一種用于腫瘤局部治療的負載雙藥物的觸變性水凝膠及其制備方法
【專利摘要】本發明屬于生物醫藥【技術領域】，具體為一種用于腫瘤局部治療的負載雙藥物的觸變性水凝膠及其制備方法。本發明的觸變性可注射水凝膠，可用于局部注射(包括但不限于瘤內注射、瘤旁注射等)治療腫瘤。本發明的觸變性可注射水凝膠由絲素蛋白和羥丙基纖維素組成。其中絲素蛋白質量百分數為1.2~18%，羥丙基纖維素質量百分數為0.2~8%，絲素蛋白和羥丙基纖維素的質量比為1.5~9。抗癌藥物為姜黃素和鹽酸阿霉素，其中姜黃素的濃度為60~1900μg/mL，鹽酸阿霉素的濃度為10~3200μg/mL。所述載藥水凝膠具有觸變可注射性以及長時間的藥物緩釋效果。
【專利說明】一種用于腫瘤局部治療的負載雙藥物的觸變性水凝膠及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥【技術領域】，具體涉及一種用于腫瘤局部治療的負載雙藥物的觸變性水凝膠及其制備方法。
【背景技術】
[0002]癌癥是導致人類死亡的一個主要原因，目前每年在全球奪去800多萬人的生命。系統的化療是現今臨床治療癌癥的一個主要方法，然而通過靜脈注射化療藥物進行系統給藥存在很大的缺陷:首先，靜脈注射最大耐受量的抗腫瘤藥物會對健康器官造成嚴重的損傷，比如心肌癥、白血球減少等；其次，由于系統給藥不具有靶向性，并且需要克服諸如血液循環系統、網狀內皮組織等各種屏障，從而降低了化療藥物的治療效率。而腫瘤局部給藥由于可以提高病變部位的藥物濃度同時減小對健康器官的損傷而引起越來越多的關注。其中瘤內注射采用將化療藥物直接作用于腫瘤靶點，不僅大大提高了藥物的作用效率，而且降低了系統毒性。
[0003]水凝膠是一種能夠吸水并保有大量水分的具有交聯網絡結構的聚合物，其中可注射式水凝膠由于可以避免外科手術風險而被廣泛研究。可注射水凝膠負載藥物可以緩慢釋放藥物，從而達到減少給藥次數，降低毒副作用并減輕病痛的目的；調節水凝膠的結構還可以調控藥物釋放的速率，達到最佳的治療效果。因此水凝膠藥物載體十分適合用于局部注射治療腫瘤。然而，原位形成的可注射式水凝膠由于采用將液態前驅體注入體內形成凝膠，存在著液態前驅體滲漏到周圍組織而產生炎癥的風險，并且體內復雜的環境(如溫度、離子強度和其他物質的存在等)可能會影響凝膠的形成乃至其最終的結構。觸變性水凝膠則可以克服上述缺點。觸變性水凝膠是預先在體外形成凝膠，這種凝膠在剪切力作用下具有剪切變稀的性質，因此具有可注射性；當剪切力撤除后又會回復到之前凝膠狀的非流動態。
[0004]阿霉素(Doxorubicin, Adriamycin)由于其高效和廣譜的抗腫瘤效果而被臨床廣泛用于腫瘤化療，然而阿霉素對正常組織具有很大的毒副作用，尤其會產生心臟毒性，并且阿霉素易產生多藥耐藥性，使其使用劑量受到很大限制。姜黃素(Curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃、莪術或郁金等的根莖中提取出來的一種脂溶性酚類色素，具有抗炎、抗氧化和抗癌等藥理作用，而且迄今為止尚未發現姜黃素的毒副作用。有研究表明，姜黃素和阿霉素同時使用可以起到協同的抗腫瘤效果:不僅提高了抗腫瘤效果，而且降低了阿霉素的多藥耐藥性并且對其產生的心臟毒性有顯著改善。但是姜黃素在水中溶解度極低(11 ng/mL),導致其生物利用度差，限制了臨床使用。本發明制備了一種觸變性可注射水凝膠，不僅能同時負載鹽酸阿霉素和姜黃素，而且能起到協同抗腫瘤的效果。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種同時載有親水性鹽酸阿霉素和疏水性姜黃素兩種抗腫瘤藥物的觸變性可注射水凝膠及其制備方法，凝膠制備和載藥的工藝簡單并且環保，所制備的凝膠具有良好的生物相容性和生物降解性，能在較長時間內緩釋藥物。
[0006]本發明提供的負載親水性和疏水性抗腫瘤藥物的觸變性水凝膠水凝膠，其組分為:絲素蛋白、羥丙基纖維素和水，負載的抗腫瘤藥物組分為姜黃素和鹽酸阿霉素。
[0007]本發明中，水凝膠中絲素蛋白質量分數為1.2~18%，其中優選為1.3~17%，最優選為1.4~16% ;羥丙基纖維素質量分數為0.2~8%，其中優選為0.3~7%，最優選為0.4%~6％ ;絲素蛋白和羥丙基纖維素的質量比為1.5、，其中優選為1.9~5.7，最優選為2.3~4。
[0008]本發明中，載藥水凝膠中抗癌藥物姜黃素的濃度為60~l900 yg/mL，優選為200~1700 μ g/mL，最優選為300-1500 μ g/mL ;鹽酸阿霉素的濃度為10~3200 yg/mL，優選為 20~3000 μ g/mL，最優選為 30~2800 μ g/mL。
[0009]本發明所述負載親水性和疏水性抗腫瘤藥物的觸變性水凝膠的制備方法，具體步驟如下:
(1)將姜黃素粉末溶于0.5 mol/L氫氧化鈉水溶液中，加入質量分數2~20%絲素蛋白溶液中，混合均勻，姜黃素終濃度為100-2100 μ g/mL，加入0.1 mol/L鹽酸溶液調節pH到
7.2，得到姜黃素/絲素蛋白混合溶液；
(2)將鹽酸阿霉素溶于質量分數2~20%羥丙基纖維素水溶液中，混合均勻，鹽酸阿霉素終濃度為100-8000 μ g/mL，得到鹽酸阿霉素/羥丙基纖維素混合溶液；
(3)將步驟(1)和步驟(2)所得具有相同質量分數的姜黃素/絲素蛋白溶液和鹽酸阿霉素/羥丙基纖維素溶液以質量比1.5、混合，其中優選為1.9^5.7，最優選為2.3~4。混合液中絲素蛋白的質量分數為1.2~18%，其中優選為1.3~17%，最優選為1.Π6% ;羥丙基纖維素質量分數為0.2~8%，其中優選為0.3~7%，最優選為0.4~6％。混合液于37 °C恒溫，1~3小時形成水凝膠。載藥水凝膠中抗癌藥物姜黃素的濃度為60-1900 118/1^，優選為200~1700μ g/mL，最優選為300-1500 μ g/mL ;鹽酸阿霉素的濃度為10~3200 μ g/mL，優選為20~3000μ g/mL,最優選為 30~2800 μ g/mL。
[0010]本發明具有以下優點:
(1)本發明所述水凝膠的原料為來源廣泛的絲素蛋白和羥丙基纖維素，二者都是經過FDA認證能用于體內的材料，所獲得的水凝膠具有良好的生物相容性和生物降解性。
[0011](2)本發明所述制備水凝膠的方法只需通過37°C加熱，工藝簡便，制備過程未用到任何有機溶劑，綠色環保，生物安全性也得以保持。
[0012](3)本發明所述絲素蛋白溶液對疏水性藥物姜黃素具有明顯的增溶作用。
[0013](4)本發明所述水凝膠的形成過程同時負載親水性鹽酸阿霉素和疏水性姜黃素藥物，載藥方法簡單，載藥量高。
[0014](5)本發明制備的載藥水凝膠能夠實現28天持續釋放藥物，達到了長期緩釋的效果O
[0015](6)本發明制備的載藥水凝膠具有觸變性，可用于局部注射(包括但不限于瘤內注射、瘤旁注射等)治療惡性腫瘤。
[0016](7)本發明制備的載藥水凝膠能夠通過調控固含量來調控藥物的釋放速率。
[0017](8)本發明制備的載藥水凝膠能夠通過負載鹽酸阿霉素和姜黃素兩種藥物起到協同效果，可以降低阿霉素用量，進而減少相應的毒副作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為雙載藥水凝膠的制備及使用示意圖。
[0019]圖2從左到右依次為絲素蛋白/羥丙基纖維素水凝膠，載鹽酸阿霉素的絲素蛋白/羥丙基纖維素水凝膠，載姜黃素的絲素蛋白/羥丙基纖維素水凝膠，載鹽酸阿霉素和姜黃素的絲素蛋白/羥丙基纖維素水凝膠。
[0020]圖3為載藥絲素蛋白/羥丙基纖維素水凝膠具有可注射性(觸變性)。
[0021]圖4為載鹽酸阿霉素和姜黃素的絲素蛋白/羥丙基纖維素水凝膠的流變剪切-回復曲線。
[0022]圖5 為三種不同固含量(5%、7%、9%)雙載藥(200 μ g/mL Dox和 1050 μ g/mL Cur)絲素蛋白/羥丙基纖維素凝膠的體外藥物釋放曲線。
[0023]圖6為載藥絲素蛋白/羥丙基纖維素凝膠體外對人肝癌細胞HepG2的抑制效果。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖及實施例對本發明作進一步詳細的說明:
實施例1
(I)姜黃素粉末溶于0.5 mol/L氫氧化鈉水溶液中，加入質量分數2%絲素蛋白溶液中，混合均勻，加入0.1 mol/L鹽酸溶液調節pH到7.2，得到姜黃素濃度為100 μ g/mL的姜黃素/絲素蛋白水溶液。
[0025](2)鹽酸阿霉素溶于質量分數2%羥丙基纖維素水溶液中，混合均勻，得到鹽酸阿霉素濃度為100 μ g/mL的阿霉素/輕丙基纖維素水溶液。
[0026](3)將步驟(1)和步驟(2)所得具有相同質量分數的絲素蛋白溶液和羥丙基纖維素溶液以質量比6:4混合，最終混合溶液中絲素蛋白質量分數為1.2%，羥丙基纖維素的質量分數為0.8%，姜黃素濃度為60 μ g/mL,鹽酸阿霉素濃度為40 μ g/mL。于37°C恒溫，3小時形成載藥水凝膠。
[0027]實施例2
(I)姜黃素粉末溶于0.5 mol/L氫氧化鈉水溶液中，加入質量分數20%絲素蛋白溶液中，混合均勻，加入0.1 mol/L鹽酸溶液調節pH到7.2，得到姜黃素濃度為2100 μ g/mL的姜黃素/絲素蛋白水溶液。
[0028](2)鹽酸阿霉素粉末溶于質量分數20%羥丙基纖維素水溶液中，混合均勻，得到鹽酸阿霉素濃度為8000 μ g/mL的阿霉素/羥丙基纖維素水溶液。
[0029](3)將步驟(1)和步驟(2)所得具有相同質量分數的絲素蛋白溶液和羥丙基纖維素溶液以質量比9:1混合，最終混合溶液中絲素蛋白質量分數為18%，羥丙基纖維素的質量分數為2%，姜黃素濃度為1890 μ g/mL，鹽酸阿霉素濃度為800 μ g/mL。置于37°C恒溫水浴中，I小時形成載藥水凝膠。
[0030]實施例3
(I)姜黃素粉末溶于0.5 mol/L氫氧化鈉水溶液中，加入質量分數2%絲素蛋白水溶液中，混合均勻，加入0.1 mol/L鹽酸溶液調節pH到7.2，得到姜黃素濃度為200 μ g/mL的姜黃素/絲素蛋白水溶液。
[0031](2)鹽酸阿霉素粉末溶于質量分數2%羥丙基纖維素水溶液中，混合均勻，得到鹽酸阿霉素濃度為100 μ g/mL的阿霉素/羥丙基纖維素水溶液。
[0032](3)將步驟(1)和步驟(2)所得具有相同質量分數的絲素蛋白溶液和羥丙基纖維素溶液以質量比9:1混合，最終混合溶液中絲素蛋白質量分數為1.8%，羥丙基纖維素的質量分數為0.2%，姜黃素濃度為180 μ g/mL，鹽酸阿霉素濃度為10 μ g/mL。于37°C恒溫，3小時形成水凝膠。
[0033]實施例4
(I)姜黃素粉末溶于0.5 mol/L氫氧化鈉水溶液中，加入質量分數20%絲素蛋白溶液中，混合均勻，加入0.1 mol/L鹽酸溶液調節pH到7.2，得到姜黃素濃度為1800 μ g/mL的姜黃素/絲素蛋白水溶液。
[0034](2)鹽酸阿霉素粉末溶于質量分數20%羥丙基纖維素水溶液中，混合均勻，得到鹽酸阿霉素濃度為8000 μ g/mL的阿霉素/羥丙基纖維素水溶液。
[0035](3)將步驟(1)和步驟(2)所得具有相同質量分數的絲素蛋白溶液和羥丙基纖維素溶液以質量比6:4混合，最終混合溶液中絲素蛋白質量分數為12%，羥丙基纖維素的質量分數為8%，姜黃素濃度為1080 μ g/mL,鹽酸阿霉素濃度為3200 μ g/mL。于37°C恒溫，I小時形成水凝膠。
[0036]實施例5
(I)姜黃素粉末溶于0.5 mol/L氫氧化鈉水溶液中，加入質量分數為5%的絲素蛋白溶液中，混合均勻，加入0.1 mol/L鹽酸溶液調節pH到7.2，得到姜黃素濃度為1500 μ g/mL的姜黃素/絲素蛋白水溶液。
[0037](2)鹽酸阿霉素粉末溶于質量分數為5%的羥丙基纖維素水溶液中，混合均勻，得到鹽酸阿霉素濃度為667 μ g/mL的阿霉素/羥丙基纖維素水溶液。
[0038](3)將步驟(1)和步驟(2)所得具有相同質量分數的絲素蛋白溶液和羥丙基纖維素溶液以質量比7:3混合，最終得到的混合溶液中絲素蛋白質量分數為3.5%，羥丙基纖維素的質量分數為1.5% ;姜黃素濃度為1050 μ g/mL,鹽酸阿霉素濃度為200 μ g/mL。于37°C恒溫，1.5小時形成水凝膠。
[0039]實施例6
將實施例5所制備的負載雙抗腫瘤藥物的水凝膠100 μ L浸入I mL含0.1%體積吐溫80的磷酸緩沖溶液(ρΗ=7.4)緩沖液中，在37°C以100 r/min的速度震蕩，在預設的時間點取出磷酸緩沖溶液用于釋放藥物測量，加入I mL新鮮磷酸緩沖溶液(含0.1%體積吐溫80)，每個樣品設置3個平行樣。藥物含量采用高效液相色譜測量，分別測定鹽酸阿霉素在485 nm，姜黃素在425 nm處的吸光度，計算藥物累計釋放率。釋放曲線見圖。從圖5中可以看出，水凝膠中藥物可以實現長期(四周)緩慢釋放。
[0040]實施例7
(I)姜黃素粉末溶于0.5 mol/L氫氧化鈉水溶液中，加入質量分數5%的絲素蛋白溶液中，混合均勻，加入0.1 mol/L鹽酸溶液調節pH到7.2，得到姜黃素濃度為1500 μ g/mL的姜黃素/絲素蛋白水溶液。
[0041](2)鹽酸阿霉素粉末溶于質量分數分別為5%的羥丙基纖維素水溶液中，混合均勻，得到鹽酸阿霉素濃度分別為667 μ g/mL的阿霉素/羥丙基纖維素水溶液。
[0042](3)鹽酸阿霉素粉末溶于質量分數分別為5%的羥丙基纖維素水溶液中，混合均勻，得到鹽酸阿霉素濃度分別為1667 μ g/mL的阿霉素~羥丙基纖維素溶液。
[0043](4)將步驟(1)所得絲素蛋白溶液和具有相同質量分數的羥丙基纖維素溶液以質量比7:3混合，得到混合溶液中絲素蛋白質量分數為3.5%，羥丙基纖維素的質量分數為1.5%，姜黃素濃度為1050 μ g/mL。于37°C恒溫，1.5小時形成水凝膠(gC105)。
[0044](5)將絲素蛋白溶液和步驟(2)所得具有相同質量分數的羥丙基纖維素溶液以質量比7:3混合，得到混合溶液中5%絲素蛋白質量分數為3.5%，羥丙基纖維素的質量分數為1.5%，鹽酸阿霉素濃度為200 μ g/mL。于37°C恒溫，1.5小時形成水凝膠(gD20)。
[0045](6)將絲素蛋白溶液和步驟(2)所得具有相同質量分數的羥丙基纖維素溶液以質量比7:3混合，得到混合溶液中5%絲素蛋白質量分數為3.5%，羥丙基纖維素的質量分數為
1.5%，鹽酸阿霉素濃度為500 μ g/mL。于37°C恒溫，1.5小時形成水凝膠(gD50)。
[0046](7)將步驟(1)和步驟(2)所得具有相同質量分數的絲素蛋白溶液和羥丙基纖維素溶液以質量比7:3混合，得到混合液中絲素蛋白質量分數為3.5%，羥丙基纖維素的質量分數為1.5%，姜黃素濃度為1050 μ g/mL,鹽酸阿霉素濃度為200 μ g/mL。于37°C恒溫，1.5小時形成水凝膠(gD20C105)。
[0047](8)將具有相同質量分數的絲素蛋白溶液和羥丙基纖維素溶液以質量比7:3混合，得到混合液中絲素蛋白質量分數為3.5%，羥丙基纖維素的質量分數為1.5%。于37°C恒溫，1.5小時形成水凝膠(gel)。
[0048](9)將密度為2X 14個/mL的H印G2細胞懸液ImL接種于24孔transwell培養板下部，置于37°C、5%C 02、飽和濕度的細胞培養箱中培養24小時。使用步驟(4) (5) (6)
(7)(8)所述凝膠 100 μ L 及 100 μ L 20 μ g/mL 和 200 μ g/mL 鹽酸阿霉素(free D2 和free D20)加入transwell嵌套膜內，置于上述種有細胞的24孔板中。在不同時間點每孔加入50 μ L Alarmablue,培養12小時用酶標儀在560 nm和630 nm測定吸光度。后吸出Alarmablue試劑,每孔加入I mL培養基繼續培養。在第6天吸出Alarmablue后除對照組外每孔重新加入I X 14個H印G2細胞模擬腫瘤再生，每孔加入I mL培養基繼續培養。由圖6可以看出，加入鹽酸阿霉素(free D2和free D20)的細胞在第6天后出現明顯增殖,而負載藥物的水凝膠則顯示出長期的抑制效果。負載兩種藥物的水凝膠(gD20C105)比負載相同量一種藥物的水凝膠效果好，且能達到負載高含量阿霉素(gD50)水凝膠的效果。
【權利要求】
1.一種用于腫瘤局部治療的負載雙抗癌藥物的觸變性可注射水凝膠，其特征在于:水凝膠的組分為絲素蛋白、羥丙基纖維素和水，抗癌藥物組分為姜黃素和鹽酸阿霉素。
2.按照權利要求1所述用于腫瘤局部治療的負載雙抗癌藥物的觸變性可注射水凝膠，其特征在于:水凝膠中，絲素蛋白質量分數為1.2~18% ;羥丙基纖維素質量分數為0.2^8% ；絲素蛋白和羥丙基纖維素的質量比為1.5~9。
3.按照權利要求1所述用于腫瘤局部治療的負載雙抗癌藥物的觸變性可注射水凝膠，其特征在于:載藥水凝膠中抗癌藥物姜黃素的濃度為60-1900 μ g/mL,鹽酸阿霉素的濃度為 10~3200 μ g/mL。
4.一種如權利要求1、2或3所述的觸變性可注射水凝膠的制備方法，其特征在于具體步驟為: (1)將姜黃素粉末溶于0.5 mo I/L氫氧化鈉水溶液中，加入質量分數2~20%絲素蛋白溶液，混合均勻，加入0.1 mol/L鹽酸溶液調節pH到7.2，得到姜黃素/絲素蛋白混合溶液； (2)將鹽酸阿霉素粉末溶于質量分數2~20%羥丙基纖維素水溶液中，混合均勻，得到阿霉素/羥丙基纖維素混合溶液； (3)將具有相同質量分數絲素蛋白和羥丙基纖維素的兩種混合溶液混合，于37°C恒溫，1-3小時形成載藥水凝膠。
【文檔編號】A61K31/12GK104069120SQ201410254477
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】邵正中, 曹涵, 楊宇紅, 陳新 申請人:復旦大學