所述的IRF9的抑制劑優選為IRF9基因的siRNA、IRF9基因的RNA干擾載體、IRF9的抗體及其他能夠抑制IRF9表達的抑制劑中的一種。
[0020]在本發明研究中，野生型小鼠和IRF9-K0小鼠在血管損傷模型(VI)的誘導下均發生血管損傷，與野生型小鼠相比，IRF9-K0小鼠內膜新生及細胞增殖受到抑制。這些結果提示，IRF9對促進內膜新生及細胞增殖具有強大的影響，具有促進血管狹窄和支架及內膜剝脫術后再狹窄形成的能力。本發明證明了 IRF9基因在血管損傷疾病模型中有著重要的惡化作用。
[0021]本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:
(I)本發明發現IRF9基因的新功能，即IRF9基因具有促進支架及內膜剝脫術后再狹窄的作用。
[0022](2)基于IRF9在促進支架及內膜剝脫術后再狹窄中的作用，IRF9的抑制劑可用于制備治療支架及內膜剝脫術后再狹窄的藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1是WT和IRF9-K0小鼠的HE染色及內膜面積結果統計柱狀圖；其中，A:HE染色圖(K0代表1RF9-K0小鼠)，B:柱狀圖。
[0024]圖2是WT和IRF9-K0小鼠術后14d、28d血管壁細胞增殖水平標志物PCNA、CyclinDl表達的免疫熒光染色及結果統計柱狀圖；其中，A:免疫熒光染色，B:柱狀圖。
[0025]圖3是WT和IRF9-K0小鼠術后14d、28d平滑肌細胞表型標志物Smoothelin、SMA、SM22a和OPN表達的免疫熒光染色及結果統計柱狀圖；其中，A:免疫熒光染色，B:柱狀圖。
【具體實施方式】
[0026]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0027]實驗用動物及飼養:
實驗動物種屬，性別，周齡及來源:C57BL/6小鼠(WT小鼠)和IRF9基因敲除小鼠(IRF9-K0小鼠)，雄性，8-10周齡，體重24-27g，C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司；IRF9基因敲除小鼠(IRF9-K0，C57BL/6J背景)購自RIKEN BRC公司，BRC編號:RBRC00916。
[0028]動物飼養及環境條件:所有的實驗小鼠均飼養在武漢大學心血管病研究所SPF級動物房(許可證號=SYXK (鄂):2009-0053)。每12小時交替照明，溫度24±2°C，濕度40%-70%，小鼠自由飲水進食。
[0029]實施例1小鼠血管損傷模型(VI)獲得
1.實驗動物分組:使用8-10周齡，體重24-27g的WT和IRF9-K0小鼠，共分為四組:WT血管損傷組；WT假手術組；IRF9-K0血管損傷組；IRF9-K0假手術組，每組各60只小鼠。分別在手術后7天、14天、28天每組各處死20只小鼠，取損傷節段血管進行分析。
[0030]2.小鼠血管損傷模型操作流程:
I)用電子天平于動態模式下準確稱取小鼠體重(g)，用雙蒸水準確配置3%戊巴比妥鈉溶液，輕輕搖動使其充分溶解，采用80mg/kg體重劑量，計算所需戊巴比妥鈉溶液體積后用ImL注射器準確抽取相應體積溶液，行腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠充分麻醉倒(約3min)后，8%硫化鈉頸部脫毛。
[0031]2)分離頸內和頸外動脈。
[0032]3)在頸內動脈和頸外動脈分叉處用8-0線結扎頸外動脈，同時用血管夾(WPI，501784-G)暫時性阻斷頸內動脈及頸總動脈供血。
[0033]4)用顯微剪(WPI，501839)在頸外動脈結扎線的上方橫向剪一個小口。經此血管切口插入直徑 0.015 英寸的導絲(N0.C-SF-15-15, Cook, Bloomington, Indiana),旋轉導絲進退5-6次。
[0034]5)在切口近心端結扎頸外動脈，松開頸內及頸總動脈置留的血管夾，剪斷線頭，清理術野，縫合頸部切口(假手術除不進行導絲插入和旋轉進退以外，其他操作均相同)。
[0035]實施例2血管損傷模型(VI)小鼠內膜新生測定
1.小鼠取材
I)麻醉小鼠，剪破心臟放血。
[0036]2)從頸動脈近分叉處剪下頸動脈，取0.5-0.6cm長，保留頸外動脈線結。
[0037]3)將頸動脈放入PBS中，用顯微鑷輕柔排干管腔內的殘血。
[0038]4)將血管放入裝有ImL 4%多聚甲醛的1.5mL EP管中固定。
[0039]2.病理學檢測
2.1制備石臘標本切片
由實驗室專業病理工作人員制備石蠟標本切片，主要操作程序包括修剪心臟一包埋框處理一流水沖洗一脫水一透明一浸蠟一包埋一切片(3 ym)—攤片一晾干或烘烤后備用。
[0040]2.2蘇木精-伊紅( HE)染色
主要步驟為:55 °C烘烤30min — 二甲苯5min，3次一100%酒精Imin — 95%酒精Imin — 70%酒精Imin —雙蒸水Imin —蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021) 5min —水洗Imin — 1%鹽酸酒精(取3mL濃鹽酸與297mL 70%酒精充分混合均勻)l_3s —水洗Imin — Scott液(碳酸氫鈉0.35g,硫酸鎂2g,蒸懼水100mL)lmin —水洗Imin —伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024)3-5min —蒸餾水洗去浮色一70%酒精Is — 95%酒精Is — 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通風櫥內吹干，顯微鏡拍照。
[0041]以血管內彈力纖維和外彈力纖維為界，內彈力板以內為血管內膜，外彈力板以外為血管外膜，內外彈力板之間為血管中膜。用Image-Pro Plus 6.0軟件分別圈各血管管腔面積。
[0042]內膜面積大小的計算參照公式如下:
新生內膜面積=內彈力板面積-管腔面積；
中膜面積=外彈力板面積_內彈力板面積。
[0043]小鼠HE染色后的血管內膜新生的結果如圖1。通過HE染色可以觀察到，假手術組(Sham組)血管壁結構完整，排列整齊，血管內膜為單層內皮細胞，結構完整，中膜平滑肌細胞排列整齊。血管損傷組(VI組)血管壁結構不完整，血管內皮細胞缺失，新生內膜增生明顯，并伴有大量炎細胞浸潤；IRF9-K0組在術后14d新生內膜面積明顯比WT小鼠要低，這種保護作用在術后28d更明顯。同樣，內膜面積/中膜面積的比值在VI術后IRF9-K0組要低于WT組，這種作用在28d要更顯著。
[0044]實施例3血管壁細胞增殖水平的檢測
免疫突光染色檢測細胞增殖核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)、細胞周期蛋白(Cyclin Dl)的表達。所需一抗信息:PCNA (#2586; 1:100; mouse;Cell Signaling Technology), cyclin Dl (#2978; 1:25; rabbit; Cell SignalingTechnology);所需二抗信息:Alexa Fluor 568-conjugated goat ant1-rabbit IgG(A11011; Invitrogen, Carlsbad, CA), Alexa Fluor 568-conjugated goat ant1-mouseIgG (Al1004; Invitrogen, Carlsbad, 150 d, CA)。
[0045]主要步驟為:
1)烤片:將石蠟切片置于烤箱中30min以上。
[0046]2)脫蠟:二甲苯 5minX3。
[0047]3)水合:100% 乙醇 5minX2 ；95% 乙醇 5min ；70% 乙醇 5min ；ddH20 浸洗 5minX2。
[0048]4)檸檬酸鹽組織抗原修復(高壓修復):取一定量的pH6.0檸檬酸鹽抗原修復工作液于修復盒中，修復工作液的量必須能足夠浸沒整張切片，將修復盒放入已加入適量自來水的高壓鍋中，大火加熱至沸騰，將脫蠟水合后的組織切片置于耐高溫染色架上，再將染色架緩慢放入修復盒中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續加熱至噴氣，開始計時5min后，壓力鍋斷開電源，去閥開蓋，取出修復盒；室溫放置20min自然冷卻后取出切片。
[0049]5 ) ddH20 漂洗 5min X 2 次，PBS 漂洗 5min X 2 次。
[0050]6)組化筆劃圈，滴加10%羊血清(GTX27481，GeneTex)封閉，于濕盒中37°C封閉60mino
[0051]7)棄封閉液,滴加適當比例稀釋的一抗，4°C孵育過夜,37°C復溫30min,棄去一抗，PBS 洗 IOminX 3 次。
[0052]8)滴加二抗，于濕盒中37°C孵育60min，棄去二抗，PBS浸洗5minX3次。
[0053]9) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (S36939, Invitrogen)封片。
[0054]10)熒光鏡下觀察，拍照。若需保存，于暗濕盒中4°C保存。
[0055]熒光統計方法:PCNA免疫熒光染色統計采用IPP軟件計數，PCNA陽性細胞百分比=PCNA陽性細胞個數/ (內膜+中膜)的總DAPI個數*100% ；CyclinDl免疫熒光染色統計采用IPP軟件直接測陽性吸光度。
[0056]免疫熒光發觀察PCNA、CyclinDl在WT和IRF9-K0小鼠血管損傷后的表達變化，結果見圖2。PCNA, CyclinDl在血管組織中有表達，IRF9-K0小鼠在術后14d、28d PCNA的陽性細胞個數及CyclinDl的熒光強度均要小于同組的WT小鼠，表明IRF9基因敲除可以抑制PCNA, CyclinDl的表達，可抑制平滑肌細胞的增殖和內膜增生。
[0057]實施例4平滑肌細胞表型的檢測
免疫熒光染色檢測平滑肌細胞表型標志物:平滑肌肌動蛋白(Smooth Muscle Actin,SMA)、平滑肌細胞分化特異性抗原(Smoothelin)、平滑肌22 a (smooth muscle 22 alpha,SM22a )、骨橋蛋白(osteopontin，0PN)的表達。所需一抗信息:SMA (ab5694; 1:100;rabbit; Abeam), Smoothelin (sc-28562; 1:100; rabbit; Santa Cruz), OPN (BS1264;1:100; rabbit; Bioworld) and SM22 a (abl4106; 1:100; rabbit; Abeam);所需二抗信息:Alexa Fluor 488-conjugated goat ant1-rabbit IgG (Al 1008; Invitrogen,Carlsbad, CA)。
[0058]主要步驟為:
1)烤片:將石蠟切片置于烤箱中30min以上。
[0059]2)脫蠟:二甲苯 5minX3 次。
[0060]3)水合:100% 乙醇 5minX 2 次；95% 乙醇 5min ；70% 乙醇 5min ;ddH20 浸洗 5minX 2次。
[0061]4)檸檬酸鹽組織抗原修復(高壓修復):取一定量的pH6.0檸檬酸鹽抗原修復工作液于修復盒中，修復工作液的量必須能足夠浸沒整張切片，將修復盒放入已加入適量自來水的高壓鍋中，大火加熱至沸騰，將脫蠟水合后的組織切片置于耐高溫染色架上，再將染色架緩慢放入修復盒中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續加熱至噴氣，開始計時5min后，壓力鍋斷開電源，去閥開蓋，取出修復盒；室溫放置20min自然冷卻后取出切片。
[0062]5 ) ddH20 漂洗 5min X 2 次，PBS 漂洗 5min X 2 次。
[0063]6)組化筆劃圈，滴加10%羊血清(GTX27481，GeneTex)封閉，于濕盒中37°C封閉60mino
[0064]7)棄封閉液，滴加適當比例稀釋的一抗，4°C孵育過夜，37°C復溫30min。
[0065]8)棄去一抗，PBS 洗 IOminX3 次。
[0066]9)滴加二抗，于濕盒中37°C孵育60min，棄去二抗，PBS浸洗5minX3次。
[0067]10) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (S36939, Invitrogen)封片。
[0068]11)熒光鏡下觀察，拍照。若需保存，于暗濕盒中4°C保存。
[0069]熒光統計方法:采用IPP軟件直接測陽性吸光度。
[0070]血管損傷后，血管平滑肌細胞由中膜向內膜遷移，平滑肌細胞的增殖凋亡失平衡，表型由收縮型向合成型轉變，血管壁不適重塑，從而引起內膜增生。免疫熒光發觀察SMA、Smoothelin、SM22 a和OPN在WT和KO小鼠血管損傷后的表達變化，結果見圖3。SMA,Smoothelin、SM22 a和 OPN在血管組織中有表達，IRF9-K0小鼠在術后14d、28d SMA、Smoothelin, SM22 a的熒光強度均要高于同組的WT小鼠，OPN的熒光強度均要低于同組的WT小鼠，表明IRF9基因敲除可以促進SMA、Smoothelin、SM22 a的表達，抑制OPN的表達，可抑制平滑肌細胞由收縮型向合成型的表型轉換，從而抑制內膜增生。
[0071]上述實施例結果顯示，野生型小鼠和IRF9-K0小鼠在血管損傷模型(VI)的誘導下均發生血管損傷，與野生型小鼠相比，IRF9-K0小鼠內膜新生及細胞增殖受到抑制。這些結果提示，IRF9對促進內膜新生及細胞增殖具有強大的影響，具有促進血管狹窄和支架及內膜剝脫術后再狹窄形成的能力。證明了 IRF9基因在血管損傷疾病模型中有著重要的惡化作用，其抑制劑可用于制備治療血管狹窄疾病的藥物。
[0072]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.1RF9作為藥物靶標在篩選治療血管狹窄疾病的藥物中的應用。
2.1RF9作為藥物靶標在篩選治療支架后再狹窄的藥物中的應用。
3.1RF9作為藥物靶標在篩選治療內膜剝脫術后再狹窄的藥物中的應用。
4.1RF9的抑制劑在制備治療血管狹窄疾病的藥物中的應用。
5.一種治療血管狹窄疾病的藥物，包含IRF9的抑制劑。
6.1RF9的抑制劑在制備治療支架后再狹窄的藥物中的應用。
7.一種治療支架后再狹窄的藥物，包含IRF9的抑制劑。
8.1RF9的抑制劑在制備治療內膜剝脫術后再狹窄的藥物中的應用。
9.一種治療內膜剝脫術后再狹窄的藥物，包含IRF9的抑制劑。
10.根據權利要求4、6或8所述的應用或權利要求5、7或9所述的藥物，其特征在于:所述的IRF9的抑制劑為 IRF9基因的siRNA、IRF9基因的RNA干擾載體或IRF9的抗體。
【文檔編號】A61K39/395GK103784961SQ201410031604
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月23日 優先權日:2014年1月23日
【發明者】李紅良, 張書敏, 朱麗華, 張曉東, 蔣丁勝, 向梅 申請人:武漢大學