一種a群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥領域，具體地，涉及一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗 的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，Nm)是腦膜炎和爆發性敗血癥的首要 致病菌，流行性腦脊髓膜炎（以下簡稱為流腦）的發病常呈散發性，各病例之間并無明顯關 聯，通常以小規模方式爆發，在一些地區可轉變為災難性的、難以預料的地方性流行病。全 球每年流腦發病人數約為50萬，死亡5萬。Nm為需氧菌，革蘭染色陰性，有莢膜，一般成 對出現（雙球菌）。Nm根據莢膜多糖的化學組成可將其分成13個血清群，根據外膜蛋白 (Outer mem一brane protein，（MP)PorB和POrA的抗原性差異，又可分成不同的血清型和 血清亞型。A、B、C、Y和W135群腦膜炎球菌是主要的致病血清群，且血清群分布有顯著的地 理差異。在我國90 %以上的流腦病例是由A群腦膜炎奈瑟氏菌引起的。
[0003] 研究表明，A群腦膜炎球菌的莢膜多糖疫苗適用于2歲以上的兒童和成人。對于 小于18月齡的兒童，這種采用PRP的疫苗的有效率極低。
[0004] A群流腦結合疫苗的研制成功解決了疫苗在嬰幼兒中無效的問題。結合疫苗比以 往的多糖疫苗具有更強的免疫原性和更好的免疫效果，在嬰幼兒中非常有效，即使在小年 齡嬰兒中使用A群流腦結合疫苗，也是安全有效的。
[0005] 在A群流腦結合疫苗制備的過程中，目前普遍運用的制備方法是：利用液體發酵 的方法制備A群流腦菌液，殺菌后再經CDAP沉淀、乙醇沉淀、冷酚抽提、無水乙醇和丙酮洗 滌等步驟獲得精制A群流腦莢膜多糖，再用CNBr活化Hib莢膜多糖后連接己二酰肼，然后 在碳二亞胺的催化作用下A群流腦莢膜多糖通過己二酰肼的橋連作用與破傷風類毒素蛋 白結合，最后經凝膠過濾層析純化收集高分子多糖蛋白結合物，即為多糖蛋白結合疫苗原 液。
[0006] 目前，A群流腦結合疫苗制備的過程中，A群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的結合 多糖收率低。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題是提供一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的制 備方法，以克服現有A群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的結合多糖收率低的問題。
[0008] 此外，本發明還包括一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的制備方法的應用。
[0009] 本發明解決上述問題所采用的技術方案是： 一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的制備方法，包括以下步驟： Bl :將A群流腦莢膜多糖用注射用水稀釋成8mg/ml的溶液，恒溫至20°C，調節pH至 10. 50； B2 :加入與Bl所述多糖等質量的溴化氰進行活化處理，維持pHlO. 5活化20分鐘，調 節pH至8. 5 ; B3 :加入與BI所述多糖溶液等體積、等濃度的癸二酸二酰肼溶液進行偶聯反應，維持 pH8. 5反應15分鐘； B4 :將B3所得的反應物多次稀釋-超濾濃縮，去掉殘余溴化氰，得到A群流腦多糖-癸 二酸二酰肼衍生物； B5 :在M所得的A群流腦多糖-癸二酸二酰肼衍生物中加入與與Bl所述多糖等質量 的破傷風類毒素蛋白溶液，再用注射用水稀釋，使多糖終濃度為3mg/ml ; B6:將B5所得溶液混勻后置冰浴中，加入碳二亞胺粉末至終濃度為30 mmol / L，維 持pH5. 5,于2~8°C反應60分鐘，調PH至7. 0置2~8°C靜置10小時； B7:將B6所得的反應物經S印harose 4FF凝膠柱分離純化，收集V。附近的洗脫液，將 收集到的洗脫液除菌過濾，得到A群流腦莢膜多糖與載體蛋白的偶聯物。
[0010] 在莢膜多糖與破傷風類毒素蛋白結合過程中，橋連劑是非常重要的，通過橋連作 用可以克服莢膜多糖與破傷風類毒素蛋白的空間位阻，使多糖更容易與破傷風類毒素蛋白 通過共價鍵連接在一起。現有的結合疫苗使用的橋連劑是己二酰肼，己二酰肼分子兩端各 具有一個酰肼基，容易與活化后的多糖(或破傷風類毒素）生成酰胺鍵，共價連接在一起，目 前，A群流腦結合疫苗制備的過程中，己二酰肼連接到莢膜多糖上的效率很低，需要過量添 加，而制得的莢膜多糖-己二酰肼衍生物與破傷風類毒素蛋白結合的效率也不高，造成一 定的資源浪費，導致A群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的結合多糖收率低，本發明將傳統 使用的偶聯劑己二酰肼替換成癸二酸二酰肼，癸二酸二酰肼是一種結構與己二酰肼相似的 小分子化合物，區別在于碳鏈上多2個亞甲基，分子鏈更長，用作結合疫苗連接劑，更能克 服生物大分子相互間的空間位阻，提高結合收率。
[0011] -種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的制備方法的應用，將一種A群腦膜炎球 菌莢膜多糖結合疫苗的制備方法應用于A群流腦莢膜多糖與載體蛋白的偶聯物的制備。
[0012] 綜上，本發明的有益效果是： 本發明將癸二酸二酰肼作為A群流腦結合疫苗制備的過程中的偶聯劑，癸二酸二酰肼 相比己二酰肼在碳鏈上多2個亞甲基，分子鏈更長，更能克服生物大分子相互間的空間位 阻，提尚結合收率。
【具體實施方式】
[0013] 下面結合實施例，對發明作進一步地的詳細說明，但本發明的實施方式不限于此。
[0014] 實施例： 一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的制備方法，包括以下步驟： Bl :將A群流腦莢膜多糖用注射用水稀釋成8mg/ml的溶液，恒溫至20°C，調節pH至 10. 50 ； B2:加入與Bl所述多糖等質量的溴化氰進行活化處理，維持pHlO. 5活化20分鐘，調 節pH至8. 5 ; B3:加入與Bl所述多糖溶液等體積、等濃度的癸二酸二酰肼溶液進行偶聯反應，維持 pH8. 5反應15分鐘； B4:將B3所得的反應物多次稀釋-超濾濃縮，去掉殘余溴化氰，得到A群流腦多糖-癸 二酸二酰肼衍生物； B5 :在M所得的A群流腦多糖-癸二酸二酰肼衍生物中加入與與Bl所述多糖等質量 的破傷風類毒素蛋白溶液，再用注射用水稀釋，使多糖終濃度為3mg/ml ; B6 :將B5所得溶液混勻后置冰浴中，加入碳二亞胺粉末至終濃度為30 mmol / L，維 持pH5. 5,于8°C反應60分鐘，調PH至7. 0置8°C靜置10小時； B7 :將B6所得的反應物經S印harose 4FF凝膠柱分離純化，收集V。附近的洗脫液，將 收集到的洗脫液除菌過濾，得到A群流腦莢膜多糖與載體蛋白的偶聯物。
[0015]-種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的制備方法的應用，將一種A群腦膜炎球 菌莢膜多糖結合疫苗的制備方法應用于A群流腦莢膜多糖與載體蛋白的偶聯物的制備。
[0016]對得到的A群流腦莢膜多糖與載體蛋白的偶聯物取樣按藥典方法檢測多糖含量、 蛋白含量、游離多糖、相對分子質量，于8°C保存，共制備3批，結果如表1所示： 表1
另按同樣的方法使用己二酰肼作為偶聯劑，進行結合反應，制備結合疫苗原液即A群 流腦英I吳多糖與載體蛋白的偶聯物，各項指標如表2所;^;: 表2
本發明制備A群流腦莢膜多糖結合物的多糖收率在30%以上，與傳統結合方法15~ 20%的收率對比，多糖收率有很大的提高，節省了生產原料，使單劑成品疫苗的人力、原料、 能源成本得到很大程度的降低。
[0017]如上所述，可較好的實現本發明。
【主權項】
1. 一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： Bl :將A群流腦莢膜多糖用注射用水稀釋成8mg/ml的溶液，恒溫至20°C，調節pH至 10. 50 ； B2 :加入與Bl所述多糖等質量的溴化氰進行活化處理，維持pHlO. 5活化20分鐘，調 節pH至8. 5 ; B3 :加入與Bl所述多糖溶液等體積、等濃度的癸二酸二酰肼溶液進行偶聯反應，維持 pH8. 5反應15分鐘； B4 :將B3所得的反應物多次稀釋-超濾濃縮，去掉殘余溴化氰，得到A群流腦多糖-癸 二酸二酰肼衍生物； B5 :在M所得的A群流腦多糖-癸二酸二酰肼衍生物中加入與與Bl所述多糖等質量 的破傷風類毒素蛋白溶液，再用注射用水稀釋，使多糖終濃度為3mg/ml ; B6 :將B5所得溶液混勻后置冰浴中，加入碳二亞胺粉末至終濃度為30 mmol / L，維 持pH5. 5,于2~8°C反應60分鐘，調PH至7. 0置2~8°C靜置10小時； B7 :將B6所得的反應物經S印harose 4FF凝膠柱分離純化，收集V。附近的洗脫液，將 收集到的洗脫液除菌過濾，得到A群流腦莢膜多糖與載體蛋白的偶聯物。2. -種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的制備方法的應用，其特征在于，將權利要 求1所述的一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的制備方法應用于A群流腦莢膜多糖與 載體蛋白的偶聯物的制備。
【專利摘要】本發明涉及一種A群腦膜炎球菌莢膜多糖結合疫苗的制備方法及應用，制備方法包括以下步驟：A群流腦莢膜多糖的稀釋、活化、與癸二酸二酰肼偶聯到A群流腦多糖-癸二酸二酰肼衍生物；再將A群流腦多糖-癸二酸二酰肼衍生物與破傷風類毒素溶液在碳二亞胺的催化反應得到A群流腦莢膜多糖與載體蛋白的偶聯物。本發明將癸二酸二酰肼作為A群流腦結合疫苗制備的過程中的偶聯劑，癸二酸二酰肼相比己二酰肼在碳鏈上多2個亞甲基，分子鏈更長，更能克服生物大分子相互間的空間位阻，提高結合收率。
【IPC分類】A61P31/04, A61K39/385, A61K39/095
【公開號】CN105031643
【申請號】CN201510543858
【發明人】伍長華, 王乾, 李洪光
【申請人】成都歐林生物科技股份有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年8月31日