豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株、疫苗組合物及其制備方法和應用的制作方法

豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株、疫苗組合物及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株，該豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株是將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的Nsp9基因、Nsp10基因分別置換為經典豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株的Nsp9基因、Nsp10基因，重組成一個新的嵌合病毒。該豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株可以進一步含有高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株的GP5基因。本發明還公開了含該弱毒株的疫苗組合物及其在制備預防和/或治療豬繁殖與呼吸綜合征的藥物中的應用。該弱毒株克服了人工傳代致弱疫苗的安全性問題；該弱毒株制備的疫苗組合物既可用于預防普通的豬繁殖與呼吸綜合征，又能預防高致病性的豬繁殖與呼吸綜合征。
【專利說明】豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株、疫苗組合物及其制備方 法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸用生物制品【技術領域】，具體涉及利用反向遺傳技術構建豬繁殖與呼 吸綜合征病毒弱毒株及其應用。

【背景技術】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) 又稱"豬藍耳病"，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)所引起的豬的一種高度傳染病，以母豬發熱、厭食、 早期流產、死胎、木乃伊胎、產弱仔等繁殖障礙及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為主要特征 (殷震，劉景華.動物病毒學.第2版.北京：科學出版社.1997)。同時，PRRSV可引起動物 機體發生免疫抑制，進而繼發多種病原的感染。
[0003] 該疾病首先于1987年在美國被發現，隨后在歐洲發現，二十世紀九十年代早期在 亞洲被鑒定。通過對全球不同地域分離的PRRSV進行系統進化分析，發現PRRSV主要存在 兩種基因型：1型(歐洲型)，以荷蘭分離到的Lelystad病毒（LV株)為代表；II型(美洲型)， 以美國分離到的VR2332株為代表。
[0004] 1996 年，國際病毒學分類委員會（International committee on taxonomy of virus, ICTV)在世界病毒學大會上正式將豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV、馬動脈 炎病毒（equine arteritis virus,EAV)、鼠乳酸脫氧酶病毒（lactate dehydrogenase elevating virus, LDV)、猴出血熱病毒（simian haemorrhagic fever virus,SHFV)都 歸到新建立的動脈炎病毒科(Arteriviridae)中，并將動脈炎病毒科歸到套式病毒目 (Nidovirales)中（Cavanagh D. Nidovirales:a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae.Archives of virology,1997,142(3):629-633;Gonzalez JM, Gomez-Puertas P, Cavanagh D, et al. A comparative sequence analysis to revise the current taxonomy of the family Coronaviridae. Archives of virology, 2003, 148 (11):2207-2235)。
[0005] PRRSV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約15. Okb，由結構蛋白編碼區、 非結構蛋白編碼區、5'非編碼區（5'UTR)和3'端非編碼區（3'UTR)組成，其中5'UTR上游 為帽子結構，3'UTR下游為Poly(A)尾，包含9個開放閱讀框（Open reading frame，0RF)， 分別為 ORFla、ORFlb、0RF2a、0RF2b、0RF3、0RF4、0RF5、0RF6、0RF7,分別編碼 ppla、pplab、 GP2a、GP2b (又稱 E)、GP3、GP4、GP5、M、N蛋白（SnijderEJ，MeulenbergJJ·Themolecular biology of arteriviruses. Journal of general virology,1998(79):961-979;Dea S,Gagnon CA, Mardassi H, et al.Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)virus:comparison of the North American and European isolates. Archives of Virology, 2000, 145:659-688;Wu WH, Fang Y, Farwell R, et al. Al〇-kDa structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by 0RF2b. Virology, 2001,287:183-191)。其 中，ppla和pplab是由0RF1通過核糖體移碼機制編碼產生的兩個多聚蛋白，由經ORFla編 碼產生的三種蛋白酶切割產生12種非結構蛋白，分別為：為Nspla、Ν?φ?β、Nsp2、Nsp3、 Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7a、Nsp7P、Nsp8、Nsp9 (RNA 依賴的 RNA 聚合酶)、NsplO (解旋酶)、 Nspll (核酸內切酶)和 Nspl2 (Fang Y，Snijder EJ.The PRRSV replicase:exploring the multifunctionality of an intriguing set of nonstructural proteins. Virus rese arch,2010, 154:61-76;Charerntantanakul ff. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines:immunogenicity, efficacy and safety aspects. World journal of virology，2012，l(l):23-30)。已有研究證實，單獨 Nsp9、NsplO、Nspll 對 病毒致病性以及病毒在體內的復制無影響(姜一峰，周艷君，王亞欣，等.豬繁殖和 呼吸綜合征病毒HuN4株Nsp9、NsplO、Nspl 1對毒力影響的研究.中國動物傳染病學 報，2011，19(6) : 1-6)。
[0006] 目前，PRRS已普遍存在于世界范圍內，每年都會造成巨大的經濟損失，已經成 為養豬業的巨大威脅。尤其是2006年在我國爆發的"豬高熱綜合征"（porcine high fever syndrome, PHFS)或"高致病性豬繁殖與呼吸綜合征"（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP_PRRS)，傳播范圍多達 10 個省，感染超 過200萬頭豬，約40萬頭豬死亡的病例。經研究表明：該病的主要病原為發生遺傳變異 的美洲型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRS virus，HP-PRRSV) (Tian KG，Yu XL, Zhao TZ, et al. Emergence of fatal PRRSV variants:Unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark. PLoS ONE, 2007, 2(6) :e526)。
[0007] 目前，已有的PRRS商品化疫苗包括滅活疫苗和弱毒活疫苗，但滅活疫苗接種次數 多，抗體產生慢，保護效果不穩定，經常導致免疫失敗；不能誘導針對異源PRRS病毒株的強 的免疫作用。弱毒活疫苗是將強毒株經連續傳代致弱而成，需要投入大量的人力和物力，研 發周期長，甚至還存在毒力返強的風險，此外，弱毒活疫苗對于不同型和變異較大的毒株之 間的免疫保護也很弱。因此，迫切需要研發一種安全有效、免疫廣譜的疫苗。


【發明內容】

[0008] 本發明為了克服上述現有技術存在的問題及缺點，提供了利用基因工程手段制備 的豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株。
[0009] 本發明的主要目的在于提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株，其特征在于， 所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株是將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的Nsp9基 因、NsplO基因分別置換為經典豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株的Nsp9基因、NsplO基因， 重組而成一個新的嵌合病毒。
[0010] 作為本發明的進一步改進，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株是將所述豬繁殖 與呼吸綜合征病毒弱毒株的GP5基因進一步置換為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱 毒株的GP5基因，重組而成一個新的嵌合病毒。
[0011] 優選地，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株包括10FUJ-2株、JXA1株。
[0012] 10FUJ-2 株公開于 Yu XL, Chen NH, Wang LL, et al. New genomic characteristics of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruses do not lead to significant changes in pathogenicity.Veterinary Microbiology，2012, 158:291-299.
[0013] JXA1株，該毒株的保藏號為CGMCC No. 1964,保藏單位為中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心，在中國專利CN101045917A中公開。
[0014] 更優選地，所述經典豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株包括PRRS MLV株、CH-1R株。
[0015] prrs mlv株其疫苗可以通過商業途徑獲得：商品名為丨ngelvac?PRRS mlv疫苗。 生產商為德國勃林格殷格翰（上海）動物保健品有限公司。
[0016] CH-1R株可以通過商業途徑獲得：商品名為"藍力佳"，成都天邦生物制品有限公 司。
[0017] 本發明的一種實施方式中，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株為10FUJ-2 株，所述經典豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株為PRRS MLV株或CH-1R株。
[0018] 更優選地，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株包括JXA1-R株。
[0019] 本發明的一種優選實施方式中，一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株，其中，所 述豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株是將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒10FUJ-2株的 Nsp9基因、NsplO基因分別置換為經典豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株PRRS MLV株或 CH-1R株的Nsp9基因、NsplO基因，重組而成一個新的嵌合病毒。
[0020] 本發明的一種優選實施方式中，一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株，其中，所 述豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株是將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒10FUJ-2株的 Nsp9基因、NsplO基因分別置換為經典豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株PRRS MLV株的Nsp9 基因、NsplO基因；以及將所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株的GP5基因進一步置換為 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株JXA1-R株的GP5基因，重組而成一個新的嵌合病 毒。
[0021] 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株JXA1-R株的保藏號為CGMCC No. 2467， 保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，在中國專利CN101307305A 中公開。
[0022] 本發明所用術語"高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（HP-PRRS)"可以在出現以下一 種或幾種臨床癥狀的豬中檢測到：皮膚發紅（rubefaction)、出血點（blood spots)、瘀斑 (petechiae)、紅斑轉白疹和小膿包（pimple)，常見于耳、口、鼻、背和大腿內側。其他常見 癥狀可包括：高熱(超過40°C )、抑郁（depression)、厭食（anorexia)、咳嗽（cough)、哮喘 (asthma)、跋行（lameness)、戰栗、呼吸道疾病和腹瀉（diarrhea)。高致病性豬繁殖與呼吸 綜合征（HP-PRRS)是由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV)引起的。
[0023] 本發明所用術語"高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒"、"高致病性豬繁殖與呼吸 綜合征病毒株"或"HP-PRRSV"是指，但不限于，具有與SEQ ID No. 1基本相同的核苷酸序 列的PRRSV。優選地，HP-PRRSV具有與SEQ ID No. 1基本相同的核苷酸序列的PRRSV。與 SEQ ID No. 1基本相同是指，PRRSV的核苷酸序列優選包含與SEQ ID No. 1有85%-100%相 同的序列，優選在HP-PRRSV并非本文所述PRRSV的條件下，例如與作為參考病毒分離物的 VR2332相比，0RF5的核苷酸同源性低于91%，優選低于92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%。HP-PRRSV 核苷酸序列優選有超過 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88% 或 89%，與 SEQ ID No. 1相同，同樣優選在HP-PRRSV并非本文所述PRRSV的條件下，例如與作為參考病 毒分離物的VR2332相比，0RF5的核苷酸同源性低于91%，優選低于92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98% 或 99%。還更優選地，PRRSV 核苷酸序列有超過 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或超過99%與SEQ ID No. 1相同，優選在HP-PRRSV并非本文所述PRRSV的條件下， 例如與作為參考病毒分離物的VR2332相比，0RF5的核苷酸同源性低于91%，優選低于92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0024] 本發明所用術語HP-PRRSV還指任何在Nsp2蛋白中具有指定修飾的PRRSV。根據 該定義，HP-PRRSV是指編碼Nsp2蛋白的PRRSV，其中對應于SEQ ID No. 2的氨基酸位置482 的亮氨酸缺失，而且它引起高熱臨床癥狀。或者除SEQ ID No. 2的氨基酸位置482的亮氨 酸缺失以外，對應于SEQ ID No. 2的氨基酸534-562的氨基酸也發生了缺失。在本發明中 SEQ ID No. 2也應被理解為是一種舉例，術語Nsp2蛋白不應限于SEQ ID No. 2所示的Nsp2 蛋白。根據以上教導，本領域技術人員很容易在具有與SEQ ID No. 2不同的Nsp2蛋白序列、 但具有相同修飾的PRRSV中鑒別出任意相應修飾，這意味著，缺失與SEQ ID No. 2的482位 亮氨酸對應的亮氨酸，和/或缺失與SEQ ID No. 2的氨基酸534-562對應的氨基酸。
[0025] 此外，本發明所用術語HP-PRRSV還指，具有與SEQ ID No. 1 (如上述定義）基本相 同的核苷酸序列、且編碼Nsp2蛋白的PRRSV，其中與SEQ ID No. 2的氨基酸位置482的亮氨 酸對應的氨基酸，和/或與SEQ ID No. 2的氨基酸534-562對應的氨基酸在PRRSV編碼的 Nsp2蛋白中缺失。
[0026] 此外，本發明所用術語HP-PRRSV還指，作為具有與SEQ ID No. 1基本相同核苷酸 序列的PRRSV的HP-PRRSV，在HP-PRRSV并非本文所述PRRSV的條件下，例如與作為參考病 毒分離物的VR2332 (如上述)相比，0RF5的核苷酸同源性低于91%，優選低于92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或99%，且編碼Nsp2蛋白，其中與SEQ ID No. 2的氨基酸位置482的亮氨 酸對應的氨基酸和/或與SEQ ID No. 2的氨基酸534-562對應的氨基酸在PRRSV編碼的 Nsp2蛋白中缺失。
[0027] 此外，本發明所用術語HP-PRRSV還指，作為具有與SEQ ID No. 1基本相同核苷酸 序列的PRRSV的HP-PRRSV，優選在HP-PRRSV并非本文所述PRRSV的條件下，如與作為參考 病毒分離物的VR2332 (如上所述）相比，0RF5的核苷酸同源性低91%，優選低于92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或99%，且編碼Nsp2蛋白，其中與針對氨基酸位置536-550、546-560 或476-490的肽反應的抗體顯示無反應性。
[0028] 本發明所述PRRSV VR-2332株，于1992年7月7日按照布達佩斯條約的規定保藏 于美國典型培養物保藏中心，Roclville，Maryland，保藏號為ATCC VR-2332。
[0029] 本發明所用術語"Nsp2"指由PRRSV ORFla編碼的ppla蛋白裂解后的非結構蛋 白之一，具有高度變異性，在歐洲型毒株中的氨基酸位置為Ala386-Glyl463 (共1078氨基 酸)，在北美型毒株中的氨基酸位置為Ala384-Glyl579 (共1196氨基酸）（Fang Y，Snijder EJ. The PRRSV replicase:exploring the multifunctionality of an intriguing set of nonstructural proteins. Virus research, 2010, 154:61-76)。
[0030] 此夕卜，以下PRRSV分離物已知是HP-PRRSV。因此，術語HP-PRRSV在本文中應包括以 下病毒株中的任一種，以及它們的后代：l〇FUJ-2、AH-1、AHCFSH、AHCFZC、BB07、BD-8、BQ07、 CL07、CX07、CZ07、FY060915、FY080108、GC-2、GCH-3、⑶1、⑶2、⑶2007、⑶3、⑶4、⑶SD1、 ⑶Y1-2007、⑶Y2-2007、⑶YF1、GS2008、GXHZ12、GXHZ13、GXHZ14、GXHZ16、GXHZ19、GXHZ2、 GXHZ21、GXHZ4、GXLZ5、GXLZ7、GY、GZCJ、GZDJ、GZHW1、GZHW2、GZHX、GZJS、GZKB、GZKY、GZLJ1、 GZWB、GZWM、GZZB、Hainan-1、Hainan-2、HB1、HB2、HB3、HB-Tshl、HB-Xtl、HEN46、HeN-KF、 HeN-LH、HeN-LY、HLJDF、HLJMZ1、HLJMZ2、HLJMZ3、HLJZY、HM-1、HN2、HN2007、HN3、HNld、HNly、 HNLYO1、HNNXO1、HNPJO1、HNsp、HNXT1、HNyy、HNyz、HQ-5、HQ-6、HUB、HuN、HUN1、HUN11、HUN15、 HUN16、HUN17、HUN2、HUN3、HUN4、HUN5、HUN6、HUN7、Hunan-1、Hunan-2、Hunan-3、HUNH2、 HUNH4、HuNhl、HUNL1、HUNX4、HZ061226、HZ070105、Jiangsu-1、Jiangsu-2、Jiangsu-3、 Jiangxi-2、Jiangxi-4、JLYS、JN、JX1、JX143、JX2、JX-2、JX2006、JX3、JX4、JX5、JXA1、KS06、 LC07、LJ、LS06、LS-4、LY07、NB070319、SC07、SD、SD14、SDWF2、SH02、ST-7、SX2007、SY0608、 TJDMJ、TJZHJ2、TJZHJ3、TQ、TQ07、TW07、WF07、XJ07、XL2008、YN2008、YNBS、YNDL、YNMG、YNWS、 YNYS、YNYX1、YNYX3、ZJ06、ZJCJ、ZJWL、ZX07、ZS070921。后代是指，但不限于，來源于上述 任一種親代病毒，且與相應的親本病毒株有超過86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%和99%的核苷酸序列同一性的病毒。
[0031] 本發明所用術語"經典豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株"或"PRRSV-經典弱毒株" 是指，但不限于，包括來源于上述任一種HP-PRRSV的任何減毒病毒，如與VR2332保藏的病 毒分離株或其任何后代基本相同的PRRSV ;或其任何減毒病毒分離株的后代，如：VR2332 保藏的病毒分離株的任何減毒后代。在一些優選形式中，PRRSV-經典弱毒株和可藥用載 體可以是 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. (Saint Joseph, M0)的丨ngelvac、」 PRRS MLV疫苗(系列號JA-A64A-149)。術語PRRSV-經典弱毒株還可包括已知為如下的分 離物：CH-1R、R98、PTK、CH-la、CH-1R01、HB-2、HN1、HT06、HZ07、LS05、LY03、NH04、PL97-1、 SI、SH061130、SX071226、TW07-1、WF03、XX03、ZJJ04、ZJJ05、ZJJ07,均為起源于中國的非 HP-PRRSV。
[0032] 本發明所用術語"高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株"或"HP-PRRSV-弱毒 株"是指，但不限于，包括來源于上述任一種HP-PRRSV經傳代致弱而成的疫苗用毒株，如與 JXA1保藏的病毒分離株經傳代致弱而成且基本相同的PRRSV疫苗株。在一些優選形式中， HP-PRRSV-弱毒株和可藥用載體可以是普萊柯生物工程股份有限公司的高致病性豬繁殖與 呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株)、吉林正業生物制品股份有限公司的高致病性豬繁殖與呼吸 綜合征活疫苗（HuM-Fl 12株)或北京健翔和牧生物科技有限公司的高致病性豬繁殖與呼吸 綜合征活疫苗（TJM-92株)。
[0033] 本發明所用術語"豬繁殖與呼吸綜合征"與"PRRS"，"豬繁殖與呼吸綜合征病 毒"、"豬繁殖與呼吸綜合征病毒株"與"PRRSV"，"高致病性豬繁殖與呼吸綜合征"與 "HP-PRRS"，"高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒"、"高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株" 與"HP-PRRSV"，"經典豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株"與"PRRSV-經典弱毒株"、"高致病 性豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株"與"HP-PRRSV-弱毒株"在本發明中均可互換使用。另 外，本發明所用術語"PRRSV"除非另有說明，是指任何美洲型或歐洲型PRRSV。
[0034] 本發明所用術語"美洲型PRRSV"是指具有與美洲型PRRSV分離株相關遺傳特征的 任何PRRSV，所述美洲型PRRSV分離株如但不限于20世紀90年代早期在美國分離的PRRSV (Collins JE, Benfield DA,Christianson WT, et al.Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332)in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs. Journal of veterinary diagnostic investigation，1992, 4:117-126)、美洲型 PRRSV 分離株 MN_lb (Kwang J, Kim HS, Joo HS. Cloning, expression, and sequence analysis of the 0RF4gene of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus MN-lb. Journal of veterinary diagnostic investigation，1994,6:293-296)、PRRSV Quebec IAF_exp91 株（Mardassi H, Mounir S，Dea S. Molecular analysis of the 0RFs3to7of porcine reproductive and respiratory syndrome virus,Quebec reference strain. Archives of virology，1995, 140:1405-1418)和美洲型PRRSV分離株VR-2385(Meng XJ，Paul PS，Halbur PG. Molecular cloning and nucleotide sequencing of the3'-terminal genomic RNA of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Journal of general virology，1994, 75:1795-1801)。
[0035] 本發明所用術語"歐洲型PRRSV"是指具有與下述歐洲型PRRSV相關的遺傳特征的 任何PRRSV，所述歐洲型PRRSV是指1991年在歐洲第一次分離的（Wensvoort G，Terpstra C, Pol JMA, et al. Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad virus. Veterinary quarterly，1991，13 (3) : 121-130)，在本領域中有時也稱為 "Lelystad 病毒"。
[0036] 本發明所用術語"遺傳特征"是指相應毒株共享的基因組核苷酸序列相似性和氨 基酸序列相似性。
[0037] 本發明所用術語"豬"是指任何屬于豬科（Suidae)成員的動物，如豬。
[0038] 本發明所用術語"開放閱讀框"或"0RF"是指編碼不含插入的終止密碼子的特定 PRRSV蛋白質所需的最小核音酸序列。
[0039] 本發明所用術語" Nsp9 "是指RNA依賴的RNA聚合酶，是由PRRSV0RF1編碼的 pplab蛋白裂解后的4個非結構蛋白之一，含有685氨基酸，在歐洲型中的氨基酸位置 為 Ala2352-Glu3036,在美洲型中的氨基酸位置為 Ala2459-Glu3143 (Fang Y，Snijder EJ. The PRRSV replicase:exploring the multifunctionality of an intriguing set of nonstructural proteins. Virus research，2010, 154:61-76)。
[0040] 本發明所用術語"NsplO"是指解旋酶，是由PRRSV ORFlb編碼的pplab蛋白裂 解后的4個非結構蛋白之一，在歐洲型中氨基酸的位置為Gly3037-Glu3478 (共442氨 基酸)，在美洲型中氨基酸的位置為Gly3144-Glu3584 (共441氨基酸）（Fang tSnijdei' EJ. The PRRSV replicase:exploring the multifunctionality of an intriguing set of nonstructural proteins. Virus research，2010, 154:61-76)。
[0041] 本發明所用術語"減毒"是指：經遺傳修飾的PRRSV與未經修飾的親本株相比毒力 減弱。如果病毒株的一種或多種確定疾病嚴重性的參數在統計學上顯示顯著性降低，則其 "毒性更小"。這類參數可包括病毒血癥水平、發燒、呼吸性窘迫嚴重性、生殖癥狀嚴重性或 肺損傷的嚴重性等。
[0042] 除非另有說明，本發明所用術語"經遺傳修飾"是指通過人工改造的遺傳突變。
[0043] 本發明所用術語"反向遺傳技術"又稱"反向遺傳操作技術"（Reverse genetics manipulation technique)，是指在體外通過構建RNA病毒的感染性分子克隆，將病毒基因 組RNA逆轉錄成cDNA，在DNA分子水平上對其進行各種體外人工操作，由病毒基因組cDNA 和各種輔助蛋白來組裝新的RNA病毒的一項研究技術（Neumann G，Whitt MA，Kawaoka Υ· A decade after the generation of a negative-sense RNA virus from cloned cDNA-what have we learned?Journal of general virology, 2002,83(11) :2635_2662)，也叫全長感 染性cDNA克隆技術，又常被稱為"病毒拯救"。由于最終"拯救"出的RNA病毒來源于cDNA克 隆，因此，可通過中間過程中人為加入的DNA環節，在DNA水平上對RNA病毒基因組進行各 種體外人工操作，如進行基因突變、基因敲除(缺失)、基因插入、基因置換和基因互補（即構 建嵌合病毒）等改造，解決了對RNA病毒基因組難以操作這一難題，極大地方便了人們進行 病毒各基因的功能、致病機理和病毒病防治策略的研究，同時為新型疫苗的研制和開發提 供了新的思路（Huang Z，Elankumaran S，Panda A，et al. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.Poultry science, 2003, 83(6):899-906)〇
[0044] 本發明所用術語"突變"是指將一個氨基酸替換為另一個，或將編碼核苷酸替換為 另一個(如"C"替換為"T")，即所謂的"取代"，優選以編碼的氨基酸被該改變的形式進行， 或指任何其它突變，如"缺失"或"插入"。突變通常在編碼核苷酸序列中進行。
[0045] 可使用本領域常規技術人員已知的重組技術對多核苷酸分子進行遺傳修飾， 包括本領域已知的通過定向突變，或通過隨機突變(如通過暴露于化學誘變劑或輻射 中)，還可通過本領域已知的標準方法完成，如對所述的感染性克隆(如Meulenberg JJ, Bos-de Ruijter JN, ffensvoort G, et al. An infection cDNA clone of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Advances in experimental medicine biology, 1998,440:199-206)進行定向誘變（如 Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001)〇
[0046] 本發明所用術語"相同"或"同一性"又稱"同源性"，是指描述兩個或更多個多肽 或核苷酸序列時，可以表示這些序列在特定區域具有特定百分比的相同殘基或核苷酸。所 述百分比可以如下計算：優選地比對這兩個序列，比較這兩個序列的所述特定區域，確定這 兩個序列中出現相同殘基的位置的數量，以此得到匹配位置數，將該匹配位置數除以該特 定區域的位置總數，將結果乘以100,得到序列同一性的百分比。當這兩個序列長度不同或 比對時出現一個或多個錯開的末端，以及所比較的該特定區域僅包括單個序列時，將單個 序列的殘基包括在該計算公式的分母而非分子中。
[0047] 本發明所用術語"疫苗組合物"又叫"致免疫組合物"，表示一種包含減毒的 HP-PRRSV或PRSSV-經典弱毒株(或其滅活病毒)，或兩者的任何重組毒株，或兩者任何免疫 原性片段或組分的組合物，優選為豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株，其在宿主中激發"免疫 應答"，是抗PRRSV的細胞免疫應答和/或抗體介導的免疫應答。
[0048] 本發明所用術語"激發免疫學應答"或"免疫應答"是指針對致免疫組合物或疫苗 組合物的任何細胞免疫應答和/或抗體介導的免疫應答，所述疫苗組合物或致免疫組合物 被施用給接受該疫苗組合物或致免疫組合物的動物。通常，"免疫應答"包括但不限于下列 一或多種效應：產生或激活抗體、B細胞、T輔助細胞、T抑制細胞、和/或細胞毒T細胞、和 /或yd T細胞，它們特異性針對目標組合物或疫苗中所含的一或多種抗原。優選地，宿主表 現出治療性或保護性免疫學應答，從而與未接受所述致免疫組合物或疫苗的對照相比，增 強對新感染的抵抗力，和/或減弱疾病的臨床嚴重程度。這樣的保護作用通過上述與宿主 感染有關的癥狀的發生率減少、或嚴重程度減弱、或直至癥狀消失來證實。
[0049] 本發明所用術語"保護"或"保護作用"是指，因被施用本發明的疫苗組合物，使 HP-PRRS或PRRS感染的臨床癥狀的嚴重程度減弱或發生率減少。所述嚴重程度的減弱或發 生率的減少，是指與一個或多個未接受本發明疫苗組合物的動物相比。
[0050] 本發明所用術語"基本相同"可表示SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,在有8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95、100個或更多個核苷酸或氨基酸的區域內，有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、97%、98%或99%相同，或從核酸的角度分析，與SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的互 補序列基本互補。
[0051] 本發明的另一目的在于提供一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量 的所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株以及藥學上可以接受的載體。
[0052] 優選地，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株含量為彡105_°TCID5(I/頭份。
[0053] 本發明的再一目的在于提供一種制備所述的疫苗組合物的方法，其中，所述方法 包括：（1)培養增殖所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株；以及（2)收獲所述培養增殖的豬 繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株，加入藥學上可以接受的載體。
[0054] 本發明的還一目的在于提供所述的疫苗組合物在制備預防和/或治療豬繁殖與 呼吸綜合征的藥物中的應用。
[0055] 優選地，所述豬繁殖與呼吸綜合征是由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒和/或 經典豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染引起。
[0056] 基于此，本發明具有以下突出的優點：
[0057] (1)本發明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株遺傳背景清楚；且不會出現毒力返 強，這可克服人工傳代致弱疫苗安全性的問題。
[0058] (2)由于本發明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株中既有弱毒株的部分抗原基 因，又有高致病性毒株的部分抗原基因，該弱毒株既可用于預防普通的豬繁殖與呼吸綜合 征，又能預防高致病性的豬繁殖與呼吸綜合征。
[0059] (3)相對于病毒在連續傳代致弱需要的更長時間來說，基因工程疫苗的構建過程 所花費的時間要短得多。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0060] 圖1為親本病毒10FuJ-2株和拯救病毒vBSMN-FuJ株的多步生長曲線。
[0061] 序列表中：
[0062] 序列1為HP-PRRSV JX143株的全部核苷酸序列；
[0063] 序列2為PRRSV VR2332株Nsp2的氨基酸序列；
[0064] 序列3為PRRSV-經典弱毒株MLV Nsp9的核苷酸序列；
[0065] 序列4為PRRSV-經典弱毒株MLV NsplO的核苷酸序列；
[0066] 序列5為PRRSV-經典弱毒株CH-1R Nsp9的核苷酸序列；
[0067] 序列6為PRRSV-經典弱毒株CH-1R NsplO的核苷酸序列；
[0068] 序列7為HP-PRRSV-弱毒株JXA1-R株GP5的核苷酸序列。

【具體實施方式】
[0069] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人 員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0070] 本實施例中所用HP-PRRSV (10FUJ-2株)全序列在NCBI中的登錄號為JQ663547 ; 所用PRRSV-經典弱毒株（丨ngelvac? PRRS MLV株）的基因序列在NCBI中的登錄號為 AF159149,所用PRRSV-經典弱毒株（CH-1R株)的基因序列在NCBI中的登錄號為EU807840 ; 所用HP-PRRSV-弱毒株（JXA1-R株）GP5的基因序列在NCBI中的登錄號為KC422725,但該 實施方式無論在任何情況下均不構成對本發明的限定。
[0071] 以下實施例中以高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株10FUJ-2株、JXA1株，經典 豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株PRRS MLV株、CH-1R株、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病 毒弱毒株JXA1-R株說明本發明。
[0072] 實施例中所用的攻毒毒株為中國分離株JXA1株，該毒株的保藏號為CGMCC No. 1964,保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，在中國專利 CN101045917 中公開。
[0073] 下述實施例中所述的實驗方法，若無特殊說明，均為常規方法；所述的生物材料， 若無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0074] 實施例1HP-PRRSV10FUJ-2株感染性分子克隆的構建及生物學特性研究
[0075] 1. 1HP-PRRSV10FUJ-2株感染性分子克隆的構建
[0076] 1. 1. lpBluescript II KS(+)載體的改造
[0077] 根據對lOFuJ-2全基因組序列的酶切位點分析，將pBluescript II KS(+)的多 克隆位點區進行改造，以便于后續的全長cDNA拼接。改造后的多克隆位點區的酶切位點 依次為：MluI-SfiI-XhoI-BamHI-BglII-NotI。改造好的載體經Notl酶切鑒定正確后送 Invitrogen測序，驗證改造后的多克隆位點區的正確性。改造后的載體命名為pBSMN。
[0078] 1.1. 2引物設計與合成
[0079] 根據NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中報道的高致病件豬繁殖與呼吸綜 合征病毒10FUJ-2株(登錄號JQ663547)基因組全序列，用Primer Premier5. 0軟件設計 了 5對擴增PRRSV10FUJ-2株全基因組cDNA各個片段的引物(見表1)。其中引物SF1中引 入了 Mlul酶切位點和T7啟動子，引物SR15347中引入了 Notl酶切位點。
[0080] 表1PRRSV10FUJ-2株全基因組cDNA各個片段的引物
[0081]

【權利要求】
1. 一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株，其特征在于，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒 弱毒株是將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株的Nsp9基因、NsplO基因分別置換為經典 豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株的Nsp9基因、NsplO基因，重組而成一個新的嵌合病毒。
2. 根據權利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株，其特征在于，所述豬繁殖 與呼吸綜合征病毒弱毒株是所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株的GP5基因進一步置換 為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株的GP5基因，重組而成一個新的嵌合病毒。
3. 根據權利要求1?2任一項所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株，其中，所述高致 病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株包括10FUJ-2株、JXA1株。
4. 根據權利要求1?2任一項所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株，其中，所述經典 豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株包括PRRSMLV株、CH-1R株。
5. 根據權利要求2所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株，其中，所述高致病性豬繁 殖與呼吸綜合征病毒弱毒株包括JXA1-R株。
6. -種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的權利要求1?5任一項所述豬 繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株以及藥學上可以接受的載體。
7. 根據權利要求6所述的疫苗組合物，其中，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株含 量為彡105 °TCID5Q/頭份。
8. -種制備權利要求6?7任一項所述的疫苗組合物的方法，其中，所述方法包括： (1) 培養增殖1?5任一項所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株；以及 (2) 收獲所述培養增殖的豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒株，加入藥學上可以接受的載 體。
9. 根據6?7任一項所述的疫苗組合物在制備預防和/或治療豬繁殖與呼吸綜合征的 藥物中的應用。
10. 根據權利要求9所述的應用，其中，所述豬繁殖與呼吸綜合征是由高致病性豬繁殖 與呼吸綜合征病毒和/或經典豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染引起。
【文檔編號】A61K39/12GK104250638SQ201410133403
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年4月3日 優先權日:2014年4月3日
【發明者】張許科, 孫進忠, 譚菲菲, 田克恭 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司