細胞支架構建體的制作方法

細胞支架構建體的制作方法
【專利摘要】本發明涉及使用接種有獲自自體來源的細胞的支架而進行的層狀結構的體腔器官或組織結構的再生、重建、修復、擴張或替換。
【專利說明】細胞支架構建體
[0001] 本申請是基于申請日為2009年11月4日， 優先權日:為2008年11月4日，申請號 為200980153634. 8 (PCT/US2009/063306)，發明名稱為："細胞支架構建體"的專利申請的 分案申請。

【技術領域】
[0002] 本發明涉及使用接種有獲自自體來源的細胞的支架而進行的層狀結構的體腔器 官或組織結構的再生、重建、修復、擴張或替換。

【背景技術】
[0003] -些畸形可導致膀胱發育異常并需要進行手術擴張。例如后尿道瓣膜、雙側輸尿 管異位、膀胱外翻、生殖腔外翻和脊柱裂（即脊髓脊膜突出）的病癥會使膀胱變得順應性 差，從而導致膀胱容量變小并產生較高的壓力。在臨床上，這會使患者發生失禁，并增加由 于泌尿系統壓力過高而導致的腎衰竭的風險。目前對這些兒童患者的標準治療是通過腸膀 胱成形術進行的膀胱擴張（Lewis et al. Br. J. Urol. (1990) ;65:488-491)。膀胱擴張包括 從患者的大腸上取一部分，并將該組織連接到已經存在的膀胱上，以增加順應性、降低壓力 和增加容量。這一手術相當復雜和昂貴。即使手術在技術上很成功，在手術過程中也會伴隨 各種中間風險，患者還可能發生慢性并發癥。這些手術的侵入性、花費和并發癥使得該手術 只能被限制用于最嚴重的膀胱缺陷患者。對成人進行的類似手術過程是針對通常由于膀胱 癌而需要進行膀胱替換的患者進行。對成人而言，需要切除整個膀胱并用大腸來替換。盡 管具有不利影響的風險，每年在美國仍完成10, 〇〇〇例這樣的手術，其中約10%為患有先天 性畸形的兒童，90%為患有后天失調例如膀胱癌的成年人。在醫學上，顯然迫切地需要改進 的方法來消除或至少大大減少由現行標準的護理引起的不利影響。
[0004] 在人類尿膀胱是一個肌性膜性的囊，位于盆腔前部并作為尿液的儲存裝置，它通 過輸尿管接收尿液并通過尿道排出尿液。在人類中，膀胱位于盆腔中的髖骨（恥骨聯合）的 后方，由膀胱向下和向后連接到被稱為尿道的引流管，尿道開口到體外。膀胱會發生多種疾 病和損傷，這引起了患者的膀胱惡化。例如，膀胱惡化可能由傳染性疾病、腫瘤和發育異常 導致。此外，膀胱惡化也可能由創傷（例如車禍和運動損傷）所導致。常常有必要對膀胱癌 患者實行尿流改道。在美國每年新增超過54, 000例的膀胱癌病例。大多數膀胱癌為上皮 細胞起源，全世界每年新增約336, 000例尿路上皮癌（移行細胞癌（TCC) MKakizoe (2006) Cancer Sci. 97(9)821)。
[0005] 當個體由于泌尿系統損傷或功能喪失而不能排尿時，尿流改道是一種引導尿液從 體內排出的方法。通常，任何阻礙尿液流動并增加輸尿管和/或腎內的壓力的病癥都可能 需要尿流改道。一些需要尿流改道的適應癥包括需要進行膀胱切除術的膀胱癌、損害腎 功能的神經性膀胱功能障礙、膀胱的輻射損傷、女性的不可控性失禁以及慢性骨盆疼痛綜 合征。通常對于尿流改道有兩種主要的策略：尿道再造術（urostomy)和可控性尿流改道 (continent diversion)。尿道再造術包括在腹部制造一個與體內管道相通的開孔，所述體 內管道例如小腸粘膜下層（SI)的一小段，例如回腸、結腸或空腸。在這種方法中，所述短 SI的另一端與輸尿管相連接，輸尿管正常情況下是將尿液從腎運輸至膀胱。尿液通過輸尿 管流入所述短SI，然后通過所述開孔流至體外的收集袋中。這種方法的另一種替代方案是 將輸尿管直接與所述開孔相連接，這也稱為輸尿管造瘺術（ureterostomy)。可控性尿流改 道包括在胃或小腸或大腸部位在體內制造一個袋或儲存裝置，這樣可能需要或不需要再使 用開孔。例如，可以取一段腸子并將其改造為更接近球形的形狀，從而制造可控性皮膚儲存 裝置。所述經過改形的區段的一端與輸尿管連接，另一端與開孔連接并通向體外的收集袋。 最后，將所述經過改形的區段放置在原來膀胱的位置，將其一端與輸尿管連接，另一端與尿 道連接，這樣就完成了原位尿流改道，使得個體可以通過尿道排尿，而不必再通過所述開孔 排尿。
[0006] 雖然小腸粘膜下層（SI)可用于尿流改道，但據報道除去粘膜和粘膜下層會使腸 區段發生收縮（參見例如Atala，A.，J. Urol. 156:338 (1996))。其他已有報道的由于使用胃 腸區段進行膀胱手術的問題包括：形成結石、粘液產生增多、腫瘤形成、感染、代謝紊亂、長 時間攣縮和吸收。已經表明，使用天然材料進行尿流改道時，由于膀胱組織具有其特殊的肌 肉彈性以及尿道上皮的不透性功能，使其并不容易被替換。此外，使用患者自身的腸區段進 行尿流改道需要進行至少兩個不同的手術過程，第一個手術是取出腸區段，第二個手術是 安裝尿流改道。由于需要多個手術，從而增加了手術的總成本、患者的風險以及患者的總體 不適程度。
[0007] 因此，鑒于與使用胃腸區段進行尿道改道相關的多種并發癥以及需要多次手術過 程，仍然需要方法和裝置來為需要尿道改道系統的患者提供這類系統。
[0008] 尿失禁是一個普遍的問題，會發生于所有年齡和身體健康水平的人群，無論在 社區還是在醫療機構中都會發生。醫學上，尿失禁容易使患者發生尿路感染，褥瘡，會陰 部紅疹和尿膿毒癥。在社會學和心理學層面，尿失禁會引起尷尬、社會歧視、抑郁癥，以 及尤其是對老年人而言會引起寄居機構的風險增加（^^20 6丨31.，4]111.1^￥.661'0111：〇1· Geriatrics, 9:74 (1989))。在經濟上，關于尿失禁的花費也是驚人的，僅美國每年花在關于 失禁方面的費用就超過百億美元。
[0009] 尿失禁可以歸因于真性的尿壓力（膀胱及尿道過度活動）或固有的括約肌功能障 礙（"ISD"）或兩種原因均有。尿失禁在婦女中尤其常見，并在較少程度上存在于兒童（特 別是ISD)和接受了前列腺根除術的男性。
[0010] 應激性尿失禁是不自主的尿液流失，發生于增加腹內壓的物理活動的過程中，例 如在咳嗽，打噴嚏，大笑或運動時。一個人可能患有上述兩種類型的尿失禁中的一種或兩種 均有，當兩種均有時，就被稱為混合性尿失禁。雖然對尿失禁已有了一些認識，但是在大多 數情況下的急迫性尿失禁是特發性的，這意味著具體原因無法確定。尿失禁可能發生在任 何年齡的任何人群，并且在女性和老年人群中更為常見。
[0011] 逼尿肌是膀胱壁肌肉，它的收縮使得尿液從膀胱排出。逼尿肌功能異常例如逼尿 肌反射亢進的結果包括膀胱順應性變差、膀胱內壓力升高和膀胱容量減小，所有這些結果 都可能導致上尿路惡化。
[0012]目前治療急迫性尿失禁的一種方法是注射神經毒素，例如肉毒桿菌毒素，例如 Botox敗據認為，肉毒桿菌毒素通過麻痹膀胱壁上的逼尿肌或者可能影響膀胱傳入途徑 和減少膀胱上皮下神經中感覺受體，從而發揮對膀胱活動過度的效果。肉毒桿菌毒素分子 的大尺寸可以限制其擴散能力，從而防止其達到傳入和傳出神經纖維。因此，當前治療膀胱 活動過度癥（OAB)的方法例如需要許多次地（通常是20至50次）將肉毒桿菌毒素注射進 膀胱壁肌肉，從而增加了就醫次數和相關的治療費用。此外，慢性地和長期地抑制從膀胱釋 放的感覺神經遞質的安全性尚未確定。
[0013] 其他治療尿失禁的方法涉及給予具有膀胱松弛特性的藥物，抗膽堿能藥物是此類 藥物的主要代表。例如，抗膽堿藥例如普魯本辛（propantheline bromide),或者平滑肌松 弛劑/抗膽堿能藥物的組合例如消旋奧昔布寧和dicyclomin的組合，已被用來治療尿失禁 (參見例如，A. J. Wein，Urol. Clin. N. Am.，22:557 (1995))。然而，這種藥物治療經常不能夠 對所有類型的尿失禁患者均獲得完全的成功，并且經常導致患者出現明顯的副作用。
[0014] 除了藥物療法之外，在本發明出現之前，本領域技術人員常用的方法包 括人造括約肌（Lima S.V.C.et al.，J. Urology, 156:622_624 (1996) ;Levesque P.E.et al.，J. Urology, 156:625-628 (1996))、膀胱；頸支撐假體（Kondo A. et al.，J.Urology，157:824-827 (1996))、注射交聯的膠原?61'!11&11(：.16七&1.，工 Urology,157:122-124(1997) ；Perez L.M.et al. , J. Urology,156:633-636 (1996)； Leonard Μ· P. et al.，J. Urology, 156:637-640 (1996))以及注射聚四氟乙烯（Perez L. M. et al.，J. Urology, 156:633-636 (1996))。
[0015] 一種最近為人們所熟知的治療由ISD引起的尿失禁的方法是對患者實行尿道周 內視鏡的膠原蛋白注射。這擴張了膀胱肌肉，并致力于減少膀胱泄漏或應激性尿失禁的可 能性。
[0016] 現有的治療尿失禁的技術方案有著眾所周知的缺點。雖然在內視鏡指導下在膀胱 頸周圍注射膠原蛋白的方法對于括約肌缺陷獲得了相當高的成功率，并且沒有顯著的發病 率，但是膠原蛋白的使用可能會導致平均在兩年之后發生的衰竭，并且還需要考慮到其成 本效益問題（（Khullar V.et al. ,British J.Obstetrics&Gynecology, 104:96-99(1996)) 。此外，對可能由于遷移現象而導致的患者控制力的惡化（Perez L. M. et al.)可能需要重 復注射，以恢復控制力（Herschorn S.et al.，J. Urology, 156:1305-1309 (1996))。
[0017] 在前列腺根除術之后使用膠原來治療應激性尿失禁的結果也通常令人失望 (Klutke C. G. et al.，J. Urology, 156:1703-1706(1996))。而且，一個研究提供證據表明， 注射牛皮膠原會產生IgG和IgA類的特異性抗體（McCell and，M.and Delustro，F.，J. Urologyl55, 2068-2073(1996))。因此，可以預計的是，隨著時間推移可能會出現患者對膠 原的過敏。
[0018] 雖然僅獲得了有限的成功，但是由于缺少其他合適的替代方法，經尿道的膠原注 射仍然是一種可接受的固有括約肌缺陷的治療方法。
[0019] 目前，醫生們對于患有活動過度性膀胱障礙或急性尿失禁的患者起初都先進行非 侵入性的藥物治療。然而，如果藥物治療無效，醫生們都會推薦侵入性更強的治療方案。
[0020] 因此，需要侵入性最小的由于擴張現有的層狀結構的體腔器官或組織結構（例如 膀胱）的方法。
[0021] 已經成功地應用組織工程學原理提供了可植入的細胞接種基質，以用于層狀結構 的體腔器官或組織結構的重建、修復、擴張或替換，所述體腔器官或組織結構例如膀胱、膀 胱的一部分或膀胱組件。如Atala的美國專利No. 6, 576, 019所述，所述細胞可以來源于可 以患者自身的組織，包括膀胱、尿道、輸尿管和泌尿生殖組織。然而，作為使用最初的器官位 置作為發育新的和健康的工程組織的基本單元的方法而言，依賴于這樣的細胞培養系統的 開發和維持是有問題的。例如，在治療有缺陷的膀胱時，細胞來源就是具體的問題，因為用 來源于有缺陷的膀胱的膀胱細胞進行培養，結果可能培養出的細胞也是有缺陷的。使用這 樣的細胞并不是用于接種新的膀胱支架或基質的明智選擇。因此，需要另外的適用于接種 可植入的新的器官/組織結構支架或基質的細胞來源。
[0022] 有大量文獻支持這一觀念：人類脂肪組織是成人干細胞的豐富來 源（Devlin et al. (2004)，Cytotherapy6:7_14 ;Awad，et al. (2003)，Tissue Engineering9:1301-12 ；Erickson et al. (2002), Biochemical and Biophysical Research Communications290:763-769 ；Gronthos et al. (2001), Journal of Cellular Physiologyl89:54-63 ；Halvorsen et al. (2001) ；Metabolism50:407-413 ； Halvorsen et al. (2001), Tissue Eng. 6:729-41 ；Harp et al. (2001), Biochemical and Biophysical Research Communication281:907-912 ;Hicok et al. (2004), Tissue EngineeringlO:371-380 ；Safford et al. (2002),Jun7,294 (2):371-9 ；Safford et al, (2004), Experimental Neurologyl87:319-28 ；Sen et al. (2004), Journal of Cellular Biochemistry81:312-319 ；Sigal et al. (1994),Hepatologyl9:999-1006 ； Wickham et al. (2003), Clinical Orthopedics and Related Research, 412:196-212 ； Ashijian et al. (2003),Plast Reconstr Surg. 111:1922-31 ；De Ugarte et al. (2003)，Cells Tissues Organs. 174:101-9 ;Mizumo et al. (2002)，Plast Reconstr Surg. 109:199-209 ；Morizono et al. (2003), Hum Gene Ther. 14:59-66 ； Winter et al. (2003), Arthritis Rheum. 48:418-29 ；Zuk et al. (2001), Tissue Eng7:2n-228;Zuk et al.(2002)，Mol Bioll3:4279 - 4295，綜述于 Gimble et al. (2003)，CytotherapyS: 362-369)。這些細胞被稱為脂肪來源的成人干（ADAS)細 胞，它們具有與MSC相似的免疫基因型和分化潛能（Gixmthos et al. (2001)，Joumal of Cellular Physiologyl89:54-63 ；Safford et al. (2002), Biochem Biophys Res Commun. 294(2):371-9 ;Zuk et al. (2002)，Mol Biol Celll3:4279-4295)。
[0023] 在公眾領域中已知能夠從人類吸脂手術樣本中分離成人干細胞的有 效的和可重復的方法（Aust et al. (2004)，Cytotherapy6:7-14 ;Halvorsen et al. (2001)，Metab〇liSm50:407-413)。所述方法包括將組織用膠原酶消化、差異離心和在培 養中擴增。在經過24小時的培養之后，一克組織能夠產生50, 000至100, 000個基質細胞 (Sen et al. (2001)，J Cellular Biochemistry81:312-319)。對來源于 20 個獨立供體的 樣本的分析獲得了一致的結果：從Iml吸脂手術廢液中平均能夠收獲401，000個細胞，其存 活率為94% (Aust et al. (2004)，Cytotherapy6:7_14)。對這些細胞進行擴增，可以在兩 周時間內從標準脂肪吸取物中獲得含有大于5億個細胞的細胞群。
[0024] 在存在地塞米松、胰島素、異丁基甲基黃嘌呤和噻唑烷二酮的條件下，ADAS細胞會 經歷脂肪形成過程（Sen et al. (2001) Journal of Cellular Biochemistry81:312-319)。 ADAS細胞的分化潛能并不限于分化為脂肪細胞譜系。已經報道了促使ADAS細胞向軟骨 細胞和成骨細胞途徑分化的條件（Awad，et al. (2003)，Tissue Engineering9:1301_12; Erickson e t a I. (2002), Biochemical and Biophysical Research Communications290:763-769 ；Halvorson et al. (2001),Metabolism50:407-413 ； Hicok et al. (2004), Tissue EngineeringlO:371-380 ；ffickham et al. (2003), Clinic Orthopedics and Related Research412:196-212)。在通過皮下植入被植入免疫缺 陷型小鼠體內后，人類ADAS細胞與羥基磷灰石生物材料合成骨基質相結合（Hikok et al. (2004)，Tissue Engineeringl0:371-380)。有大量數據能夠證明，在存在抗氧化劑 和其他培養基物的條件下培養的來源于鼠類或人類脂肪組織的成人干細胞（分別稱為 muADAS和huADAS)會發生與神經分化相一致的形態學和基因型的變化（De Ugarte(2003) Cells Tissues Organs. 174:101-9 ；Safford et al. (2002),294(2):371-9 ；Safford et al. (2004), Experimental Neurologyl87:319-28) 〇
[0025] 如 Jayo et al. Regen. Med. (2008) 3 (5)，671-682 (下文中稱為 " Jayo I "）所述， 試圖修復器官或組織的方法的特征在于頻繁地通過膠原沉積或有時通過疤痕組織形成來 不完全地替換組織。Jayo等人還觀察到一個更有益的組織工程學結果，就是組織結構或器 官的原始結構和功能的再生。還可參見Jayo et al.，J. Urol. (2008) 180 ;392-397(下文中 稱為"Jayo II"）。已確信由某些分子與體內的再生過程有關。例如，趨化因子MCP-I是其 中最熟悉的，它具有募集單核細胞的能力。然而，它似乎還是血管平滑肌細胞增殖的強有絲 分裂原。MCP-I將循環系統中的單核細胞募集至血管受損的區域，所述單核細胞通常轉化 為巨噬細胞并稱為細胞因子和生長因子的儲庫。巨噬細胞還攝取膽固醇并氧化脂肪。巨噬 細胞和肌肉前體細胞均被認為是MCP-I信號傳導的靶標。CCR-2受體是MCP-I (CCL2)的配 體，CCR-2缺陷型小鼠表現出再生缺陷和增強的脂肪生成/纖維化。CCR-2缺陷型小鼠的局 部受到骨骼肌再生刺激時與正常小鼠相比具有如下區別：細胞間隙增多、出現大量炎性細 胞、肌纖維腫腫大且變圓、細胞間隙中有更多的成纖維細胞積累、脂肪浸潤與脂肪堆積周圍 的膠原分布、伴有I丐沉積的纖維化（Warren et al.(2005), FASEB J. 19:413-415 ;Selzman et al. (2002), Am J Physiol Heart Circ Physiol.283 (4) ；H1455-H1461 ；Shannon et al. (2007), Am. J. Cell Physiol. 292:C953-C967 ；Shireman et al. (2006), J. Surg. Res. 134(I):145-57. Epub2006Feb20 ；Amann et al. (1998), Brit.J.Urol.82:118-121 ； Schecter et al. (2004),J.Leukocyte Biol.75:1079-1085 ；Deonarine et al. ,(2007) ,Transl Med. 5:11 ;Lumeng et al. (2007)，J Clin. Invest. 117(1) :175 - 184)。
[0026] 本發明涉及來源于自體來源的細胞群，所述自體來源與將如本文所述被再生、重 建、修復、擴張或替換的器官或組織結構不同；本發明還涉及分離這類細胞的方法、接種有 這類細胞的新的器官/組織結構支架或基質（構建體）和制備它們的方法，以及使用這類 新的器官/組織結構構建體治療有需要的患者的方法。
[0027] 發明概述
[0028] 本發明涉及使用接種有來自受試者的自體細胞的支架，在受試者體內進行層狀結 構的體腔器官或組織結構的再生、重建、修復、擴張或替換。
[0029] 在一個方面，本發明提供了尿流改道構建體和制備和使用所述構建體的方法。在 一個實施方案中，所述尿流改道針對受試者的有缺陷的膀胱，且包括：(a)第一可植入的、 生物相容性構建體，所述構建體包括管狀支架，所述管狀支架具有被構造為與腹腔壁區域 相連接的第一末端和第二封閉末端，和至少一個被構造為與第一輸尿管相連接的第一側部 開口；以及（b)并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細胞群，所述自體細胞群沉積在所述 支架的表面上或其中。在另一個實施方案中，所述尿流改道針對受試者的有缺陷的膀胱，且 包括：一個第一可植入的、生物相容性的管狀支架，所述支架適于尿液的臨時儲存和通過， 所述支架包括一個被構造為與所述受試者的腹腔壁上的開口相連接的第一末端，和至少一 個適于與一個第一輸尿管相連接的第一側部開口，從而使得來自所述第一輸尿管的尿液能 夠通過所述開口流至所述管狀支架的內部；和（b)并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細 胞群，所述自體細胞群沉積在所述支架的表面上或其中。
[0030] 在一個實施方案中，本發明提供了制備用于有需要的受試者體內的有缺陷的膀胱 的尿流改道構建體的方法，所述方法包括下述步驟：a)提供一個第一可植入的生物相容性 支架，所述支架包括一個管狀支架，所述管狀支架具有一個被構造為與腹腔壁區域相連接 的第一末端和一個第二封閉末端，和至少一個被構造為與一個第一輸尿管相連接的第一側 部開口；以及（b)將并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細胞群沉積在所述支架的一個第 一區域上或其中，以形成尿流改道構建體。在另一個實施方案中，所述方法包括下述步驟： a)提供一個可植入的、生物相容性的管狀支架，所述支架適于尿液的臨時儲存和通過，所述 支架包括一個被構造為與所述受試者的腹腔壁上的開口相連接的第一末端和一個第二封 閉末端，和至少一個適于與一個第一輸尿管相連接的第一側部開口，從而使得來自所述第 一輸尿管的尿液能夠通過所述開口流至所述管狀支架的內部；以及（b)將并非來源于所述 有缺陷的膀胱的自體細胞群沉積在所述支架的一個第一區域上或其中，以形成尿流改道構 建體。
[0031] 在另一個實施方案中，本發明提供了制備用于有需要的受試者體內的有缺陷的膀 胱的尿流改道構建體的方法，所述方法包括下述步驟：a)提供一個第一可植入的生物相容 性支架，所述支架包括一個管狀支架，所述管狀支架具有一個被構造為與腹腔壁區域相連 接的第一末端和一個第二封閉末端，和至少一個被構造為與一個第一輸尿管相連接的第一 側部開口；以及（b)將并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細胞群沉積在所述支架的一個 第一區域上或其中，以形成尿流改道構建體；以及c)將所述構建體植入所述受試者體內以 形成尿流改道。在另一個實施方案中，所述方法包括下述步驟：a)提供一個可植入的、生物 相容性的管狀支架，所述支架適于尿液的臨時儲存和通過，所述支架包括一個被構造為與 所述受試者的腹腔壁上的開口相連接的第一末端和一個第二封閉末端，和至少一個適于與 一個第一輸尿管相連接的第一側部開口，從而使得來自所述第一輸尿管的尿液能夠通過所 述開口流至所述管狀支架的內部；以及（b)將并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細胞群 沉積在所述支架的一個第一區域上或其中，以形成尿流改道構建體；以及c)將所述構建體 植入所述受試者體內以形成尿流改道。在另一個實施方案中，所述方法包括將一個尿流改 道構建體植入所述受試者體內的步驟，所述尿流改道構建體包括：(a) -個管狀支架，所述 管狀支架具有一個被構造為與腹腔壁區域相連接的第一末端和第二封閉末端，和至少一個 被構造為與一個第一輸尿管相連接的第一側部開口；以及（b)并非來源于所述有缺陷的膀 胱的自體細胞群，所述自體細胞群沉積在所述支架的表面上或其中，以形成所述尿流改道。
[0032] 在所有實施方案中，所述尿流改道支架還可包括一個被構造為與第二輸尿管相連 接的第二側部開口。在所有實施方案中，所述第一末端可被構造為與所述腹腔壁的位置平 齊。在所有實施方案中，所述第一末端可被構造為縫合在所述受試者的皮膚上。在所有實 施方案中，所述第一末端可被構造為形成開孔。在所有實施方案中，所述開孔還可包括開孔 扣。在所有實施方案中，所述支架還包括被構造為形成開孔的墊圈環。在所有實施方案中， 所述生物相容性支架為可生物降解的。在所有實施方案中，所述支架可包括選自下列的材 料：聚乙醇酸，聚乳酸，以及聚乙醇酸和聚乳酸的共聚物。在所有實施方案中，所述細胞群為 平滑肌細胞群。在所有實施方案中，所述改道可以替換所述有缺陷的膀胱。在所有實施方 案中，所述改道可為臨時性的。在所有實施方案中，所述改道可為永久性的。在所有實施方 案中，所述管狀支架可具有矩形或三角形或圓形的截面形狀。在所有實施方案中，所述改道 可不含有尿道上皮細胞。在所有實施方案中，本發明的方法可提供一種新的尿路管道，其特 征在于能夠再生類似尿道的組織。在所有實施方案中，所述再生的組織的特征可為具有下 列一種或多種結構：尿道上皮、固有層和平滑肌束。在所有實施方案中，在所述再生的組織 中可觀察到下列一種或多種結構：輸尿管-膀胱連接（UCJ)、所述導管的頭區和所述導管的 圍腔區。在所有實施方案中，所述再生的組織的特征可為具有下列一種或多種結構：粘膜、 粘膜下層和具有維管基質的平滑肌。在所有實施方案中，所述再生的組織為覆蓋平滑肌的 連續尿道上皮。在所有實施方案中，所述尿路管道在被植入后形成上皮化的粘膜。
[0033] 在一個方面，本發明涉及分離的平滑肌細胞群。在一個實施方案中，所述細胞群來 源于外周血，并包含具有收縮功能的一種或多種細胞，并且對平滑肌細胞標記物呈陽性。在 另一個實施方案中，所述細胞群來源于脂肪組織，并包含具有收縮功能的一種或多種細胞， 并且對平滑肌細胞標記物呈陽性。
[0034] 在所有實施方案中，所述細胞群的特征可為具有選自下列的一種或多種平滑肌細 胞標記物：心肌蛋白（myocardin)、a-平滑肌肌動蛋白、I丐結合蛋白（calponin)、肌球蛋白 重鏈、BAALC、結蛋白（desmin)、成肌纖維細胞抗原和SM22。在所有實施方案中，所述細胞群 可表達心肌蛋白（ΜΥ0⑶）。在所有實施方案中，術語"ΜΥ0⑶"包括編碼MYO⑶多肽的核酸和 MYO⑶多肽。
[0035] 在所有實施方案中，所述細胞群的收縮功能可為鈣依賴性的。
[0036] 在另一方面，本發明提供了直接來源于人類脂肪組織的平滑肌細胞（SMC)群。在 一個實施方案中，至少一種生物標記物在所述SMC群中的表達相對于其在人類骨髓來源 的MSC中的表達有差異，所述至少一種生物標記物選自：0ct4B、骨橋蛋白、BMP6、⑶44,和 IL-lB、⑶F5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAMl、PECAM、vWF和Flk-l。在另一個實施方案中，至 少一種生物標記物在所述SMC群中的表達比其在人類骨髓來源的MSC中的表達水平要低， 所述至少一種生物標記物選自：⑶F5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAMl、PECAM、vWF 和 Flk-I。 在另一個實施方案中，在另一個實施方案中，至少一種生物標記物在所述SMC群中的表達 比其在人類骨髓來源的MSC中的表達水平要高，所述至少一種生物標記物選自：0ct4B、骨 橋蛋白、BMP6、CD44 和 IL-1B。
[0037] 在另一個實施方案中，本發明提供了直接來源于人類脂肪組織的平滑肌細胞群， 所述平滑肌細胞群的特征在于與人類骨髓來源的MSC中相應蛋白的表達水平相比：（a) ⑶F5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAM1、PECAM、vWF 和 Flk-I 中的至少一種的表達水平降低； 和（b)0ct4B、骨橋蛋白、BMP6、⑶44和IL-IB中的至少一種的表達水平升高。在又另一個實 施方案中，所述平滑肌細胞群的特征在于與人類骨髓來源的MSC中相應蛋白的表達水平相 t匕：（a)GDF5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAM1、PECAM、vWF 和 Flk-I 的表達水平全部降低；和 (b)0ct4B、骨橋蛋白、BMP6、⑶44和IL-IB的表達水平全部升高。
[0038] 在另一個實施方案中，本發明提供了直接來源于脂肪組織的平滑肌細胞群，所述 平滑肌細胞群包括⑶45+的一種或多種細胞和/或⑶117+的一種或多種細胞。
[0039] 在另一個實施方案中，本發明提供了直接來源于人類脂肪組織的平滑肌細胞群， 所述平滑肌細胞群的增殖周期比人類骨髓來源的MSC短。
[0040] 在另一個實施方案中，本發明提供了直接來源于脂肪組織的平滑肌細胞群，所述 平滑肌細胞群在培養物中表現出增殖的接觸依賴性抑制。
[0041] 在又另一個實施方案中，本發明提供了直接來源于脂肪組織的平滑肌細胞群，所 述平滑肌細胞群的特征在于至少一種平滑肌細胞（SMC)標記物響應于凝血噁烷A2模擬物 而下調。在一個實施方案中，所述SMC標記物選自心肌蛋白和肌球蛋白重鏈-平滑肌同種 型（SMMHC)。在另一個實施方案中，所述心肌蛋白和SMMHC響應于凝血噁烷A2模擬物而下 調。
[0042] 在一個實施方案中，本文所述的平滑肌細胞群為純化的細胞群。
[0043] 在一個方面，本發明提供了細胞來源于脂肪組織的細胞制品或細胞群。在另一個 實施方案中，所述細胞群來源于脂肪組織的SVF。在另一個實施方案中，所述SVF包括異源 的細胞群。在另一個實施方案中，所述細胞群包括完全分化的平滑肌細胞。在又另一個實 施方案中，本發明提供了與人類骨髓來源的間充質干細胞（MSC)群有區別的人類脂肪來源 的平滑肌細胞群。在一個實施方案中，所述區別指的是所述人類脂肪來源的SMC群與人類 骨髓來源的MSC群相比，在轉錄物組學、蛋白質組學和功能屬性方面有所不同。在一個實施 方案中，所述來源于脂肪組織的細胞群從自體來源獲得。
[0044] 在另一方面，本發明提供了從自體外周血或脂肪來源分離平滑肌細胞群的方法。
[0045] 在一個實施方案中，所述方法包括下述步驟：(a)將所述外周血樣本與密度梯度 材料相接觸；(b)離心所述樣本以確定包括單核細胞級分的密度梯度；(c)從所述密度梯度 中提取所述單核細胞級分，其中所述級分包括含有一種或多種平滑肌細胞的細胞群，所述 一種或多種平滑肌細胞具有收縮功能并對平滑肌細胞標記物呈陽性。在另一個實施方案 中，所述方法還包括（d)培養所述細胞群的步驟。在一個實施方案中，所述被培養的細胞群 在培養物中形成平滑肌細胞集落。在又另一個實施方案中，所述集落在培養約5天至約10 天后形成。在另外一個實施方案中，所述細胞群不形成內皮集落。在其他實施方案中，所述 方法還包括擴增步驟（d)中的細胞群。在另一個實施方案中，所述被擴增的細胞群為純化 的細胞群。
[0046] 在另一個實施方案中，所述方法包括下述步驟：(a)用膠原酶消化脂肪組織樣本； (b)離心所述樣本以確定基質血管級分（SVF);和（c)從所述樣本中提取SVF，其中所述級 分包括含有一種或多種平滑肌細胞的細胞群，所述一種或多種平滑肌細胞具有收縮功能并 對平滑肌細胞標記物呈陽性。在另一個實施方案中，所述方法還包括（d)培養所述細胞群 的步驟。在其他實施方案中，所述方法還包括擴增步驟（d)中的細胞群。在另一個實施方 案中，所述被擴增的細胞群為純化的細胞群。
[0047] 在另外一個實施方案中，本發明提供了提供分離的平滑肌細胞群的方法，所述方 法包括下述步驟：a)在不使用平滑肌細胞分化誘導培養基的條件下培養來源于人類脂肪 SVF的平滑肌細胞制品；和b)從所述培養的細胞制品中分離完全分化的平滑肌細胞群。在 另一個實施方案中，在所述培養步驟之前先進行酶促消化脂肪組織的步驟。在另一個實施 方案中，在所述培養步驟之前先進行離心所述被消化的脂肪組織以提供SVF的步驟。在其 他實施方案中，在所述培養步驟之前先進行洗滌和平板接種所述SVF的步驟。在另一個實 施方案中，所述培養步驟包括篩選與粘附至細胞培養載體的細胞。在又另一個實施方案中， 所述培養步驟不包括使用含有誘導平滑肌細胞分化的組分的培養基。在另一個實施方案 中，所述培養步驟包括使用含有血清的細胞培養基，所述血清例如胎牛血清（FBS)，它包括 幾種內源性生長因子。在另一個實施方案中，所述培養步驟不包括選擇并向所述細胞培養 基中加入特異性和外源性生長因子。通常，"外源性"生長因子為除了內源性生長因子之外 的選擇并加入至細胞培養基中的生長因子，內源性生長因子通常已由培養基中的血清組分 (例如FBS)來提供。外源性生長因子可為重組生長因子。在一個實施方案中，所述培養步 驟不包括使用含有外源性生長因子的細胞培養基。在另一個實施方案中，所述培養步驟不 包括使用含有重組生長因子的細胞培養基。
[0048] 在所有實施方案中，所述平滑肌細胞群不是脂肪來源的干細胞群，和/或所述平 滑肌細胞群不是間充質干細胞群。
[0049] 在另一方面，本發明提供了用于為有需要的受試者提供新的層狀結構的腔體器官 或組織結構的構建體。在一個實施方案中，所述構建體包括：(a)包括聚合物基質或支架的 可植入的構建體；和（b)沉積在所述聚合物基質的表面上或其中的自體細胞群，所述自體 細胞群不來源于與新的器官或組織結構相應的天然器官或組織。
[0050] 在另一方面，本發明提供了為有需要的受試者提供新的膀胱或其部分的構建體。 在一個實施方案中，所述構建體包括：(a)包括聚合物基質或支架的可植入的構建體；和 (b)沉積在所述聚合物基質的表面上或其中的且不來源于所述受試者的膀胱的自體細胞 群。
[0051] 在某些實施方案中，所述成形的聚合物基質構建體具有橢圓形的形狀。在一些實 施方案中，所述成形的聚合物基質構建體在被植入時形成折疊構型。在一個實施方案中，所 述成形的聚合物基質構建體在被植入前經過處理，以使得所述成形的聚合物基質構建體在 被植入時更為柔軟。在另一個實施方案中，所述成形的聚合物基質構建體的最大長度為約 10cm。在一個實施方案中，所述成形的聚合物基質構建體的最大長度為約4cm。在另一個實 施方案中，所述成形的聚合物基質構建體的最大長度為約3cm。在又另一個實施方案中，所 述成形的聚合物基質構建體的最大寬度為約4cm。在一個實施方案中，所述成形的聚合物基 質構建體具有的二維表面積為約30cm 2。在另一個實施方案中，所述成形的聚合物基質構建 體具有的二維表面積為約25cm2。
[0052] 在其他實施方案中，所述構建體含有包括一種或多種外周血來源或脂肪組織來源 的平滑肌細胞的細胞群，所述一種或多種外周血來源或脂肪組織來源的平滑肌細胞具有收 縮功能，并且對于平滑肌細胞標記物呈陽性。在一個實施方案中，所述構建體的所述細胞群 具有鈣依賴性收縮功能。
[0053] 在所有實施方案中，所述構建體中不含有其他細胞群。在所有實施方案中，所述構 建體可不含有尿道上皮細胞。在所有實施方案中，沉積在所述基質上的所述自體細胞群為 本文所述的人類脂肪來源的平滑肌細胞群。在所有實施方案中，所述人類脂肪來源的SMC 細胞群可為直接來源于SVF和完全分化的細胞群。在所有實施方案中，被接種在所述基質 上的人類脂肪來源的SMC細胞群在所述構建體被植入至所述受試者的所需部位后，具有產 生MCP-I的能力。在一個實施方案中，所述MCP-I誘導天然間充質干細胞趨向于所植入的 位置。
[0054] 在另一方面，本發明提供了適于被植入有需要的受試者體內的新的器官或組織結 構構建體的制備方法。在一個實施方案中，所述方法包括下述步驟：a)獲得人類脂肪組織 樣本；b)從所述樣本中分離完全分化的平滑肌細胞群；c)培養所述細胞群；和d)將所述細 胞群與成型的聚合物基質細胞構建體相接觸，其中所述步驟a)、b)、c)和d)進行約45天或 更短時間。在所有實施方案中，所述人類脂肪組織樣本從自體來源獲得。在另一個實施方 案中，所述方法還包括檢測平滑肌細胞標記物的表達的步驟。在另一個實施方案中，所述表 達為mRNA表達。在另外一個實施方案中，所述表達為多肽表達。在一個實施方案中，通過 細胞內免疫熒光方法檢測所述多肽表達。
[0055] 在另一方面，本發明提供了為有需要的受試者提供層狀結構的腔體器官或組織結 構的方法。在一個實施方案中，所述方法包括下述步驟：a)提供生物相容性的、合成的或天 然的聚合物基質，所述聚合物基質的形狀與需要治療的器官或組織結構的至少一部分相適 應；b)在所述聚合物基質的一個第一區域上或其中沉積自體細胞群，所述自體細胞群不來 源于與所述新的器官或組織結構相對應的天然器官或組織；和c)將所述成形的聚合物基 質細胞構建體植入至所述受試者體內，以用于形成層狀結構的腔體器官或組織結構。在另 一方面，本發明提供了為有需要的受試者提供新的膀胱或其部分的方法。在一個實施方案 中，所述方法包括：a)提供生物相容性的、合成的或天然的聚合物基質，所述聚合物基質的 形狀與膀胱或其部分相適應；b)在所述聚合物基質的一個第一區域上或其中沉積自體細 胞群，所述自體細胞群不來源于所述受試者的膀胱；和c)將所述成形的聚合物基質細胞構 建體植入至所述受試者體內，以用于形成新的膀胱或其部分。在另一個實施方案中，本文所 述方法的步驟b)中的所述細胞群含有一種或多種外周血來源的平滑肌細胞，所述平滑肌 細胞具有收縮功能且對平滑肌細胞標記物呈陽性；或者，步驟b)中的所述細胞群含有一種 或多種脂肪組織來源的平滑肌細胞，所述平滑肌細胞具有收縮功能且對平滑肌細胞標記物 呈陽性。在另一個實施方案中，所述細胞群的收縮功能為鈣依賴性的。在所有實施方案中， 沉積在所述基質上的自體細胞群為本文所述的人類脂肪來源的平滑肌細胞群。在所有實施 方案中，被接種在所述基質上的人類脂肪來源的SMC細胞群在所述構建體被植入至所述受 試者的所需部位后，具有產生MCP-I的能力。在一個實施方案中，所述MCP-I誘導天然間充 質干細胞趨向于所植入的位置。
[0056] 在一個實施方案中，本發明的方法還包括對被植入的管道構建體用所述受試者的 網膜、腸系膜、肌肉筋膜和/或腹膜進行包裹以使其能夠血管化的步驟。
[0057] 本發明還涉及使用接種有來源于有需要的受試者的自體細胞的支架來擴張所述 受試者的層狀結構的體腔器官或組織結構。在一個方面，本發明提供了在需要這種治療的 受試者體內擴張已有的層狀結構的腔體器官或組織結構的方法，所述方法通過下述步驟實 現：提供聚合物基質或支架，所述聚合物基質或支架的形狀與需要治療的器官或組織結構 的至少一部分相適應，且所述聚合物基質或支架的大小足以使其通過腹腔鏡方法而被植 入；將不是來源于所述器官或組織結構的自體細胞群沉積在所述聚合物基質的一個第一區 域上或其中；以及通過腹腔鏡方法將所述成形的聚合物基質構建體植入至所述受試者體內 的治療位置，以使得所述已有的層狀結構的腔體器官或組織結構被擴張。在某些實施方案 中，所述腔體器官或組織結構為膀胱或膀胱的一部分。
[0058] 在另一方面，本發明提供了用于增加需要此治療的受試者的膀胱容積的方法，所 述方法通過下述步驟實現：提供生物相容性的、合成的或天然的聚合物基質或支架，所述聚 合物基質或支架的形狀與膀胱的至少一部分相適應，且所述聚合物基質或支架的大小足以 使其通過腹腔鏡方法而被植入；將不是來源于所述受試者的膀胱的自體細胞群沉積在所述 聚合物基質的一個第一區域上或其中；以及通過腹腔鏡方法將所述成形的聚合物基質構建 體植入至所述受試者體內的治療位置，由此增加膀胱容積。在一個實施方案中，膀胱容積的 增加量為約50mL。在另一個實施方案中，膀胱容積的增加量為約100mL。
[0059] 在又另一方面，本發明提供了用于擴張需要此治療的受試者的膀胱中的膀胱切口 位置的方法，所述方法通過下述步驟實現：提供生物相容性的、合成的或天然的聚合物基質 或支架，所述聚合物基質或支架的形狀與膀胱的至少一部分相適應，且所述聚合物基質或 支架的大小足以使其通過腹腔鏡方法而被植入；將不是來源于所述受試者的膀胱的自體細 胞群沉積在所述聚合物基質的一個第一區域上或其中；以及通過腹腔鏡方法將所述成形的 聚合物基質構建體植入至所述受試者體內的治療位置，由此擴張膀胱切口位置。
[0060] 在又另一方面，本發明提供了治療需要此治療的受試者的尿失禁的方法，所述方 法通過下述步驟實現：提供生物相容性的、合成的或天然的聚合物基質或支架，所述聚合物 基質或支架的形狀與膀胱的至少一部分相適應，且所述聚合物基質或支架的大小足以使其 通過腹腔鏡方法而被植入；將不是來源于所述受試者的膀胱的自體細胞群沉積在所述聚合 物基質的一個第一區域上或其中；以及通過腹腔鏡方法將所述成形的聚合物基質構建體植 入至所述受試者體內的治療位置，由此增加膀胱容積。
[0061] 本發明還提供了包括本發明的聚合物基質或支架的成套工具及其使用說明書。 [0062] 在另一方面，本發明提供了用于在植入后監測受試者體內的新的器官或組織結構 再生的預后方法。在一個實施方案中，所述方法包括檢測獲自所述受試者的測試樣本和對 照樣本中的MCP-I表達水平，其中所述測試樣本中的MCP-I表達水平高于對照樣本則表明 了受試者體內的再生。在另一個實施方案中，其中所述新的器官或組織結構來源于本文所 述的自體平滑肌細胞群。在另一個實施方案中，檢測MCP-I多肽表達。在另一個實施方案 中，使用抗MCP-I試劑來檢測MCP-I多肽表達。在另一個實施方案中，所述抗MCP-I試劑為 抗體。在另一個實施方案中，使用免疫組化方法檢測MCP-I多肽表達。在一個實施方案中， 在所述檢測步驟之前先進行從受試者獲取所述測試樣本的步驟。在另一個實施方案中，所 述測試樣本為血液。
[0063] 附圖簡述
[0064] 圖1顯示了膀胱擴張支架的一個實例。
[0065] 圖2顯示了膀胱替換支架的一個實例。
[0066] 圖3顯示了尿流改道或管道支架的一個實例。
[0067] 圖3A顯示了具有不同類型截面的尿流改道構建體的一個實例，還顯示了被設計 為與輸尿管相連接的開口的可能位置。
[0068] 圖3B顯示了尿流改道構建體的幾種變化方案（A-開口呈卵形；B-開口呈卵形 的容器；C -封閉的卵形容器和三個管）。
[0069] 圖4顯示了尿流改道或管道構建體的不同應用。
[0070] 圖5A-B顯示了肌肉等效物支架的實例。
[0071] 圖6顯示了呈片狀或帶狀形式的各種肌肉等效物支架的圖。
[0072] 圖7顯示了不同的肌肉等效物支架及其分別的植入方法。圖7a顯示了平面片狀 支架的形成。圖7b顯示了適于通過腹腔鏡方法植入的支架，所述支架可在植入時被卷起并 送入腹腔鏡管中，然后在腹腔中展開。圖7c顯示了適于通過腹腔鏡方法植入的支架片，所 述支架片形成卷曲構型以便于通過腹腔鏡管被插入，然后它將在腹腔中展開。圖7d顯示了 適于通過腹腔鏡方法植入的支架片，所述支架片形成卷曲構型或手風琴形的構型以便于通 過腹腔鏡管被插入，然后它將在腹腔中展開。圖7e顯示了用于植入肌肉等效物支架的可能 的手術方法。圖7f顯示了在空膀胱和充盈的膀胱中的植入位置。圖7g顯示了帶有手術切 口的膀胱模型，顯示了在表面上切割是產生的橢圓形切口。
[0073] 圖8顯示了預折疊的手風琴形構型的支架片，以便于被插入通過腹腔鏡管口。
[0074] 圖9A顯示了被預先切為帶狀然后縫合在一起的支架，從而使其能夠堆積和被插 入腹腔鏡管口中，并保證了在腹腔中的定位。
[0075] 圖9B顯示了一個長18. 7cm、寬2. Ocm的具有兩折的支架。
[0076] 圖9C顯示了一個長13. 3cm、寬2. 8cm的具有三折的支架。
[0077] 圖9D顯示了一個長9. 7cm、寬4. Ocm的具有四折的支架。
[0078] 圖9E顯示了一個包括兩片的支架，其中每一片長9. 7cm、寬2. Ocm并具有兩折。
[0079] 圖10顯示了被植入的管道構建體的構型的實例。
[0080] 圖11顯示了臨時性尿流改道構建體的植入組件的實例。
[0081] 圖12顯示了永久性尿流改道構建體的植入組件的實例。
[0082] 圖13顯示了尿流改道構建體的其他應用。
[0083] 圖14顯示了犬外周血單核細胞級分（血塊黃層）的培養物。
[0084] 圖15顯示了犬外周血生長出的細胞。
[0085] 圖16顯示了犬平滑肌細胞在傳代幾次之后的形態。
[0086] 圖17顯示了從豬和人類的脂肪分離的平滑肌細胞。
[0087] 圖18顯示了對平滑肌細胞標記物的基因表達的RT-PCR分析。
[0088] 圖19顯示了平滑肌細胞標記物的免疫熒光蛋白表達。
[0089] 圖20顯示了從人類外周血分離的平滑肌細胞的免疫染色。
[0090] 圖21顯示了從血液（A)、脂肪組織⑶和膀胱組織（C)分離的豬平滑肌細胞的收 縮力測定結果。
[0091] 圖22顯示了從人類脂肪組織分離的平滑肌細胞的生長與每單位面積回收的細胞 數之間的函數關系。
[0092] 圖23顯示了從豬的脂肪（A)、外周血（B)和膀胱平滑肌（C)分離的平滑肌細胞生 長與每代回收的細胞數之間的函數關系。
[0093] 圖24顯示了從人類膀胱平滑肌、脂肪、外周血和膀胱尿道上皮分離的細胞中細胞 因子MCP-I的表達。
[0094] 圖25顯示了 MCP-I的產生和接種細胞的密度之間的相關性。
[0095] 圖26顯示了輸尿管支架。
[0096] 圖27顯示了一種新的管道構建體。
[0097] 圖28顯示了一種與輸尿管（實線箭頭）相連接的新的管道構建體（虛線箭頭）。
[0098] 圖29顯示了與輸尿管（實線箭頭）相連接的構建體的內流端和朝向手術產生的 開口（虛線箭頭）的外流端。
[0099] 圖30顯示了所述開孔和用于尿液引流的導管。
[0100] 圖31-32顯示了植入有不含細胞的支架的動物的細胞檢查圖。
[0101] 圖33顯示了植入有用血液來源的SMC接種的支架的動物的細胞檢查圖。
[0102] 圖34-36植入有用血液來源的SMC接種的支架的動物的細胞檢查圖。
[0103] 圖37顯示了植入有用血液來源的SMC接種的支架的動物的細胞檢查圖。
[0104] 圖38-39顯示了植入有用脂肪來源的SMC接種的支架的動物的細胞檢查圖。
[0105] 圖40-42顯示了植入有用脂肪來源的SMC接種的支架的動物的細胞檢查圖。
[0106] 圖43顯示了植入有用脂肪來源的SMC接種的支架的動物的細胞檢查圖。
[0107] 圖44顯示了尿路管道的修整示意圖。
[0108] 圖45顯示了植入有新的尿路管道構建體的動物的亞肉眼照片。
[0109] 圖46顯示了植入有新的尿路管道構建體的動物在輸尿管-管道連接處附近的新 的尿路管道的顯微照片。
[0110] 圖47顯示了植入有新的尿路管道構建體的動物在輸尿管-管道連接處附近的新 的尿路管道的顯微照片。
[0111] 圖48顯示了植入有新的尿路管道構建體的動物的管道中壁的顯微照片。
[0112] 圖49顯示了植入有新的尿路管道（膀胱SMC支架）的動物的腎盂造影照片。
[0113] 圖50顯示了植入有新的尿路管道（脂肪SMC支架）的動物的腎盂造影照片。
[0114] 圖51顯示了植入有新的尿路管道（脂肪SMC支架）的動物的腎盂造影照片。
[0115] 圖52顯示了植入有新的尿路管道（血液SMC支架）的動物的腎盂造影照片。
[0116] 圖53顯示了植入有新的尿路管道（血液SMC支架）的動物的腎盂造影照片。
[0117] 圖54顯示了植入有新的尿路管道（血液SMC支架）的動物的腎盂造影照片。
[0118] 圖55顯示了植入有新的尿路管道（血液SMC支架）的動物的腎盂造影照片。
[0119] 圖56顯示了植入有新的尿路管道（僅有支架）的動物的腎盂造影照片。
[0120] 圖57顯示了有新的尿路管道（僅有支架）的動物的腎盂造影照片。
[0121] 圖58顯示了有新的尿路管道（僅有支架）的動物的腎盂造影照片。
[0122] 圖59顯示了后固定的管道（A)和修整示意圖（B)。圖59C表明了管道的各區域。
[0123] 圖60顯示了植入有新的尿路管道（脂肪SMC支架）的動物的顯微照片。
[0124] 圖61顯示了植入有新的尿路管道（膀胱SMC支架）的動物的顯微照片。
[0125] 圖62顯示了植入有新的尿路管道（脂肪SMC支架）的動物的顯微照片。
[0126] 圖63顯示了植入有新的尿路管道（膀胱SMC支架）的動物的顯微照片。
[0127] 圖64顯示了由再生的泌尿組織形成的新的膀胱管道的組織學特征。
[0128] 圖65顯示了天然輸尿管-膀胱連接處的三種肌肉組分。
[0129] 圖66顯示了管道構建體受體的子宮-管道（utero-conduit)連接處。
[0130] 圖67顯示了植入的管道構建體的組織學。
[0131] 圖68顯示了豬的㈧膀胱來源、（B)脂肪來源和（C)外周血來源的平滑肌細胞的 形態學特征。
[0132] 圖69顯示了豬的膀胱來源、脂肪來源和外周血來源的平滑肌細胞的平滑肌細胞 相關標記物的RT-PCR分析。
[0133] 圖70顯示了豬的膀胱來源、脂肪來源和外周血來源的平滑肌細胞的平滑肌細胞 相關標記物的免疫熒光分析。
[0134] 圖71顯示了豬的㈧膀胱來源、（B)脂肪來源和（C)外周血來源的平滑肌細胞的 收縮力。
[0135] 圖72顯示了（A)膀胱來源、（B)脂肪來源和（C)外周血來源的外周血來源的平滑 肌細胞的生長動力學。
[0136] 圖73顯示了從新的尿路管道構建體形成的再生的泌尿組織的組織學特征。
[0137] 圖74顯示了植入有尿流改道構建體的動物體內上皮化粘膜的存在。
[0138] 圖75顯示了植入的新的膀胱構建體在4個月時的膀胱造影照片。A-膀胱來源的 SMC ;B -血液來源的SMC ;C -脂肪組織來源的SMC ;D -天然膀胱對照。
[0139] 圖76顯示了植入的新的膀胱構建體隨時間變化的㈧容積和⑶順應性。
[0140] 圖77顯示了 4個月以后的動物的平均體重。
[0141] 圖78顯示了 4個月以后的動物的平均血清肌酸酐水平。
[0142] 圖79顯示了 4個月以后的動物的平均BUN。
[0143] 圖80顯示了 4個月以后的動物的平均堿性磷酸酶（ALP)。
[0144] 圖81顯示了 4個月以后的動物的平均總蛋白水平。
[0145] 圖82顯示了 4個月以后的動物的平均白細胞（WBC)水平。
[0146] 圖83顯示了植入的構建體在4個月以后的膀胱造影照片（血液來源的SMC)。
[0147] 圖84顯示了植入的構建體在4個月以后的膀胱造影照片（脂肪來源的SMCs)。
[0148] 圖85顯示了人類膀胱發育的周期。
[0149] 圖86顯示了隨著年齡的膀胱容積增加和尿液輸出量。
[0150] 圖87A-C顯示了循環影響再生的結果。
[0151] 圖88顯示循環對臨床結果的再生-增強效果的轉換。
[0152] 圖89顯示了肌肉等效物支架的植入。
[0153] 圖90顯示了動物在植入肌肉等效物支架后4周時的膀胱造影照片。
[0154] 圖91顯示了表達在脂肪來源的細胞群中各種標記物的水平：㈧脂連素 (adiponection)和 FABP-4 ; (B)SMa A、SM22、心肌蛋白、SMMHC ; (C)鈣結合蛋白；（D)VECAD、 vWF、PECAM、FLTl ;和（E) FLK 和 TEK。
[0155] 圖92顯示了平滑肌標記物對培養基類型的依賴性：(A) SMa A、SM22、心肌蛋白、 SMMHC ;和⑶鈣結合蛋白。
[0156] 圖93顯示了在脂肪來源的細胞和間充質干細胞中，平滑肌標記物鈣結合蛋白、心 肌蛋白和SMMHC的表達的比較。
[0157] 圖94顯示了在釋放來源的細胞中SMa A、SM22、心肌蛋白和鈣結合蛋白隨時間的 表達。
[0158] 圖95顯示了在脂肪來源的細胞和間充質干細胞中內皮標記物的表達。
[0159] 圖96顯示了脂肪來源的細胞中細胞表面標記物的表達。
[0160] 圖97顯示了間充質干細胞中細胞表面標記物的表達。
[0161] 圖98顯示了 MSC、膀胱來源的SMC、Ad-SMC和人類主動脈平滑肌細胞的蛋白質組 學標記的比較性分析。
[0162] 圖99顯示了脂肪來源的細胞在培養物中隨時間的增殖能力。
[0163] 圖100顯示了脂肪來源的細胞和間充質干細胞對U46619的響應。
[0164] 圖101顯示了中胚層分化標記物的RT-PCR分析結果。
[0165] 圖102顯示了在MSC/AdSMC中的0ct4A/0ct4B表達的RT-PCR分析結果。
[0166] 發明詳述
[0167] 本發明涉及的細胞群來源于與將進行本文所述的重建、修復、擴張或替換的器官 或組織結構不同的器官或組織結構來源，本發明還涉及分離這類細胞的方法、用這類細胞 接種的新的器官/組織結構支架或基質（構建體）及其制備方法，以及使用這類新的器官 /組織結構構建體治療有需要的患者的方法。
[0168] 1.定義
[0169] 除非另有定義，都在本文所使用的技術術語和科學術語的含義均與本發 明所述【技術領域】的普通技術人員所通常理解的含義相同。Principles of Tissue Engineering, 3rdEd. (Edited by R Lanza, R Langer, &J Vacanti)，2007 為本領域技術人員 提供了本申請所使用的許多術語的一般性指導。
[0170] 本領域技術人員應當認識到，許多與本文所述的方法和材料類似或等同的方法和 材料都可用于實施本發明。實際上，本發明并不局限于本文所述的方法和材料。為了本發 明的目的定義以下術語。
[0171] 本文所使用的術語"平滑肌細胞"或"SMC"指的是有收縮力的細胞，它們來源于與 本文所述的重建、修復、擴張或替換構建體和方法所應用的目標器官或組織不同的天然器 官或組織。所述SMC可來源于外周血或脂肪組織。對于脂肪組織而言，所述SMC可來源于 含有血管組織的SVF。因此，所述SMCs可來源于脂肪來源的血管床的毛細血管、動脈和小靜 脈，或所述SMC可來源于含有周細胞的血管周圍環境。本發明提供的平滑肌細胞在被接種 至本文所述的支架或基質上并在其上被培養后，能夠形成常見于中空器官（例如膀胱、腹 腔、胃腸道等等）壁上的非橫紋肌，并具有能夠收縮和舒張的特征。本領域普通技術人員能 夠知曉平滑肌細胞的其他特性。
[0172] 本文所使用的術語"細胞群"指的是直接從合適的哺乳動物組織來源分離并經過 隨后的體外培養而獲得的多個細胞。本領域普通技術人員能夠知曉適用于本發明的分離和 培養細胞群的各種方法，以及適用于本發明的細胞群中的各種細胞數量。所述細胞群可為 脂肪來源的、但其中基本不含脂肪細胞或非粘附性脂肪細胞的平滑肌細胞群（SMC)。所述 SMC細胞群的特征可為與平滑肌細胞相關的標記物的表達。所述SMC細胞群也可為純化的 細胞群。所述SMC細胞群可來源于自體來源。
[0173] 本文所使用的術語"自體"指的是由同一個體衍生或轉移而來。自體平滑肌細胞 群來源于將作為本文所述可植入構建體的受體的受試者。
[0174] 術語"標記物"或"生物標記物"通常指的是DNA、RNA、蛋白、碳水化合物或基于糖 脂的分子標記物，它們在培養的細胞群中的表達或存在可通過標準方法（或本文所述的方 法）進行檢測，并且與培養的細胞群中一種或多種細胞為特定細胞類型的事實相一致。通 常，術語細胞"標記物"或"生物標記物"指的是在本文所述的細胞群中表達并通常由天然細 胞表達的分子。所述標記物可為由細胞表達的多肽，或為在染色體上的可識別的位置，例如 由天然細胞表達的基因、限制性內切酶識別位點或編碼多肽的核酸（例如mRNA)。所述標記 物可為被稱為"基因表達標記物"的基因的表達區域，或為不具有已知編碼功能的一些DNA 區段。
[0175] 術語"平滑肌細胞標記物"通常指的是DNA、RNA、蛋白、碳水化合物或基于糖脂的分 子標記物，它們在培養的細胞群中的表達或存在可通過標準方法（或本文所述的方法）進 行檢測，并且與培養的細胞群中一種或多種細胞為平滑肌細胞的事實相一致。通常，術語平 滑肌細胞（SMC) "標記物"或"生物標記物"指的是通常由天然平滑肌細胞表達的分子。所 述標記物可為由細胞表達的多肽，或為在染色體上的可識別的位置，例如由SMC細胞表達 的基因、限制性內切酶識別位點或編碼多肽的核酸。所述標記物可為被稱為"基因表達標記 物"的基因的表達區域，或為不具有已知編碼功能的一些DNA區段。本發明考慮到的這類標 記物包括但不限于下述標記物中的一種或多種：心肌蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、鈣結合蛋 白、肌球蛋白重鏈、BAALC、結蛋白、成肌纖維細抗原、SM22,以及上述標記物的任何組合。
[0176] 術語"差異表達的基因"、"有差異的基因表達"以及它們的同義詞在本文中可以互 換使用，指的是一種基因在第一種細胞或細胞群中被激活的表達水平高于或低于其在第二 種細胞或細胞群表達的水平。這一術語還包括這樣的基因，其表達在所述第一或第二種細 胞在培養傳代過程中的不同階段被激活的表達水平有高低的區別。還應當理解的是，差異 表達的基因可在核酸水平或蛋白水平上被激活或被抑制，或可能經歷改變的天然剪接而生 成不同的多肽產物。這種不同可能表現為例如多肽在mRNA水平、表面表達、多肽的分泌或 其他分區方面的改變。差異的基因表達可包括兩種或多種基因或其基因產物之間的表達的 比較，或兩種或多種基因或其基因產物之間的表達比例的比較，或甚至為同一基因的兩種 不同的加工產物之間的比較，上述比較是在所述第一種細胞和所述第二種細胞之間進行， 并且兩種細胞之間應存在差異。差異的表達包括例如所述第一種細胞和所述第二種細胞之 間的基因或其表達產物的表達時序或細胞表達類型的定量和定性的差異。出于本發明的目 的，認為"有差異的基因表達"指的是在所述第一和第二種細胞或在培養傳代過程的不同階 段中，給定基因的表達差異為至少約1倍、至少約1. 5倍、至少約2倍、至少約2. 5倍、至少 約3倍、至少約3. 5倍、至少約4倍、至少約4. 5倍、至少約5倍、至少約5. 5倍、至少約6倍、 至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約10. 5倍、至少約11倍、至少約 11. 5倍、至少約12倍、至少約12. 5倍、至少約13倍、至少約13. 5倍、至少約14倍、至少約 14. 5倍或至少約15倍。標記物的差異表達可為在脂肪來源的細胞（所述第一種細胞）中 相對于在間充質干細胞或MSC (所述第二種細胞）中的差異表達。
[0177] 術語"抑制"、"下調"、"低表達"和"降低"在本文中可以互換使用，意為基因的表 達、或編碼一種或多種蛋白或蛋白亞基的RNA分子或RNA等價物分子的水平、或一種或多種 蛋白或蛋白亞基的活性相對于一種或多種對照（例如一種或多種陽性和/或陰性對照）而 言有所下降。所述低表達可為在脂肪來源的細胞中相對于MSC中的表達降低。
[0178] 本文所使用的術語"上調"或"過表達"為意為基因的表達、或編碼一種或多種蛋 白或蛋白亞基的RNA分子或RNA等價物分子的水平、或一種或多種蛋白或蛋白亞基的活性 相對于一種或多種對照（例如一種或多種陽性和/或陰性對照）而言有所上升。所述過表 達可為在脂肪來源的細胞中相對于MSC中的表達上升。
[0179] 術語"收縮功能"指的是平滑肌收縮功能，包括滑動的肌動蛋白和肌球蛋白纖維之 間的相互作用，該相互作用由鈣激活的肌球蛋白的磷酸化啟動，并產生依賴于細胞內鈣水 平的收縮。
[0180] 術語"接觸依賴性抑制"指的是當兩個或多個細胞彼此接觸時細胞生長的停止。如 果在細胞培養物中觀察到細胞彼此堆積，或類似地觀察到轉化細胞培養物中的集落形成， 則認為細胞生長沒有被接觸抑制，也就是說細胞缺乏接觸依賴性抑制的屬性。間充質干細 胞不具有這一屬性。相反地，具有接觸依賴性抑制屬性的細胞不會被觀察到在培養物中彼 此堆積。
[0181] 術語"外周血"通常意為在全身循環的血液。
[0182] 術語"脂肪組織"或"脂肪"通常意為基本由脂肪細胞形成的松散的結締組織。脂 肪組織可從身體的各個部位獲得，收縮部位包括但不限于皮下（皮下脂肪）和內部器官周 圍（內臟脂肪）。
[0183] 術語"構建體"指的是沉積在由一種或多種合成的或天然存在的生物相容性材料 形成的支架或基質上的至少一種細胞群。所述細胞群可在體外或體內與支架或基質相結 合。
[0184] 術語"樣本"或"患者樣本"或"生物學樣本"通常意為獲自個體、體液、身體組織、細 胞系、組織培養物或其他來源的任何生物學樣本。這一術語包括體液，例如，血液例如外周 血或靜脈血，尿液，以及其他生物學來源的樣本，例如脂肪吸取物和固體組織活檢樣本，例 如活檢標本（例如脂肪組織活檢標本），或組織培養物或來源于組織培養物的細胞以及其 后代。這一定義還包括從來源獲得后經過任何方式處理之后的樣本，例如通過試劑處理、溶 解或對某種組分（例如蛋白或多核苷酸）的富集。這一定義還涵蓋臨床樣本，還包括培養物 中的細胞、細胞上清液、細胞裂解物、血清、血漿、生物學液體和組織樣本。樣本的來源可為 實體組織，例如來源于新鮮的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣本或活檢樣本或吸取物； 血液或任何血液成分；體液例如腦脊液、羊水、腹水或細胞間液；來源于受試者任何發育階 段的細胞。所述生物學樣本可含有并不天然存在于天然組織中的化合物，例如防腐劑、抗凝 齊IJ、緩沖劑、固定劑、營養劑、抗生素等等。所述樣本可用于診斷測定或監測測定。從哺乳動 物獲取樣本的方法是本領域公知的。如果術語"樣本"單獨使用，它仍舊表示所述"樣本"為 "生物學樣本"或"患者樣本"，即所述術語可以互換使用。樣本也可為測試樣本。
[0185] 本文所使用的術語"測試樣本"指的是來源于已被植入本文所述的構建體的受試 者的樣本。所述測試樣本可來源于哺乳動物受試者的各種來源，包括但不限于血液、血清、 尿液、精液、骨髓、粘膜、組織等等。
[0186] 本文所使用的術語"對照"或"對照樣本"指的是陰性對照，其中預期獲得陰性結 果以幫助與測試樣本中的陽性結果相關聯。或者，所述對照可為陽性對照，其中預期獲得陽 性結果以幫助與測試樣本中的陰性結果相關聯。適用于本發明的對照包括但不限于：已知 具有正常的細胞因子水平的樣本、從已知沒有被植入本文所述的構建體的哺乳動物受試者 獲得的樣本，和從已知為正常的哺乳動物受試者獲得的樣本。對照也可為在受試者被植入 本文所述的構建體之前從所述受試者獲得的樣本。此外，所述對照可為含有與測試樣本所 含細胞具有相同起源的正常細胞的樣本。本領域技術人員能夠知曉適用于本發明的其他對 照。
[0187] 本文所使用的術語"患者"指的是需要治療的任何個體動物，更優選地為哺乳動物 (包括人類動物，例如，狗、貓、馬、兔、動物園動物、牛、豬、羊以及非非人類靈長動物）。最優 選地，本文所述的患者為人類。
[0188] 本文所使用的術語"受試者"意為應接受治療的任何個體人類受試者，包括患者， 它正具有或曾經具有一種或多種器官功能缺陷或衰竭的征兆、癥狀或指征，包括泌尿系統 的缺陷、受損或功能不全。這樣的受試者包括但不限于新近或之前被確診的受試者和表現 疾病復發的受試者，或者出于任何原因而具有器官功能缺陷或衰竭風險的受試者。所述受 試者可能之前已經接受過與器官功能缺陷或衰竭相關的治療或者未經治療。受試者可為尿 流改道治療的候選者，包括但不限于患有膀胱癌而需要切除膀胱的受試者、患有神經性膀 胱功能障礙而影響腎功能的受試者、患有膀胱放射性損傷的受試者和患有不自主性尿失禁 的受試者。所述受試者可為新近或之前被確診需要進行尿流改道的受試者和經歷并發癥的 受試者，或者出于任何原因而具有泌尿系統功能缺陷、受損或功能不全風險的受試者。所述 受試者可能之前已經接受過與泌尿系統功能缺陷、受損、或功能不全相關的治療或者未經 這樣的治療。
[0189] 本文所使用的術語"尿流改道"或"管道"指的是所述受試者與所植入的尿流改 道構建體、愈合的輸尿管和鄰近的圍腔經過一段時間相互作用之后所形成的器官或組織結 構。圍腔與允許尿液通過腹腔壁的區室前部相連接，可由連接所述構建體的尾端（位于腹 腔內）和皮膚的腹腔包膜的最前管狀部分形成。
[0190] 術語"尾"和"頭"是相對于尿液產生和流動的描述性術語。術語"尾"指的是所述 尿流改道構建體在植入后最接近所述開孔處的一端，而術語"頭"指的是所述尿流改道構建 體在植入后最接近腎臟和輸尿管的一端。
[0191] 術語"碎屑"指的是在植入尿流改道構建體之后在愈合和再生過程中形成的碎片。 碎屑可由脫落的組織細胞、炎性滲出物和支架生物降解產物形成。如果所述管道被這類碎 片堵塞（外流不正常），那么停滯的碎片會在所述管道的腔中形成碎屑或半固體塊。
[0192] 術語"清創術"指的是通過手術或非手術方法從管道中去除外來物質或被撕裂的、 無生命力的、被污染的或死亡的組織，以防止感染、防止堵塞和促進愈合過程。所述清創術 可包括去除碎屑。
[0193] 術語"開孔"指的是通過手術生成的用于使尿液從尿流改道構建體的引流管外流 端流出體外的開口。尿液通常由體外的尿袋收集。
[0194] 術語"開孔端"或"開孔扣"指的是用于保持所述開孔的開口處完整的手段例如裝 置。
[0195] 本文所使用的術語"擴張"或"擴大"指的是增加已有的層狀結構的腔體器官或組 織結構的大小。例如，在本發明的一個方面，已有的層狀結構的腔體器官或組織結構可被擴 大 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28 或 29 個百分點。在本 發明的另一方面，已有的層狀結構的腔體器官或組織結構可被擴大例如以增加已有的層狀 結構的腔體器官或組織結構的已有的容積。
[0196] 本文所使用的術語"容積"指的是在確定的區域內能夠含有的液體的量。
[0197] "再生預后"或"再生性預后"通常指的是對植入本文所述的構建體后的可能過程 或結果的預報或預計。如本文所述，再生預后包括對下述一種或多種情況的預報或預計：在 膀胱替換或擴張后膀胱功能的發展或改善、在管道植入后尿流改道功能的發展，改善的膀 胱容積的發展和改善的膀胱順應性的發展。如本文所述，"對再生的預后"意為對對植入新 的器官或組織結構后的可能過程或結果提供預報或預計。在一些實施方案中，"對再生的預 后"包括對下述一種或多種情況提供預報或預計：在膀胱替換或擴張后膀胱功能的發展或 改善、在管道植入后尿流改道功能的發展，膀胱容積的發展或改善的膀胱容積，以及膀胱順 應性的發展或改善的膀胱順應性。
[0198] "再生的組織"指的是在植入本文所述的構建體后發展出的器官或組織結構的組 織。所述器官或組織結構可為膀胱或膀胱的一部分。所述再生的組織可包括襯有平滑肌的 連續的尿道上皮。
[0199] 2.細朐群
[0200] 本發明提供了用于層狀結構的體腔器官或組織結構的重建、修復、擴張或替換的 平滑肌細胞群，其中所述細胞群包括具有收縮功能并對一種或多種平滑肌細胞標記物呈陽 性的至少一種細胞。
[0201] 如本文所述，已經應用組織工程學原理成功地提供了用于層狀結構的體腔器 官和組織結構的重建、修復、擴張或替換的可植入的細胞接種基質，所述體腔器官和組 織結構例如膀胱或通常由尿道上皮和平滑肌層構成的膀胱組件。（Becker et al. Eur. Urol. 51, 1217-1228 (2007) ；Frimberger et al. Regen. Med. I, 425-435 (2006) ；Roth et al. Curr. Urol. R印· 10, 119-125(2009) ;Wood et al. Curr. Opin. Urol. 18, 564-569)。平滑 肌細胞可來源于患者自身的組織，包括膀胱、尿道、輸尿管和其他泌尿生殖組織。然而，作為 使用最初的器官位置作為發育新的和健康的工程組織的基本單元的方法而言，依賴于這樣 的細胞培養系統的開發和維持是有問題的（例如在膀胱癌的治療過程中）。顯然這樣的癌 細胞不適于接種在可植入的新的膀胱支架或基質上。
[0202] 本發明提供了來源于與將進行重建、修復、擴張或替換的器官或組織結構不同的 器官或組織結構來源的細胞群。在一個實施方案中，所述來源為自體來源。
[0203] 在另一方面，所述細胞群表達與平滑肌細胞群一致的標記物或平滑肌細胞群典型 的標記物。
[0204] 在另一方面，本發明提供了從與將進行重建、修復、擴張或替換的腔體器官或組織 結構不同的器官或組織結構來源分離的平滑肌細胞群。在一個優選實施方案中，所述腔體 器官或組織結構為膀胱或膀胱的一部分。
[0205] 在一個方面，所述來源為外周血。在一個實施方案中，所述外周血來源的平滑肌細 胞群來源于患者樣本。所述患者樣本可為靜脈血。
[0206] 在一個方面，所述來源為脂肪組織。在一個實施方案中，所述脂肪組織來源的平滑 肌細胞群來源于患者樣本。所述患者樣本可為在吸脂手術過程中取出的脂肪組織或脂肪吸 取物。在一個優選實施方案中，患者樣本
[0207] 在再另一個實施方案中，本發明的分離的細胞群在被培養后可發展出多種平滑肌 細胞特征，所述特征包括但不限于："峰-谷"狀形態學，一種或多種平滑肌細胞標記物的表 達，收縮功能，纖維形成和細胞因子合成。
[0208] 在一個方面，被培養的細胞群的特征在于其具有"峰-谷"狀形態學。具有"峰-谷" 狀形態學的細胞可具有多種特征，包括但不限于：紡錘形狀、在傳代時具有平坦和纖維狀、 呈平行列狀地延伸和排列、"漩渦"狀的生長外觀，以及上述任意特征的組合。在一個實施方 案中，所述細胞群在合適的培養基中培養時發展出平滑肌細胞典型的"峰-谷"狀形態學。
[0209] 在另一方面，被培養的細胞群的特征在于存在一種或多種平滑肌細胞標記物。在 一個實施方案中，所述細胞群在合適的培養基中培養時表達可檢測的平滑肌細胞標記物， 所述標記物包括但不限于一種或多種下列蛋白：心肌蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、鈣結合蛋 白、肌球蛋白重鏈、BAALC、結蛋白、成肌纖維細胞抗原、SM22,以及它們的任意組合。
[0210] 在另一方面，被培養的細胞群的特征在于存在表達一種或多種細胞表面標記物的 一種或多種細胞。在一個實施方案中，所述細胞群在合適的培養基中培養時含有對細胞表 面標記物呈陽性的一種或多種細胞，所述細胞表面標記物包括但不限于下列一種或多種標 記物：⑶73、⑶90、⑶105、⑶166、⑶31、⑶54、⑶56、⑶117,以及它們的任意組合。在另一個 實施方案中，所述細胞群在合適的培養基中培養時含有⑶45+、⑶31+、⑶54+、⑶56+、⑶90+ 和⑶105+的一種或多種細胞。
[0211] 在另一方面，被培養的細胞群的特征在于存在具有收縮功能的一種或多種細胞。 在一個實施方案中，所述細胞群在合適的培養基中培養時發展出收縮功能。在另一個實施 方案中，所述收縮功能為鈣依賴性的。在另一個實施方案中，所述鈣依賴性的收縮功能可通 過與鈣螯合劑相接觸的抑制而得到證實。在另一個實施方案中，所述鈣螯合劑為EDTA。本 領域普通技術人員能夠知曉其他本領域已知的合適的螯合劑。
[0212] 在又另一方面，被培養的細胞群的特征在于纖維形成。在一個實施方案中，所述細 胞群在合適的培養基中培養時經歷纖維形成。
[0213] 在一個方面，所述細胞群包括表達一種或多種細胞因子的至少一種細胞。在一個 實施方案中，所述細胞因子選自=MCP-U制瘤素 M、IL-8和GR0。
[0214] 在一個方面，本發明的細胞群在分離后的培養過程中具有有限的增殖壽命。在其 他實施方案中，所述細胞群的增殖壽命為約1代、約2代、約3代、約4代、約5代、約6代、 約7代、約8代、約9代、約10代、約11代、約12代、約13代、約14代、約15代、約16代、 約17代或約18代。在一個優選實施方案中，所述細胞群在培養中的增殖壽命不超過5代。 脂肪來源的SMC通常在培養中3-5天傳一代，血液來源的SMC通常在培養中14天開始產生 第一代，然后每3-5天傳一代（詳見實施例1)。
[0215] 在一個方面，本發明提供了含有至少一種再生性細胞的再生性細胞群，所述再生 性細胞當沉積在本文所述的支架或基質上并被植入至有需要的受試者體內時，能夠使得按 本文所述進行重建、修復、擴張或替換的器官或組織結構發生再生。再生性細胞群在被植入 有需要的患者體內后能夠刺激或起動層狀結構的體腔器官或組織結構的再生。通常，器官 或組織結構的再生的特征為細胞組件、組織結構和架構、功能以及調節性發育的重建。此 夕卜，再生性細胞群最大程度上消除了在細胞接種腔體器官或組織結構構建體植入位置上可 能發生的不完整性或障礙。在植入職位處的組織破壞的表現為膠原沉積增加和/或疤痕組 織形成，這兩者中的每一個都可以通過使用再生性細胞群而被最大程度地消除。此外，某些 細胞事件是再生性過程的指征。對于通過本文所述的細胞群和支架再生的膀胱或膀胱的一 部分而言，再生的器官或組織結構包括從朝向腔體表面延伸的多個微脈管放射性發散的具 有維管組織的平滑肌薄壁組織，以及具有對齊粘膜表面的完全發育血管的基質元件（見上 文Jayo II)。再生的膀胱或膀胱的一部分的特征還有存在紡錘樣/間充質細胞和ciSMAW 性的肌肉前體細胞。在一個實施方案中，所述a SM陽性的紡錘樣細胞可在新生基質組織 中和多個新生血管（小動脈）周圍觀察到。
[0216] 在一個實施方案中，本發明提供的細胞群當沉積在本文所述的支架或基質上并被 植入至有需要的受試者體內時，能夠使得按本文所述進行重建、修復、擴張或替換的器官或 組織結構發生修復。在其他實施方案中，修復效果的特征為疤痕組織形成和/或膠原沉積。 本領域技術人員能夠知曉本領域已知的修復的其他特征。
[0217] 在另一方面，所述再生性細胞群提供了再生性效果，其特征在于對重建的層狀結 構的腔體器官或組織結構的大小的適應性調節。在一個實施方案中，所述再生性細胞群的 再生性效果通過特異性針對接受了接種有所述再生性細胞群的支架或基質的受試者的適 應性調節而得到確認。在一個實施方案中，所述適應性調節為使用本文所述的構建體的受 試者的膀胱的替換或擴張，從而使得新的膀胱生長并發育為與所述受試者身體成比例的大 小。
[0218] 在一個實施方案中，所述能夠刺激再生的細胞群為產生MCP-I的細胞群，所述細 胞群含有至少一種表達趨化因子產物MCP-I的細胞。MCP-I再生性刺激的特征為某種細胞 類型向植入位置的募集。在一個實施方案中，MCP-I將肌肉祖細胞募集至植入位置以在新的 膀胱中增殖。在另一個實施方案中，MCP-I將單核細胞募集至植入位置，所述單核細胞又可 以產生各種細胞因子和/或趨化因子以促進再生性過程。在另一個實施方案中，MCP-I誘 導網膜細胞發育為肌細胞。
[0219] 在一個方面，本發明提供了特異性細胞因子例如MCP-I作為組織再生的替代性標 記物的用途。這類標記物可以與基于功能是否重建的再生評估組合使用。隨著再生過程的 時程對替代性標記物的監測可以作為再生的預后指征。
[0220] 在另一個實施方案中，所述細胞群為純化的細胞群。本文所述的純化的細胞群的 特征在于基于形態學、標記物表達和功能中的一種或多種的表型。所述表型包括但不限于 下列的一種或多種：峰-谷形態學、一種或多種平滑肌細胞標記物的表達、細胞因子的表 達、在培養中有限的增殖壽命、收縮功能以及誘導纖維形成的能力。所述表型可包括本文所 述的或本領域技術人員已知的其他特征。在另一個實施方案中，所述純化的細胞群基本上 與本文所述的平滑肌細胞群相同。基本相同的純化的細胞群通常具有至少約90%的均一 性，這可通過形態學、標記物表達和功能中的一種或多種來判斷。在其他實施方案中，所述 純化的細胞群具有至少約95%的均一性、至少約98%的均一性或至少約99. 5%的均一性。
[0221] 在另一個實施方案中，所述平滑肌細胞群直接來源于人類脂肪組織，并且其特征 在于下列一種或多種蛋白的表達水平與其在人類骨髓來源的間充質干細胞（MSC)中的表 達水平有差異：骨橋蛋白、0ct4B、生長分化因子5(⑶F5)、肝細胞生長因子（HGF)、白血病 抑制因子（LIF)、黑素瘤細胞粘附分子（MCAM)、脈管細胞粘附分子I (VCAMl)、PECAM、vWF、 Flk-1、發育不良相關轉錄因子2(RUNX2)、骨形態發生蛋白6(BMP6)、CD44和IL-1B。在另 一個實施方案中，所述SMC細胞群與人類骨髓來源的MSC相比：(a)⑶F5、HGF、LIF、MCAM、 RUNX2、VCAM1、PECAM、vWF和Flk-I中的一種或多種的表達水平下降；和/或（b)0ct4B、骨 橋蛋白、BMP6、⑶44和IL-IB中的一種或多種的表達水平上升。在另一個實施方案中，所述 SMC 細胞群與人類骨髓來源的 MSC 相比：（a) GDF5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAMl、PECAM、vWF 和Flk-I的表達水平全部下降；和/或（b)0ct4B、骨橋蛋白、BMP6、CD44和IL-IB的表達水 平全部上升。
[0222] 在另一個實施方案中，所述平滑肌細胞群直接來源于脂肪組織，所述脂肪組織包 括一種或多種⑶45+細胞和/或一種或多種⑶117+細胞。
[0223] 在其他實施方案中，本發明提供了直接來源于人類脂肪組織的平滑肌細胞群，所 述平滑肌細胞群與人類骨髓來源的MSC相比具有較短的增殖壽命。在另一個實施方案中， 所述SMC細胞群在培養物中表現出增殖的接觸依賴性抑制。在另一個實施方案中，所述直 接來源于脂肪組織的SMC細胞群的特征在于至少一種平滑肌細胞（SMC)標記物響應于凝血 噁烷A2模擬物而下調。在其他實施方案中，所述SMC標記物選自心肌蛋白和肌球蛋白重 鏈-平滑肌同種型（SMMHC)。在另一個實施方案中，所述心肌蛋白和SMMHC響應于凝血噁 烷A2模擬物而下調。
[0224] 在所有實施方案中，所述SMC細胞群來源于自體來源。
[0225] 在一個方面，本發明考慮了本文所述的平滑肌細胞群用于呼吸疾病的應用。氣道 平滑肌存在于大多數脊椎動物的氣管系統中。呼吸系統眼部疾病指的是所述受試者由于肺 部肌肉的功能不正常而具有有缺陷的呼吸系統。據報道，某些細胞群在被給予至肺部時可 提供有益的效果（例如Ohnishi et al. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2008December; 3(4) :509 - 514)。這些SMC細胞群可對患有呼吸系統疾病（例如哮喘、肺氣腫或慢性阻塞 性肺病（COPD))的個體有益處。對于患有肺癌的個體也可能有益處。在一個實施方案中， 自體SMC細胞群可從有需要的受試者的脂肪組織或外周血分離。可將所述細胞群接種于適 于植入至所述受試者肺部位置的支架上。本發明的細胞群的一個優勢為：如果受試者的呼 吸系統有缺陷（例如患有肺癌）時，可能不能從所述受試者的肺部獲得合適的SMC。所述細 胞群可用于受試者的肺的全部或部分被切除的情況（例如肺癌的情況）。在受試者的肺的 全部或部分被切除后，可以從活檢樣本中分離自體SMC細胞群，經過培養后接種于合適的 支架上并植入所述受試者體內，以提供新的肺或新的肺部組織結構。
[0226] 在另一方面，本發明考慮了本文所述的SMC細胞群用于眼部疾病的應用。眼部疾 病指的是所述受試者由于眼部肌肉的功能不正常而具有眼部缺陷。平滑肌存在于眼內的睫 狀肌并控制眼的容積，以用于觀察不同距離的物體并調節房水通過Schlemm氏管的外流。 平滑肌還存在于眼部的虹膜。這些SMC細胞群可對患有眼部疾病（例如老花眼和遠視眼） 的患者有一處。對于患有肺癌的個體也可能有益處。在一個實施方案中，自體SMC細胞群 可從有需要的受試者的脂肪組織或外周血分離。可將所述細胞群接種于適于植入至所述受 試者眼部位置的支架上。本發明的細胞群的一個優勢為：如果受試者的眼部有缺陷或由于 眼部組織的可用性受到限制時，可能不能從所述受試者的眼部獲得合適的SMC。可以從活檢 樣本中分離自體SMC細胞群，經過培養后接種于合適的支架上并植入所述受試者體內，以 提供新的眼部組織。
[0227] 在另一個實施方案中，可以不使用支架（例如通過植入）而將本發明的平滑肌細 胞群給予患有呼吸系統疾病或眼部疾病的受試者。本領域普通技術人員能夠知曉合適的植 入方法。
[0228] 在一個實施方案中，自體SMC細胞群可從有需要的受試者的脂肪組織或外周血分 離。可將所述細胞群接種于適于植入至所述受試者肺部位置的支架上。本發明的細胞群的 一個優勢為：如果受試者的呼吸系統有缺陷（例如患有肺癌）時，可能不能從所述受試者的 肺部獲得合適的SMC。所述細胞群可用于受試者的肺的全部或部分被切除的情況（例如肺 癌的情況）。在受試者的肺的全部或部分被切除后，可以從活檢樣本中分離自體SMC細胞 群，經過培養后接種于合適的支架上并植入所述受試者體內，以提供新的肺或新的肺部組 織結構。在另一個實施方案中，可以不使用支架（例如通過植入）而將本發明的平滑肌細 胞群給予患有呼吸系統疾病的受試者。本領域普通技術人員能夠知曉合適的植入方法。
[0229] 3.分離細朐群的方法
[0230] 自體細胞群直接來源于需要治療的受試者。所述受試者提供來源的組織通常與需 要治療的器官或組織結構不同。自體細胞群可以來源于患者的自身組織，例如來源于脂肪 組織或外周血。所述自體細胞可以從活檢樣本中分離。此外，所述細胞在使用前可被冷凍 或擴增。
[0231] 為了準備構建細胞接種的支架，獲自受試者的含有平滑肌細胞的樣本被解離形成 合適的細胞懸液。分離和培養細胞的方法在已授權的美國專利No. 5, 567, 612中有述，該專 利文獻通過援引的方式明確地納入本文。將細胞解離為單細胞狀態的過程并不是開始原代 培養所必需的，因為在體外培養一段時間（例如一周）后就可以形成單細胞懸液。可以通 過機械方法和酶學方法破壞連結細胞的細胞外基質和胞間連接，從而進行組織解離。如果 需要，可以在體外培養自體細胞，以增加可用于接種支架的細胞的數量。
[0232] 在接種前，可以使用遺傳物質轉染細胞。在聚合物接種之前，可以用特異性基因轉 染平滑肌細胞。細胞-聚合物構建體可以攜帶能使宿主長期存活或使組織形成新的器官所 需要的遺傳信息。
[0233] 可以使用或不使用本領域技術人員已知的細胞分級步驟來制備細胞培養物。可以 基于細胞大小、DNA含量、細胞表面抗原和存活力來進行細胞分級。例如，可以從脂肪組織 中富集平滑肌細胞，并同時減少內皮細胞和脂肪細胞以收集平滑肌細胞。雖然可以使用細 胞分級，但是它并不是實施本發明所必需的。
[0234] 在本文所述的方法中，另一種任選的過程為冷凍保存。可以使用冷凍保存來例如 降低對多次侵入性手術過程的需要。可以擴增取自活檢樣本或取自受試者的細胞，可以使 用一部分擴增的細胞并將另一部分細胞冷凍保存。能夠擴增和保存細胞就減少了必需的手 術過程的次數。冷凍保存用途的另一實例是在組織庫中的應用。自體細胞可在例如供體組 織庫中儲存。當新的器官或組織結構需要細胞時，可以按照需要由冷凍保存的細胞提供。患 病的或正接受可能危害其已有的器官或組織結構的治療的患者可以冷凍保存一種或多種 活檢樣本。然后，如果患者自身的器官或組織結構發生衰竭，就可以融化冷凍保存的自體細 胞并用于治療。例如，如果在經過治療后的新的器官或組織結構中復發癌癥，可以使用冷凍 保存的細胞來重建器官或組織結構，就不再需要另外的活檢樣本。
[0235] 可以按照下述總體方法來從脂肪或外周血中分離平滑肌細胞。可以獲得合適重量 (例如以克為單位）和/或面積（例如以cm 2為單位）的脂肪活檢標本。可以在在計劃植 入新的器官或組織結構構建體之前獲得合適體積（例如以ml為單位）的外周血。
[0236] 下面描述一種適用于從脂肪的基質血管級分（SVF)中分離平滑肌細胞的代 表性實例方法，所述脂肪的基質血管級分（SVF)代表了由多種細胞類型組成的不均 一的細胞群，包括內皮細胞和平滑肌細胞，以及由國際細胞治療協會（International Society for Cellular Therapy(ISCT))標準定義的 MSC 樣細胞（Domini et al.2006Cytotherapy8:4, 315-317)。可以從活檢樣本中獲得合適重量的（以克為單位）的 脂肪組織（例如7-25g)，用PBS洗滌（例如3次），用手術刀和剪將組織剪碎，轉移至50mL 錐形瓶中并在含膠原酶（例如〇· 1至〇· 3% ) (Worthington)和1 % BSA的DMEM-HG溶液中 在37°C培養60分鐘。可以持續振蕩或間歇性振蕩所述錐形瓶以促進消化。可以以600g離 心10分鐘以沉淀SVF并在添加10% FBS的DMEM-HG中重懸。然后使用基質-脈管級分來 進行第〇代細胞的接種。
[0237] 下面描述一種適用于從外周血中分離平滑肌細胞的代表性實例方法。可將合適的 體積（例如25ml)的外周血以1:1稀釋于PBS中，加入25ml Histopaque_1077(Sigma)并 置于50mL錐形瓶中以分層。在離心（例如800g，30min)后，可以收集單核細胞級分，用PBS 洗滌一次并重懸于α-ΜΕΜ/10% FBS(Invitrogen)中以進行第0代細胞的接種。
[0238] 本領域普通技術人員能夠知曉其他用于分離平滑肌細胞的方法。
[0239] 在一個方面，本發明提供了無需使用誘導分化為平滑肌細胞的條件而從SVF中分 離出分離的平滑肌細胞群的方法。在一個實施方案中，所述方法包括a)獲得脂肪組織，b) 消化所述脂肪組織，c)離心所述被消化的脂肪組織以提供基質血管級分（SVF)，d)無需使 用誘導分化為平滑肌細胞的條件而培養所述SVF，和e)從脂肪組織來源的SVF中分離平滑 肌細胞群。在一個實施方案中，所述培養步驟包括洗滌所述SVF，在細胞培養基重懸所述 SVF，以及將所述重懸的SVF鋪板。在另一個實施方案中，所述培養步驟包括提供貼靠細胞 培養載體（例如培養板或容器）的細胞群。在另一個實施方案中，所述方法還包括擴增所 述培養的細胞群。在其他實施方案中，所述方法還包括分析所述平滑肌細胞群是否具有平 滑肌細胞的特征。在一個實施方案中，所述脂肪組織來源于自體來源。
[0240] 在一個實施方案中，所述培養條件不需要使用能夠誘導脂肪組 織SVF來源的細胞群分化為平滑肌細胞的細胞培養組分。據Jack et al.，J Biomaterials30 (2009) 3529-3270報道，在含有肝素的誘導培養基上培養來源于SVF的未 分化的脂肪干細胞6周，以使得干細胞分化為平滑肌細胞（還可參見Rodriguez的美國專 利No. 7, 531，355)。Jack et al.報道的干細胞不需要在培養期間內被分份。在另一個實 施方案中，所述培養條件不需要使用誘導培養基，包括含有肝素的誘導培養基。在另一個實 施方案中，本發明的方法包括使用不含有能夠使細胞群分化為平滑肌細胞或培養和擴張細 胞群所需的外源性生長因子的培養條件。
[0241] 本發明的方法與其他報道過的方法相比的優勢包括省略了使脂肪來源的干細胞 分化為平滑肌細胞的步驟，這就減少了獲得脂肪活檢樣本和從中分離平滑肌細胞群之間的 時間。此外，由于不再需要誘導分化的其他細胞培養基組分（例如外源性生長因子），也就 具有了降低成本的優勢。
[0242] 在另一方面，本發明提供了分離和培養平滑肌細胞群的方法，所述平滑肌細胞群 含有至少一種具有收縮功能和對一種或多種平滑肌細胞標記物呈陽性的細胞。在一個實施 方案中，所述方法包括從需要重建、修復、擴張或替換層狀結構的腔體器官或組織結構的患 者獲得樣本的步驟，其中所述樣本不是從需要被重建、修復、擴張或替換的腔體器官或組織 結構獲得的。在另一個實施方案中，所述平滑肌細胞來源于患者樣本。在另一個實施方案 中，所述腔體器官或組織結構為膀胱或膀胱的一部分。在一個實施方案中，所述樣本為自體 樣本。在另一個實施方案中，所述樣本為外周血樣本。在又另一個實施方案中，所述樣本為 脂肪組織樣本。所述脂肪組織可為通過腹部吸脂手術而取出的所述受試者的組織。
[0243] 在另一個實施方案中，在所述獲得步驟之后還進行分離步驟。
[0244] 對外周血樣本而言，所述分離步驟包括使樣本與密度梯度材料相接觸，離心所述 樣本以確定含有單核細胞級分的密度梯度，以及從所述密度梯度中提取所述單核細胞級 分。在所述分離步驟之后還可以進行培養步驟，即培養來自所提取的級分的細胞。
[0245] 對于脂肪組織樣本而言，所述純化步驟包括用膠原酶消化所述樣本，離心經過消 化的樣本，將離心的樣本混合以從原代脂肪細胞中分離基質細，離心混合的樣本以獲得基 質-脈管級分，該級分可被重懸以進行隨后的培養。
[0246] 在一個方面，本發明提供了不使用誘導分化的細胞培養基而提供分離的平滑肌細 胞（SMC)群的方法。在一個實施方案中，所述方法包括下述步驟：a)獲得脂肪組織活檢樣 本，b)酶促消化所述脂肪組織，c)離心經消化的脂肪組織以提供含有不均一細胞群的基質 血管級分（SVF)，d)洗滌和鋪板所述不均一的細胞群；e)在不使用平滑肌細胞分化誘導培 養基的條件下培養所述細胞群，f)從培養的細胞中分離完全分化的SMC細胞群。在另一個 實施方案中，所述培養步驟e)包括篩選貼靠細胞培養載體的細胞。在另一個實施方案中， 所述培養步驟e)不包括使用含有外源性生長因子的細胞培養基。在一個實施方案中，所 述培養方法包括使用含有最少必須培養基（例如DMEM或α-MEM)和胎牛血清（例如10% FBS)的細胞培養基，并通過本領域普通技術人員已知的標準條件進行培養。在另一個實施 方案中，所述平滑肌細胞群不是脂肪來源的干細胞群。在另一個實施方案中，所述平滑肌細 胞群不是間充質干細胞群。
[0247] 4.支架（Scaffolds)
[0248] 如Atala的美國專利No. 6576019(其全部內容通過援引的方式納入本文）所述， 支架或聚合物基質可由各種不同的材料構成。通常，生物相容性材料特別是可生物降解材 料是用于構建本文所述的支架的優選材料。所述支架為具有至少兩個分離表面的可植入 的、生物相容性的、合成的或天然的聚合物基質。所述支架的形狀與需要治療的所述腔體器 官或組織結構的至少一部分相適應。所述生物相容性材料是可生物降解的。生物相容性指 的是所述材料沒有毒性或對于生物學功能沒有損害性效果。可生物降解指的是所述材料可 以在患者體內被吸收或降解。可生物降解材料的實例包括例如可吸收的縫線。用于形成 支架的代表性材料包括天然的或合成的聚合物，例如膠原，聚（α酯）例如聚（乳酸）、聚 (乙醇酸）、聚原酸酯和聚酸酐以及它們的共聚物，它們可以通過水解以受控的速度降解并 被吸收。這些材料可以實現對降解性、可操作性、大小和構型的最大程度的控制。優選的可 生物降解聚合物材料包括以可吸收的合成縫線材料的形式開發的聚乙醇酸和聚羥基乳酸 (polyglactin)。聚乙醇酸和聚輕基乳酸纖維可以以廠商提供的形式使用。其他支架材料包 括纖維素醚、纖維素、纖維素酯、氟化聚乙烯、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰 亞胺、聚丙烯酸酯、聚苯并惡唑、聚碳酸酯，聚醚腈（polycyanoarylether)、聚酯、聚酯碳酸 酯、聚醚、聚醚醚酮，聚醚酰亞胺、聚醚酮、聚醚砜、聚乙烯、聚氟烯烴、聚酰亞胺、聚烯烴、聚 惡二唑、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、聚硫、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚三唑、聚 氨酯、聚乙烯，聚偏氟乙烯、再生的纖維素、硅酮、脲醛，或這些材料的共聚物或物理混合物。 可用合適的抗微生物劑浸漬所述材料或者用有色添加劑對所述材料著色，以改善其視覺效 果和有助于手術過程。
[0249] 其他可生物降解的支架材料包括由Ethicon公司（Ethicon Co.，Somerville, N. J.)生產的合成縫線材料，例如M0N0CRYL?(乙醇酸和ε-己內酯的共聚物）、VICRYL? 或Polyglactin910(乳酸和乙醇酸的共聚物，涂覆有Polyglactin370和硬脂酸 鈣）和PANACRYL? (乳酸和乙醇酸的共聚物，涂覆有己內酯和乙醇酸的共聚物）。 (Craig P.H. , WiIliams J.A. , Davis K.ff. , et al. :A Biological Comparison of Polyglactin910and Polyglycolic Acid Synthetic Absorbable Sutures. Surg. 141 ； 1010,（1975))和聚乙醇酸。這些材料可以以廠商提供的形式使用。
[0250] 在又另一個實施方案中，所述基質或支架可以使用天然的去細胞化器官的一部分 來產生。可以通過從器官中去除全部細胞和組織內容而對生物結構或器官部分去細胞化。 去細胞化過程包括一系列的連續提取。這種提取過程的一個關鍵特征是避免了可能打亂或 破壞生物結構的復雜內部結構的劇烈提取過程。第一步包括除去細胞碎片和細胞膜的溶 解。然后再溶解核胞質組分和核組分。
[0251] 優選地，通過使用溫和的機械破壞方法除去包圍器官部分的細胞膜和細胞碎片， 從而使所述生物結構例如器官部分被去細胞化。所述溫和的機械破壞方法必須足以破壞細 胞膜。然而，所述去細胞化過程應避免損傷或打亂所述生物結構的復雜內部結構。溫和的 機械破壞方法包括刮去器官部分的表面、在合適體積的液體（例如蒸餾水）中攪拌器官部 分或攪拌器官。在一個優選實施方案中，所述溫和的機械破壞方法包括在合適體積的蒸饋 水中攪拌器官部分，直至細胞膜被破壞且細胞碎片被從所述器官移除。
[0252] 在除去細胞膜后，再除去所述生物結構的核和胞質組分。這可以通過溶解細胞和 核組分但不破壞其內部結構的方式來進行。為了溶解核組分，可以使用非離子型去污劑或 表面活性劑。非離子型去污劑或表面活性劑包括但不限于：可以獲自Rohm and Haas of Philadelphia、Pa.的 Triton 系列產品，包括 Triton X-100、Triton N-101、Triton X-114、 Triton X-405、Triton X-705和Triton DF-16,它們可從多個供貨商處購得；Tween系列 產品，例如單月桂酸酯（Tween20)、單棕櫚酸酯（Tween40)、單油酸酯（Tween80)和聚氧乙 烯-23-月桂醚（Brij. 35)、聚氧乙烯醚W-I (Polyox)等等，膽酸鈉、去氧膽酸鹽、CHAPS、阜 角苷、正癸基-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-D-吡喃葡萄糖苷和 Nonidet P-40。
[0253] 本領域技術人員能夠知曉屬于上述類別的化合物的描述和可商購的供貨 商，這些也可見于〃Chemical Classification, Emulsifiers and Detergents"，McCut cheon's, Emulsifiers and Detergents, 1986, North American and International Editions, McCutcheon Division, MC Publishing Co. , Glen Rock, N. J. , U. S. A. and Judith Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry, Calbiochem. R. , Hoechst Celanese Corp. , 1987。在一個優選實施方案中， 上述非離子型表面活性劑為Triton序列產品，優選地為Triton X-100。
[0254] 可以根據被去細胞化的生物結構的類型來改變上述非離子型去污劑的濃度。例 如，對于精細組織例如血管，應降低去污劑的濃度。非離子型去污劑的優選濃度可為約 0. 001至約2. 0% (w/v)。更優選地為約0. 05至約I. 0% (w/v)。再更優選地為約0. 1% (w/ v)至約0. 8% (w/v)。優選的濃度范圍為約0. 001至約0. 2% (w/v)，特別優選的范圍為約 0· 05 至約 0· 1% (w/v)。
[0255] 對于包括致密的胞質纖維網絡、細胞間復合物和頂端微細胞結構的細胞骨架組 分，可以使用堿性溶液例如氨水進行溶解。包括銨鹽及其衍生物的其他堿性溶液也可用于 溶解細胞骨架組分。合適的銨鹽溶液的實例包括硫酸銨、乙酸銨和氨水。在一個優選實施 方案中，使用了氨水。
[0256] 可以根據被去細胞化的生物結構的類型來改變所述堿性溶液例如氨水的濃度。 例如，對于精細組織例如血管，應降低去污劑的濃度。優選的濃度范圍可為約0.001至約 2. 0% (w/v)。更優選地為約0. 005至約0. 1% (w/v)。再更優選地為約0. 01% (w/v)至約 0. 08% (w/v) 〇
[0257] 去細胞化的凍干的結構可儲存于合適的溫度下直至需要使用時。在使用前，可以 將所述去細胞化的結構在合適的等滲緩沖液或細胞培養基中進行平衡。合適的緩沖劑包 括但不限于磷酸鹽緩沖溶液（PBS)、鹽水、MOPS，HEPES，Hank's平衡鹽溶液等等。合適的細 胞培養基包括但不限于RPMI1640、Fisher's培養基、Iscove' s培養基、McCoy's培養基、 Dulbecco' s培養基等等。
[0258] 其他可用的生物相容性材料包括不銹鋼、鈦、硅酮、金和硅橡膠。
[0259] 可以加固所述聚合物基質或支架。例如，可以在合成基質或支架形成的過程中加 入加固材料，或者在植入之前將加固材料貼附在天然或合成的基質上。用于形成加固的代 表性材料包括天然或合成的聚合物，例如膠原，聚（α酯），例如聚（乳酸），聚（乙醇酸）， 聚原酸酯和聚酸酐，以及它們的共聚物，它們都可以以受控的速度通過水解降解并被吸收。 這些材料可以實現對可降解性、可操作性、大小和構型的最大程度的控制。
[0260] 可以根據機械性質來表征所述可生物降解聚合物，例如使用Instron測試儀來測 量拉伸強度，通過凝膠滲透色譜（GPC)來測量聚合物的分子量，通過差示掃描量熱法（DSC) 來測量轉變溫度，以及通過紅外（IR)光譜來測量鍵結構；或者可以通過毒理學來表征所述 可生物降解聚合物，初始的篩選測試包括Ames測定和體外致畸性測定和動物體內植入研 究，以研究其免疫原性、炎性、釋放和降解性質等。可以使用掃描電鏡來測定體外細胞貼附 和存活力，使用放射性同位素來進行組織學和定量測定。還可以根據被植入患者體內后材 料降解所需的時間來表征可生物降解材料。通過變化所述構建方式，例如厚度和網篩大小， 所述可生物降解材料基本上能夠在約2年至約2個月之間、優選地在約18個月和約4個月 之間、最優選地在約15個月和約8個月之間、最優選地在約12個月和約10個月之間發生 生物降解。如果必要的話，可以構建所述可生物降解材料以使其在約3年或約4年或約5 年更長時間內不發生降解。
[0261] 可以如上所述地使用可控的有孔結構編織所述聚合物基質或支架。可以使用孔的 大小來確定細胞分布。例如，聚合物基質或支架上的孔的大小可以大到使得細胞能夠從一 個表面遷移至相對的表面。或者，所述孔可以小到僅能允許聚合物基質或支架的兩側進行 液體流通但不允許細胞通過。為實現這一目的，合適的孔直徑可為約0. 04微米至約10微 米、優選地為約0. 4微米至約4微米。在一些實施方案中，聚合物基質或支架的表面可具有 足夠大的孔，以使得細胞群可以貼附和遷移至孔中。孔在聚合物基質或支架的底部可以變 得比較小，以防止細胞從所述聚合物基質或支架的一側遷移至相對側。具有較小孔直徑的 聚合物基質或支架的一個實施方案為層狀結構，其中在兩層大孔材料之間夾有小孔材料。 聚碳酸酯膜是特別合適的，因為它們在編織時可以精細控制孔的大小，例如孔的大小可為 約0. Ol微米、約0. 05微米、約0. 1微米、約0. 2微米、約0. 45微米、約0. 6微米、約I. O微 米、約2. 0微米和約4. 0微米。在亞微米水平上，所述聚合物基質或支架使得細菌、病毒和 其他微生物可以透過。
[0262] 在設計每一種具體基質或其部分的時候要考慮以下特征或標準：（i)形狀、 (ii)強度、（iii)硬度和剛性，和（iv)可縫合性（所述基質或其部分易于被縫合或以其 他方式貼附至鄰近組織的程度）。如本文所述，給定基質或支架的硬度透過彈性模量來 定義，彈性模量是表示使支架變形的每單位面積上的壓力與導致的變形程度之間比例的 系數。（參見例如 Handbook of Biomaterials evaluation, Scientific, Technical, an d Clinical Testing of Implant Materials, 2nd edition, edited by Andreas F.von Recum, (1999) ；Ratner, et al., Biomaterials Science:An Introduction to Materials in Medicine,Academic Press (1996))。支架的剛性指的是給定支架具有的彈性（或缺乏 彈性）的程度。
[0263] 上述標準的每一個都是變量，例如可以通過材料和制造工藝的選擇而被改變，以 使得所述基質或其部分能夠最好地被放置和修飾，以治療醫學指征和實現其目的功能。例 如，包括用于膀胱替換、重建和/或擴張的基質或支架的材料必須足夠結實，以支持縫合不 會破裂，同時還要有足夠的順應性以容納變化的尿液體積。
[0264] 最佳地，所述基質或支架的形狀應使得：在其生物降解后，所得的重建的膀胱與天 然膀胱一樣在空的時候可以收縮，且在從新的器官或組織結構中取出尿路導管后輸尿管不 會被堵塞也不會留下漏孔。生物工程膀胱構建體可以以整體方式生產，也可以各個部分獨 立生產，或者以特殊部分的方式生產再進行組合。生產的每一個特殊基質或支架部分可具 有特殊功能。或者是為了便于制備而生產特殊部分。特殊部分可由特殊材料構建，并可被 設計為具有特殊性質。特殊部分的性質可包括與天然組織（例如輸尿管）相似的拉伸強度 (0. 5至I. 5MPa2)和30至100%的最終延展性，或者收縮拉伸強度為0. 5至28MPa2,最終延 展性為10_200*%，壓縮強度可為〈12。
[0265] 優選的是由纖維形成的網篩狀結構，所述纖維可為圓形、扇形、扁平型、星型，可以 孤立或與其他纖維交織在一起。分支纖維的使用所基于的原理，與通常用于解決表面面積 對體積的比例增加的問題的原理相同。所有的多細胞生物體均利用這種重復分支結構。分 支系統形成器官之間以及各器官的功能單位之間的通訊網絡。使用細胞接種和植入這種構 型使得可以植入大量細胞，每個細胞均與宿主的環境相接觸，使得養分和廢物能夠自由交 換，同時實現血管新生化。所述聚合物基質或支架可根據所需的最終形式、結構和功能制成 彈性或剛性。
[0266] 在一個優選實施方案中，所述聚合物基質或支架由具有15 μ m的平均纖維直徑的 聚乙醇酸纖維形成，并使用4-0Polyglactin910縫線形成膀胱形狀的模型。將所得的結構 用液化共聚物涂覆，所述液化共聚物例如聚-DL-丙交酯-共-乙交酯50:50,80mg/ml亞甲 基氯，以獲得合適的機械形式并固定其形狀。
[0267] 在另外一個實施方案中，用生物相容性和可生物降解形凝材料涂覆本發明的支 架。在一個實施方案中，所述形凝材料包括聚丙交酯-共-乙交酯共聚物。在另一個實施 方案中，所述形凝材料為液化的。
[0268] 在另一方面，可以在植入前（在用細胞接種聚合物基質或支架之前或之后）用 添加劑或藥物處理本發明的支架，從而例如在植入后促進新組織的再生。因此，例如可以 在所述聚合物基質或支架中加入生長因子、細胞因子、細胞外基質或支架組分以及其他生 物活性材料，從而促進植入物愈合和新組織的再生。通常應根據待被重建、替換或擴張 的組織或器官來選擇這樣的添加劑，以保證在植入的器官或組織中能夠形成合適的新組 織（對于用于促進骨愈合的這類添加劑的實例而言，可參見例如Kirker-Head，C. A. Vet. Surg. 24(5) :408-19(1995))。例如，當使用聚合物基質（任選地接種有內皮細胞）來擴張血 管組織時，可以使用血管內皮生長因子（VEGF)(參見例如美國專利No. 5, 654, 273)來促進 新的血管組織的再生。如果使用加入的細胞，那么可以加入的生長因子和其他添加劑（例 如表皮生長因子（EGF)、肝素結合表皮樣生長因子（HBGF)、成纖維細胞生長因子（FGF)、細 胞因子、基因、蛋白等等）的量可超過在聚合物基質上接種的細胞所產生的任何這類生長 因子的量（如果確實產生的話）。優選地，提供的這類添加劑的量足以促進新組織類型的再 生，所述組織類型適合于將要被修復、替換或擴張的組織或器官（例如通過引起或加速宿 主細胞向植入物中的滲透）。其他可用的添加劑包括抗細菌藥劑抗生素。
[0269] 一種優選的支撐基質或支架含有交叉的細絲，在所述細胞支撐物被植入后，它們 可以使得營養物通過很短的距離擴散至細胞而使得細胞能夠存活。在植入后，隨著細胞團 的擴增，所述細胞支撐基質或支架能夠同步地被血管化。
[0270] 在植入前在體外進行三維結構構建體的構建，可以促進細胞在植入后在體內的最 終分化，并且盡可能地降低對所述基質的炎性反應的風險，由此避免了植入物的攣縮和收 縮。
[0271] 在使用前，可以使用任何已知的方法對所述聚合物基質或支架進行滅菌。所使用 的方法取決于在聚合物基質中所使用的材料。滅菌方法的實例包括蒸汽滅菌、干熱滅菌、放 射滅菌、用例如環氧乙烷的氣體滅菌，以及氣體和煮沸滅菌。
[0272] 組成支架的合成材料可使用例如溶劑澆鑄、模壓、拉細絲、結網、浸析、編織和涂覆 等方法來成型。在溶劑澆鑄方法中，將一種或多種聚合物溶于適當的溶劑例如二氯甲烷中 形成溶液，將所述溶液澆鑄在分枝形狀的浮雕結構上。在溶劑蒸發后獲得薄膜。在模壓方 法中，將聚合物在最高達30, 000磅/平方英寸的壓力下壓成適當的形狀。拉細絲包括從熔 融聚合物中拉絲，結網包括通過將纖維壓制成毛氈狀的材料而形成網篩。在浸析方法中，將 含有兩種物質的溶液噴灑為接近所述構建體的最終形式的形狀。然后用溶劑溶解掉其中一 種組分，導致孔隙的形成（參見Mikos,美國專利No. 5, 514, 378,通過援引的方式納入本 文）。在成核方法中，將支架形狀的薄膜暴露于放射性裂變產物以產生放射性損壞材料的 痕跡。然后用酸或堿蝕刻聚碳酸酯層，將放射性損壞材料的痕跡翻印成孔。最后可以使用 激光成型和在許多材料中燒穿成孔，以形成具有均勻孔徑的結構。涂覆指的是用例如液化 共聚物（聚-DL-丙交酯-共-乙交酯50:5080mg/ml亞甲基氯）的材料涂覆或浸透聚合物 結構，從而改變其機械性質。可以進行一層涂覆，也可以進行多層涂覆，直至獲得所需的機 械性質。上述成型技術可以組合使用，例如，聚合物基質或支架可被編織、模壓和膠粘在一 起。而且，通過不同工藝成型的不同聚合物材料可以連接在一起形成組合形狀。所述組合 形狀可為層狀結構。例如，可以將一種聚合物基質或支架貼附在一種或多種聚合物基質上 以形成多層聚合物基質或支架結構。這種貼附可以通過使用液體聚合物膠粘或通過縫合來 進行。此外，所述聚合物基質或支架可以以固體塊的形式形成，并通過激光或其他標準技術 來成型至其所需的最終形式。激光成型指的是使用激光去除材料的過程。
[0273] 在一個優選實施方案中，所述支架由無紡聚乙醇酸（PGA)毛氈和聚（乳酸-共-乙 醇酸）聚合物（PLGA)形成。在另一個優選實施方案中，所述支架為尿流改道支架。
[0274] 如Bertram等人的美國專利公布20070276507(其全部內容通過援引的方式納入 本文），本發明的聚合物基質或支架可成型為任意數量的所需構型，以滿足其任意數量的總 體系統、幾何學或空間的限制。所述基質可為三維基質，并且經過成型以符合層狀結構的腔 體器官或組織結構的尺寸和形狀.例如，當使用聚合物基質進行膀胱重建時，可以使用經 過成型而符合整個膀胱或其一部分的三維基質。天然地，所述聚合物基質可成型為不同的 大小和形狀，以符合不同體型的患者的膀胱。任選地，所述聚合物基質在成型后應使得在其 生物降解后，所得的重建的膀胱在排空時能夠像天然的膀胱一樣地可收縮。所述聚合物基 質也可成型為其他形式，以適應患者的特殊需要。例如，先前具有損傷或功能障礙的患者可 能具有改變的腹腔，因此可能需要特殊的膀胱替換支架、膀胱擴張支架、膀胱管道支架和逼 尿肌肌肉等效物支架來配合。
[0275] 在一個方面，本發明考慮了適于與本文所述的平滑肌細胞群一起使用的其他支 架。例如，可以提供適于植入至肺部的支架。
[0276] A.擴張或替換令·架
[0277] 在另一方面，所述聚合物基質或支架的形狀符合膀胱的一部分。在一個實施方 案中，所述成型的基質為適于替換所述受體已有膀胱的至少約50%、至少約60%、至少約 70 %、至少約80 %、至少約90 %或至少約95 %。在另一方面，所述成型的聚合物基質或支架 與膀胱的100%或全部膀胱相符合。
[0278] 在一個實施方案中，所述聚合物基質包括一個第一可植入的、生物相容性的、合成 的或天然的、具有兩個分離表面的聚合物基質或支架；和一個第二可植入的、生物相容性 的、合成的或天然的、具有兩個分離表面的聚合物基質或支架，它們適合于彼此接合，并且 其在接合時的形狀符合需要治療的腔體器官或組織結構至少一部分。所述第一和第二聚合 物基質可由一個整體單元形成并被分為兩個或多個不同部分，或者由兩個或多個不同部分 形成并適于接合。在一些實施方案中，所述第一和第二聚合物基質在接合后可用于腔體器 官或組織結構的重建、修復、擴張或替換。
[0279] 在一些實施方案中，所述第一和第二聚合物基質是對稱的，而在其他實施方案中， 所述第一和第二聚合物基質是不對稱的。在一個實施方案中，所述第一聚合物基質或支架 具有半球形或準半球形的形狀，有一個封閉的圓頂末端和一個開放的赤道狀邊緣；所述第 二聚合物基質或支架具有適于與所述第一聚合物基質的赤道狀邊緣結合的卡圈。在另一個 實施方案中，所述第一和第二聚合物基質均為半球或準半球狀，有一個封閉的圓頂末端和 一個開放的赤道狀邊緣。在又另一個實施方案中，所述第一和第二聚合物基質各具有一個 圓形或半圓形的底座和至少2個從所述底座呈放射狀延伸的花瓣形部分。在這一實施方案 中，所述第一和所述第二聚合物基質的底座和花瓣形部分彼此接合產生一個空心球狀或準 球狀的基質或支架，從而使得在所述接合的聚合物基質的一側形成一個縱向凸出的橢圓形 開口，而在所述縱向開口的對側形成一個圓形開口。在另一個實施方案中，所述第一和第二 聚合物基質由三部分組成，包括適于接合的頂片、前片和側片。在這一實施方案中，所述三 個不同的部分通過至少三個、優選為四個垂直接縫而接合，從而形成冠狀的新的膀胱構建 體。優選地，冠狀構建體單獨用作用于腔體器官的重建、修復、擴張或替換的裝置。在一個 實施方案中，所述構建體為膀胱擴張支架。膀胱擴張支架的一個實例示于圖1。在另一個實 施方案中，所述構建體為膀胱替換支架。膀胱替換支架的一個實例示于圖2。
[0280] 此外，當所述構建體必須與天然脈管或管道相連接時，所述第一聚合物基質和/ 或所述第二聚合物基質可包括至少一個適于接受管狀脈管或插入物的容器或端口。所述脈 管或插入物本身為例如圓柱狀或管狀的成型聚合物基質，各自具有至少一個位于所述圓柱 狀聚合物的第一末端的凸緣。優選地，所述所述脈管或插入物由與上述第一或第二聚合物 基質相同的生物相容性材料構成。在一些實施方案中，所述脈管或插入物還包括適于包圍 所述圓柱狀或管狀脈管或插入物聚合物基質的墊片。例如，所述墊片為水凝膠。任選地，所 述所述圓柱狀或管狀脈管或插入物包括墊片。所述墊片可為水凝膠。此外，所述圓柱狀或 管狀插入物可為自我穩定的。
[0281] 在另一個實施方案中，當所述支架或基質（在用細胞接種后）必需與天然脈管或 管道相連接時，所述適于接受管狀脈管或插入物的容器或端口也應用于下文所述的其他基 質。
[0282] B.尿流改道
[0283] 本發明提供了可被細胞接種并用作在受試者的尿流改道的構建中替換胃腸道組 織的新的尿流改道或管道支架。例如，本文所述的新的尿流改道可用于接受了膀胱根除術 治療的患者，否則所述患者可能需要使用回腸回路改道。
[0284] 在一個方面，本發明考慮了適于用作有需要的受試者的尿流改道的管道支架或基 質，所述管道支架或基質由本文所述的方法形成。所述管道支架的一端可以與一條或多條 輸尿管相連接，另一端可以與受試者體外的尿液儲庫相連接。在一個實施方案中，所述管道 可以通過開孔而通向受試者的體外。在另一個實施方案中，所述聚合物基質包括一個以管 狀形式提供的第一可植入的、生物相容性的、合成聚合物基質或支架。在一些實施方案中， 所述管狀支架包括一個被設計為與受試者的輸尿管相連接的第一末端。在另一個實施方案 中，所述第一支架還包括一個被設計為在受試者體內形成開孔或括約肌的第二末端。在另 一個實施方案中，所述第一支架還包括至少一個被設計為與至少一條輸尿管相連接的側部 開孔。在一些實施方案中，所述第一支架包括被設計為與第一輸尿管相連接的第一側部開 孔和被設計為與第二輸尿管相連接的第二側部開孔。
[0285] 在另一個實施方案中，所述管狀結構包括一個具有平滑邊緣的第一末端和具有不 均一或不不平滑邊緣的第二末端。所述不均一邊緣可包括一個圓形的底座和從該底座呈放 射狀延伸的幾個花瓣形部分。所述花瓣形部分的數目可為1個、2個、3個、4個、5個或6個。 所述不平滑邊緣可包括例如圖3所示的一系列花瓣形部分。在一個實施方案中，所述管狀 結構具有適于用作有需要的患者的尿流改道系統或管道的形式。在另一個實施方案中，例 如在輸尿管切除術的情況下，所述系統使尿液從一條或多條輸尿管改道至腹腔壁區域。在 其他實施方案中，例如在膀胱切除術的情況下，所述系統使尿液從膀胱改道至腹腔壁區域。 在另一個實施方案中，所述系統使膀胱和尿道相連接。在又另一個實施方案中，可以用一個 第一系統使尿液從一條或多條輸尿管改道至腹腔壁區域，并使用一個第二系統使尿液從膀 胱改道至腹腔壁區域。在所有實施方案中，所述系統可使尿液從一條或多條輸尿管改道至 腹腔壁區域，例如形成開孔。
[0286] 在另一個實施方案中，所述管狀基質或支架為尿流改道或管道支架。
[0287] 在一個實施方案中，所述尿流改道系統的管狀結構的截面形狀為矩形、圓形或三 角形。圖3A顯示了本文所考慮的一些不同的截面形狀。
[0288] 在另一個實施方案中，管狀結構保留足夠的剛性，以在植入后保持暢通。在另一個 實施方案中，通過或不通過在上述管狀結構的腔中使用導管來保持其剛性。當使用導管時， 可將其置于所述管狀結構的腔空間內以提供額外的通透性。
[0289] 在另一個實施方案中，所述管道支架還可包括一個圓形或卵形的第二支架，其被 設計為將所述第一支架的第一末端與輸尿管相連接。在又另一個實施方案中，所述管道支 架還可包括一個墊圈形的第三支架，其被設計為開孔或括約肌的形式并與所述第一管狀支 架的第二末端一起形成受試者身體的開孔。圖3B顯示了尿流改道構建體的變化方案（A-開口呈卵形；B-開口呈卵形的容器；C-封閉的卵形容器和三個管）。
[0290] 在一些實施方案中，所述管狀結構可包括墊片結構，以用于連接至組織、器官或身 體部分，以實現吻合從而形成可控的開孔或括約肌。在另一個實施方案中，所提供的墊片的 厚度小于約lmm、小于約I. 5mm、小于約2mm、小于約2. 5mm、小于約3mm、小于約3. 5mm、小于 約4mm、小于約4. 5mm或小于約5mm。
[0291] 在一個實施方案中，所述尿流改道或管道支架被成型為圖3所示的構型。
[0292] 在另一個實施方案中，所述管狀結構包括一個具有平滑邊緣的第一末端和一個具 有不均一或不平滑邊緣的第二末端。所示不均一邊緣可包括一個或多個緊固件，被設計為 與受試者的外部區域相連接，例如以開孔至受試者體外的形式。在一個實施方案中，所述管 狀結構的第一和第二末端可為圖3所示的形式。所示緊固件的數量可為1個、2個、3個、4 個、5個或6個。
[0293] 在另一個實施方案中，所述管狀支架具有如圖27所示的形式。
[0294] 圖4A顯示了正常人類泌尿系統的一部分解剖結構。
[0295] 在一個實施方案中，所述管狀結構的形式適于用作有需要的患者體內的尿流改道 或管道。在另一個實施方案中，在另一個實施方案中，例如在輸尿管切除術的情況下，所述 管道使尿液從一條或多條輸尿管改道至腹腔壁區域（圖4D)。在其他實施方案中，例如在膀 胱切除術的情況下，所述管道使尿液從膀胱改道至腹腔壁區域（圖4B)。在另一個實施方案 中，所述管道使膀胱和尿道相連接（圖4D)。在又另一個實施方案中，可以用一個第一管道 使尿液從一條或多條輸尿管改道至腹腔壁區域，并使用一個第二管道使尿液從膀胱改道至 腹腔壁區域。在所有實施方案中，所述管道可使尿液從一條或多條輸尿管改道至腹腔壁區 域（圖4B)。在所有實施方案中，所述管道均可被設計為形成開孔。
[0296] 在一個實施方案中，所述尿流改道或管道支架的管狀結構的截面形狀為矩形、圓 形或三角形。在另一個實施方案中，所述管狀結構保留足夠的剛性，以在植入后保持暢通。 在另一個實施方案中，通過或不通過在上述管狀結構的腔中使用導管來保持其剛性。在一 些實施方案中，尿流改道支架還包括被設計為在植入后置于所述管狀結構的腔空間內的導 管。在一個實施方案中，所述導管為類似Foley氏管的球囊導管。當使用導管時，可將其置 于所述管狀結構的腔空間內以提供額外的通透性。本領域普通技術人員能夠知曉可適用于 本發明的本領域中已知的其他導管。
[0297] 在另一個實施方案中，所述支架的管狀壁厚度應為小于約2mm、小于約2. 5mm、小 于約3. 5mm、小于約4mm、小于約4. 5mm、小于約5mm、小于約5. 5mm或小于約6mm。
[0298] 在一些實施方案中，所述支架可具有可變的外徑和內徑。在一個實施方案中，所述 支架的末端可為喇叭口形、非喇叭口形、封口形或圓形。
[0299] 在其他實施方案中，所述支架可允許尿液透過。在一個實施方案中，所述支架的孔 徑大于約〇微米至約500微米。在另一個實施方案中，所述孔徑為約100微米至約200微 米。在另一個實施方案中，所述孔徑為約150微米至約200微米。在其他實施方案中，所述 孔徑為約100微米、約110微米、約120微米、約130微米、約140微米、約150微米、約160 微米、約170微米、約180微米、約190微米或約200微米。在一些實施方案中，所述孔徑為 約100微米、約200微米、約300微米、約400微米、約500微米或約600微米。在其他實施 方案中，所述支架的孔徑構型包括單孔徑分布、多孔徑分布或梯度孔徑分布。
[0300] 在另一個實施方案中，所述支架材料可縫合的，并且可以與組織形成不滲漏的連 接。
[0301] 在其他實施方案中，選擇所述管狀支架的材料，以保證在為在植入應用的過程中 保持通暢、支持細胞貼附和與宿主組織一起生長并保持柔性。在另一個實施方案中，所述材 料的爆裂強度應超過其在與體內的正常體液循環接觸時所承受的壓力。在其他實施方案 中，所述材料應具有與宿主組織生長相適應的降解時間。
[0302] C.肌肉等效物
[0303] 在一個方面，本發明的聚合物基質或支架為肌肉等效物支架。在一個實施方案中， 肌肉等效物支架為逼尿肌肌肉等效物支架。在另一個實施方案中，所述支架適用于通過腹 腔鏡手術植入。
[0304] 在一個方面，聚合物基質包括其形狀適合于至少一部分需要所述治療的器官或組 織結構和其大小是足夠通過腹腔鏡方法植入的聚合物基質或支架。在某些實施方案中，本 發明的聚合物基質或支架長度約為3至20cm之間。在一個實施方案中，聚合物基質或支架 的最大長度約20cm。在另一個實施方案中，聚合物基質或支架的最大長度約15cm。在另一 個實施方案中，聚合物基質或支架的最大長度約l〇cm。在另一個實施方案中，聚合物基質或 支架的最大長度約8cm。在另一個實施方案中，聚合物基質或支架的最大長度約4cm。在又 另一個實施方案中，聚合物基質或支架的最大長度約3cm。在某些實施方案中，本發明的聚 合物基質或支架的寬度約為1至8cm之間。在一些實施方案中，聚合物基質或支架的最大 寬度約4cm。在其他實施方案中，聚合物基質或支架的最大寬度約3cm。在另外的實施方式 中，聚合物基質或支架的最大寬度約5cm。
[0305] 在一個實施方案中，聚合物基質或支架具有三維（3-D)形狀。在另一個實施方案 中，聚合物基質或支架具有扁平形狀。在一個實施方案中，所述扁平形狀的聚合物基質或 支架包括預處理區域以允許更大的靈活性。在某些實施方案中，該預處理區域在將要褶皺 的區域中具有涂層。在一個實施方案中，聚合物基質或支架具有足夠的延展性以便進行卷 曲、折疊或成型以用于通過腹腔鏡管和/或端口進行植入。在這種實施方式中，聚合物基質 或支架具有足夠的延展性以便展開、鋪開或恢復到穿過腹腔鏡管和/或端口插入之后的形 狀。在一個實施方案中，聚合物基質或支架在通過腹腔鏡管和/或端口植入之前被切割成 2、3、4、5、6、7、8、9或10個條帶。在某些實施方案中，該2、3、4、5、6、7、8、9或10個條帶在通 過腹腔鏡管和/或端口植入之前彼此接合。該2、3、4、5、6、7、8、9或10個條帶可通過膠水、 訂書釘、縫線或本領域普通技術人員熟知的其他技術方式接合在一起。在這種實施方式中， 該2、3、4、5、6、7、8、9或10個條帶為折疊的和/或堆疊的以穿過腹腔鏡管和/或端口。在 這種實施方式中，該2、3、4、5、6、7、8、9或10個條帶在穿過腹腔鏡管和/或端口插入之后為 展開的和/或鋪開的。在一些實施方案中，在正確地穿過腹腔鏡管和/或端口插入之后，先 前放置的接合裝置被收緊。
[0306] 在一個實施方案中，聚合物基質包括一個第一可植入的、生物相容性、合成的或天 然的聚合物基質或支架，其具有補片或條帶樣式。在一個實施方案中，該補片具有適合于用 作患者所需的膀胱中逼尿肌肌肉等效物的樣式。在另一個實施方案中，該補片具有適合于 用作患者所需的增大已有膀胱容積的樣式。在某些實施方案中，該補片將膀胱的大小增大 了約50mL至約500mL。在一些實施方案中，該補片增大了膀胱大小50mL。在一些實施方案 中，該補片增大了膀胱大小約450mL。在一個實施方案中，表面面積增大了 30cm2使得200mL 的膀胱容積增大到250mL。在另一個實施方案中，表面面積增大了 25cm2使得350mL的膀胱 容積增大到400mL。在一個實施方案中，所述支架具有約30cm 2的二維表面積。在另一個實 施方案中，所述支架具有約25cm2的二維表面積。在一個實施方案中，所述補片為條帶、圓 盤、方形、橢圓或其他任意合適的樣式。在其他實施方案中，所述補片具有預折疊的樣式，例 如風琴狀。
[0307] 圖5A-B示出了肌肉等效物支架或聚合物基質的示例。在一個實施方案中，聚合物 基質或支架為雙楔形狀，例如圖5A所示的形狀。在另一個實施方案中，聚合物基質成型為 圖6-9所示出的其中一種結構。
[0308] 在所有實施方案中，聚合物基質或支架成型為以使得膀胱和基質或支架上的應變 最小化。
[0309] 在另一個實施方案中，聚合物基質包括一個第一可植入的、生物相容性、合成的或 天然的聚合物基質或支架，其具有補片或條帶樣式。在一個實施方案中，該補片具有適合于 用作患者所需的膀胱中逼尿肌肌肉等效物的樣式。在另一個實施方案中，該補片具有適合 于用作患者所需的增大已有膀胱容積的樣式。在一些實施方案中，該補片增大了膀胱大小 50mL。在一個實施方案中，所述補片為條帶、圓盤、方形、橢圓或其他任意合適的樣式。在其 他實施方案中，所述補片具有預折疊的樣式，例如風琴狀。
[0310] 在一個實施方案中，聚合物基質成型為圖1-9或27所示出的其中一種結構。
[0311] 在所有實施方案中，所述用于這些基質或支架生物相容性材料例如是可生物降解 的。在全部這些實施方案中，所述生物相容性材料可為聚乙醇酸。
[0312] 在所有實施方案中，聚合物基質或支架涂覆有生物相容性和可生物降解的形凝材 料。在一個實施方案中，所述形凝材料可以包括液化共聚物。在另一個實施方案中，所述液 化共聚物可以包括液化乳酸/乙醇酸共聚物。在一個實施方案中，所述液化共聚物可包括 聚-DL-丙交酯-共-乙交酯。
[0313] 5.構律體
[0314] 在一個方面，本發明提供一種或多種至少接種了一種細胞群的聚合物支架或基 質。這些支架已經接種了一種細胞群，在本文中可被稱為"構建體"。在一個實施方案中， 該細胞接種的聚合物基質或基質形成新的膀胱構建體，該新膀胱構建體選自膀胱替代構建 體、膀胱擴張構建體、膀胱管道構建體和逼尿肌肌肉等效物構建體。
[0315] 本領域技術人員能夠知曉本文描述的一種或多種細胞群的接種或沉積可以通過 現有技術中各種已知的方法來實現。例如，生物反應器孵化和培養（美國公布的Bertram 等人的專利申請20070276507 ;McAllister等人的美國專利7, 112, 218 ;Auger等人的 美國專利5, 618, 71 ;Niklason等人的美國專利6, 537, 567)、壓力引誘接種（Torigoe et al. (2007)Cell Transplant. , 16(7):729-39 ；ffang et al. (2006)Biomaterials. May ； 27(13) :2738-46)和靜電接種（Bowlin等人的美國專利5, 723, 324)可以使用。此外，最新的 同時在電紡纖維外上細胞氣溶膠衣的技術對接種或者沉積來說也可以是合適的（Stankus et al. (2007)Biomaterials, 28:2738-2746)〇
[0316] 在一個實施方案中，細胞的沉積包括將支架和增強細胞附著的蛋白質接觸的步 驟。在另一個實施方案中，該增強蛋白為纖維連接蛋白、膠原質和MATRIGEL?的一種或多 種。在另一個實施方案中，該支架不包含增強細胞附著的蛋白質。在另一個實施方案中，細 胞的沉積包括在將支架與細胞群接觸后的培養步驟。在又另一個實施方案中，該培養可能 包括一個生物反應器中脈動的和/或穩定的流動。
[0317] 從本文描述的脂肪或外周血分離的平滑肌細胞群可以在本文所述的支架上接種。
[0318] 以下為在支架上接種細胞的方法的代表性實例。脂肪的或外周血來源的平滑肌細 胞可以擴增最長達7周，以產生在支架上接種所需的細胞數量。適于在支架上接種的細胞 的密度如下所述。脂肪來源的平滑肌細胞可在細胞收獲前擴增2代，以在支架上接種產生 構建體。外周血來源的平滑肌細胞為在支架上接種的培養可在收獲之前擴增3-4代。為提 供細胞接種的支架，合適的材料（例如PGA毛氈）可以切成一定大小，縫合成合適的形狀， 并涂覆材料（例如PLGA)。該支架然后可以用合適的方法滅菌（例如環氧乙烷）。在細胞 接種的前一天，該滅菌的支架可以通過60 %乙醇/40 % D-PBS、100 % D-PBS、D-MEM/10 % FBS 或α -MEM/10% FBS預濕而飽和，接著室溫下在D-MEM/10% FBS或α -MEM/10% FBS里培養 過夜。支架可以接種脂肪來源的或外周血來源的平滑肌細胞，在濕潤的、37°C含5%的CO2 的培養器中使構建體成熟，直至植入受試者體內（例如7天）。本領域普通技術人員能夠知 曉為制備用于細胞接種的支架和在支架上接種細胞的其他方法。
[0319] 在一個方面，本發明提供了在減少的時間框架下制備構建體的方法，這對等待植 入構建體的所述受試者有益。據報道，來源于SVF的未分化的脂肪干細胞在分化成平滑肌 細胞之前必須在誘導培養基中培養6星期（Jack et al. 2009,見上文）。在一個實施方案 中，所述方法包括下述步驟：a)獲得人類脂肪組織樣本；b)從樣本中分離完全分化的平滑 肌細胞群；c)培養所述細胞群；和d)將所述細胞群與聚合物基質細胞構建體接觸，其中步 驟a)、b)、c)和d)需要實施約45天或少于45天的時間。在另一個實施方案中，該分離步 驟是在沒有細胞篩選的情況下實施的。在另一個實施方案中，該分離步驟b)是在完成步驟 a)后實施約72小時或少于72小時的時間。在又另一個實施方案中，所述培養步驟c)實施 約4周或少于4周的時間。在其他實施方案中，該接觸步驟d)實施約10天或少于10天的 時間。在另一個實施方案中，步驟a)、b)、c)和d)實施28天或少于28天的時間。在另一 個實施方案中，該分離步驟b)在完成a)步驟后實施約48小時或少于48小時的時間。在 一個實施方案中，所述培養步驟c)實施約2周或少于2周的時間。在另一個實施方案中， 該接觸步驟d)實施約5天或少于5天的時間。在所有實施方案中，該人類脂肪組織樣本均 從自體來源獲得。在另一個實施方案中，所述方法還包括檢測平滑肌細胞標記物的表達的 步驟。在另一個實施方案中，所述表達為mRNA表達。在另外一個實施方案中，所述表達為 多肽表達。在一個實施方案中，該多肽表達由細胞內免疫熒光檢測。
[0320] 在一個實施方案中，該支架包括本文所述的細胞群。在另一個實施方案中，該支架 基本上由本文所述的細胞群構成。在另一個實施方案中，該支架由本文所述的細胞群組成。
[0321] 所述第一聚合物基質或第二聚合物基質，如果有的話，或兩者都有，包含至少一種 細胞群，該細胞群沉積在所述第一聚合物基質的一個第一表面、所述第二聚合物基質的一 個第一表面的表面上或表面中，或兩者都有，以形成基質或支架加細胞的構建體，其中至少 一種細胞群基本上包括一個肌細胞群。該肌細胞群例如為平滑肌細胞群。在一個優選實施 方案中，所述第一表面和所述第二表面為所述第一和第二聚合物基質的每個外部表面。
[0322] 在另一個實施方案中，所述包含基質和細胞的構建體不含任何其他細胞群。在一 個優選實施方案中，所述構建體不含有尿道上皮細胞。
[0323] 這些構建體是用于向有需要的受試者提供腔體器官或組織結構，如泌尿生殖器器 官，包括例如膀胱、輸尿管和尿道。所述受試者可能需要重建、修復、擴張或替換這些器官或 組織。在一個實施方案中，該腔體器官或組織結構為膀胱或其部分，該聚合物基質或支架在 該基質表面沉積有平滑肌細胞。該構建體也可能用于提供尿流改道或管道、或逼尿肌肌肉 等效物。
[0324] 在一個方面，本發明提供尿流改道或管道支架或接種本文所述的細胞群的基質。 該支架已接種細胞群，在本文中可被稱為"構建體"。在一個實施方案中，該尿流改道或膀胱 管道構建體由本文所述的一種或多種支架和沉積于本文所述的一種或多種支架的一個或 多個表面上的細胞群組成。
[0325] 在一個方面，本發明提供了肌肉等效物構建體，其可用于為有需要的受試者增強 已有的腔體器官或組織結構如泌尿生殖器器官，包括例如膀胱。所述受試者可能會需要這 些器官或組織的擴張或治療。在一個實施方案中，該腔體器官或組織結構為膀胱或其部分， 該聚合物基質或支架在基質表面沉積有平滑肌細胞。在一個實施方案中，該構建體用于提 供逼尿肌肌肉等效物.。
[0326] 本領域普通技術人員能夠知曉在基質或支架上沉積細胞群有數種合適的方法。
[0327] 在一個方面，構建體適合于植入需要新器官或組織結構的受試者體內。在一個實 施方案中，所述構建體包括產生細胞因子MCP-I的細胞群。在另一個實施方案中，該MCP-I 引起受試者或受體的天然間充質干細胞向植入位置遷移。在一個實施方案中，所述受體的 遷移的天然間充質干細胞幫助新器官或組織結構的再生。
[0328] 在另一方面，本發明提供特定密度的細胞接種的支架。在一個實施方案中，一個 支架由細胞密度約20 X IO6至約30 X IO6個細胞的平滑肌細胞群接種。在另一個實施方案 中，該細胞密度為約IX IO6至約40 X 106、約IX IO6至約30 X 106、約IX IO6至約20 X 106、 約IX IO6至約IOX 106,或約IX IO6至約5X IO6個細胞。
[0329] 在另外一個實施方案中，該密度為約20X IO6至約98X IO6個細胞。在再另一個 實施方案中，該密度為約21 X IO6至約97X 106、約22X IO6至約95X 106、約23X IO6至約 93 X 106、約 24 X IO6 至約 91 X 106、約 25 X IO6 至約 89 X 106、約 26 X IO6 至約 87 X 106、約 28 X IO6 至約 85 X 106、約 29 X IO6 至約 83 X 106、約 30 X IO6 至約 80 X 106、約 35 X IO6 至約 75 X 106、約 40 X IO6 至約 70 X 106、約 45 X IO6 至約 65 X 106,或約 50 X IO6 至約 60 X IO6 個細 胞。在一個優選實施方案中，該密度為約24X IO6至約91 X IO6個細胞。
[0330] 在另一個實施方案中，該密度為約2. 5 X IO6至約40 X 106、約5 X IO6至約40 X 106、 約 7. 5 X IO6 至約 35 X 106、約 10 X IO6 至約 30 X 106、約 15 X IO6 至約 25 X IO6 和約 17. 5 X IO6 至約22. 5X IO6個細胞。在另一個實施方案中，該細胞密度為約IX 106、約2X106、約 3 X 106、約 4 X 106、約 5 X 106、約 6 X 106、約 7 X 106、約 8 X 106、約 9 X 106、約 10 X 106、約 11\106、約12\106、約13\10 6、約14\106、約15\106、約16\106、約17\10 6、約18父106、 約 19X106、約 20X 106、約 21X106、約 22X 106、約 23X 106、約 24X 106、約 25X 106、約 26X 106、約 27X 106、約 28X 106、約 29X 106、約 30X 106、約 31X 106、約 32X 106、約 33X 106、 約 34X 106、約 35X 106、約 36X 106、約 37X 106、約 38X 106、約 39X 106、約 40X 106、約 41X 106、約 42X 106、約 43X 106、約 44X 106、約 45X 106、約 46X 106、約 47X 106、約 48X 106、 約 49X 106、約 50X 106、約 51X106、約 52X 106、約 53X 106、約 54X 106、約 55X 106、約 56X 106、約 57X 106、約 58X 106、約 59X 106、約 60X 106、約 61X 106、約 62X 106、約 63X 106、 約 64X 106、約 65X 106、約 66X 106、約 67X 106、約 68X 106、約 69X 106、約 70X 106、約 71X 106、約 72X 106、約 73X 106、約 74X 106、約 75X 106、約 76X 106、約 77X 106、約 78X 106、 約 79X 106、約 80X 106、約 81X106、約 82X 106、約 83X 106、約 84X 106、約 85X 106、約 86X 106、約 87X 106、約 88X 106、約 89X 106、約 90X 106、約 91X 106、約 92X 106,約 93X 106、 約 94X 106、約 95X 106、約 96X 106、約 97X 106、約 98X IO6 或約 99X IO6 個細胞。
[0331] 在又另一方面，本發明提供接種細胞的支架，該細胞在一支架的每cm2有特定的細 胞密度。在一個實施方案中，該密度為約3, 000細胞/cm2至約15, 000細胞/cm2、約3, 500 細胞/cm2至約14, 500細胞/cm2、約4, 000細胞/cm2至約14, 000細胞/cm2、約4, 500細胞 /cm2 至約 13, 500 細胞 /cm2、約 5, 000 細胞 /cm2 至約 13, 000 細胞 /cm2、約 4, 500 細胞 /cm2 至約13, 500細胞/cm2、約5, 000細胞/cm2至約13, 000細胞/cm2、約5, 500細胞/cm2至約 12, 500 細胞/cm2、約 6, 000 細胞/cm2 至約 12, 000 細胞/cm2、約 6, 500 細胞/cm2 至約 11，500 細胞/cm2、約7, 000細胞/cm2至約11，000細胞/cm2、約7, 500細胞/cm2至約10, 500細胞 /cm2、約 8, 000 細胞 /cm2 至約 10, 000 細胞 /cm2、約 7, 500 細胞 /cm2 至約 9, 500 細胞 /cm2， 或約8, 000細胞/cm2至約9, 000細胞/cm2。在一個優選實施方案中，該密度為約3, 000細 胞/cm2至約7, 000細胞/cm2,或約9, 000細胞/cm2至約15, 000細胞/cm2。
[0332] 在一個方面，本發明的構建體適于在植入后為所述受試者提供特定的特征。在一 個實施方案中，該構建體適于在植入后為所述受試者提供再生。在另一個實施方案中，該構 建體適于促進受試者在植入位置的再生。例如，在植入之后，再生的組織可以在植入位置從 所述構建體自身中形成。在另一個實施方案中，所述構建體可以在植入之后賦予所述受試 者功能性的特征。例如，尿流改道構建體可適于賦予受試者的尿液從一個第一輸尿管（例 如第一側部開孔）到管狀支架的內部的通路，和/或適于在受試者外部提供臨時性尿液儲 存和通路（例如管狀支架）。在一個實施方案中，尿流改道構建體可適于在植入后提供上皮 化的粘膜。在另一個實施方案中，構建體可適于提供受試者體內的新器官或組織結構的穩 態調節的發育。
[0333] 6.俥用方法
[0334] 在一個方面，本發明考慮了為需要這類治療的受試者提供層狀結構的腔體器官或 組織結構的方法。在一個實施方案中，該受試者可能需要重建、修復、擴張、或替換器官或組 織。在一個實施方案中，所述方法包括提供生物相容性的合成的或天然的聚合物基質的步 驟，這些基質成形，以根據器官或組織結構的需要符合至少器官或組織結構的部分。該提供 步驟之后，可以沉積本文所述的至少一種非來源于需重建、修復、擴張或替換的所述受試者 的該器官的組織結構的細胞群。該沉積步驟可以包括在聚合物基質上培養所述細胞群。在 基質上沉積所述細胞群以提供構建體之后，可以將其植入患者體內的治療位置以形成所需 的層狀結構的腔體器官或組織結構。在一個實施方案中，該層狀結構的腔體器官或組織結 構為膀胱或膀胱的一部分。
[0335] 在另一方面，本發明提供了為有需要的受試者提供層狀結構的腔體器官或組織結 構的方法。在一個實施方案中，所述方法包括下述步驟：a)提供生物相容性的合成的或天 然的聚合物基質，該基質的形狀符合需要所述治療的該器官或組織結構的至少一部分；b) 在聚合物基質的第一區域上或其中沉積并非來源于與新器官或組織結構相應的天然器官 或組織的自體細胞群；和c)將所述成型的聚合物基質細胞構建體植入所述受試者，以形成 層狀結構的腔體器官或組織結構。在另一方面，本發明提供了向有需要的受試者提供新的 膀胱或其部分的方法。在一個實施方案中，所述方法包括a)提供生物相容性的合成的或天 然的聚合物基質，該基質的形狀符合膀胱或其部分；b)在聚合物基質的第一區域上或其中 沉積并非來源于受試者膀胱的自體細胞群；和c)將所述成形的聚合物基質細胞構建體植 入所述受試者以形成新的膀胱或其部分。在另一個實施方案中，本文所述方法的所述步驟 b)的細胞群中包含一種或多種外周血來源的平滑肌細胞，它們對平滑肌細胞標記物呈陽性 并具有收縮功能，或步驟b)所述細胞群包含一種或多種脂肪組織來源的平滑肌細胞，它們 對平滑肌細胞標記物呈陽性并具有收縮功能。在另一個實施方案中，所述細胞群的收縮功 能是鈣依賴性的。
[0336] 在一個實施方案中，本發明的方法還包括用受試者的網膜、腸系膜、肌肉筋膜、和/ 或腹膜包裹管道構建體以使其血管化的步驟。
[0337] 在另一方面，本發明提供了為有需要的受試者的有缺陷的膀胱提供尿流改道或管 道的方法。在一個實施方案中，所述給有需要的受試者提供尿流改道的方法包括下述步驟： (a)提供生物相容性管道支架；(b)在所述支架的第一區域上或其中沉積第一細胞群，所述 第一細胞群實質上為肌肉細胞群；和（C)將步驟（b)的支架植入所述受試者以形成允許尿 液流出所述受試者體外的管道。在另一個實施方案中，該生物相容性材料為可生物降解的。 在其他實施方案中，該生物相容性材料為聚乙醇酸。在又另一個實施方案中，所述第一細胞 群實質上為平滑肌細胞群。
[0338] 在一個實施方案中，所述方法包括提供本文所述的尿流改道或管道支架的方法。 在其它另一個實施方案中，該尿流改道或管道支架以多部分的形式提供，如第一個支架、第 二個支架和第三個本文所述的支架。在另一個實施方案中，所述方法還包括沉積并非來源 于該有缺陷的膀胱的細胞群以形成尿流改道或管道構建體的步驟。在另一個實施方案中， 該沉積步驟可以包括在所述支架上培養所述細胞群。在一些實施方案中，所述方法還包括 將尿流改道構建體植入有需要的患者的步驟。在另一個實施方案中，該植入是在有缺陷的 膀胱的位置。
[0339] 在一個實施方案中，所述構建體的開口末端（例如，一個被設計為與腹腔壁相連 接的第一末端）匯聚于貫穿腹部或恥骨弓壁的皮膚（造瘺術），以形成開孔或括約肌。在另 一個實施方案中，將導管穿過開放的開孔插入所述構建體的空腔，以提供尿液外流。
[0340] 圖10顯示了植入管道構建體的結構。
[0341] 在另一個實施方案中，本發明的方法還包括監測在尿流改道構建體植入后的堵塞 的步驟。所述堵塞可以是碎屑堆積引起的。如果檢測到堵塞，所述方法還可以包括從管道 腔內清除碎屑的步驟。
[0342] 在一個方面，本發明臨時性地為有需要的受試者提供尿流改道。在一個實施方案 中，臨時性尿流改道或管道構建體被植入受試者以形成一個開放的開孔，導管或其它設備 被臨時性地穿過開孔插入至管道構建體內的內腔。在想要尋求有缺陷的膀胱的永久性解決 方案時，臨時性管道提供了允許尿液從所述受試者排出的優勢。例如，所述管道構建體的植 入可以在接種細胞群的新膀胱植入之前、之后或同時實施（參見例如Bertram et al，見上 文）。圖11顯示了一個臨時性尿流改道構建體的植入組件的實例。
[0343] 在一個實施方案中，本發明的方法還包括用受試者的網膜、腸系膜、肌肉筋膜和/ 或腹膜包裹尿流改道或管道構建體以使其血管化的步驟。
[0344] 在一個方面，本發明永久性地為有需要的受試者提供尿流改道。圖12顯示了永久 性尿流改道構建體的植入組件的實例。
[0345] 在一個實施方案中，本文所述的構建體可以用于前列腺尿道替換和尿流改道。這 些步驟對于需要前列腺根除術來切除前列腺尿道的受試者來說是必須的。其他實施方案 中，該構建體可以用于經皮膚的改道管道，以形成帶有類閥門扭結的可控管道。在另一個實 施方案中，該構建體可用作膀胱頸手術中的膀胱頸吊索和包覆材料以及帶有可控通道的尿 液排出口或可導尿開口。這些實施方案的實例如圖13所示。
[0346] 在一個方面，本發明的尿流改道構建體提供上皮化的粘膜。在一個實施方案中，所 述構建體適于在植入上形成上皮化粘膜。在一個實施方案中，上皮化粘膜包括前庭部分和 粘膜皮膚部分。在另一個實施方案中，前庭部分鄰近于粘膜皮膚部分。在另一個實施方案 中，粘膜皮膚部分位于所述連接到受試者的腹腔壁和皮膚的構建體的開孔末端。通常，天然 存在的粘膜皮膚部分以存在粘膜和皮膚外皮為特征，并且典型地存在于鄰近于身體的外部 皮膚末端和覆蓋身體內部的粘膜開始的開口。所述由本發明的方法和構建體提供的上皮化 粘膜在植入受試者體內后在該尿流改道構建體的所述第一末端發育。在另外一個實施方案 中，所述上皮化粘膜的特征是存在上皮細胞，其首先出現在前庭部分并逐漸擴張或從粘膜 皮膚部分向所述構建體的開口部繁殖。在另一個實施方案中，上皮細胞的特征為上皮細胞 標記物的表達。在另外一個實施方案中，上皮細胞標記物為細胞角蛋白。所述細胞角蛋白 可以是現有技術已知的角蛋白的一種或多種，包括但不限于細胞角蛋白1至19。在另一個 實施方案中，該角蛋白可以用AE-1/AE3抗體檢測出。
[0347] 向待被擴張的器官或組織中植入支架可以根據實施例中所描述的方法或根據現 有技術已知的方法來實施。通過把植入材料縫合于目標器官，可以將該基質或支架植入到 所述受試者的器官或組織。
[0348] 所述技術可以用于在需要此類治療的患者體內，以使已有的層狀結構的腔體器官 或組織結構擴張。例如，已有的層狀結構的腔體器官或組織結構可以通過下述步驟被擴張： 提供聚合物基質或支架，該基質或支架的形狀符合需要所述治療的器官或組織的至少一部 分，并且其大小足以通過腹腔鏡方法被植入；在所述聚合物基質的一個第一區域上或其中 沉積非來源于該器官或組織結構的自體細胞群；以及，通過腹腔鏡方法將所述成形的聚合 物基質構建體植入所述患者體內的所述治療位置，從而使得已有的層狀結構的腔體器官或 組織結構被擴張。
[0349] 圖7e顯示了用于植入本文所述的肌肉等效物支架的可能的手術方法。圖7f顯示 了在空的和充盈的膀胱上的植入位置。圖7g顯示了帶有手術切口的膀胱模型，顯示了在表 面切片上產生的橢圓體。塑料管可用作有限可用空間的模型，以穿過本發明折疊的或卷曲 的聚合物基質或支架。
[0350] 所述技術也可以用于增加需要該治療的患者的膀胱容積。例如，膀胱容積可以通 過下述步驟而得到增加：提供生物相容性的合成的或天然的聚合物基質，該基質或支架的 形狀符合需要所述治療的器官或組織的至少一部分，并且其大小足以通過腹腔鏡方法被植 入；在所述聚合物基質的一個第一區域上或其中沉積非來源于該器官或組織結構的自體細 胞群；以及，通過腹腔鏡方法將所述成形的聚合物基質構建體植入所述患者體內的所述治 療位置，從而使得膀胱容積增加。在一個實施方案中，本發明的所述基質或支架適合于增 加膀胱容積約50mL。在其他實施方案中，本發明的所述基質或支架適合于增加膀胱容積約 100mL。在其他實施方案中，本發明的基質或支架適合于增加膀胱容積約60、約70、約80或 約 9OmL。
[0351] 所述技術可以更進一步用于擴張需要該治療的患者的膀胱切口位置。例如，膀胱 切口位置可以通過下述步驟而被擴張：提供生物相容性的合成的或天然的聚合物基質，該 基質或支架的形狀符合需要所述治療的器官或組織的至少一部分，并且其大小足以通過腹 腔鏡方法被植入；在所述聚合物基質的一個第一區域上或其中沉積非來源于該器官或組織 結構的自體細胞群；以及，通過腹腔鏡方法將所述成形的聚合物基質構建體植入所述患者 體內的所述治療位置，從而使得膀胱切口位置被擴張。
[0352] 本發明的另一個非限制性應用包括對相應治療有需求的患者的尿失禁的治療方 法。例如，尿失禁可以通過下述步驟得到治療：提供生物相容性的合成的或天然的聚合物基 質，該基質或支架的形狀符合需要所述治療的器官或組織的至少一部分，并且其大小足以 通過腹腔鏡方法被植入；在所述聚合物基質的一個第一區域上或其中沉積非來源于該器官 或組織結構的自體細胞群；以及，通過腹腔鏡方法將所述成形的聚合物基質構建體植入所 述患者體內的所述治療位置，從而使得膀胱容積增加。
[0353] 在一個實施方案中，本文所述的支架、細胞群和方法還可被用于制備治療本文所 述的障礙的藥物。所述障礙包括需要再生、重建、修復、擴張或替換層狀結構的體腔器官或 組織結構的受試者的任何病癥。在另一個實施方案中，所述器官或組織結構為膀胱或膀胱 的部分。
[0354] 在另一個實施方案中，沉積在植入的構建體上的細胞產生MCP-I并在植入位置釋 放，它會刺激天然間充質干細胞（MSC)向植入位置遷移。在另一個實施方案中，所述天然 MSC促進和/或加強植入構建體在植入位置的再生。
[0355] 在一個實施方案中，如本文所述，沉積的細胞群來源于外周血或脂肪組織平滑肌 細胞（SMC)群。在另一個實施方案中，所述SMC細胞群包括至少一種有收縮功能并對平滑肌 細胞標記物呈陽性的細胞，所述平滑肌細胞標記物例如心肌蛋白、α -平滑肌肌動蛋白、鈣 結合蛋白、肌球蛋白重鏈、BAALC、結蛋白、成肌纖維細胞抗原、SM22,以及它們的任意組合。 在其他實施方案中，所述SMC細胞群包括至少一種表現心肌蛋白（MYO⑶）表達的細胞。該 MYO⑶表達可以為MYCOD多肽或編碼MYO⑶多肽的核酸的表達。在另一個實施方案中，所 述SMC的收縮功能是鈣依賴性的。在一個實施方案中，需要重建、修復、擴張或替換的受試 者所需的所述該層狀結構的腔體器官或組織結構是膀胱或膀胱的一部分。在另一個實施方 案中，所述聚合物基質不含有尿道上皮細胞。
[0356] 在所有實施方案中，本發明的方法利用植入一種支架，該支架以接種有本文所述 的細胞群的膀胱替換支架、膀胱擴張支架、膀胱管道支架或逼尿肌肌肉等效物支架為基礎。
[0357] 在另一個實施方案中，本文所述的層狀結構的體腔器官或組織結構的再生、重建、 修復、擴張或替換的方法包括以下步驟：a)提供生物相容性的合成的或天然的聚合物基 質，該基質的形狀符合需要所述治療的腔體器官或組織結構的至少一部分；b)在所述聚合 物基質的第一區域上或其中以本文所述的細胞密度沉積一個第一細胞群，所述細胞群實質 上為肌肉細胞群；和c)將所述成形的聚合物基質細胞構建體植入所述患者的所述治療位 置，以形成層狀結構的腔體器官或組織結構。在另一個實施方案中，在體內形成的所述層狀 結構的腔體器官或組織結構具有天然膀胱組織的順應性。
[0358] 在另一方面，本發明提供了在植入有此需要的受試者后、基于生物力學刺激或循 環而再生新的膀胱的方法。在一個方面，所述方法適用于促進已經為膀胱或其一部分的擴 張或替換而植入的新的膀胱構建體的再生。在一個實施方案中，所述新的膀胱構建體由接 種在新的膀胱基質或支架上的細胞形成。在另一個實施方案中，所述新的膀胱支架是膀胱 替換支架、膀胱擴張支架、膀胱管道支架或逼尿肌肌肉等效物支架。
[0359] 在一個方面，本發明的所述方法可用于由接種在新的膀胱支架上的至少一種細胞 群形成的植入的新的膀胱構建體。在一個實施方案中，所述細胞接種聚合物基質（或基質） 為膀胱替換支架、膀胱擴張支架、膀胱管道支架或逼尿肌肌肉等效物支架。在一個實施方案 中，所述至少一種細胞群實質上包括肌肉細胞群。在另一個實施方案中，所述肌肉細胞群可 為平滑肌細胞群。如本文所述，可用使用不同的細胞接種密度。
[0360] 在一個方面，在新的膀胱植入后以不同的次數和不同的持續時間來實施本發明的 方法。在一個實施方案中，該循環在一段時間內以日為基準，在一段時間以周為基準或者每 隔一周實施。在另一個實施方案中，每日循環方案的持續時間為約2周、約3周、約4周、約 5周、約6周、約7周、約8周、約9周、約10周、約11周、約12周、約13周、約14周或多于 14周。
[0361] 在一個實施方案中，受試者的每日循環方法可以包括下述步驟：用約1小時填充 該新的膀胱，用約1小時將該充滿的新的膀胱排水，和通常允許新的膀胱自由排水過夜。該 方法可以在受試者的每日循環方案的第一天實施。這種每日循環的操作可用在第一天之后 連續實施幾天。在一個實施方案中，該循環方案可以在第一天之后的某天實施，在這段時間 內，該填充的步驟可以增加到約2小時、約3小時、約4小時或比4小時更多。在另一個實 施方案中，在允許新的膀胱自由排水之前，所述填充和排水的時間可以在一天之內重復多 于一次。
[0362] 在另一個實施方案中，所述受試者在植入后再植入導管，該循環時間由夾住或者 松開受試者的導管來進行控制。
[0363] 本領域普通技術人員能夠理解，本文也考慮了其他的循環方案。
[0364] 一個循環方案的實例如下所述。在如本文所述地將由接種在新的膀胱基質或支 架上的細胞而形成的新的膀胱構建體植入后，循環將會在每2周（14±2天的間隔）實施， 從植入后的1個月后開始持續到約第90日。循環將在某些類型的評估（例如植入的新膀 胱順應性測量）之后但是在其它類型評估（例如熒光成像）之前完成。在順應性測量完成 后，可通過用消毒鹽水以10_25mL/min的速率再充盈膀胱（通過保溫箱預熱）的方式實施 循環。該循環將至少重復5-10次。剛開始將會達到0-10毫米貢柱的壓力，并且從開始時 就進行記錄。針對每個循環在每個在導管周圍觀察到的時間逝去點（leakage)(又名逝去 點），或者在輸入的量與剛實施的順應性測量相等的時候（以兩者最先發生的時間為準）， 記錄時間、輸入的等滲溶液的體積和產生的壓力。
[0365] 在一個實施方案中，本發明提供了促進植入受試者體內的新的膀胱再生的方法， 所述方法包括下述步驟：(a)用液體填充植入的新的膀胱；(b)排空步驟（a)中填充的新的 膀胱。在另一個實施方案中，所述方法包括步驟（c)重復步驟（a)和（b)。在另一個實施方 案中，所述方法在植入后兩周內開始。在一個實施方案中，所述步驟（a)和（b)每天進行一 次、每周進行一次或每兩周進行一次。在其他一些實施方案中，所述填充步驟（a)進行約1 小時，所述排空步驟（b)進行約一小時。在又另一個實施方案中，步驟（a)和（b) -直持續 進行至植入后至少六周。在另一個實施方案中，步驟（a)和（b) -直持續進行至植入后不 超過十周。在另一個實施方案中，步驟（a)和（b) -直持續進行至植入后超過十周。在其 他實施方案中，所述填充步驟包括擴張所述新的膀胱。在另一個實施方案中，所述再生包括 使受試者體內的新的膀胱的容量相對于未經過循環的新的膀胱而言有所增加。在另一個實 施方案中，所述再生包括使受試者體內的新的膀胱的順應性相對于未經過循環的新的膀胱 而言有所增加。在其他實施方案中，所述再生包括使受試者體內的新的膀胱的細胞外基質 發育相對于未經過循環的新的膀胱而言有所增加。在一個實施方案中，細胞外基質發育的 增加包括彈性蛋白纖維的發育。
[0366] 在另一方面，本發明涉及為哺乳動物提供新的膀胱的穩態調節發育、從而使得植 入的新的膀胱能夠適應受體的需要的方法。在一個實施方案中，植入的新的膀胱生長至與 所述受體成比例的大小。在另一個實施方案中，所述為受試者提供新的膀胱的穩態調節發 育的方法包括下述步驟：(a)提供生物相容性聚合物支架；(b)在所述支架的一個第一區域 上或其中沉積一個第一細胞群，所述第一細胞群實質上為肌肉細胞群；和（c)將步驟（b)的 支架植入所述受試者體內，以建立穩態調節發育。在另一個實施方案中，所述穩態調節發育 包括器官大小和結構的重建。在另一個實施方案中，所述穩態調節發育包括與體重成比例 的新的膀胱容量。在一個實施方案中，在植入后約四個月獲得成比例的新的膀胱容量。在 另一個實施方案中，所述為受試者提供新的膀胱的穩態調節發育的方法包括監測穩態調節 發育的階段或植入的新的膀胱的進展。所述監測可包括膀胱造影過程以顯示植入的新的膀 胱的位置和形狀，和/或測量尿動力順應性和容量。
[0367] 在另一方面，本發明提供了在患者體內植入新的器官或組織結構后對患者的預后 進行評估的方法。在一個實施方案中，所述方法包括下述步驟：檢測獲自所述受試者的測試 樣本中的MCP-I表達水平；(b)確定測試樣本中的MCP-I表達水平相對于對照樣本（或對 照參照值）的水平；和（c)基于MCP-I表達水平的測定來預測所述患者的再生性預后，其中 如果測試樣本中的MCP-I表達水平高于對照樣本（或對照參照值）即為對所述受試者再生 的預后。
[0368] 在另一方面，本發明提供了在患者體內植入新的器官或組織結構后對患者的預后 進行評估的方法，所述方法包括：(a)獲得患者的生物學樣本；和（b)監測所述生物學樣本 中的MCP-I表達，其中MCP-I的表達即為對患者的再生預后。在一些實施方案中，患者生物 學樣中的MCP-I表達比對照樣本（或對照參照值）高即為受試者的再生預后。在一些實施 方案中，患者生物學樣中的MCP-I表達比對照樣本（或對照參照值）低即為受試者的未再 生預后。所述患者樣本可為測試樣本，包括體液例如血液或尿液。
[0369] 在一些實施方案中，所述測定步驟包括使用有合適的處理器執行的軟件程序，并 實現下述目的（i)測量測試樣本和對照樣本中的差異的MCP-I表達水平；和/或（ii)對測 量測試樣本和對照樣本中的差異的MCP-I表達水平所得的數據進行分析。合適的軟件和處 理器都是本領域公知的，并且可以商購獲得。所述程序可被固化在軟件中并存儲與可讀介 質上，所述介質例如CD-ROM、軟盤、硬盤、DVD或與處理器相關的內存，但是本領域技術人員 容易理解的是，整個程序或其部分都可以以公知的方式在處理器以外的裝置中運行和/或 固化在固件中和/或專用硬件模塊中。
[0370] 例如，在測定步驟之后，測量結果、發現、診斷、預測和/或治療建議通常被記錄并 傳送至技術員、醫生和/或患者。在某些實施方案中，將使用計算機來將這類信息傳送給相 關人員，例如患者和/或主治醫生。在一些實施方案中，可以進行測定或將所述結果或診斷 傳送至另一個國家或地區來進行分析。
[0371] 在一個優選實施方案中，以對具有差異水平的MCP-I表達的受試者測得的MCP-I 表達水平為基礎，在測定完成和預后/預測產生以后將得到的預后、預測和/或治療建議盡 快與受試者溝通。可以通過受試者的主治醫生與所述受試者進行所述結果和/或相關信息 的溝通。或者，可以通過任何溝通手段直接與測試受試者進行結果的溝通，所述手段包括書 寫和電子溝通形式，例如電話或電子郵件的溝通。在使用電子郵件溝通的情況下，使用計算 機可以促進溝通。在某些實施方案中，可以使用本領域技術人員熟知的計算機硬件和軟件 的組合，自動地產生和傳送基于測試的含有預后測試結果和/或所得結論和/或治療建議 的溝通信息。美國專利No. 6, 283, 761記載了健康護理定位溝通系統的一個實例；但是本發 明并不限于使用這種特定溝通系統的方法。在本發明方法的某些實施方案中，所述方法的 全部或部分步驟，包括樣本的測定、預后和/或再生的預測、以及測定結果或預后的溝通， 都可以在另外的環境（例如外部環境）中進行。
[0372] 在另一方面，本文所述的預后方法為評估植入的成功程度以及再生的康復/治療 方法提供了有用的信息。在一個實施方案中，所述方法包括下述步驟：檢測獲自所述受試者 的測試樣本中的MCP-I表達水平；(b)確定測試樣本中的MCP-I表達水平相對于對照樣本 (或對照參照值）的水平；和（c)基于MCP-I表達水平的測定來預測所述患者的再生性預 后，其中如果測試樣本中的MCP-I表達水平高于對照樣本（或對照參照值）則表明新的器 官或組織結構出于再生階段。
[0373] 總體而言，本文所使用的術語"再生預后"包括對下述任意一種或多種情況的預報 和預測：通過植入本文所述的構建體進行膀胱替換或擴張后功能性膀胱的發展和改善；在 植入本文所述的構建體后功能性尿流改道的發展；在植入本文所述的構建體后膀胱容量的 發展或改進的膀胱容量；或者在植入本文所述的構建體后膀胱順應性的發展或改進的膀胱 順應性。
[0374] 在所有實施方案中，為需要本文所述的治療的患者提供層狀結構的腔體器官或組 織結構的方法可包括在植入后如本文所述地評估再生的步驟。
[0375] 在所有實施方案中，本發明涉及為有需要的受試者提供新的器官或組織結構的方 法，所述方法包括某些植入后的監測步驟。在一個實施方案中，監測植入的構建體的效果和 表現，例如在植入后的不同時間點通過超聲成像、腎盂造影照片以及尿液和血液分析進行。 這些監測步驟在實施例3-6中有更詳細的描述。
[0376] 7.試劑盒
[0377] 本發明還包括試劑盒，所述試劑盒含有本發明的聚合物基質和支架以及相關材料 和/或細胞培養基和使用說明書。使用說明書可包括例如培養細胞或給予所述細胞和/或 細胞產物的說明。所述使用說明書還可包括為了通過腹腔鏡植入而對本發明的聚合物基質 和支架進行預處理、折疊或制備的說明。
[0378] 在一個實施方案中，本發明提供了含有本文所述的支架和使用說明書的試劑盒。 在另一個實施方案中，所述試劑盒中的支架為下述一種或多種支架：膀胱擴張支架、膀胱替 換支架、尿路管道支架或肌肉等效物支架。
[0379] 8.報告
[0380] 當為了商業目的實施本發明的方法時，通常會產生報告或再生性預后的總結。本 發明的方法所產生的報告應包括在提供本文所述構建體的手術之前和之后對再生的可能 過程和結果的預測。所述報告可包括對于預后任何指征的信息。本發明的方法和報告還可 包括在數據庫中存儲所述報告。或者，所述方法還可針對受試者從數據庫中產生報告并在 報告中記載數據。在一個實施方案中，所述報告為紙質報告，在另一個實施方案中，所述報 告為聲音報告，在另一個實施方案中，所述報告為電子報告。已經考慮了將所述報告提供給 醫生和/或患者。所述報告的接收還可包括與含有數據和報告的服務器計算機建立網絡連 接，并從所述服務器計算機請求數據和報告。本發明提供的方法的全部或部分都可以自動 進行。
[0381] 提供下述實施例僅是出于說明的目的，并不意欲以任何方式限制本發明的范圍。
[0382] 本申請中引用的所有專利、專利申請和參考文獻的全部內容均通過援引的方式納 入本文。 實施例
[0383] 實施例1作為SMCs源的外周血和脂肪組織
[0384] 血液源細胞
[0385] 成功分離犬，豬，和人類外周血平滑肌細胞。概括地說，制備50毫升含有1:1外 周血與磷酸鹽緩沖液的稀釋液且在中性粒細胞分離液中、一種密度梯度材料上分層，并且 在室溫下在1，354xg離心20分鐘。離心作用后，密度梯度（從上到下）清楚地顯示為4層： 血清，血沉棕黃層，中性粒細胞分離液，紅細胞。單核細胞位于血沉棕黃層，其以乳白/灰色 的帶形式存在。血沉棕黃層被收回并且轉移進一根單獨的50ml圓錐試管。用PBS稀釋到 50ml。將樣品在室溫下711xg離心10分鐘至球團細胞。混懸球團且培養細胞。通過細胞 傳代、當達到適當的細胞數量時，部分被固定進行終點分析，包括免疫檢測平滑肌細胞蛋白 質表達，平滑肌細胞mRNA轉錄物的核酸檢測，細胞收縮，細胞因子和酶合成。
[0386] 結果
[0387] 培養基選擇。單獨的40_40ml單核部分犬外周血樣混懸在6種不同介質配方內， 接種于6孔Primaria細胞培養板或膠原層板中。
[0388] 如圖14A-E中所示，在一周的培養后，在全部條件下觀察到小的粘性的菌落和小 細胞團塊（DMEM介質離析沒被顯示）但是細胞的種類難以識別。在α-ΜΕΜ+10% FBS中生 長時，在Primaria培養皿上觀察到小串葡萄狀和細胞團塊，EGM-2培養基和伴隨添加物，和 EGM-2培養基和伴隨添加物（減去VEGF和FGF2) (A，C，Ε)和膠原蛋白I型，在組織培養上 涂上在相同的介質（B，D，F)里生長的塑料板。看到與生長在DMEM配方中（數據未顯示） 外周血培養相似的結果。
[0389] 如圖15中所示，在兩周的培養后，在Primaria(左平板）和膠原層板（中間平板） 上、a-MEM中觀察到生長暈菌落和小單層。形態學上，這些菌落似乎是平滑肌（圖15,頂 板）或者內皮（圖15,中間平板）。平滑肌（圖15,頂板）或者內皮（圖15,中間平板）形 態的生長暈菌落也在其他介質/底材狀態（合適的平板）下形成。一些巨噬細胞最初被保 存在a -MEM中（圖15,底部左和中間平板），但是沒帶進隨后的傳代。隔離在10% FBS的 a MEM中的Primaria盤上的細胞具有平滑肌（左上平板）或者巨噬細胞（底部左平板）形 態。沒有內皮細胞在這些條件（中間左平板）下被隔離。隔離在10% FBS的a -MEM中、膠 原層板上的細胞具有平滑肌（最高的中間平板），內皮（中間中間平板）和巨噬細胞（底 部中間平板）形態。其他介質/基質配方例如EGM-2 (最高位置平板）和20% FBS的DMEM 補充劑（中間正確平板）也允許間充質和類內皮細胞的生長。
[0390] 12種培養基/底材狀態，α -ΜΕΜ/10% FBS的Primaria中包含大部分沒有內皮細 胞的均勻隔離的平滑肌細胞（圖15,左上平板）菌落。細胞在Primaria板上隔離，平鋪在 Nunclon表面（在α -ΜΕΜ/10% FBS中）顯示典型的"峰谷"形態的是平滑肌細胞（SMC)， 與在其他研究中的描述一致（Kassis et al. (2006) ;Koerner et al. (2006) ;Simper et al. (2002)，上文）。
[0391] 如圖16中所示，這些細胞經過數次傳代后仍然保持其形態（圖16A-G)。豬頸動脈 SMC(圖16H)和狗膀胱SMC(圖161)的圖像比較顯示。在更晚傳代（圖16F，G)的平滑肌 細胞變得更大，更多展開。早期的傳代（A-E)像平滑肌細胞（SMC)隔離自豬頸動脈（H)和 狗膀胱（I)。過后平滑肌細胞（F，G)的傳代更大，更多展開，產生一個平滑肌表現型。
[0392] 脂肪衍生細胞
[0393] 平滑肌細胞與豬脂肪組織隔離依照下列程序。全部程序在生物安全罩里進行。
[0394] 獲取脂肪樣品。在用于生物安全容器之前，在室溫或者4°C下儲存不超過24小時。
[0395] 每IOOmlPBS中加入1克BSA和0. 1到0. 3克的膠原酶制備膠原酶溶液。通過 0. 2μπι過濾裝置過濾溶液。加熱至37°C。
[0396] 每脂肪體積加入等效體積的膠原酶溶液到每個離心瓶。需要組織體積的膠原酶溶 液（例如，每IOml脂肪組織膠原酶溶液IOml)。
[0397] 用消毒劑擦拭，蓋上蓋子，用石蠟膜包裹，并且放在37°C培養箱里振蕩60分鐘。或 者，試試管放在37°C水浴器中，以每20分鐘手動振蕩一次。
[0398] 室溫下300xg離心5分鐘。
[0399] 從離心機中取出試管，積極地振動10秒，使細胞完全混合。這是完成基質細胞與 主要脂肪細胞的分離。
[0400] 300xg離心5分鐘。小心吸出頂層的油，主要脂肪細胞（黃的層浮動的細胞），以 及膠原酶溶液。在球團上留下大約IOml的棕色的膠原酶溶液，以便基質血試管的餾分（在 底部的深色的紅細胞）不被擾亂。
[0401] 混懸細胞團塊于1% BSA的PBS中，用Steri-Flip過濾。
[0402] 300xg離心細胞5分鐘、吸出剩余的膠原酶溶液。吸出時，吸管的端從頂那里吸出， 以便油被盡可能完全清除。細胞團應該密封在底部。
[0403] 每個離管中加入組織培養液10ml，混懸細胞。把細胞集合到一根離心管中，離心。
[0404] 吸出上清液。用10毫升培養基懸浮細胞。
[0405] 平分細胞至對等數目的燒瓶的中。平板接種24-72個小時后，從燒瓶吸出培養基。 以PBS洗滌并且吸出。
[0406] 每瓶加原始體積的新鮮培養基。
[0407] 細胞長到80-90%合流，然后傳代或者保存。
[0408] 通過細胞傳代、當達到適當的細胞數量時，部分被固定進行免疫檢測平滑肌細胞 蛋白質表達。
[0409] 圖17是關于培養的形態學評價。在培養3到5天后，評價形態學。從人和豬細胞 脂肪組織分離得到的細胞顯示平滑肌細胞形態特征（圖17)。那些細胞呈現峰-谷形態，并 且顯示另外特性例如細長形，在傳代上變平和成纖維細胞樣，拉長并且在平行排列，和一個 "旋渦"形狀，所有這些均是培養的平滑肌細胞的特點。
[0410] 平滑肌標志。增加收縮基因的表達（以及他們編碼的蛋白質） 與 SMC 成熟一致（Jeon et al. J Cell Scill9, 4994-5005 (2006) ;Ross et al.J Clin Inves. 116,3139-3149 (2006) ；Sinha et al.Am J Physiol Cell Physiol287, 1560-1568(2004))。心肌是對平滑肌收縮蛋白進行編碼的基因轉錄調節器，其 中包括SM22, α平滑肌肌動蛋白，平滑肌肌漿球蛋白重鏈和鈣調理蛋白（Qiu et al. (2005) Circ Res983-991 ；ffang et al. (2003)Proc Natl Acad Scil00:7129-7134；Yoshida et al. (2003)Circ Res92:856-864)。心肌是平滑肌分化所必需的，并且足以驅動某些細胞平 滑肌基因表達（Milyavsky et al. (2007)Cancer Cellll:133_146;van Tuyn et al. (2005) 上文；Wang et al. (2003)，上文；Yoshida et al. (2003)，上文）。我們確定是否從血或者 脂肪組織中隔離的平滑肌細胞通過隔離總RNA并且進行半定量的RT-PCR表達平滑肌細胞 標記心肌，平滑肌α肌動蛋白，SM22,肌漿球蛋白重鏈，和鈣調理蛋白。
[0411] 如圖18中所示，結果表明，在基因水平這些細胞表達所有這些平滑肌細胞標記， 和在膀胱平滑肌細胞里發現的平滑肌細胞標記一致。這些數據支持外周血或者脂肪組織隔 離的這些平滑肌細胞具有平滑肌細胞性質的觀點。
[0412] 表型特征。我們已經表明這些外周血隔離平滑肌細胞與平滑肌收縮蛋白（圖18) 一樣表達為平滑肌基因表達的轉錄調節器。圖18顯示SMC標志心肌，平滑肌α肌動蛋白， SM22,平滑肌肌漿球蛋白重鏈和鈣調理蛋白的RT-PCR分析。樣品來自于豬脂肪，外周血和 膀胱（傳代4)隔離的平滑肌細胞。從脂肪組織隔離的SMCs可以在每次傳代之間培養3-5 天，從血隔離的SMCs可以頭次傳代之前培養14天，3-5天后進行再次傳代培養。β肌動蛋 白的基因表達當作凝膠用于內部的加載控制。從動物脂肪和外周血細胞隔離的細胞表達型 與膀胱SMC的相符合。
[0413] 圖19顯示免疫熒光法染色，將多種抗體直接用于平滑肌細胞表達蛋白染色。標記 α肌動蛋白，SM22,鈣調理蛋白和平滑肌肌漿球蛋白重鏈在從豬脂肪，外周血和膀胱隔離的 平滑肌細胞里檢測。這些蛋白質全部涉及平滑肌細胞的收縮的功能。平滑肌α肌動蛋白， SM22,鈣調理蛋白和平滑肌肌漿球蛋白重鏈在多次傳代的平滑肌細胞中染色。這些蛋白質 的亞細胞定位與膀胱SMC相比在平滑肌細胞里實際上相同。在細胞的應力纖維里的這些蛋 白質的詳細的染色被注意到。這是期望的典型的平滑肌細胞染色模型。
[0414] 圖20顯示的是從人外周血（傳代5)隔離的平滑肌細胞的免疫染色。使用平滑肌 α肌動蛋白，SM22,鈣調理蛋白的探針。同種細胞中兩種蛋白質平滑肌的α肌動蛋白和鈣 調理蛋白（右平板頂部）雙重染色法共同顯示。在單個細胞中不止1個的平滑肌細胞標記 同時表達更進一步支持這些是平滑肌細胞的觀點。
[0415] 收縮性。由于外周血得到平滑肌細胞表達平滑肌收縮蛋白，我們進行一次三維的 凝膠收縮測定評價他們的收縮性能。當被嵌入在三維的凝膠（Travis et al. (2001)Circ Res88:77-83)內時，SMC已經顯示自發引起膠原基質的收縮。脂肪組織得到的平滑肌細胞 也被進行收縮性測試。
[0416] 圖21顯示與膀胱平滑肌細胞（C)的相比較豬血得到的（A)細胞和豬脂肪組織得 到的（B)細胞收縮性更強。把EDTA加到混合物中抑制收縮，支持了收縮是依賴鈣的想法， 也是平滑肌細胞的另一種特性。數據表明直徑較小依賴細胞的收縮，并且是在細胞容量內 的功能。細胞種子為500, 000細胞/毫升，通過在兩天后減少膠原質凝膠直徑證明其能進 行收縮。豬膀胱平滑肌細胞作為陽性對照。證明收縮的鈣依賴性，鈣螯合劑EDTA加入到分 開的樣品中抑制收縮。結果確認細胞的收縮能力以鈣依賴的的方式類似于膀胱得到的平滑 肌細胞。
[0417] 發展動力學。為了在細胞治療應用里利用平滑肌細胞，確定是否在一個可接受的 時間段內達到需要的細胞量是重要的。結果從對犬和豬研究表明，平滑肌菌落（從40ml外 周血樣品中）被觀察到在早于7天后接種，并且能在不到14天（圖14和15)內通過。在 研究中，在培養（傳代2的端）的18天后獲得120萬細胞，在它們冷凍保藏期間。50天后 這些特別的細胞被融化，通常在約80%融合時通過確定發展動力學。在融化后6天，細胞群 體擴大到1670萬個細胞（傳代3的末期）。再培養7天后，細胞群體達到3170萬個細胞 (傳代4的末期）。這項初始研究表明30天的培養可取得約3000萬細胞。
[0418] 圖22涉及到細胞有限的增殖潛能。圖22顯示每單位面積從人體脂組織隔離的平 滑肌細胞作為功能性細胞恢復的數量變化的函數。這些數據表明在4和5傳代之間，恢復 的細胞數量開始下降，支持這些細胞是有限和有限增生的能力的論點，為祖細胞所獨有的 特征，但不是真實的干細胞。
[0419] 圖23顯示從豬脂肪，外周血和膀胱平滑肌隔離的平滑肌細胞的發展，作為每條傳 代恢復的細胞數量的函數。如圖所示，在2和3傳代之間，在超過2-4周的時間段，細胞數 量方面取得巨大的擴大，使數十個數百萬個細胞的恢復成為可能。這證明脂肪衍生細胞的 有限或者有限的增殖潛能。
[0420] 增殖的接觸抑制。從外周血和脂肪組織隔離的平滑肌細胞顯示增殖的接觸抑制。 例如，在圖14-17提供的這些細胞的形態學上的評價證明超過幾條傳代的增殖的接觸抑制 的存在。當細胞彼此接觸時增殖停止。相反，MSCs不顯示增殖的接觸抑制，在轉換細胞培 養過程中，觀察到他們可以相互堆積，類似于焦點形成。例如，Zhou et al.報道有關離析 的情況，以及來自老鼠骨髓的單核細胞餾分的MSCs培養，并且觀察到，以在3詞傳代之后， 培養 MSCs 存在接觸抑制（見 10850 頁和圖 1A) (Cancer Res. 2006 ;66 (22) : 10849-10854)。
[0421] 細胞因子MCP-I的制備。MCP-I是一種膀胱迫肌細胞產品。在主動脈平滑肌細胞 里，MCP-I在再生中起作用。MCP-I以具有吸收單核細胞的能力而眾所周知。類似于趨化因 子；這也是血管損傷區域血管平滑肌細胞增生和循環吸收單核細胞的一種有效的促細胞分 裂劑。單核細胞轉換的巨噬細胞通常被用作細胞因子類和增長系數的存儲器。巨噬細胞和 肌前體細胞兩個都是MCP-I信號目標。這和細胞因子在體內吸收干細胞和祖細胞相關，潛 在的有助于再生過程。
[0422] 為測定人周血平滑肌細胞產生的MCP-I數量，來自R&D系統的一個基于酶聯免疫 吸附測定的測定系統被使用。培養基樣品被一式兩份、與標準曲線相比，分析得到的MCP-I 水平，結果為ug/24hr/百萬個細胞。確定了從人膀胱平滑肌隔離的細胞，脂肪，外周血以及 膀胱尿道上皮（陰性對照）細胞因子MCP-I的表達。
[0423] 圖24顯示，來自上述分析的結果表明人周血得到和人體脂組織得到的平滑肌細 胞與人膀胱平滑肌細胞相比產生相當水平的MCP-I。這些數據支持這一結論，正如膀胱SMC 一樣，從脂肪和外周血隔離的平滑肌細胞表達MCP-1。另外，這些數據使我們假設MCP-I在 再生中起關鍵作用，通過直接或者間接的引起肌祖細胞吸收/遷移，或者在構建體內擴散。
[0424] 討論。從動物脂肪隔離的平滑肌細胞證明了平滑肌細胞的幾種特征。我們的研究 已經表明，使用標準酶消化和低速的離心作用可以輕易使細胞容從動物脂肪中隔離。細胞 可以迅速擴大，在不到一個月時間內或許達到3000萬細胞。我們的研究進一步證明這些細 胞可以，實際上，描述一個平滑肌細胞群體而不是一個真實的干細胞數量，如同平滑肌標記 早在傳代3時存在。SMC標記mRNA的表達在早于PO時就可被觀察到，像被RTPCR證明的那 樣。而且，隔離的平滑肌細胞具有收縮功能如同按標準膠原質凝膠收縮測定證明的那樣。
[0425] 平滑肌細胞的特性。我們已經顯示在隨后的傳代期間，平滑肌細胞細胞形態被保 留。在基因和蛋白質水平平滑肌標記具有良好的相關性。
[0426] 細胞因子誘導。脂肪的平滑肌細胞對MCP-I的表達引導我們假設，MCP-I在新器 官或者組織結構再生中起關鍵作用，通過直接或者間接的引起肌祖細胞吸收/遷移，或者 在構建體內擴散。
[0427] 實施例2 MCP-I的制備和細胞密度
[0428] 使用商業上可用的工具檢測和測定來自膀胱平滑肌細胞培養條件的培養基的 MCP-1。測試來自9個構建體（3種，每種分別3種接種水平）的條件培養基樣品和用于接 種構建體的配對的SMC細胞的MCP-I水平。結果如表2. 1所示。
[0429] 表 2. 1
[0430]

【權利要求】
1. 一種用于受試者中的有缺陷的膀胱的尿流改道，包括： a) 第一可植入的、生物相容性構建體，所述構建體包括管狀支架，所述管狀支架具有被 構造為與腹腔壁截面相連接的第一末端和第二封閉末端，和至少一個被構造為與第一輸尿 管相連接的第一側部開口；以及 b) 并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細胞群，所述自體細胞群沉積在所述支架的表 面上或其中。
2. 根據權利要求1所述的尿流改道，其中所述支架還包括被構造為與第二輸尿管相連 接的第二側部開口。
3. 根據權利要求1所述的尿流改道，其中所述第一末端被構造為與所述腹腔壁的位置 平齊。
4. 根據權利要求3所述的尿流改道，其中所述第一末端被構造為縫合在所述受試者的 皮膚上。
5. 根據權利要求4所述的尿流改道，其中所述第一末端被構造為形成開孔。
6. 根據權利要求5所述的尿流改道，其中所述開孔還包括開孔扣。
7. 根據權利要求5或6所述的尿流改道，其中所述支架還包括被構造為形成開孔的墊 圈環。
8. 根據權利要求1所述的尿流改道，其中所述生物相容性支架為可生物降解的。
9. 根據權利要求1所述的尿流改道，其中所述支架包括選自下列的材料：聚乙醇酸、聚 乳酸、以及聚乙醇酸和聚乳酸的共聚物。
10. 根據權利要求1所述的尿流改道，其中所述細胞群為平滑肌細胞群。
11. 根據權利要求1所述的尿流改道，其中所述改道替換所述有缺陷的膀胱。
12. 根據權利要求1所述的尿流改道，其中所述改道為臨時性的。
13. 根據權利要求1所述的尿流改道，其中所述改道為永久性的。
14. 根據權利要求1所述的尿流改道，其中所述管狀支架具有矩形截面構造。
15. 根據權利要求1所述的尿流改道，其中所述管狀支架具有三角形截面構造。
16. 根據權利要求1所述的尿流改道，其中所述管狀支架具有圓形截面構造。
17. 根據權利要求1所述的尿流改道，其中所述改道不含有尿道上皮細胞。
18. -種用于需要的受試者中的有缺陷的膀胱的尿流改道構建體的制造方法，包括： a) 提供第一可植入的生物相容性支架，所述支架包括管狀支架，所述管狀支架具有被 構造為與腹腔壁區域相連接的第一末端和第二封閉末端，和至少一個被構造為與第一輸尿 管相連接的第一側部開口；以及 b) 將并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細胞群沉積在所述支架的第一區域上或其 中，以形成尿流改道構建體。
19. 根據權利要求18所述的方法，其中所述支架還包括被構造為與第二輸尿管相連接 的第二側部開口。
20. 根據權利要求18所述的方法，其中所述第一末端被構造為與所述腹腔壁的位置平 齊。
21. 根據權利要求20所述的方法，其中所述第一末端被構造為縫合在所述受試者的皮 膚上。
22. 根據權利要求21所述的方法，其中所述第一末端被構造為形成開孔。
23. 根據權利要求22所述的方法，其中所述開孔還包括開孔扣。
24. 根據權利要求22或23所述的方法，其中所述支架還包括被構造為形成開孔的墊圈 環。
25. 根據權利要求18所述的方法，其中所述生物相容性支架為可生物降解的。
26. 根據權利要求18所述的方法，其中所述支架包括選自下列的材料：聚乙醇酸、聚乳 酸、以及聚乙醇酸和聚乳酸的共聚物。
27. 根據權利要求18所述的方法，其中所述細胞群為平滑肌細胞群。
28. 根據權利要求18所述的方法，其中所述改道替換所述有缺陷的膀胱。
29. 根據權利要求18所述的方法，其中所述改道為臨時性的。
30. 根據權利要求18所述的方法，其中所述改道為永久性的。
31. 根據權利要求18所述的方法，其中所述管狀支架具有矩形截面構造。
32. 根據權利要求18所述的方法，其中所述管狀支架具有三角形截面構造。
33. 根據權利要求18所述的方法，其中所述管狀支架具有圓形截面構造。
34. 根據權利要求18所述的方法，其中所述改道不含有尿道上皮細胞。
35. -種提供用于需要的受試者中的有缺陷的膀胱的尿流改道的方法，包括： a) 提供第一可植入的生物相容性支架，所述支架包括管狀支架，所述管狀支架具有被 構造為與腹腔壁截面相連接的第一末端和第二封閉末端，和至少一個被構造為與第一輸尿 管相連接的第一側部開口；以及 b) 將并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細胞群沉積在所述支架的一個第一區域上 或其中，以形成尿流改道構建體；以及 c) 將所述構建體植入所述受試者中以形成所述尿流改道。
36. -種提供用于需要的受試者中的有缺陷的膀胱的尿流改道的方法，包括向所述受 試者中植入尿流改道構建體，所述尿流改道構建體包括：(a)管狀支架，所述管狀支架具有 被構造為與腹腔壁截面相連接的第一末端和第二封閉末端，和至少一個被構造為與第一輸 尿管相連接的第一側部開口；以及（b)并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細胞群，所述 自體細胞群沉積在所述支架的表面上或其中，以形成所述尿流改道。
37. 根據權利要求35或36所述的方法，其中所述支架還包括被構造為與第二輸尿管相 連接的第二側部開口。
38. 根據權利要求35或36所述的方法，其中所述第一末端被構造為與所述腹腔壁的位 置平齊。
39. 根據權利要求35或36所述的方法，其中所述第一末端被構造為縫合在所述受試者 的皮膚上。
40. 根據權利要求39所述的方法，其中所述第一末端被構造為形成開孔。
41. 根據權利要求40所述的方法，其中所述開孔還包括開孔扣。
42. 根據權利要求40或41所述的方法，其中所述支架還包括被構造為形成開孔的墊圈 環。
43. 根據權利要求35或36所述的方法，其中所述生物相容性支架為可生物降解的。
44. 根據權利要求35或36所述的方法，其中所述支架包括選自下列的材料：聚乙醇 酸、聚乳酸、以及聚乙醇酸和聚乳酸的共聚物。
45. 根據權利要求35或36所述的方法，其中所述細胞群為平滑肌細胞群。
46. 根據權利要求35或36所述的方法，其中其中所述改道替換所述有缺陷的膀胱。
47. 根據權利要求35或36所述的方法，其中所述改道為臨時性的。
48. 根據權利要求35或36所述的方法，其中所述改道為永久性的。
49. 根根據權利要求35或36所述的方法，其中所述管狀支架具有矩形截面構造。
50. 根據權利要求35或36所述的方法，其中所述管狀支架具有三角形截面構造。
51. 根據權利要求35或36所述的方法，其中所述管狀支架具有圓形截面構造。
52. 根據權利要求35或36所述的方法，其中所述改道不含有尿道上皮細胞。
53. 根據權利要求35或36所述的方法，其中所述尿路管道構建體在植入后形成再生的 組織。
54. 根據權利要求53所述的方法，其中所述再生的組織包括覆蓋平滑肌的連續尿道上 皮。
55. 根據權利要求35或36所述的方法，其中所述尿路管道構建體在植入后形成上皮化 的粘膜。
【文檔編號】A61F2/04GK104274256SQ201410270167
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2009年11月4日 優先權日:2008年11月4日
【發明者】約翰.W.盧德洛, 曼紐爾.J.杰約, 喬迪普.巴蘇, 蒂莫西.A.伯特拉姆, 克里斯托弗.金海默, 凱利.I.格思里, 羅杰.拉甘, 迪帕克.賈因, 奧盧瓦托因.奈特, 理查德.佩因, 薩拉.F.昆蘭, H.S.拉波波特, 納姆拉塔.桑加 申請人:坦吉恩股份有限公司