一種從斑嗜藍孢孔菌中提取的抗氧化多糖及其制備方法
【專利摘要】一種從斑嗜藍孢孔菌Fomitiporia?punctata（P.Karst.）Murrill中提取的抗氧化多糖及其制備方法。本發明的抗氧化多糖是將斑嗜藍孢孔菌子實體磨成粉后，經熱水浸提、乙醇沉淀、除蛋白、透析、凍干、離子交換和分子篩而獲得。該抗氧化多糖為淡黃色粉末，分子量為151KDa，由阿拉伯糖、果糖、半乳糖和葡萄糖4種單糖組成，比例為1:6:29:43，同時存在α和β兩種構型。易溶于熱水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮等有機溶劑。該多糖具有較強的抗小鼠紅細胞溶血和一定的清除DPPH、超氧陰離子及羥基自由基的作用。本發明中斑嗜藍孢孔菌抗氧化多糖為天然提取物，其制備方法簡單，成本較低，純度高。
【專利說明】一種從斑嗜藍孢孔菌中提取的抗氧化多糖及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】,具體涉及一種斑嗜藍孢孔菌(Fomitiporia punctata(P.Karst.)Murrill，俗名:斑褐孔菌、層臥孔菌)中提取的抗氧化多糖及其制備方法。
【背景技術】
[0002]我國真菌資源豐富，許多真菌作為珍貴的藥、食兩用菌受到廣泛關注。隨著對真菌資源開發和研究的不斷深入，已從中分離獲得了許多活性成分，諸如腺苷、留醇類、有機酸、萜類等小分子活性物質，除此之外，還有多糖、蛋白、多糖-蛋白復合物等大分子化合物，具有良好的抗病毒、降血糖和增強免疫調節等功能，因此，食、藥用真菌作為中草藥中的“上上藥”，其研究開發存在很大潛力。
[0003]斑嗜藍抱孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill,屬擔子菌綱，非裙菌目，多孔菌科，主要分布在我國的吉林、遼寧、河北、陜西、江蘇、浙江、湖北、湖南、福建、廣西、江西、安徽、云南等地。一般寄生于櫟、槭及其他闊葉樹的樹皮和腐木上，其子實體多年生，無菌蓋，平伏貼生于基物表面可達20cm或更大。菌管多層，干時龜裂，每層厚約2~3_，并逐年縮小，形成扁半球形的子實體，其總厚度達約15mm，管孔表面初期銹褐色，后期由于被灰色菌絲所充塞而變為淡煙色至棕灰色，子實體的邊緣灰黑色，管孔壁厚，完整，管口呈圓形。
[0004]目前，雖然市場上已有將斑嗜藍孢孔菌粗提物作為保健品的商品和治療冠心病、心絞痛的藥品銷售，但對斑嗜藍孢孔菌的藥理活性成分的研究報道甚少，缺少相應的理論支撐。
[0005]本發明首次從斑嗜藍孢孔菌子實體中分離純化得到一種具有抗氧化活性的多糖。
【發明內容】
[0006]本發明目的在于提供斑嗜藍孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill中的一種抗氧化多糖及其制備方法，該多糖具有一定的抗小鼠紅細胞溶血、清除DPPH、超氧陰離子和羥基自由基的生物活性。
[0007]本發明提供的從斑嗜藍孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill中提取的抗氧化多糖為淡黃色粉末，分子量為151KDa，由阿拉伯糖、果糖、半乳糖和葡萄糖4種單糖組成，比例為1:6:29:43，同時存在α和β兩種構型，易溶于熱水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮等有機溶劑。
[0008]本發明涉及的斑嗜藍抱孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill中的抗氧化多糖是按照如下方法制備的:
[0009](I)將斑嗜藍抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 子實體研成粉末，80~100°C熱水浸提3~5h，過濾所得濾渣再次浸提，合并濾液，即得斑嗜藍孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 子實體粗提液；
[0010](2)斑嗜藍抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 子實體粗提液經旋轉蒸發濃縮后，加入3~5倍體積無水乙醇，邊加邊劇烈攪拌，產生沉淀。于2~6°C放置過夜，10000~20000rpm離心20~30min,收集沉淀，依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗漆沉淀數次，即得斑嗜藍孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill粗提物；
[0011](3)將(2)步中得到的斑嗜藍抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.)Murrill粗提物用蒸餾水復溶，置于分液漏斗中，用Sevage法除蛋白，然后裝入分子截留量為3000~1000ODa的透析袋中，在2~6°C，足量蒸餾水中透析，經冷凍干燥，即得斑嗜藍孢孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 多糖粗粉；
[0012](4)將(3)步中得到的斑嗜藍抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.)Murrill多糖粗粉溶解于10~IOOmM Tris-Hcl (pH7.4)溶液中，上樣于DEAE-Cellulose陰離子交換柱，用O~2mol/L NaCl溶液連續梯度洗脫，收集洗脫峰；
[0013](5)將洗脫峰上樣于S^hadex G_75分子篩，用蒸餾水洗脫，獲得抗氧化多糖。
[0014]本發明中斑嗜藍抱孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill抗氧化多糖采用HPLC-ELSD進行純度和分子量的檢測，證明其是分子量為151KDa的純品。
[0015]本發明中斑嗜藍抱孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill抗氧化多糖對小鼠紅細胞溶血有較好的抑制作用，對DPPH、超氧陰離子及羥基自由基也具有一定的清除作用。
[0016]將上述斑嗜藍抱孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill中抗氧化多糖命名為 FPAPS (Fomitiporia punctata antioxidant polysaccharide)。
[0017]所述的 斑嗜藍孢孔菌抗氧化多糖可應用于治療氧化應激水平升高引起疾病的藥物的制備。
[0018]本發明具有的優點和有益效果:
[0019](I)本發明中斑嗜藍抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖為天然提取物，具有良好的安全性；(2)本發明中斑嗜藍孢孔菌Fomitiporiapunctata(P.Karst.)Murrill抗氧化多糖為純品；(3)本發明中斑嗜藍孢孔菌Fomitiporiapunctata (P.Karst.)Murrill抗氧化多糖具有良好的抗氧化效果；(4)本發明中斑嗜藍孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill抗氧化多糖制備簡單,成本低,適于大規模生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1 是本發明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖的離子交換層析圖。
[0021]圖2 是本發明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖的凝膠色譜層析圖。
[0022]圖3 是本發明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖的HPLC-ELSD 圖。
[0023]圖4是標準葡聚糖的分子量標準曲線圖。
[0024]圖5 是本發明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖對小鼠紅細胞溶血的抑制作用圖。
[0025]圖6 是本發明 Fomitiporia punctata (P.Karst.)Murrill 抗氧化多糖對 DPPH 的清除作用圖。
[0026]圖7 是本發明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖對超氧陰
離子清除作用圖。
[0027]圖8 是本發明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖對羥基自
由基的清除作用圖。
[0028]圖9 是本發明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖的紅外光譜圖。
[0029]圖10 是本發明 Fomitiporia punctata (P.Karst.)Murrill 抗氧化多糖的核磁共
振氫譜圖。
[0030]圖11 是本發明 Fomitiporia punctata (P.Karst.)Murrill 抗氧化多糖的 200 ~400nm紫外掃描圖。
[0031]圖12 是本發明 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 抗氧化多糖的HPLC-ELSD法單糖組成分析圖。
[0032]圖13是6種標準單糖的HPLC-ELSD法分析圖。
具體實施例
[0033]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
[0034]實施例1、本發明抗氧化多糖的制備
[0035](I)將斑嗜藍抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 子實體研成粉末，加入20倍體積蒸餾水混勻，于80°C恒溫水浴提取5h，過濾所得濾渣再次提取，合并濾液，即斑嗜藍孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill子實體粗提液；
[0036](2)斑嗜藍抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 子實體粗提液經旋轉蒸發濃縮，向其中加入4倍體積無水乙醇，邊加邊劇烈攪拌，產生沉淀。于4°C放置過夜，1000Orpm離心20min，收集沉淀，依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌沉淀數次，即得斑嗜藍孢孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 粗提物；
[0037](3)將斑嗜藍孢孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 粗提物用蒸懼水復溶，置于分液漏斗中，加入1/4體積Sevage試劑(三氯甲烷:正丁醇=4:1)，劇烈震搖lOmin，靜置30min，分液除去下層有機相和中間層白色絮狀物，重復操作7次，取上層水相經旋轉蒸發除去殘留的有機溶劑。然后裝入分子截留量為3500Da的透析袋中，在4°C，足量蒸懼水中透析2~3d,經冷凍干燥，即得斑嗜藍孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.)Murrill多糖粗粉；
[0038](4)將斑嗜藍抱孔菌 Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 多糖粗粉溶解于IOmM Tris-Hcl (pH7.4)溶液中，上樣于DEAE-Cellulose陰離子交換柱，用O~2mol/LNaCl溶液連續梯度洗脫，蒽酮-硫酸法跟蹤監測每管洗脫液在620nm處的吸光值，得到洗脫曲線(圖1 )，收集洗脫峰；
[0039](5)將洗脫峰上樣于S印hadex G_75分子篩，用蒸餾水洗脫，蒽酮-硫酸法跟蹤監測每管洗脫液在620nm處的吸光值，得到洗脫曲線(圖2)，收集洗脫峰獲得抗氧化多糖。
[0040]實施例2、本發明抗氧化多糖的純度和分子量測定
[0041](I)將已知分子量的標準葡聚糖(Dextran Τ-10、Τ-50、Τ-70、T-100、T-200)分別用雙蒸水配制成濃度為1%的標準液，0.22 μ m濾膜過濾，本發明抗氧化多糖做同樣處理。
[0042](2)色譜條件:色譜柱為Shodex SUGAR KS-804糖柱(8.0 X 300mm);蒸發光散射檢測器(ELSD)，柱溫:室溫;流動相:雙蒸水；進樣量:20 μ L ;空壓:3 X IO5Pa
[0043](3)分子量標準曲線繪制:將標準葡聚糖分別進樣20 μ L，采集圖譜，以分子量Mw為縱坐標，保留時間t為橫坐標，繪制標準曲線(圖4)。
[0044](4)將抗氧化多糖進樣20μ L，采集圖譜，根據出峰情況判定純度，圖3顯示單一狹窄對稱峰，可以判定該多糖為純品，將保留時間6.6min代入標準曲線(圖4)，計算得到該多糖分子量為151kDa。
[0045]實施例3、本發明抗氧化多糖的清除DPPH自由基作用
[0046](I)抗氧化多糖用無水甲醇做溶劑,配制成濃度為0.5mg/mL的溶液，DPPH用無水甲醇配制成終濃度為lX10_4mol/L的溶液。
[0047](2)分別取上述多糖溶液0.06,0.12,0.18,0.3,0.6mL于1.5mL離心管中，用DPPH溶液補足1.2mL，等體積無水甲醇代替樣品溶液的處理作為空白對照，抗壞血酸作為正對照，黑暗中放直30min。
[0048](3)在517nm處測定各處理的吸光值，每個處理做3個平行。
[0049](4)按“清除率=Ll-(As-Ab)Ai] X100%”公式計算DPPH清除率，其中Ai為不加樣的DPPH溶液的吸光值，As為樣品與DPPH反應后的吸光值，Ab為樣品的吸光值。
[0050]該抗氧化多糖的清除DPPH自由基活性見圖6，該圖顯示，在工作濃度為25~250ug/ml范圍內，該多糖的DPPH自由基清除活性隨著濃度的增大而升高，在250ug/ml時清除活性最高，為50.98%。
[0051]實施例4、本發明抗氧化多糖的超氧陰離子自由基清除作用
[0052]本研究采用ImL Tris-HCl緩沖液(mM，pH8.0)的超氧陰離子產生體系，其中含有78uM NADH, 50uM NBT, IOuM PMS以及不同濃度的試樣，以沒食子酸作為正對照，用Tris-HCl補足lmL，在560nm測定超氧陰離子與NBT的顏色反應。
[0053]按“清除率=(A — A1VAX 100%”公式計算試樣的超氧陰離子自由基清除率，其中A為對照體系的吸光值，Al為含試樣體系的吸光值。
[0054]如圖7所示，本發明抗氧化多糖在工作濃度為10~300ug/mL濃度范圍內，隨濃度升高，其超氧陰離子清除率先升高后下降，在200ug/mL時清除率最高為68.57%。
[0055]實施例5、本發明抗氧化多糖的紅外光譜分析
[0056]取本發明抗氧化多糖2mg與KBr研磨混勻,壓片,用紅外光譜儀在4000~500CM-1波數范圍內進行紅外掃描。
[0057]結果如圖9所示，表明樣品在波數3420.2301^(0_!1的伸縮振動)，2924.40cm_1(C-H的伸縮振動)和1637.80CHT1 (糖的水化物吸收峰)處均有多糖類物質的特征吸收峰。波數1400~1200cm—1范圍內為C-H變角振動，它與C-H的伸縮振動構成了糖環的特征吸收。波數889.23CHT1處為β-D-葡聚糖的特征吸收峰，表明該多糖以β -糖苷鍵為主，單糖組分中含有葡萄糖，1045.18cm-1和1080.23CHT1兩處是呋喃糖環特征吸收峰，表明單糖是以呋喃糖苷的形式存在。
[0058]實施例6、本發明抗氧化多糖的單糖組成分析
[0059]將本發明抗氧化多糖酸水解成單糖后，用流動相(乙腈:水=70:30)配制成IOmg/mL的溶液，色譜柱為NH2P-504E氨基柱，HPLC-ELSD法采集圖譜(圖12 )，圖中顯示4個峰值，出峰時間分別為5.2min、5.5min、6.2min和6.5min,表明該多糖的水解產物中有4種單糖成分。
[0060]同時，將六種標準單糖(阿拉伯糖、山梨醇、果糖、甘露糖、山梨醇和葡萄糖)用流動相配制成5mg/mL的標準液。首先單個進樣，后混合進樣，在同樣條件下采集圖譜，得到圖13，自左至右依次為阿拉伯糖、果糖、山梨醇、甘露糖、半乳糖和葡萄糖，出峰時間分別為
5.2min、5.5min、5.6min、5.8min、6.2min和6.5min。根據出峰時間可判定，本發明抗氧化多糖的4種單糖組分為阿拉伯糖、果糖、半乳糖和葡萄糖，根據四種單糖的峰面積估計其比例約為 1:6:29:43。`
【權利要求】
1.一種斑嗜藍孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill中提取的抗氧化多糖，所述的抗氧化多糖來自斑嗜藍孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill,淡黃色粉末，分子量為151KDa，由阿拉伯糖、果糖、半乳糖和葡萄糖4種單糖組成，比例為1:6:29:43。
2.權利要求1所述的斑嗜藍孢孔菌中提取的抗氧化多糖的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將斑嗜藍抱孔菌Fomitiporiapunctata (P.Karst.) Murrill子實體研成粉末，80~100°C熱水浸提3~5h，過濾所得濾渣再次浸提，合并濾液，即得斑嗜藍孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 子實體粗提液； (2)將上步得到的斑嗜藍抱孔菌Fomitiporiapunctata (P.Karst.) Murrill子實體粗提液經旋轉蒸發濃縮，加入3~5倍體積無水乙醇，邊加邊劇烈攪拌，產生沉淀；于2~6°C放置過夜，10000~20000rpm離心20~30min,收集沉淀,依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗漆沉淀數次，即得斑嗜藍孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill粗提物； (3)將(2)步中得到的斑嗜藍抱孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 粗提物用蒸餾水復溶，置于分液漏斗中，用Sevage法除蛋白，然后裝入分子截留量為3000~1000ODa的透析袋中，在2~6°C，足量蒸餾水中透析，經冷凍干燥，即得斑嗜藍孢孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 多糖粗粉； (4)將(3)步中得到的斑嗜藍抱孔菌Fomitiporia punctata (P.Karst.) Murrill 多糖粗粉溶解于10~IOOmM Tris-Hcl (pH7.4)溶液中，上樣于DEAE-Cellulose陰離子交換柱，用O~2mol/L NaCl溶液連續梯度洗脫，收集洗脫峰； (5)將洗脫峰上樣于S^hade`xG_75分子篩，用蒸餾水洗脫，獲得抗氧化多糖。
3.權利要求1所述的斑嗜藍孢孔菌抗氧化多糖在制備用于治療因自由基等引起氧化應激水平升高導致疾病的藥物方面的應用。
【文檔編號】A61P39/06GK103819574SQ201410082755
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2014年3月7日
【發明者】劉方, 王銀平, 劉趙昆 申請人:南開大學