一種負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架及其制備方法，所述支架由聚合物基質和負載信號分子的無機納米粒子組成；將聚合物溶解在溶劑中，得到均一溶液后，將負載信號分子的無機納米粒子混入聚合物溶液中，超聲分散后鑄入模具中，相分離過夜；退去模具，得到聚合物凝膠，然后進行溶劑置換，冷凍干燥，即得。本發明可根據模具形狀制備出具有復雜三維形貌的組織工程支架；本發明操作簡單，不需復雜設備，可大批量生產；本發明制備的負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架，可模擬體內細胞、細胞外基質(ECM)和信號分子之間的多重相互作用，為組織治療和修復提供理想的環境。
【專利說明】一種負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于組織工程支架及其制備領域，特別涉及一種負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架及其制備方法。
【背景技術】
[0002]支架、細胞和信號分子是組織工程的三大要素。其中，支架是非常關鍵的組成部分，起著支撐細胞生長、引導組織再生等作用。理想的組織工程支架應該具有仿生天然細胞外基質(ECM)的納米纖維結構。熱致相分離(TIPS)技術一種常用制備納米纖維的方法，它操作簡單，可用于制備各種具有復雜三維形貌的納米纖維支架。采用TIPS制備的支架，纖維直徑在50~500nm，孔隙率超過90%，與致孔技術相結合，還可制備出三維多孔納米纖維支架，因而，TIPS被認為是最具應用前景的一種納米纖維支架制備方法。聚左旋乳酸(PLLA)是常用的采用TIPS制備納米纖維支架的材料，具有良好的生物相容性，并已被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準可用于臨床。信號分子也是組織工程的一個重要的部分，在某些疾病的治療及組織的再生修復方面具有重要的輔助促進作用。
[0003]Song 等(J Biomed Mater Res Part B.2012:1OOB:2178-2186.)以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)為聚合物基質，介孔二氧化硅納米粒子(MSNs)為藥物載體，采用靜電紡絲技術構建了雙藥物控釋體系；Zheng等(Polym Chem.2013,4:933-941.)同樣采用靜電紡絲技術構建了 PLGA/納米羥基磷灰石(n-HA)復合納米纖維支架，負載抗癌藥物用于癌癥治療。但是靜電紡絲技術難以制備具有復雜三維結構的支架，限制了其在組織工程中的應用范圍。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架及其制備方法，該方法操作簡單，不需要復雜設備，可大批量生產；制備的負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架，可模擬體內細胞、ECM和生長因子之間的多重相互作用，為組織治療和修復提供理想的環境。
[0005]本發明的一種負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架，所述支架由聚合物基質和負載信號分子的無機納米粒子組成；其中無機納米粒子相對于聚合物基質的質量分數為0.1% -50% ;宏觀上可具有復雜的三維形貌，微觀上呈現納米纖維結構。
[0006]所述聚合物為聚左旋乳酸、聚左旋乳酸與可生物降解聚合物的混合材料中的一種。
[0007]所述可生物降解聚合物為聚ε -己內酯、聚羥基乙酸、聚羥丁酸、聚羥基烷基酸酯、聚癸二酸丙三醇酯、聚己內酯-左旋乳酸共聚物、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚氨酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯 、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍、聚對苯二甲酸乙二醇酯、膠原、明膠、絲素蛋白、纖維蛋白原、纖維素、殼聚糖中的一種或幾種。[0008]所述信號分子為藥物、生長因子、基因、粘性短肽、抗凝活血性物質中的一種或幾種。
[0009]所述信號分子優選鐵胺DF0、鹽酸阿霉素D0X、1-磷酸鞘氨醇SlP中的一種。
[0010]所述無機納米粒子為介孔二氧化硅、介孔生物活性玻璃、石墨烯、納米羥基磷灰石、碳納米管中的一種或幾種。
[0011]本發明的一種負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架的制備方法，包括:
[0012]在40_80°C條件下，將聚合物溶解在溶劑中，得到聚合物溶液，然后將負載信號分子的無機納米粒子和聚合物溶液混合，超聲分散處理l_5min，鑄入模具內，相分離過夜；退去模具，得到聚合物凝膠，溶劑置換，冷凍干燥，即得負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架；其中聚合物溶液的濃度為5~15% (w/v)。
[0013]所述溶劑為水、甲醇、乙醇、己烷、環己烷、叔丁醇、六氟異丙醇、三氟乙醇、1，4-二氧六環、四氫呋喃、N，N-二甲基酰胺、氯仿、丙酮、二氯甲烷中的一種或幾種。
[0014]所述相分離溫度為-20~-80°C。
[0015]所述溶劑置換所用溶劑為水、乙醇、甲醇、己烷、環己烷中的一種或幾種，溶劑置換溫度為-20~10°C左右，交換溶劑2-3天，每天換3-5次溶劑。
[0016]所述冷凍干燥時間為l-2d。 [0017]本發明充分利用熱致相分離技術能夠制備納米纖維支架的優勢，采用醫學上可接受的聚合物材料作為基質，達到促進細胞在支架上的粘附、增殖及分化等，同時也促進營養物質在支架內的運輸和代謝廢物的排出。并通過向支架材料中引入負載信號分子的無機納米粒子，從而引入生物活性成分。從而制備的組織工程支架既能模擬ECM的納米纖維結構，又具有相應的信號分子釋放功能，可用于臨床上疾病的治療以及缺損組織的修復。
[0018]有益.效果
[0019](I)本發明可根據模具形狀制備出具有復雜三維形貌的組織工程支架；
[0020](2)本發明操作簡單，不需復雜設備，可大批量生產；
[0021](3)本發明制備的負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架，可模擬體內細胞、ECM和生長因子之間的多重相互作用，為組織治療和修復提供理想的環境。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1是制備的MSNs的形貌結構圖，其中A為FSEM圖片，B為TEM圖片；
[0023]圖2是制備的三維PLLA/MSNs復合納米纖維支架的圖片，其中A為數碼照片，B為PLLA/MSNs支架的SEM圖片，C為B放大后的SEM圖片；
[0024]圖3是制備的PLLA/MSNs復合支架的紅外分析圖片；其中A波數范圍為4000~lOOOcnT1的紅外分析圖、B為波數范圍950-7000^1的紅外分析圖。
【具體實施方式】
[0025]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。[0026]實施例1
[0027]負載去鐵胺(DFO)的三維PLLA納米纖維支架用于促進骨組織再生
[0028](1)ρΗ響應性介孔硅納米粒子(MSNs)的制備及去鐵胺(DFO)的負載:
[0029]MSNs 的制備:參照文獻方法(J Am Chem Soc.2004 ; 126:13216-13217)，采用模板法合成MCM-41型MSNs。合成步驟如下:將Ig十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)加入含有480ml去離子水的圓底燒瓶中，加入3.5ml2mol/L NaOH溶液，水浴控溫在80°C。溶液澄清后在電磁攪拌下加入5ml正硅酸乙酯(TEOS)，反應2h后產生白色沉淀。將固體抽濾并分別用去離子水和乙醇洗滌3次，烘干后得到白色產品。為去除模板劑CTABJf 1.5g制備的固體樣品置于含9ml鹽酸和160ml甲醇的蒸餾燒瓶中，60°C下常壓回流24h，抽濾后獲得的樣品真空干燥除去殘余溶劑，即得到不含模板劑的MSNs。為利于小分子藥物的負載，控制MSNs的平均粒徑和孔徑分別為200-300nm和2_3nm。
[0030]DFO的負載:將DFO溶于去離子水中配制成5mll.0mg/ml的溶液，然后加入0.15gMSNs，溶液在室溫下攪拌24h使DFO負載到MSNs的孔道中，離心分離后獲得MSNs/DFO載藥微粒。
[0031]殼聚糖(CHI)和海藻酸鈉(ALG) “加帽”的MSNs/DFO微球制備:將殼聚糖溶于pH為3的0.5M酸性NaCl溶液中配制成5mg/ml的溶液。然后將0.25g MSNs/DFO加入到25ml殼聚糖溶液中，室溫下攪拌lh，離心分離并用去離子水洗滌。沉積了殼聚糖的微球再置于25ml5mg/ml的海藻酸鈉溶液中，經室溫攪拌lh、離心分離和去離子水洗滌。重復2次上述步驟，制備出含CHI/ALG自組裝層的(CHI/ALG)n/CH1-MSNs微球，表面層為殼聚糖。
[0032](2)負載DFO的三維PLLA納米纖維支架的制備:
[0033]稱取Ig聚左旋乳酸(PLLA)，溶解在IOml四氫呋喃(THF)溶液中，并在60°C條件下攪拌溶解。待溶液均一澄清后，將特定比例的(CHI/ALG)n/CH1-MSNs微球(相對于PLLA質量分數為1% )，繼續在相同條件下攪拌2h左右，期間輔以超聲分散。然后將溶液迅速倒入直徑18mm左右的圓柱狀特氟龍模具中，蓋上蓋子后迅速放置在_80°C冰箱中過夜。
[0034]從-80°C冰箱中取出模具，去除蓋子后將模具迅速放置在0°C的去離子水中，一段時間后去掉模具，將半成型支架繼續浸泡在0°C的去離子水中。整個浸泡過程持續2d，期間每天換3次去離子水。
[0035]取出支架放入_80°C冰箱中預冷2h或更久，然后取出放入冷凍干燥機中干燥2d，取出即可得到負載DFO的三維PLLA納米纖維支架。
[0036]實施例2
[0037]負載鹽酸阿霉素(DOX)的三維PLLA納米纖維支架用于骨癌切除術后修復
[0038](I) pH響應性介孔硅納米粒子(MSNs)的制備及鹽酸阿霉素(DOX)的負載:
[0039]MSNs 的制備:參照文獻方法(J Am Chem Soc.2004 ; 126:13216-13217)，采用模板法合成MCM-41型M SNs。合成步驟如下:將Ig十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)加入含有480ml去離子水的圓底燒瓶中，加入3.5ml2mol/L NaOH溶液，水浴控溫在80°C。溶液澄清后在電磁攪拌下加入5ml正硅酸乙酯(TEOS)，反應2h后產生白色沉淀。將固體抽濾并分別用去離子水和乙醇洗滌3次，烘干后得到白色產品。為去除模板劑CTABJf 1.5g制備的固體樣品置于含9ml鹽酸和160ml甲醇的蒸餾燒瓶中，60°C下常壓回流24h，抽濾后獲得的樣品真空干燥除去殘余溶劑，即得到不含模板劑的MSNs。為利于小分子藥物的負載，控制MSNs的平均粒徑和孔徑分別為200-300nm和2_3nm。
[0040]DOX的負載:將DOX溶于去離子水中配制成5ml 1.5mg/ml的溶液，然后加入
0.15gMSNs，溶液在室溫下攪拌24h使DOX負載到MSNs的孔道中，離心分離后獲得MSNs/DOX載藥微粒。
[0041]殼聚糖(CHI)和海藻酸鈉(ALG) “加帽”的MSNs/DOX微球制備:將殼聚糖溶于pH為3的0.5M酸性NaCl溶液中配制成5mg/ml的溶液。然后將0.25g MSNs/DOX加入到25ml殼聚糖溶液中，室溫下攪拌lh，離心分離并用去離子水洗滌。沉積了殼聚糖的微球再置于25ml5mg/ml的海藻酸鈉溶液中，經室溫攪拌lh、離心分離和去離子水洗滌。重復4次上述步驟，制備出含CHI/ALG自組裝層的(CHI/ALG)n/CH1-MSNs微球，表面層為殼聚糖。
[0042](2)負載DOX的三維PLLA納米纖維支架的制備:
[0043]稱取Ig聚左旋乳酸(PLLA)，溶解在IOml四氫呋喃(THF)溶液中，并在60°C條件下攪拌溶解。待溶液均一澄清后，將特定比例的(CHI/ALG)n/CH1-MSNs微球(相對于PLLA質量分數為2% )，繼續在相同條件下攪拌2h左右，期間輔以超聲分散。然后將溶液迅速倒入直徑18mm左右的圓柱狀特氟龍模具中，蓋上蓋子后迅速放置在_80°C冰箱中過夜。
[0044]從-80°C冰箱中取出模具，去除蓋子后將模具迅速放置在0°C的去離子水中，一段時間后去掉模具，將半成型支架繼續浸泡在0°C的去離子水中。整個浸泡過程持續2d，期間每天換3次去離子水。
[0045]取出支架放 入_80°C冰箱中預冷2h或更久，然后取出放入冷凍干燥機中干燥2d，取出即可得到負載DOX的三維PLLA納米纖維支架。
[0046]實施例3
[0047]負載1-磷酸鞘氨醇(SlP)的PLLA/PCL多孔納米纖維支架用于骨缺損的修復
[0048](1)ρΗ響應性介孔硅納米粒子(MSNs)的制備及SlP的負載:
[0049]MSNs 的制備:參照文獻方法(J Am Chem Soc.2004 ; 126:13216-13217)，采用模板法合成MCM-41型MSNs。合成步驟如下:將Ig十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)加入含有480ml去離子水的圓底燒瓶中，加入3.5ml2mol/L NaOH溶液，水浴控溫在80°C。溶液澄清后在電磁攪拌下加入5ml正硅酸乙酯(TEOS)，反應2h后產生白色沉淀。將固體抽濾并分別用去離子水和乙醇洗滌3次，烘干后得到白色產品。為去除模板劑CTABJf 1.5g制備的固體樣品置于含9ml鹽酸和160ml甲醇的蒸餾燒瓶中，60°C下常壓回流24h，抽濾后獲得的樣品真空干燥除去殘余溶劑，即得到不含模板劑的MSNs。為利于小分子藥物的負載，控制MSNs的平均粒徑和孔徑分別為200-300nm和2_3nm。
[0050]SlP的負載:將SlP溶于二氯甲烷(DCM)中配制成5mll.0mg/ml的溶液，然后加入
0.15g MSNs,溶液在室溫下攪拌24h使SlP負載到MSNs的孔道中，離心分離后獲得MSNs/SlP載藥微粒。
[0051]殼聚糖(CHI)和海藻酸鈉(ALG) “加帽”的MSNs/SIP微球制備:將殼聚糖溶于pH為3的0.5M酸性NaCl溶液中配制成5mg/ml的溶液。然后將0.25g MSNs/SIP加入到25ml殼聚糖溶液中，室溫下攪拌lh，離心分離并用去離子水洗滌。沉積了殼聚糖的微球再置于25ml5mg/ml的海藻酸鈉溶液中，經室溫攪拌lh、離心分離和去離子水洗滌。重復3次上述步驟，制備出含CHI/ALG自組裝層的(CHI/ALG)n/CH1-MSNs微球，表面層為殼聚糖。
[0052](2)負載SlP的三維多孔PLLA/PCL復合納米纖維支架的制備:[0053]稱取0.6g聚左旋乳酸(PLLA)和0.4g聚ε -己內酯(PCL)，溶解在IOml四氫呋喃(THF)溶液中，并在60°C條件下攪拌溶解。將特定比例的(CHI/ALG)n/CH1-MSNs微球(相對于聚合物質量分數為1% )，繼續在相同條件下攪拌2h左右，期間輔以超聲分散。然后將溶液迅速倒入直徑18mm左右的圓柱狀特氟龍模具中，蓋上蓋子后迅速放置在-80°C冰箱中過夜。
[0054]從-80°C冰箱中取出模具，去除蓋子后將模具迅速放置在0°C的去離子水中，一段時間后去掉模具，將半成型支架繼續浸泡在0°C的去離子水中。整個浸泡過程持續2d，期間每天換3次去離子水。
[0055]取出支架放入_80°C冰箱中預冷2h或更久，然后取出放入冷凍干燥機中干燥2d，取出即可得到負載SlP的三維多孔PLLA/PCL復合納米纖維支架。
【權利要求】
1.一種負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架，其特征在于:所述支架由聚合物基質和負載信號分子的無機納米粒子組成；其中無機納米粒子相對于聚合物基質的質量分數為 0.1% -50% O
2.根據權利要求1所述的一種負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架，其特征在于:所述聚合物為聚左旋乳酸、聚左旋乳酸與可生物降解聚合物的混合材料中的一種。
3.根據權利要求2所述的一種負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架，其特征在于:所述可生物降解聚合物為聚ε -己內酯、聚羥基乙酸、聚-β-羥丁酸、聚羥基烷基酸酯、聚癸二酸丙三醇酯、聚己內酯-左旋乳酸共聚物、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚氨酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍、聚對苯二甲酸乙二醇酯、膠原、明膠、絲素蛋白、纖維蛋白原、纖維素、殼聚糖中的一種或幾種。
4.根據權利要求1所述的一種負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架，其特征在于:所述信號分子為藥物、生長因子、基因、粘性短肽、抗凝活血性物質中的一種或幾種。
5.根據權利要求1所述的一種負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架，其特征在于:所述無機納米粒子為介孔二氧化硅、介孔生物活性玻璃、石墨烯、納米羥基磷灰石、碳納米管中的一種或幾種。
6.一種如權利要求1-5任一所述的負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架的制備方法，包括: 在40-80°C條件下， 將聚合物溶解在溶劑中，得到聚合物溶液，然后將負載信號分子的無機納米粒子和聚合物溶液混合，超聲分散處理l_5min，鑄入模具內，相分離過夜；退去模具，得到聚合物凝膠，溶劑置換，冷凍干燥，即得負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架；其中聚合物溶液的濃度為5~15% w/Vo
7.根據權利要求6所述的一種負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架的制備方法，其特征在于:所述溶劑為水、甲醇、乙醇、己烷、環己烷、叔丁醇、六氟異丙醇、三氟乙醇、1，4- 二氧六環、四氫呋喃、N，N- 二甲基酰胺、氯仿、丙酮、二氯甲烷中的一種或幾種。
8.根據權利要求6所述的一種負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架的制備方法，其特征在于:所述相分離溫度為-20~-80°C。
9.根據權利要求6所述的一種負載信號分子的三維組織工程納米纖維支架的制備方法，其特征在于:所述溶劑置換所用溶劑為水、乙醇、甲醇、己烷、環己烷中的一種或幾種，溶劑置換溫度為-20~10°C左右，交換溶劑2-3天，每天換3-5次溶劑。
【文檔編號】A61L27/44GK103948967SQ201410178168
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月29日 優先權日:2014年4月29日
【發明者】何創龍, 王偉忠, 馮煒, 周小軍, 尹郅祺 申請人:東華大學