丹參配方顆粒在制備預防和治療艾滋病腦病藥物方面的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于制藥【技術領域】，具體涉及丹參配方顆粒在制備預防和治療艾滋病腦病及HIV-1Tat蛋白所致神經損傷藥物方面的應用。本發明用HIV-1Tat蛋白損傷類神經細胞系PC12和小鼠腦片上的神經細胞，用不同濃度的丹參配方顆粒進行保護，分別用MTT實驗、LDH檢測和Tunel實驗檢測丹參配方顆粒減少Tat蛋白所致神經細胞死亡的效果；用Dil金顆粒散射標記樹突棘，檢測丹參配方顆粒減少Tat蛋白損傷神經細胞突觸連接功能的效果。通過實驗結果的統計學分析，發現丹參配方顆粒對Tat蛋白所致的神經細胞損傷具有很好的保護效果，可用于制備預防和治療艾滋病腦病及Tat蛋白所致神經損傷的藥物。
【專利說明】丹參配方顆粒在制備預防和治療艾滋病腦病藥物方面的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于制藥【技術領域】，具體涉及一種傳統中藥丹參配方顆粒的一個新用途，即該中藥在制備預防和治療艾滋病腦病藥物方面的應用，尤其是在預防和治療Hiv-1Tat蛋白所致神經損傷藥物方面的應用。
【背景技術】
[0002]艾滋病腦病，現在又稱為HIV相關神經認知功能紊亂(HAND，HIV-assotiatedneurocognitive disorders),以運動、行為和認知障礙為特征，近期根據病情嚴重程度被分為三種形式:無癥狀神經認知功能損傷(Asymptomatic neurocognitiveimpairment, ANI),輕度神經認知功能紊亂(mild neurocognitive disorder, MND)和HIV相關癡呆(HIV associated dementia, HAD)。
[0003]HIV-1造成神經損傷的詳細機制有待深入研究，但可以肯定的是HIV-1具有神經毒性的蛋白通過直接或間接的形式損傷神經元是HAND發病的根本原因。HIV在感染15天后就可進入CNS (central nervous system, CNS),穿越血腦屏障的單核細胞釋放病毒顆粒，然后感染腦內的小膠質細胞和星形膠質細胞。與CNS病毒載量相比，HAD癥狀與神經兀丟失、損傷關系更緊密(Kaul M, HIV-1 infection and AIDS: consequencesfor the central nervous system.[J].Cell Death Differ 2005; 12 (Suppl I))，其損傷可分為直接損傷和間接損傷。直接損傷指HIV蛋白可以直接誘導神經元凋亡，減少神經樹突和樹突棘數量、損傷突觸連接；間接損傷指由HIV感染的小膠質細胞或星形膠質細胞損傷神經兀功能和神經再生(Kathryn A.HIV-Associated NeurocognitiveDisorder: Pathogenesis `and Therapeutic Opportunities.J neurimmune pharamac,2010,5:294-309; Hazleton JE.Novel mechanisms of central nervous systemdamage in HIV infection.HIV AIDS (Auckl).2010，2:39-49.)。神經再生與 HAND 發生也有關系；宿主因素對HAND發生也有影響。
[0004]Tat是HIV-1基因組編碼的蛋白，具有神經毒性，是誘導HAND發生的重要因素。Tat可以通過N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體誘導神經元凋亡(Eugenin EA.HIV-tatinduces formation of an LRP-PSD-95-NMDAR-nN0S complex that promotes apoptosisin neurons and astrocytes.Proc Natl Acad Sc1.2007,104(9):3438 - 3443);Tat還可以誘導星形膠質細胞凋亡，而星形膠質細胞對神經元有支持、營養和保護作用，其丟失和無能對神經損傷有重要作用；另外，Tat和HIV編碼的Gpl20蛋白能夠刺激小膠質細胞和星形膠質細胞釋放TNF-a、IL-1 β破壞血腦屏障使更多的病毒或感染細胞進入腦內。Gpl20且能通過神經元表面的CXCR4和CCR5直接誘導其凋亡；HIV的LTR，Nef，Vpr都有神經毒性，但現有研究結果表明其神經毒性可能遠小于Tat和Gpl20(Jayadev S.Host and viralfactors influencing the pathogenesis of HIV-associated neurocognitivedisorders.J Neuroimmune Pharmacol.2009,4(2):175-89)。[0005]在高效抗反轉錄病毒治療(highlyactive antiretroviral therapy, HAART)推廣前，15%HIV晚期感染者發生HAD，50%以上感染者發生某種形式HANDt5HARRT治療被廣泛應用后，仍有50%感染者發生HAND。2010年針對1555名HIV感染者的調查表明，排除嚴重復合病例，ANI 發病率為 33%, MND 12%, HAD 2%(Heaton RK.HIV-associated neurocognitivedisorders persist in the era of potent antiretroviral therapy: CHARTERStudy.Neurology.2010，75 (23):2087-2096)。HAART 治療降低了 HAD 發生率，但確診后其死亡率很高(Lescure FX.1ncidence and impact on mortality of severeneurocognitive disorders in persons with and without HIV infection: aDanish nationwide cohort study.Clin Infect Dis.2011，52 (2): 235-43),是艾滋病死亡一個獨立的重要危險因素。在澳大利亞的調查表明，1993-1995年，HAD確診后患者的平均生存期為11.9個月，中國患者HAD確診后，平均生存期僅為4.7個月。
[0006]HARRT治療延長了 HIV感染者的生命，但感染者生命的延長以及HIV感染者的增加也使HAND患者數量逐步增加。目前，HAND仍沒有特異、有效的治療藥物。為了延長HIV感染者生命、改善HIV感染者生活質量，必須針對感染所致神經損傷研發特異性藥物。許多學者認為雖然有效HARRT治療是必需的，但應輔以針對神經功能紊亂的治療(Kathryn A.HIV-Associated Neurocognitive Disorder: Pathogenesis andTherapeutic Opportunities.J neur immune pharamac, 2010, 5:294-309)。雖然已有新藥用于HAND臨床試驗,有的效果令人失望,有的仍在實驗進行(Kathryn A.HIV-AssociatedNeurocognitive Disorder: Pathogenesis and Therapeutic Opportunities.Jneurimmune pharamac,2010,5:294-309)。
[0007]PC12細胞是大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞株，是一種類神經元細胞系，具有與神經元類似的生長特性，常用于神經退行性疾病的藥物篩選、效果評價及機制研究。
[0008]中藥丹參(Salvia miltiorrhiza)為唇形科鼠尾草屬植物干燥的根及根莖,性微苦微寒，主要具有組織再生、活氣化瘀、保肝消痛、安神寧心等功效。現代藥理學研究表明:丹參具有清除氧自由基，抑制`脂質過氧化反應，發揮抗氧化作用。丹參的活性成分包括脂溶性的丹參酮1、丹參酮II A、丹參酮II B、紅根草鄰醌及丹參二醇和水溶性成分丹酚酸A、丹酚酸B、原兒茶醛等。其中丹參水溶性成分丹酚酸A能夠顯著地清除氧自由基。
[0009]丹參配方顆粒屬于中藥配方顆粒的一種，中藥配方顆粒是依據原國家藥品監督管理局印發《中藥配方顆粒管理暫行規定》，由具備資質的企業依照《中國藥典》現行版一部及部頒標準中藥材項下炮制方法制備的中藥提取顆粒劑，屬于中藥飲片管理范疇。目前，廣州一方等多家單位獲得批號生產丹參配方顆粒。
[0010]目前，雖有丹參和丹酚酸C抗HIV效果的報道，但抗HIV是指控制HIV在細胞內的復制以及在細胞間傳播，這和本發明申請防治HIV所編碼蛋白的神經毒性有根本不同。HIV是一種反轉錄病毒，可以整合到宿主細胞的基因組上，即使在病毒不復制時，甚至不存在具有感染能力的病毒顆粒時，其整合到宿主細胞基因組上的基因依然可以表達具有神經毒性的病毒蛋白，導致不同形式的HAND，而至今人們還沒有找到能夠清除整合有HIV基因組細胞的藥物。由以上分析可以看出，HIV感染和HAND雖然有聯系，但HAND有其獨立的發病機制，是一個相對獨立的神經識別與記憶障礙的疾病，減少HIV Tat蛋白的神經毒性將能夠在一定程度上治療HAND。有關丹參配方顆粒對HIV-1 Tat蛋白所致神經損傷的保護或在HAND治療中的應用至今國內外并無相關報道。
【發明內容】
[0011]本發明目的在于提供一種丹參配方顆粒在制備預防和治療艾滋病腦病藥物方面的應用，尤其是在預防和治療Hiv-1Tat蛋白所致神經損傷藥物方面的應用。
[0012]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
丹參配方顆粒在制備預防和治療艾滋病腦病藥物方面的應用。
[0013]具體的，所述丹參配方顆粒在制備預防和治療HIV-1Tat蛋白所致神經損傷藥物方面的應用。
[0014]本發明的創新點在于發現了傳統中藥丹參配方顆粒的一種新用途，其對HIV-1編碼Tat蛋白所致神經損傷具有保護作用，可用于制備預防和治療HAND的藥物和保健品。
[0015]本發明將HIV-1Tat蛋白損傷類神經細胞系PC12和小鼠腦片上的神經細胞，用不同濃度的丹參配方顆粒進行保護，分別用MTT實驗、LDH檢測和Tunel標記實驗檢測丹參配方顆粒減少Tat蛋白所致神經元死亡的效果；用Dil金顆粒散射標記樹突棘，檢測丹參配方顆粒減少Tat蛋白損傷神經突觸連接功能的效果。通過對對照組、Tat蛋白模型組和丹參配方顆粒藥物保護組實驗結果的統計學分析，發現丹參配方顆粒對Tat蛋白所致的神經元損傷具有很好的保護效果。
[0016]中國專利“丹酚酸A凍干粉針用于制備抑制腦組織神經元損傷或死亡藥物的用途”(申請號201210488012.4)中提到:丹參的水溶性成分丹酚酸A能夠對腦血栓或腦血栓再灌注所致神經元的凋亡具有保護功能，然而該專利主要以人為制造腦血栓及腦血栓再灌注為模型，其所致神經損傷的機制在于腦血栓所致缺血、缺氧和出血。本專利申請與其不同在于:I) Tat蛋白所致神經損傷機制及HAND發病機制與腦血栓所致神經損傷機制不同。腦血栓的誘因很多，形成栓塞的機制復雜，但其損傷神經的機制卻較為明確，如同其申請書所述在于缺血、缺氧與出血；而Tat蛋白神經損傷及HAND發病機制非常復雜，至今未明，但顯然和缺血缺氧所致神經損傷不同，如HAND發病與HIV蛋白影響神經元再生有關，與誘導膠質細胞凋亡也有關系。2)中國專利申請201210488012.4針對的是多因素導致的一種共同病理現象；本專利申請所述丹參配方顆粒的新用途具有明確的作用靶點和疾病種類。3)至今沒有證據證明:HIV Tat蛋白或其它HIV蛋白能夠導致腦血栓并進而損傷腦神經。4)本專利申請發現丹酹酸A可以增加被Tat蛋白減少的樹突棘數量,保護突觸連接功能；而中國專利申請201210488012.4僅僅以腦血栓缺血和再灌注所致神經損傷為模型，檢測對其所致神經元凋亡的保護，沒有對增加樹突棘數量和保護突觸連接功能進行分析。5)本專利申請發現了丹參配方顆粒具有控制Tat蛋白神經毒性的功能，丹參的藥用成分非常復雜，發揮控制Tat蛋白神經毒性的有效成分可能是丹酚酸A，也可能是其它成分，如丹參酮II A、紅根草鄰醌及原兒茶醛等。基于以上分析，可以發現本發明專利申請的是丹參配方顆粒一個完全不同 的新藥用功能。
[0017]艾滋病腦病(HAND)是世界公認的一個重大醫學課題，其發病機制、診斷和治療的研究都具有重要意義。本發明發現我國傳統中藥丹參配方顆粒對該病具有較好的治療效果，將有可能在一定程度上解決這一重大問題，具有國際意義。如能公開并授權，將再次顯示我國傳統中藥的優勢和獨特之處。【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為不同濃度丹參配方顆粒對PC12細胞存活率的影響(i±S,/?=3);
圖2為丹參配方顆粒對Tat蛋白損傷PC12細胞的保護作用(i±S，/?=3);圖中:##P<0.01與對照組相比;*Ρ〈0.05 ;* *Ρ〈0.01與Tat蛋白模型組相比；
圖3為LDH法檢測培養上清中乳酸脫氫酶活性(i±S,/?=3);圖中:##P〈0.01與對照組相比；* *Ρ〈0.01與Tat蛋白模型組相比；
圖4為Tunel檢測丹參配方顆粒對Tat蛋白損傷腦片神經細胞的保護；圖中A為對照組；Β為Tat蛋白模型組；C為藥物保護組；標尺=100 μ m ；
圖5為Tunel檢測丹參配方顆粒對Tat蛋白損傷腦片神經細胞的保護(X ± S,^?=3);圖中:##Ρ<0.01與對照組相比;* */Χ0.01與Tat蛋白模型組相比；
圖6為DiI金顆粒散射標記樹突棘的數量；圖中A為對照組；B*Tat蛋白模型組'C為藥物保護組；標尺=4 μ m ;
圖7為DiI金顆粒散射標記樹突棘密度的數量±S,/?=3);圖中:##P<0.01與對照組相比；* *7X0.01與Tat蛋白模型組相比。
【具體實施方式】
[0019]以下通過實施例對本發明做進一步的說明，但本發明的保護范圍不限于此。
[0020]實施例1
(一)主要試劑、細胞和儀器
HIV-1 Tat蛋白購自深圳柏萬森生物貿易有限公司(美國Prospec公司生產，批號:212PCLADEB28);中藥丹參配方顆粒購自廣東一方制藥有限公司(產品批號:1002014;用滅菌水配制成所需濃度)。大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞株(PC12)購自中國科學院上海細胞所。MTT購自Sigma公司(產品批號:MTBF7873V);LDH(乳酸脫氫酶)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Tunel檢測試劑盒購于美國promega公司(批號:0000073091 )。滅活胎牛血清(批號:111023)購于杭州四季青生物工程材料有限公司；馬血清(批號:841843)和DMEM培養基(批號:823186)及MEM培養基(批號:793870)均購自Gibco公司；其它試劑均為分析純。酶標儀(美國BIOTEK公司);奧林巴斯顯微成像系統(Olympus, FV10) ;Mcllwain組織自動切片機(CAMPDEN，220-240);震蕩切片機(LR59590，USA)。
[0021](二)實驗方法
1、實驗設計與分組
實驗共分為對照組、Tat蛋白模型組、藥物作用組和藥物保護組四個組，具體見表1。
[0022]表1實驗分組與設計
【權利要求】
1.丹參配方顆粒在制備預防和治療艾滋病腦病藥物方面的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于:所述丹參配方顆粒在制備預防和治療HIV-1Tat蛋白所致神經損傷藥物方面的`應用。
【文檔編號】A61K36/537GK103845403SQ201410068604
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年2月27日 優先權日:2014年2月27日
【發明者】劉紅亮, 王靖凱, 石貞玉, 胡磊, 劉彬, 鄧錦波, 徐括喜 申請人:河南大學