一種增強4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種增強4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方法，通過在CRM197A中加入萬能表位肽P30，并采用基因重組大腸桿菌來生產含有萬能表位肽的白喉毒素變異體CRM197的A鏈的蛋白載體P30CRM197A；然后將4種不同血清群(包括A、C、W135及Y)莢膜多糖通過共價鍵連接至所述含有萬能表位肽的P2CRM197A蛋白載體上形成4價流行性腦膜炎球菌多糖-P30CRM197A結合物；采用這種方法獲得的4價流行性腦膜炎球菌多糖-P30CRM197A結合物與不含有萬能表位肽的對應蛋白載體CRM197A獲得的4價流行性腦膜炎球菌多糖-CRM197A結合物相比較，其免疫原性比對照提高了3-5倍。
【專利說明】一種增強4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性 的方法 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明涉及一種增強4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方法。 【背景技術】
[0002] 當多糖以共價鍵連接至蛋白載體上時，能將半抗原的多糖轉變成全抗原，使得多 糖的免疫原性得到增強。以此方法合成的多糖蛋白結合疫苗已被廣泛地應用于小兒，成功 地預防了包括肺炎球菌，流行性腦膜炎球菌以及流行性嗜血桿菌b型等細菌的感染。
[0003] 用于合成多糖蛋白結合物的蛋白載體有多種，如破傷風類毒素、白喉類毒素、白喉 毒素變異體CRM197,以及基因重組技術生產的流行性嗜血桿菌表面蛋白D等；但是，由于不 同蛋白的免疫特性，以不同蛋白載體合成的多糖蛋白結合物的免疫原性有差異，動物體免 疫后，對于由不同蛋白載體與同一種多糖合成形成的多糖蛋白結合物，所顯現的多糖免疫 原性也不同。由此可見，采用不同技術生產的蛋白載體，合成出來的多糖蛋白結合物的免疫 原性有差異。
[0004] 進入動物機體內后，抗原經抗原處理細胞（Antigen Process Cell, APC)處理 后產生表位肽（epitope) [1]，在和主要組織相容性復合物（Major Histocompatibility Complex，MHC)分子結合后，進而呈現在APC細胞表面，能夠被T淋巴細胞識別，這是免疫學 通過實驗已經得出的結論。現在知道，一個已知表位肽的免疫原性取決于三個因素：
[0005] 第一、適當表位肽的產生；
[0006] 第二，和表位肽結合的主要組織相容性復合物分子的呈現；
[0007] 第三，識別表位肽與主要組織相容性復合物形成的結合物的Τ細胞的呈現。
[0008] 其中，任何一個環節的缺少都將導致免疫應答缺失。
[0009] 用小鼠進行的試驗表明，缺乏適當的表位肽與主要組織相容性復合物形成的結合 物分子是最常導致動物體免疫響應缺失的原因。主要組織相容性復合物具有高度的多形態 性，已知的表位肽僅通過一個或者幾個等位基因（Alleles)就可結合至主要組織相容性復 合物，而不是全部表位肽片段。另外，有實驗結果顯示，由于抗原處理不適當，或者T細胞耐 受性空缺,也會導致免疫響應的缺失。
[0010] 有實驗表明，破傷風毒素的表位肽FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (稱為P30)，可和大量 不同的主要組織相容性復合物Class II結合，顯示其能夠被T細胞識別，具有萬能免疫原 性的特性，被稱之萬能表位肽。
[〇〇11] 萬能免疫原性表位肽具有和多個人類主要組織相容性抗原復合物Class II分子 的同型和異型體結合。這種萬能表位肽和人類主要組織相容性抗原復合物Class II分子 隨機的結合可用于開發合成疫苗，因為其能夠激活人群中的大部分個體的獲得性免疫系統 的應答。
[0012] 研究表明，P30表位肽由破傷風毒素的947 - 967氨基酸序列組成 (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE)。在含有該表位肽的蛋白進入機體后，蛋白將被攝入至APC細胞 內，被消化降解。但是，這些表位肽將保存完整，在和主要組織相容性復合物結合后，被呈現 在APC細胞表面，并被T細胞識別，這表明萬能表位肽以相同的方式和多種DR分子作用。
[0013] MHC分子是加工后抗原的雜性受體，其功能是在胸腺中的免疫耐受誘導和周邊免 疫響應外來抗原的過程中，來呈現其抗原中的表位肽。因此，MHC分子必須在呈現大量的表 位肽（容許更好的抗原識別，但更多的消耗T細胞儲備），和少許表位肽（大量的T細胞儲 備，但是少許有效地呈現外來抗原）中達到平衡。也就是說，如果抗原中含有在APC細胞處 理后能夠保存完整性、并具有代表性的少量表位肽，在和MHC結合后，就能夠刺激一定量的 T細胞，來建立免疫記憶效應，而這一過程不會消耗過量的T細胞，以避免消耗大量的T細 胞，造成免疫耐受。含有這種表位肽的抗原具有更強的免疫原性，這也就解釋了為什么破傷 風類毒素具有很強的免疫原性的原因。
[0014] 現發現的大部分T細胞的刺激表位肽對于不同MHC Class II單體（haplotype) 作用有限，不同動物保存和呈現不同的抗原多肽區域（印Hopes)來刺激其T細胞。這種T 細胞刺激活性的基因限制阻礙了以合成方法來開發疫苗，而這種方法對于基因上不同的人 群的應用，應該是非常有效的方法。那些被發現具有刺激多重小鼠個體和/或與大多數人 體MHC Class II分子相關聯的T細胞刺激表位肽，提供了一個設計萬能活化T細胞的有效 途徑。在普通的蛋白抗原中加入萬能表位肽（也稱為萬能T細胞抗原簇）P30,能夠被大多 數動物的MHC Class II分子識別。這種T細胞抗原簇能夠用于直接誘導T細胞，或提供幫 助B細胞生產針對于弱免疫原的抗體，增強機體獲得性免疫應答的效應。
[0015] 致病性細菌通常能夠表達高分子量，包裹在細菌表面的是莢膜多糖，簡稱多糖。對 于成人來說，莢膜多糖是具有很好的免疫原性抗原，可用于制備疫苗；但是，對于小兒，即2 歲以下的嬰幼兒，莢膜多糖被認為是非依賴于T細胞抗原。實驗顯示，當用作為抗原時，莢 膜多糖可誘導野株或者T細胞缺失小鼠生產多糖特異性IgM抗體的響應；但是，并不誘導 IgM抗體向IgG抗體的轉化。人體實驗也顯示，作為疫苗，多糖可以誘導成人生產保護性抗 體，但無法誘導嬰幼兒的免疫應答；也就是說，在小兒重復免疫莢膜多糖抗原后，無第二次 抗體增強響應，也無法誘導持續的T細胞記憶。
[0016] 現代免疫學實驗證實，多糖蛋白結合疫苗和純多糖疫苗比較的優勢在于，前者能 夠誘導免疫響應。當非依賴T細胞的莢膜多糖共價鍵地連接至載體蛋白而形成的多糖蛋白 結合物，在免疫了哺乳動物后，可誘導T細胞來幫助B細胞產生針對于結合物中的多糖部分 的IgG抗體。因此，多糖蛋白結合物誘導多糖特異性抗體IgM轉化為IgG，記憶B細胞的分 化，以及長期存在的T細胞記憶。
[0017] 流行性腦膜炎是細菌性腦脊液炎中唯一能夠造成流行的疾病，可引起相當高的 病死率和致殘率。流腦從病原體的發現至今已超過100年，呈世界范圍發布，全世界每年 流腦病例可達30萬到35萬，是世界范圍的一個嚴重公共健康問題。流腦由腦膜炎奈瑟菌 (Neisseria meningitidis,Men)引起。據流行性腦膜炎球菌莢膜多糖的化學結構，已確定 13個血清群，其中八、8、(：、1135、和￥群引起約95%的病例。
[0018] A、C、W135、和Y群的莢膜多糖是良好的免疫原，但多糖疫苗對高發人群一2歲以下 兒童幾乎不起作用，這多是由于莢膜多糖是非T細胞依賴性抗原。解決此問題的有效方法 是制備結合疫苗，即將多糖和蛋白載體進行共價鍵連接，使非T細胞依賴性抗原轉變成T細 胞依賴性抗原。這種方法可以改變莢膜多糖的抗原性質，誘導出免疫記憶。
[0019] 目前臨床上使用的4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合疫苗是由賽諾菲生產，該 產品是將4種流行性腦膜炎球菌群，包括A、C、W135和Y分別以共價鍵連接至破傷風類毒素 蛋白載體上，然后將這4種單價結合物混合配制而成。4價流行性腦膜炎球菌多糖結合疫苗 的臨床應用取得了成效，但是，有些群的免疫原性仍然較弱，需要開發出免疫原性更強的產 品來更新。
[0020] 本發明是將4種流行性腦膜炎球菌莢膜多糖分別與基因重組技術表達的，帶有 P30萬能表位肽的白喉毒素變異體P30CRM197A以共價鍵的形式連接，而合成的4種單價 Men -P30CRM197A結合物，然后進行混合配制成4價流行性腦膜炎球菌多糖結合物。該結合 物不同于市場上現有的產品之處在于，通過加入P30萬能表位肽至CRM197A蛋白中了增強 結合物的免疫原性，同時也增強以共價鍵結合至蛋白載體的流腦莢膜多糖的免疫原性。
【發明內容】
[0021] 本發明的目的是提供一種增強4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合物免疫 原性的方法，先在白喉毒素變異體CRM197的A鏈（簡稱CRM197A)中加入萬能表位肽 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (簡稱P30)，通過基因重組工程菌來生產含有P30的CRM197A蛋 白載體（簡稱P30CRM197A);然后將4種不同群的流行性腦膜炎球菌多糖，包括A、C、W135、 和Y，通過共價鍵分別與P30CRM197A蛋白載體連接形成4種單價流行性腦膜炎球菌多 糖-P30CRM197A結合物；最后將獲得的4種單價流行性腦膜炎球菌多糖-P30CRM197A結合 物進行混合得到免疫原性增強的4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合物。通過此方法獲得 的4價流行性腦膜炎球菌-P30CRM197A結合物與不帶萬能表位肽P30的CRM197A蛋白載體 合成的4價流行性腦膜炎球菌多糖-CRM197A結合物比較，該結合物的流腦多糖抗體滴度提 高了 3 - 5倍。
[0022] 本發明采取的技術方案如下：
[0023] -種增強4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方法，包括如下步 驟：
[0024] 步驟一：在白喉毒素變異體CRM197的A鏈（簡稱CRM197A)中加入萬能表位肽 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (簡稱P30)，通過基因重組工程菌來生產含有P30的CRM197A蛋白 載體（簡稱 P30CRM197A);
[0025] 步驟二：將4種不同群的流行性腦膜炎球菌多糖，包括A、C、W135、和Y，通過共價 鍵分別與P30CRM197A蛋白載體連接形成4種單價流行性腦膜炎球菌多糖-P30CRM197A結 合物；
[0026] 步驟三：將步驟二獲得的4種單價流行性腦膜炎球菌多糖-P30CRM197A結合物進 行混合得到免疫原性增強的4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合物。
[0027] 進一步，在所述P30CRM197A中含有X個P30，l彡X彡3。
[0028] 進一步，在所述P30CRM197A蛋白載體中，P30連結在CRM197A蛋白的N-末端或 C -末端，或者同時連接在N -末端和C -末端。
[0029] 進一步，在P30CRM197A中所述P30與CRM197A蛋白之間是通過GSGSG氨基酸序列 進行連接。
[0030] 進一步，所述基因重組工程菌是通過基因重組方法構建的大腸桿菌。
[0031] 進一步，所述流行性腦膜炎球菌多糖是通過分別培養4個不同群的流行性腦膜炎 球菌獲得的莢膜糖。 【具體實施方式】
[0032] 下面舉例說明本發明的具體實施方法，但不局限于以下實例。
[0033] 本發明的實施方法是用基因重組的方法，在大腸桿菌工程菌表達系統中，對 CRM197A蛋白載體和帶有萬能表位肽P30的CRM197A蛋白載體進行表達并純化；然后，將4 群流行性腦膜炎球菌莢膜多糖（簡稱Men)共價鍵地連接至P30CRM197A蛋白載體，制備出 Men - P30CRM197A結合物；將四種單價多糖蛋白結合物混合配制成疫苗后，免疫小白鼠，采 血獲得免疫血清；用ELISA方法檢測小白鼠血清中的多糖特異性抗體滴度，以評估多糖蛋 白結合物的免疫原性。
[〇〇34] 步驟一：蛋白載體和流行性腦膜炎球菌莢膜多糖的制備
[0035] 為說明本發明的有效性，制備了兩種載體蛋白，即含有P30的蛋白載體 P30CRM197A和不含P30的蛋白載體CRM197A。其中，CRM197A蛋白載體是用于合成對照用4 價流行性腦膜炎球菌多糖-CRM197A結合物樣品。
[0036] 一、CRM197A蛋白載體和P30CRM197A蛋白載體氨基酸序列的設計
[0037] 1、CRM197A蛋白載體氨基酸序列的設計
[0038] 白喉毒素是由帶有白喉毒素基因的β噬菌體在白喉桿菌內表達，在細菌胞漿中 存在形式為多肽，由560個氨基酸組成，分子量為62, 000道爾頓。其氨基酸序列如下：
[0039] MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHAGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQG NYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTE EFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSS LSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAG ANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVD IGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPI AGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAID⑶VTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISS DSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
[0040] 當分泌至細菌體外前，多肽N -末端的25個引導氨基酸序列被切除掉，變成了由 535個氨基酸組成、分子量為58kD的單鏈多肽而分泌至細菌體外，其氨基酸序列如下 ：
[0041] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDffDVIRDKTKTKIESLKEH GPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKT TAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNR PAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNG RKIRMRCRAID⑶VTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFF EIKS
[0042] 分泌至細菌體外的白喉毒素被酶切為A鏈和B鏈，其間由一個二硫鍵連接而形成 一個蛋白分子，這兩個多肽鏈具有不同的功能。A鏈為白喉毒素蛋白分子的N-末端片段， 分子量為21kD，由193個氨基酸組成，是白喉毒素的毒性功能部分。它是通過在真核生物細 胞漿內，將二磷酸三腺苷核糖（ADP -Ribosyl)的異檸檬酸脫氫酶（NAD+)部分轉移至延伸因 子2(ElongationFactor -2，EF -2)上，從而抑制細胞中的蛋白質合成，進而抑制細胞生長， 造成細胞傷亡。B鏈為白喉毒素蛋白分子的C -末端片段，分子量大約為37kD，由342個氨 基酸組成。B鏈的功能是識別敏感細胞表面的特異性受體，將白喉毒素吸附在敏感細胞上， 幫助A鏈進入細胞內。
[0043] 白喉毒素的A鏈具有良好的水溶性，其氨基酸序列如下：
[0044] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0045] 研究發現[3]，由于β噬菌體上的毒素基因 tox的突變，對于噬菌體的復制沒 有影響，但是，合成出來的毒素的毒性可能消失，或大大地降低，而形成白喉毒素突變體 (CrossReactingMaterial，CRM)，但是白喉毒素突變體的血清學免疫原性仍然和毒素相關 聯。比如，白喉毒素突變體CRM197,無白喉毒素的毒性，從氨基酸序列分析來看是由于A鏈 中的第52位氨基酸，由甘氨酸（Gly)突變成谷氨酸（Glu)，其氨基酸序列如下：
[0046] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKEFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0047] 試驗研究表明，與其它現在市場上用于肺炎球菌結合疫苗合成的蛋白載體比較， 白喉毒素變異體CRM197蛋白A鏈多肽具備以下一些優勢，如其免疫原性和白喉毒素及白喉 內毒素相關聯，分子量小，水溶性高，易于生產和進行大分子合成反應。長期的白喉類毒素 疫苗的臨床使用，已經證明其安全性和有效性。
[0048] 2、含有P30萬能表位肽的P30CRM197A蛋白載體氨基酸序列的設計
[0049] 將萬能表位肽P30連接至CRM197A蛋白載體上，構建出一種新的用于合成多糖蛋 白質結合物的蛋白載體。所用的萬能表位肽P30可連接至CRM197A蛋白載體的N -末端或 C -末端；也可將兩個不同的萬能表位肽分別連接至CRM197A蛋白載體的N -末端或C -末 端；另一種方式是將兩個萬能表位肽自身連接，然后再連接至CRM197A蛋白載體N -末端或 者C -末端；還有一種方式是將一個萬能表位肽連接至C -末端或者N -末端，兩個自身連 接的萬能表位肽連接至另一端。
[0050] 2 - 1、含有萬能表位肽P30的P30CRM197A蛋白載體氨基酸序列的設計
[0051] 2 - 1 - 1、P30 - N -末端CRM197A蛋白載體（稱為P30 - CRM197A)氨基酸序列的設 計
[0052] 通過將P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE加入至CRM197A蛋白載體的N -末端，形成一個新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0053] FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQ GNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGT EEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0054] 在P30氨基酸序列和CRM197A蛋白載體的N -末端間插入了 GSGSG片段來進行連 接，以此方法構建的蛋白稱為P30 - CRM197A蛋白載體。
[0055] 2 - 1 - 2、CRM197AC -末端-P30蛋白載體（稱為CRM197A - P30)氨基酸序列的設 計
[0056] 通過將P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE加入至CRM197A蛋白載體的C -末端，形成另一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0057] MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVD NENPLSGKAGGWKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF ⑶ GASRWLSLPFAEGSS SVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLE
[0058] 在P30氨基酸序列和CRM197A蛋白載體的C -末端間插入了 GSGSG片段來進行連 接，以此方法構建的蛋白稱為CRM197A - P30蛋白載體。
[0059] 2 -1 _3、P3〇 - N -末端 CRMIMAC -末端- P3〇 蛋白載體（稱為 P3〇 - CRM197A - P3〇) 氨基酸序列的設計
[0060] 通過將兩個P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE分別加入至CRM197A蛋白載 體的N -末端和C -末端，形成一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0061] FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQ GNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGT EEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGS GFNNFTVSFffLRVPKVSASHLE
[0062] 在P30氨基酸序列和CRM197A蛋白載體的N -末端和C -末端之間插入了 GSGSG 片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為P30 - CRM197A - P30蛋白載體。
[0063] 2 - 1 - 4、P30 - P30 - N -末端 CRM197A 蛋白載體（稱為 P30 - P30 - CRM197A)氨基 酸序列的設計
[0064] 通過將兩個P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE自身連接，然后再加入至 CRM197A蛋白載體的N -末端，形成一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0065] FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENF SSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDMGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLAL KVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRG KRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0066] 在兩個自身連接的P30氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的N-末端間插 入了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為P30 - P30 - CRM197A蛋白載體。
[0067] 2 - 1 - 5、CRM197AC -末端-P30 - P30 蛋白載體（稱為 CRM197A - P30 - P30)氨基 酸序列的設計
[0068] 通過將兩個P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE自身連接，然后再加入至 CRM197A蛋白載體的C -末端，形成一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0069] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGS GFNNFTVSFffLRVPKVSASHLE
[0070] 在兩個自身連接P30氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的C -末端間插入 了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為CRM197A - P30 - P30蛋白載體。
[0071] 2 - 1 - 6、P30 - P30 - N -末端 CRM197AC -末端-P30 蛋白載體（稱為 P30 - P30 - CRM197A - P30)氨基酸序列的設計
[0072] 通過將兩個P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE自身連接，然后再加入至 CRM197A蛋白載體的N -末端；另外，將一個P30加入至CRM197A蛋白載體的C -末端，形成 另一種新的蛋白，其氣基酸序列如下：
[0073] FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENF SSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLAL KVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRG KRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLE
[0074] 在兩個自身連接P30氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的C -末端間插入 了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為P30 - P30CRM197AP30蛋白載體。
[0075] 2 - 1 - 7、P30 - N -末端 CRM197AC -末端-P30 - P30 蛋白載體（稱為 P30 - CRM197A - P30 - P30)氨基酸序列的設計
[0076] 通過將一個P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE連接至CRM197A蛋白載體的 N -末端；另外，將兩個P30進行自身連接，然后再加入至CRM197A蛋白載體的C -末端，形 成另一種新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0077] FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQ GNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGT EEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGS GFNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLE
[0078] 在兩個自身連接P30氨基酸序列之間，以及和CRM197A蛋白載體的C -末端間插入 了 GSGSG片段來進行連接，以此方法構建的蛋白稱為P30 - CRM197A - P30 - P30蛋白載體。
[0079] 二、CRM197A蛋白載體和含有萬能表位肽的P30CRM197A蛋白載體表達質粒的構建
[0080] 1、CRM197A蛋白載體表達質粒的構建
[0081] 從GenBank獲取CRM197蛋白完整氨基酸序列PRF:224021，確定CRM197蛋白的A 鏈片段，CRM197的氨基酸1 -193為CRM197的A鏈片段。以此為依據，對該片段的氨基酸的 核酸序列進行優化，以便在大腸桿菌表達系統中高效表達。采用自制的表達質粒，用Nde I 酶識別質粒位點CATATG，Bam HI酶識別位點GGATCC。經過CRM197A的基因序列進行分析， 在序列內，無 Nde I及Bam HI酶切位點。CRM197A蛋白基因合成序列如下：
[0082] CATATG
[0083] GGTGCGGACGACGTTGTGGACTCCTCAAAATCGTTTGTCATGGAAAACTTCAGCTCTTAT
[0084] CATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAGGGCATCCAAAAACCGAAGTCA
[0085] GGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAGGAATTCTACAGCACGGACAATAAGTAT
[0086] GATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGGTAAAGCAGGCGGTGTG
[0087] GTTAAGGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAAGGTCGATAACGCCGAA
[0088] ACCATTAAAAAGGAACTGGGCCTGTCTCTGACCGAACCGCTGATGGAACAAGTGGGTACG
[0089] GAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGTGCTGAGCCTGCCGTTT
[0090] GCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACAAGCAAAAGCTCTGTCA
[0091] GTTGAACTGGAAATCAATTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGTCAAGATGCTATGTATGAA
[0092] TATATGGCTCAGGCGTGTGCGGGCAATCGCGTCCGTCGCTAA
[0093] GGATCC
[0094] 將空白質粒和合成的CRM197A蛋白基因的PCR產物中，分別加入Nde I酶和Bam HI酶進行雙酶切反應；純化后，在連接體系中加入T4連接酶進行連接，完成后純化表達質 粒，并用PCR鑒定體系及酶切圖譜進行鑒定。用BL21(DE3)感受態細胞，將表達質粒轉化 至細胞內，篩選克隆。獲得陽性表達工程菌后，建立種子庫，包括主種子和工作種子。儲存 于-20°C以下冰箱中。
[0095] 2、含有萬能表位肽的P30CRM197A蛋白載體表達質粒的構建
[0096] 2 - 1、P30 - CRM197A蛋白載體表達質粒的構建
[0097] 采用自制的空白表達質粒，用Nde I酶識別質粒位點CATATG，Bam HI酶識別位點 GGATCC。經過P30CRM197A蛋白載體基因序列進行分析，在序列內，無 Nde I及Bam HI酶切 位點。P30 - CRM197A基因合成全序列如下：
[0098] CATATG
[0099] TTCAATAATTTTACGGTGTCGTTTTGGCTGCGTGTCCCGAAAGTCTCTGCGAGTCATCTG
[0100] GAAGGTTCTGGTAGCGGTGGTGCGGATGACGTGGTTGATAGCTCTAAATCTTTCGTTATG
[0101] GAAAACTTCAGTTCCTATCATGGCACCAAACCGGGTTACGTCGATTCGATTCAGAAAGGC
[0102] ATCCAAAAACCGAAAAGCGGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAAGAATTCTAC
[0103] TCAACGGACAACAAATACGATGCGGCCGGCTACTCCGTGGACAACGAAAATCCGCTGAGC
[0104] GGTAAAGCGGGCGGTGTCGTGAAAGTTACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTGCTGGCTCTG
[0105] AAAGTTGATAATGCGGAAACCATCAAAAAAGAACTGGGCCTGTCCCTGACCGAACCGCTG
[0106] ATGGAACAAGTGGGTACGGAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGACGGTGCCTCTCGCGTT
[0107] GTCCTGAGTCTGCCGTTTGCAGAAGGCTCATCGAGCGTCGAATACATTAACAATTGGGAA
[0108] CAAGCAAAAGCTCTGAGCGTGGAACTGGAAATCAACTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGT
[0109] CAGGATGCGATGTATGAATACATGGCGCAAGCCTGCGCAGGTAATCGTGTTCGTCGC
[0110] GGATCC
[0111] 將空白質粒和合成的P30-CRM197A蛋白基因的PCR產物中，分別加入Nde I酶和 Bam HI酶進行雙酶切反應；純化后，在連接體系中加入T4連接酶進行連接，完成后純化表 達質粒，并用PCR鑒定體系及酶切圖譜進行鑒定。用BL21(DE3)感受態細胞，將表達質粒轉 化至細胞內，篩選克隆，并用PCR鑒定體系及酶切圖譜進行鑒定。獲得陽性表達工程菌后， 建立種子庫，包括主種子和工作種子。儲存于-20°C以下冰箱中。
[0112] 2 - 2、CRM197AP30、P30CRM197AP30、P30P30CRM197A、CRM197AP30P30、 P30P30CRM197AP30、以及 P30CRM197AP30P30 蛋白表達質粒的構建：
[0113] 方法和上節"2 - UP30CRM197A蛋白表達質粒的構建"相同。
[0114] 三、含有萬能表位肽P30CRM197A蛋白載體和CRM197A蛋白載體的制備
[0115] 本發明的實驗結果表明，CRM197A蛋白載體和含有萬能表位肽的CRM197A蛋白載 體的特性相似；因此，這些蛋白載體的純化方法相似，以下以含有萬能表位肽的CRM197A蛋 白載體為例說明方法。
[0116] 1、表達含有萬能表位肽P30CRM197A蛋白載體工程菌的制備
[0117] 用分子生物學標準方法將各個表達蛋白載體的質粒轉入至感受態細胞內，并進行 表達檢定。篩選出蛋白表達量高，并且通過用抗血清檢定合格的克隆，建立主種子庫和工作 種子庫。
[0118] 2、含有萬能表位肽P30CRM197A蛋白載體表達工程菌的發酵
[0119] 從大腸桿菌工程菌工作種子庫低溫冰箱中，取出一支含有萬能表位肽P30CRM197A 蛋白載體的工作種子管，在室溫下解凍；將種子管中的菌液無菌轉移至50毫升的培養基 中，在37°C，搖速為180rpm的搖床中培養至0D_ = 1. 0左右；將菌液無菌接種至1升的培 養基中，在37°C，搖速為180rpm的搖床中培養至0D_= 1.0左右；接種種子液至50升發酵 罐中的20升培養基中，在37°C下，240rpm條件下進行發酵；當0D6QQ至7 - 8時，加入IPTG 誘導重組蛋白在細菌中合成；發酵至14小時后，停止發酵，離心，收集菌體待用。
[0120] 3、含有萬能表位肽的P30CRM197A蛋白載體的純化
[0121] 由于構建含有不同萬能表位肽的蛋白載體都是以CRM197A為主體，實驗表明，盡 管加入了萬能表位肽，但對蛋白純化的參數影響不大，只需要在純化CRM197A蛋白載體的 工藝參數上進行一些修飾，就可建立起其他含有萬能表位肽的CRM197A蛋白載體的純化方 法。
[0122] 稱重50g濕菌體于2升離心杯中，加入300mllxPBSpH7. 0的緩沖液混懸菌體，在磁 力攪拌器上攪拌混勻30min ;在4°C下，4000rpm，離心20min，棄上清，收集菌體；重復該步驟 兩次；加入300mllxPBSpH7. 0至菌體離心管，在均質機上進行破碎；在4°C下，lOOOOrpm，離 心20min，收集沉淀，棄上清液；加入300mll XPBSpH7. 0緩沖液，在磁力攪拌器上攪拌30min ; 在4°C下，4000rpm，離心20min，棄上清液，收集包涵體；加入900ml變性緩沖液至洗漆后的 包涵體，在25°C下，lOOOOrpm離心30min，收集上清液，棄沉淀；將離心上清液轉移至6 -8KD 透析袋中，封閉透析袋；置透析袋于10升復性緩沖液1中，室溫下，在磁力攪拌器上攪拌透 析過夜；次日將透析袋轉入10升復性緩沖液2中，室溫攪拌透析8 - 10小時；將透析袋轉 入10升復性緩沖液3中，室溫攪拌透析過夜；次日將透析袋轉入10升復性緩沖液4中，室 溫攪拌透析8 -10小時；將透析袋轉入10升復性緩沖液5中，室溫攪拌透析過夜；次日將透 析袋轉入2升儲備緩沖液中，室溫攪拌透析8 - 10小時；更換儲備緩沖液二次，室溫透析過 夜；取lml透析液，室溫12000rpm離心10min,收集上清，測蛋白質濃度；將蛋白溶液上樣至 預先平衡的DEAE膠柱，用等梯度洗脫，并收集目的蛋白峰；然后上樣至Phenyl疏水柱進一 步純化，收集洗脫峰；最后上樣SP膠柱，收集洗脫峰；將收集獲得的純化目的蛋白轉至透析 袋中，在0. 15M的氯化鈉中透析，完成后轉移至4°C下儲存待用。
[0123] 四、流行性腦膜炎球菌莢膜多糖的制備
[0124] 1、種子庫的建立
[0125] 由贈送獲得的流行性腦膜炎球菌A、C、W135、和Y群菌株作為原始種子株建立主種 子庫和工作種子。由于這4群腦膜炎球菌的培養特性相同，在這里同一敘述方法。
[0126] 取出原始種子的種子管，加入0. 5ml的流腦培養基將菌種混勻，取0. 25ml菌液接 種至l〇ml流腦培養液中。接種后的培養液管置于36°C ±1°C的培養搖床上，搖速120rpm， 培養12 - 20小時。待0D_至1. 0時，用接種環將菌液接種至流腦瓊脂培養基平皿上，置于 36°C ±1°C的培養箱內培養12 - 20小時。用接種環將接種的流腦瓊脂培養平皿上的1至 數個菌落接種于l〇ml的流腦培養液中，置于36°C ±1°C，在培養搖床上培養12小時，搖速 150 -200rpm。培養液中細菌0D_長到1. 0,取出5ml菌液接種到200ml的新鮮流腦培養液 中，置于36°C ±1°C的培養搖床上培養12小時左右，搖速150 -200rpm。0D6QQ至1.0時，將 細菌培養液以lml分裝于200個小試管中，離心（4000rpm，lOmin)，去除上清培養液，然后 加入0. 5ml的新鮮的流腦培養液和0. 5ml的無菌脫脂牛奶，混勻，在乙醇干冰上快速冷凍。 真空凍干，編號，作為主種子批保存于4°C冰箱內。取出主種子批建立，按照主種子建立方 法，將細菌培養液接種到另一個200ml的新鮮流腦培養液中，置于36°C ±1°C的培養搖床上 培養12小時，內培養12小時左右，搖速150 - 200rpm。待0D6QQ至1. 0時，將細菌培養液以 lml分裝于200個小試管中，離心（4000rpm，lOmin)，去除上清培養液，然后加入0. 6ml的新 鮮流腦培養液和〇. 4ml的40%甘油溶液，混勻。速凍于干冰上，作為工作種子保存于-70°C 低溫冰箱中。
[0127] 2、細菌發酵
[0128] 將流行性腦膜炎球菌工作種子接種到平皿培養基上，在36. 5°C培養箱過夜。取一 個流腦菌斑，接種到5毫升的新鮮流腦培養液中，在36. 5°C和300rpm細菌培養搖床培養。 當接種的培養液達到了指數生長中期，0D為0. 6 -1. 0,將菌液轉接到250毫升培養瓶中，其 中有45毫升的新鮮流腦培養液，在36. 5°C和300rpm細菌培養搖床培養。當接種的培養液 達到了指數生長中期，0D為0. 6 -1. 0,將菌液轉接到4升培養瓶中，其中有1升的新鮮流腦 培養液，在36. 5°C和300rpm細菌培養搖床培養。當菌液達到了指數生長中期（約10 - 12 小時），OD為0.6 - 1.0,將菌液轉接到發酵罐中，其中有20升的新鮮流腦培養液。當細菌 達到指數生長中期時，加入新鮮流腦培養液和補充培養液，培養了 20小時停止發酵。
[0129] 3、多糖純化
[0130] 將流腦菌液離心沉淀的菌體，懸浮在2升的蒸餾水中，用磁力攪拌器混勻。加入 200ml的12% Deoxycholatesodium溶液入細菌懸浮液中，攪拌混勻30分鐘，然后轉入到 10°C ±3°C冷柜中攪拌8-24小時，保證菌體完全裂解、多糖釋放出來。用50%的醋酸調 節細菌裂解液的pH值到6. 4-6. 8,溫度為20°C ±5°C，停止攪拌，靜置12-24小時。以 10, OOOrpm離心1小時，收集上清液，丟棄沉淀物，用0. 05M的磷酸鹽pH7. 0透析多糖上清 液。加入等體積的〇. 2% HB溶液，用磁力攪拌器混勻30分鐘，然后，轉入到4°C冷柜中靜置 過夜。以10, OOOrpm離心30min，收集沉淀，丟棄上清液，加入100ml的0. 5M氯化鈉溶液溶 解沉淀；加入680ml無水乙醇，混勻，然后，轉入到4°C冷柜中靜置過夜。以10, OOOrpm離心 30min，收集上清液，丟棄沉淀。加入5. 2升無水乙醇，混勻，然后，轉入到4°C冷柜中靜置過 夜。以10, OOOrpm離心30min，收集沉淀，丟棄上清液，加入500ml的蒸饋水溶解沉淀，透析。 凍干。
[0131] 步驟二：四種流行性腦膜炎球菌多糖P30CRM197A結合物的制備
[0132] 本發明采用ADH法來合成流行性腦膜炎球菌多糖P30CRM197A結合物，該方法分兩 個步驟，即多糖的衍化和結合物合成。
[0133] 一、流行性腦膜炎球菌A群多糖-P30 -CRM197A結合物（稱為MenA -P30 -CRM197A) 的合成
[0134] 1、流行性腦膜炎球菌A群多糖衍化
[0135] 將20mg的MenA多糖用4ml純水溶解后,加入溴化氰進行活化。向反應液中加入 10ml的ADH溶液，最終濃度為0. 4M，在2?8°C混合反應過夜。將反應液在0. 2mol/L氯化 鈉溶液中透析。將反應液上樣G-50柱，收集外水體積峰。將結合物溶液至于透析袋中，用 純水透析，冷凍真空干燥，得到固體的衍化多糖。多糖衍生物應保存在-20°C或以下。
[0136] 2、流行性腦膜炎球菌A群多糖-P30 - CRM197A結合物的合成
[0137] 稱取5mg衍化MenA多糖至反應瓶中，加入0. 5ml的0. 15MNaCl至反應瓶中，攪拌溶 解多糖，先在室溫下，然后轉至4°C下過夜，以保證多糖溶解完全，溶液中多糖濃度為20mg/ ml。用0. 45 μ m膜無菌過濾多糖溶液至反應瓶，用0. lMNaOH或者0. 1MHC1調節pH值至5. 5。 加入相當于5mg的P30CRM197A溶液至反應瓶中，攪拌混勻；加入2. 9mg的EDC至培養瓶中， 在室溫下攪拌反應4小時。轉移反應混合液至透析袋（MWC06 - 8000)，用0. 15MNaCl溶液， 4°C下透析，換液三次。上樣Sepharose CL-4B純化，收集外水體積峰。根據分析結果，合 并結合物峰值管。無菌過濾，儲存在4°C下待用。
[0138] 3、其它單價流行性腦膜炎球菌多糖-P30 - CRM197A結合物的合成
[0139] 參照上節"流行性腦膜炎球菌A群多糖-P30 -CRM197A結合物的合成"方法 來合成其它三種結合物，包括流行性腦膜炎球菌C群多糖-P30 - CRM197A結合物（稱 為MenC - P30 - CRM197A)、流行性腦膜炎球菌W135群多糖-P30 - CRM197A結合物（稱為 MenW135 - P30 - CRM197A)、以及流行性腦膜炎球菌Y群多糖-P30 - CRM197A結合物（稱為 MenY - P30 - CRM197A)。
[0140] 二、其它含有萬能表位肽P30的CRM197A蛋白載體的4種流行性腦膜炎球菌多糖 CRM197A結合物的合成
[0141] 參照"流行性腦膜炎球菌A群多糖-P30 -CRM197A結合物的合成"方法，用其它六 種含有萬能表位肽的蛋白載體，包括CRM197A -P30、P30 -CRM197A -P30、P30 -P30 -CRM197A、 CRM197A - P30 - P30、P30 - P30 - CRM197A - P30、P30 - CRM197A - P30 - P30、以及對照樣品合 成用蛋白載體 CRM197A，合成了其它結合物，即 MenA -CRM197A -P30、MenC -CRM197A -P30、 MenW135 - CRM197A - P30、MenY - CRM197A - P30 ;MenA - P30 - CRM197A - P30、 MenC - P30 - CRM197A - P30、MenW135 - P30 - CRM197A - P30、MenY - P30 - CRM197A - P30 ; MenA - P30 - P30 - CRM197A、MenC - P30 - P30 - CRM197A、MenW135 - P30 - P30 - CRM197A、 MenY - P30 - P30 - CRM197A ;MenA - CRM197A - P30 - P30、MenC - CRM197A - P30 - P30、 MenW135 - CRM197A - P30 - P30、MenY - CRM197A - P30 - P30 ;MenA - P30 - P30 - CRM197A - P30、 MenC - P30 - P30 - CRM197A - P30、MenW135 - P30 - P30 - CRM197A - P30、 MenY - P30 - P30 - CRM197A - P30 ;MenA - P30 - CRM197A - P30 - P3、 MenC - P30 - CRM197A - P30 - P30、MenW135 - P30 - CRM197A - P30 - P30、 MenY - P30 - CRM197A - P30 - P30。
[0142] 步驟三、4價流行性腦膜炎球菌多糖P30CRM197A結合物配制及免疫原性的評估
[0143] 一、4價流行性腦膜炎球菌多糖-P30 - CRM197A結合物的配制
[0144] 用 Millipore 的 Labscale 超濾系統將制備的 MenA - P30 - CRM197A、 MenC - P30 - CRM197A、MenW135 - P30 - CRM197A、以及 MenY - P30 - CRM197A 結合物溶液 濃縮至多糖濃度大約為1000 μ g/ml，然后用0.85 %的NaCl溶液稀釋并混合至每個群 多糖濃度為l〇〇yg/ml的4價流行性腦膜炎球菌多糖-P30 -CRM197A結合物（稱為 4Men - P30 - CRM197A)，用0. 22 μ m膜除菌過濾，加入無菌磷酸鋁佐劑，最終濃度為125mg/ ml，置于2 - 8°C冰箱中儲存待用。
[0145] 按照以上方法分別配制其它4價流行性腦膜炎球菌多糖P30CRM197A結合物：
[0146] 4Men - CRM197A - P30、4Men - P30 - CRM197A - P30、4Men - P30 - P30 - CRM197A、 4Men - CRM197A - P30 - P30、4Men - P30 - P30 - CRM197A - P30、以及 4Men - P30 - CRM197A - P30 - P30 結合物。
[0147] 二、免疫動物
[0148] 取5 -6周的KM57系小鼠240只，每支小鼠免疫注射制備的7種Men -P30CRM197A 結合疫苗，注射容量為〇. lml/支小鼠/次。每種結合疫苗設定為三組，即免疫注射一針、二 針和三針。
[0149] 采集小鼠血液至離心管，在室溫下靜置2小時，在lOOOOrpm條件下離心10分鐘， 用移液槍小心吸取離心上清血清，儲存于4°C冰箱中，待檢。
[0150] 三、ELISA法檢測小鼠血清中流腦多糖抗體IgG滴度及結合物免疫原性的評估
[0151] 配制特定血清群流腦莢膜多糖儲備液lmg/ml (1XPBS溶液中），存儲于冰箱。用包 被緩沖液稀釋至4 μ g/ml，加100 μ 1包被溶液到每一個孔中來包被ELISA板，在室溫下孵育 過夜。用洗板緩沖液洗4次，加入100 μ 1封閉緩沖液，在室溫下孵育2小時，用洗板緩沖液 洗4次，可在4°C下保存一周。
[0152] 將小鼠免疫結合疫苗及對照樣品獲得的待測血清，以1:10稀釋成工作樣品血清， 稀釋適當倍數，加入到ELISA板第一排孔內，總體積200 μ 1，從第一排開始向下進行二倍系 列稀釋，在室溫下孵育2小時。用洗板緩沖液洗4次，加入100 μ 1堿性磷酸酶標記羊抗鼠 抗體（1:2000稀釋），在室溫下孵育4小時。用洗板緩沖液洗4次，加入100 μ 1磷酸-4 -硝基苯酯二鈉鹽底物溶液，在405nm讀盤。
[0153] 下表為小鼠結合物免疫血清中多糖IgG抗體滴度結果表：
[0154]
【權利要求】
1. 一種增強4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方法，其特征在于： 步驟一：在白喉毒素變異體CRM197的A鏈（簡稱CRM197A)中加入萬能表位肽 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (簡稱P30)，通過基因重組工程菌來生產含有P30的CRM197A蛋白 載體（簡稱 P30CRM197A); 步驟二：將4種不同群的流行性腦膜炎球菌多糖，包括A、C、W135、和Y，通過共價鍵分別 與P30CRM197A蛋白載體連接形成4種單價流行性腦膜炎球菌多糖-P30CRM197A結合物； 步驟三：將步驟二獲得的4種單價流行性腦膜炎球菌多糖-P30CRM197A結合物進行混 合得到免疫原性增強的4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合物。
2. 根據權利要求1所述的增強4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方 法，其特征在于：在所述P30CRM197A中含有X個P30，K X < 3。
3. 根據權利要求1所述的增強4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方 法，其特征在于：在所述P30CRM197A蛋白載體中，Ρ30連結在CRM197A蛋白的Ν -末端或C -末端，或者同時連接在Ν -末端和C -末端。
4. 根據權利要求1、2或3所述的增強4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性 的方法，其特征在于：在P30CRM197A中所述Ρ30與CRM197A蛋白之間是通過GSGSG氨基酸 序列進行連接。
5. 根據權利要求1所述的增強4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方 法，其特征在于：所述基因重組工程菌是通過基因重組方法構建的大腸桿菌。
6. 根據權利要求1所述的增強4價流行性腦膜炎球菌多糖蛋白結合物免疫原性的方 法，其特征在于：所述流行性腦膜炎球菌多糖是通過分別培養4個不同群的流行性腦膜炎 球菌獲得的莢膜糖。
【文檔編號】A61K47/48GK104096226SQ201410199301
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年5月11日 優先權日:2014年5月11日
【發明者】李建平 申請人:江蘇康泰生物醫學技術有限公司