豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征二聯疫苗及其制備方法

豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征二聯疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征的二聯疫苗及其制備方法。該二聯疫苗為凍干疫苗，其中含有豬圓環病毒2型SH株滅活病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒R98株活病毒，同時疫苗稀釋液中加入了佐劑，可進一步提高疫苗的免疫效果。本發明提供的二聯凍干疫苗抗原之間無免疫干擾作用，該疫苗成品質量檢驗均可達到各自單苗的質量標準；在免疫保護效果上，其效果優于單苗；該二聯凍干疫苗可以簡化免疫程序，降低免疫成本，減少免疫豬的應激反應，因此具有較大的市場應用價值。
【專利說明】豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征二聯疫苗及其制備 方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸用生物制品【技術領域】，涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環病毒 病二聯疫苗及其制備方法。

【背景技術】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)， 又稱藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的豬的一種急性、高度接觸性傳染病，是目前我國規模化豬場 的主要傳染病。豬圓環病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2)可造成豬免疫抑制，導 致機體抵抗力下降，從而誘發多種病毒和/或細菌的混合感染和繼發感染。這兩種疾病對 養豬業危害十分嚴重，給養豬業造成了巨大經濟損失，疫苗接種免疫仍是我國防治豬繁殖 與呼吸綜合征和豬圓環病毒2型的主要方法。目前豬用疫苗品種較多，多疫苗、多針次免疫 一方面費時費力，另一方面會增加豬體的應激反應，影響免疫效果。
[0003] 目前市場上已有豬繁殖與呼吸綜合征與豬圓環病毒病相應的單苗，需要多次分別 注射，接種動物產生的應激反應強，使用不方便，而多聯疫苗雖然使用比較方便，但疫苗各 免疫抗原成分之間往往會產生干擾作用。豬繁殖與呼吸綜合征病毒及豬圓環病毒感染豬體 均能產生免疫抑制作用，因此在制備豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒二聯疫苗 時，應保證兩者不產生免疫干擾現象，即不降低各自的免疫效果。


【發明內容】

[0004] 本發明的主要目的是提供一種含有豬繁殖與呼吸綜合征活病毒、豬圓環病毒2型 滅活病毒的二聯疫苗，可以同時防控藍耳病、豬圓環病毒病。經動物試驗證明，該二聯疫苗 的兩種抗原之間不會產生免疫干擾作用，二聯疫苗中豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病 毒2型產生的免疫效果優于單苗，因此該二聯疫苗具有較大的應用價值。
[0005] 為了實現上述指標，本發明采取了如下技術方案：
[0006] 1. -種豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征二聯疫苗，該疫苗為凍干疫苗，含有 豬圓環病毒2型（Porcine circovirus type2, PCV2)SH株滅活病毒和豬繁殖與呼吸綜合征 病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)R98 株活病毒。
[0007] 2.本發明所涉及的豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征二聯疫苗及其制備方 法，包括以下步驟：
[0008] (1)豬圓環病毒2型抗原的制備
[0009] 1)將檢驗合格的豬圓環病毒2型（SH株）種毒按（V/V) 2%?10%接種至生長成 良好單層的PK15-B1細胞瓶中，加入細胞維持液，置37°C下培養。培養4日后收獲，置-20°C 下凍融3次，收獲細胞培養物；
[0010] 2)對豬圓環病毒2型抗原進行超濾濃縮后使其病毒含量為106 5?107 5TCID5Q/ ml ；
[0011] 3)豬圓環病毒2型抗原中加入終體積比為0.05%?0.5%的β-丙內酯，混合均 勻，4°C滅活24?36小時，37°C降解2?4小時；
[0012] (2)豬繁殖與呼吸綜合征抗原的制備
[0013] 用轉瓶培養Marcl45細胞，待長成良好單層后，倒去細胞液，將豬繁殖與呼吸綜合 征病毒R98株種毒原液按（V/V)2%?10%比例接種于細胞上，輕輕旋轉細胞瓶，37°C吸附 10分鐘，加上細胞維持液，置37°C旋轉培養，當病變細胞達75%以上時收獲細胞和細胞液， 收獲后的豬繁殖與呼吸綜合征病毒液病毒含量為1〇 6 5?l〇7 5TCID5(l/ml ;
[0014] (3)配苗將上述滅活后的豬圓環病毒2型（SH株）抗原與豬繁殖與呼吸綜合征活 病毒（R98株）抗原等量混合，在抗原混合液中加入終體積比為30%?60%的常規凍干保 護劑，混勻、定量分裝、凍干；
[0015] (4)疫苗稀釋液的配制在口冊.8?7.2?85中加入10%?20%的]?〇1^311丨(16" 1661 佐劑（W/V)，利用低剪切力的磁力攪拌器乳化30?60分鐘，制備疫苗稀釋液。
[0016] 本發明詳細實施方式
[0017] 一、疫苗制備
[0018] 1.豬圓環病毒2型抗原液的制備與檢驗
[0019] (1)接毒將檢驗合格的PCV2SH株種毒按（V/V)3%接種至生長成良好單層的 PK15-B1細胞瓶中，加入細胞維持液，置37°C下培養。培養4日后收獲，置-20°C下凍融3次， 收獲細胞培養物，取少量樣品進行無菌檢驗及病毒含量的測定。收獲后病毒液置于_20°C保 存。
[0020] (2)無菌檢驗按《中國獸藥典》（中國獸藥典委員會，《中華人民共和國獸藥典2010 年版》三部，中國農業出版社，2011年，本發明以下稱《中國獸藥典》）附錄進行檢驗，抗原液 無菌生長。
[0021] (3)病毒含量測定將PCV2SH株病毒液用含4%犢牛血清的DMEM細胞維持液作10 倍系列稀釋，取1(Γ 5、1(Γ6、1(Γ73個稀釋度，分別接種PK15-B1細胞單層的96孔細胞培養板， 每個稀釋度接種4孔，100 μ 1/孔，同時設立正常細胞對照，置37°C含5% C02的培養箱中繼 續培養24小時，用含2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的DMEM細胞維持液換液，繼續培養24 小時后進行間接免疫熒光試驗，具體方法如下：
[0022] 1)病毒稀釋與接種將PCV2病毒液用含4%犢牛血清的DMEM細胞維持液作10倍 系列稀釋，取10'10'1(Γ 73個稀釋度，分別接種PK15-B1細胞單層的96孔細胞培養板，每 個稀釋度接種4孔，100 μ 1/孔，同時設立正常細胞對照，置37°C含5% C02的培養箱中繼續 培養24小時，用含2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的DMEM細胞維持液換液，繼續培養24小 時。
[0023] 2)細胞固定棄去營養液，用PBS(0. Olmol/L，pH值7. 0)洗滌細胞3次；加入冷丙 酮（80%丙酮，20%雙蒸水），150 μ 1/孔，置2?8°C下作用30分鐘。
[0024] 3)加入PCV2抗體棄去丙酮，置室溫下干燥，用PBS洗滌1次，加入1 : 20稀釋的 PCV2抗體，50 μ 1/孔，置37°C下作用1小時。
[0025] 4)加入FITC標記的SPA棄去孔內液體，用PBS洗滌5次，加入1 : 100稀釋的 FITC標記的SPA，50y 1/孔，置37°C下作用1小時，棄去孔內液體，用PBS洗滌5次。
[0026] 5)鏡檢觀察將上述細胞培養板置熒光顯微鏡下觀察。正常細胞對照孔應無熒光物 質著染；有綠色熒光物質著染的細胞孔，判為PCV2感染陽性。
[0027] 6)計算TCID5(I統計每個稀釋度病毒接種細胞孔中PCV2陽性的孔數，根據Karber 法計算病毒TCID5Q。
[0028] (4)濃縮根據病毒含量測定的結果，對PCV2抗原進行適當倍數的超濾濃縮，對 濃縮后抗原進行無菌檢驗、病毒含量的測定。經檢驗，該抗原液無菌生長，病毒含量為 10 7 0TCID50/ml。
[0029] (5)滅活將檢驗合格的病毒液中加入終體積為0. 2%的β -丙內酯，4°C滅活24小 時，37°C降解4小時獲得滅活抗原。取少量滅活后病毒液進行無菌檢驗及滅活檢驗。
[0030] (6)滅活檢驗取少量滅活病毒液接種已長成單層的PK15細胞，置37°C下吸附1小 時，棄去病毒液，加入新的細胞維持液，置37°C下繼續培養2日，無細胞病變（CPE)，連續盲 傳3代后，用IFA法檢測，無綠色PCV2陽性細胞產生。
[0031] 2.豬繁殖與呼吸綜合征抗原液的制備及檢驗
[0032] (1)抗原制備用轉瓶培養細胞，待長成良好單層后，倒去細胞液，將種毒原液按 (V/V) 2%比例接種于細胞上，輕輕旋轉細胞瓶，37°C吸附10分鐘，加上細胞維持液，置37°C 旋轉培養。每日觀察2次，記錄細胞病變情況，當病變細胞達75%以上時收獲細胞和細胞 液，在-20°C以下保存。收獲后的豬繁殖與呼吸綜合征病毒液進行無菌檢驗及病毒含量測 定。
[0033] (2)病毒含量測定將病毒用細胞維持液做10倍系列稀釋，取10'10'1(Γ63個稀 釋度，各接種于96孔培養板Marcl45細胞單層，200 μ 1/孔，置于5% C02溫箱37°C培養5 日，觀察細胞病變，根據Reed-Muench法計算病毒TCID5Q。
[0034] 4.配苗、分裝及凍干
[0035] 將上述滅活好的豬圓環病毒2型抗原與豬繁殖與呼吸綜合征活病毒抗原等量混 合，在抗原混合液中加入終體積比為50%的凍干保護劑，混勻、定量分裝、凍干。
[0036] 凍干保護劑中成分為（W/V):蔗糖為20%，脫脂奶粉為5%。
[0037] 5.疫苗稀釋液的制備
[0038] 在 PBS(pH6. 8 ?7. 2)中加入 10% 的 Montanide? Gel 佐劑（購自法國 SEPPIC 公 司）（W/V)，利用低剪切力的磁力攪拌器乳化30?60分鐘，制備疫苗稀釋液。
[0039] PBS 的成分為：0· 15mol/L NaCl，0. 025mol/L Na2HP04,0 . 00 5mol/L ΚΗ2Ρ04。
[0040] 二、疫苗成品檢驗
[0041] (一）成品檢驗
[0042] 1.性狀檢驗
[0043] 微黃色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加疫苗稀釋液后迅速溶解。
[0044] 2.無菌檢驗、支原體檢驗
[0045] 按《中國獸藥典》附錄進行檢驗，疫苗無菌、無支原體生長。
[0046] 3.安全檢驗
[0047] 將疫苗用疫苗稀釋液稀釋成每毫升含10頭份，肌肉注射14?21日齡PRRSV抗體 陰性、PCV2抗體與抗原陰性健康仔豬3頭，每頭lml，觀察14日，無異常臨床反應。
[0048] 4.效力檢驗
[0049] (1)豬圓環病毒2型部分
[0050] 小鼠免疫試驗法用5?6周齡PCV2ELISA抗體陰性健康雌性清潔級Balb/c小鼠 (PCV2ELISA抗體不高于1:50) 15只，分成3組，每組5只。用疫苗稀釋液將凍干疫苗稀釋至 0. 5頭份/ml，第1組和第2組分別皮下接種參考疫苗（圓環疫苗）和待檢疫苗，每只0. 2ml， 兩周后按相同途徑和劑量進行第2次接種；第3組不接種，作空白對照。各組小鼠均隔離飼 養觀察。首免后5周采血，分離血清，測定血清中PCV2ELISA抗體，對照組應全部為陰性，待 檢疫苗免疫組抗體平均效價應不低于參考疫苗免疫組抗體平均效價，參考疫苗免疫組抗體 平均效價應不低于1:800。
[0051] (2)豬繁殖與呼吸綜合征部分
[0052] 病毒含量將Marcl45細胞培養于細胞瓶中，每隔2日用含10%犢牛血清01^營 養液按1:2擴大培養；測定疫苗病毒含量前48小時，將該細胞傳代接種于96孔培養板，置 于5% C02溫箱37°C培養2日，形成細胞單層；按瓶簽注明頭份，將疫苗用生理鹽水稀釋為 每毫升含1頭份，再用細胞維持液做10倍系列稀釋，取10'10'1(Γ 63個稀釋度病毒液，接 種于96孔細胞培養板Marcl45細胞單層，每個稀釋度重復4孔，0. 2ml/孔；然后將細胞板 放置于5% C02溫箱37°C培養5日，觀察細胞病變（CPE)，根據Reed-Muench法計算TCID5Q。 每頭份應不低于i〇 5_°tcid5Q。
[0053] 4.剩余水分測定
[0054] 按《中國獸藥典》附錄進行測定，剩余水分含量應不超過4. 0%，說明剩余水分合 格。
[0055] 5.鑒別檢驗
[0056] 將疫苗用生理鹽水稀釋為每毫升含1頭份，接種于96孔細胞板Marcl45細胞，2孔 /樣品，100 μ 1/孔，37°C吸附1小時，加入含4%犢牛血清的DMEM細胞維持液，同時設定空 白細胞對照，在5% C02溫箱37°C培養24小時；棄去營養液，用PBS緩沖液（0. Olmol/L pH 值為7.0)洗滌細胞3次；加入冷丙酮（80%丙酮，20%雙蒸水），200 μ 1/孔，4°C 30分鐘；棄 丙酮，在室溫下干燥，用PBS緩沖液洗滌1次；加入1:500稀釋的美洲型PRRSV單克隆抗體 (購自美國VMRD公司），50 μ 1/孔，37°C 1小時；移去孔內液體，用PBS緩沖液洗滌5次；力口 入1:100稀釋的FITC標記羊抗鼠 IgG(購自武漢博士德公司），50μ 1/孔，37°C 1小時；移 去孔內液體，用PBS緩沖液洗滌5次，于熒光顯微鏡下觀察。接毒細胞胞漿均有綠色熒光， 空白對照組孔細胞漿內無熒光物質著染，說明疫苗中抗原均為PRRSV。
[0057] 6.外源病毒檢驗
[0058] 按《中國獸藥典》規定，用熒光抗體檢測法及紅細胞吸附法進行外源病毒檢驗。每 批疫苗抽取2?3瓶，分別用生理鹽水恢復，并稀釋至2頭份/ml，加入等量藍耳特異性血清 (由南京農業大學姜平教授提供），混合，37°C中和lh。分別接種至細胞單層達75%以上的 VERO、MDBK、ST細胞，每瓶接種lml，補充適量營養液。另取VERO、MDBK、ST細胞各l瓶不接 種，作為陰性對照，5% C02溫箱37°C培養，連續傳代2次，傳代后收獲的培養物用熒光抗體 法、紅細胞吸附試驗進行外源病毒檢測。
[0059] 熒光抗體檢測法收獲的細胞培養物接種至VER0、MDBK、ST細胞單層的6孔板，每種 細胞接種1個孔，同時將分別接種l〇〇TCID 5(lPPV、CSFV、BVDV病毒的細胞做為陽性對照，培 養5?7日后，按試劑盒所述（豬瘟病毒間接免疫熒光抗體檢測試劑盒、豬細小病毒間接免 疫熒光抗體檢測試劑盒、牛病毒性腹瀉間接免疫熒光抗體檢測試劑盒購自中國獸醫藥品監 察所）進行熒光檢測，陽性對照見特異性熒光，陰性對照無特異性熒光，樣品接種孔無特異 性熒光，則樣品為陰性。
[0060] 紅細胞吸附試驗將收獲的培養物接種至VERO、MDBK、ST細胞中，培養7日后，PBS 洗滌，加入0. 2% (V/V)豚鼠紅細胞和雞紅細胞等量混合懸液，分別在4°C、25°C放置30分 鐘，PBS洗滌，顯微鏡下檢查紅細胞吸附情況，不出現紅細胞吸附現象判為合格。
[0061] 7.真空度測定
[0062] 測定疫苗的真空度，各疫苗瓶內均出現紫色輝光，說明疫苗真空度檢驗合格。
[0063] (二）疫苗稀釋液的無菌檢驗
[0064] 取疫苗稀釋液按《中國獸藥典》（2010年版）附錄中方法進行檢驗，疫苗稀釋液中 無菌生長。
[0065] 本發明涉及的微生物資源信息
[0066]豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive Respiratory Syndrome virus) R98株，由南京農業大學姜平教授提供，該毒株為我國商品化豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗 (R98株）的生產用種毒，豬繁殖與呼吸綜合征病毒S1株由南京農業大學姜平教授提供， 為豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（R98株）的檢驗用毒株，該苗由中華人民共和國農業部批 準為三類新獸藥（農業部公告1222號，2009. 06. 12發布）。豬圓環病毒2型（Porcine circovirus2, PCV2)SH株（保藏號為CGMCCNo. 2389)由南京農業大學姜平教授提供； PK15-B1株細胞，由南京農業大學姜平教授提供，該毒株和細胞為我國商品化豬圓環病毒2 型滅活疫苗（SH株）的生產用種毒和細胞，該疫苗由中華人民共和國農業部批準為二類新 獸藥（農業部公告1448號，2010. 08. 27發布）。
[0067] 本發明的有益效果
[0068] (1)豬繁殖與呼吸綜合征病毒與豬圓環病毒感染豬體均能產生免疫抑制作用，二 者的混合感染或相互繼發感染可導致發病率和死亡率升高，對養殖場造成巨大經濟損失， 本發明提供的豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒二聯疫苗可同時預防兩種疫病， 確保疫苗的使用效果。
[0069] (2)在現有技術中，豬繁殖與呼吸綜合征疫苗和豬圓環病毒疫苗都是分開免疫的， 需要多次分時注射，動物可產生較強的應激反應，也增加了工作量。本發明提供的豬圓環病 毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒二聯疫苗可減少了免疫次數，避免多次接種免疫出現的 不良反應，同時還大大簡化了免疫程序，降低免疫成本。
[0070] (3)采用Gel佐劑作為稀釋液來配合二聯疫苗使用，安全性好，并可產生更好的免 疫反應，抗體維持時間更長，免疫效果更佳。 實施例
[0071] 為使本發明更加容易理解，下面將結合實施例進一步闡述本發明，應理解這些實 施例僅用于說明本發明而不局限于本發明的應用范圍，下面實施例中未提及的具體實驗方 法，通常按照常規實驗方法進行。
[0072] 實施例1
[0073] --豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征二聯疫苗的制備
[0074] 以豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征二聯疫苗13001、13002、13003批為例
[0075] 1.豬圓環病毒2型抗原液的制備與檢驗
[0076] (1)將PCV2SH株（CGMCC No. 2389,由南京農業大學姜平教授提供）種毒按（V/ V) 3%接種至生長成良好單層的PK15-B1細胞（由南京農業大學姜平教授提供）瓶中，力口 入4%犢牛血清DMEM細胞維持液（V/V)，置37°C下培養。培養4日后收獲，置-20°C下凍 融3次，收獲細胞培養物，取少量樣品進行無菌檢驗及病毒含量的測定。收獲后病毒液置 于-20°C保存。
[0077] (2)無菌檢驗按《中國獸藥典》附錄中方法進行檢驗，抗原液均無菌生長。
[0078] (3)病毒含量測定將PCV2SH株病毒液用含4%犢牛血清的DMEM細胞維持液（V/V) 作10倍系列稀釋，取1(Γ 5、1(Γ6、1(Γ73個稀釋度，分別接種PK15-B1細胞單層的96孔細胞培 養板，每個稀釋度接種4孔，100 μ 1/孔，同時設立正常細胞對照，置37°C含5% C02的培養 箱中繼續培養24小時，用含2mmol/LD-氨基葡萄糖鹽酸、4%犢牛血清（V/V)的DMEM細胞 維持液換液，繼續培養24小時后進行間接免疫熒光試驗，具體方法如下：
[0079] 1)病毒稀釋與接種將PCV2病毒液用含4%犢牛血清的DMEM細胞維持液作10倍 系列稀釋，取10'10'1(Γ 73個稀釋度，分別接種PK15-B1細胞單層的96孔細胞培養板，每 個稀釋度接種4孔，100 μ 1/孔，同時設立正常細胞對照，置37°C含5% C02的培養箱中繼續 培養24小時，用含2mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的DMEM細胞維持液換液，繼續培養24小 時。
[0080] 2)細胞固定棄去營養液，用PBS(0. Olmol/L，pH值7. 0)洗滌細胞3次；加入冷丙 酮（80%丙酮，20%雙蒸水），150 μ 1/孔，置2?8°C下作用30分鐘。
[0081] 3)加入PCV2抗體棄去丙酮，置室溫下干燥，用PBS洗滌1次，加入1 : 20稀釋的 PCV2抗體，50 μ 1/孔，置37°C下作用1小時。
[0082] 4)加入FITC標記的SPA棄去孔內液體，用PBS洗滌5次，加入1 : 100稀釋的 FITC標記的SPA，50y 1/孔，置37°C下作用1小時，棄去孔內液體，用PBS洗滌5次。
[0083] 5)鏡檢觀察將上述細胞培養板置熒光顯微鏡下觀察。正常細胞對照孔應無熒光物 質著染；有綠色熒光物質著染的細胞孔，判為PCV2感染陽性。
[0084] 6)計算TCID5(I統計每個稀釋度病毒接種細胞孔中PCV2陽性的孔數，根據Karber 法計算病毒tcid5Q。
[0085] 經檢測制備的K13001、K13002、K13003三批PCV2SH株抗原的病毒含量分別為 ΙΟ6· 〇Τ(Π 05(ι/πι1、106· 5TCID5(l/ml、105· 66TCID5(l/ml。
[0086] 2.豬圓環病毒2型抗原液的濃縮、滅活及檢驗
[0087] (1)濃縮根據病毒含量測定的結果，對PCV2 (SH株）抗原進行超濾濃縮，對濃縮后 抗原進行無菌檢驗、病毒含量的測定。經檢驗，K13001、K13002、K13003三批PCV2SH株抗原 液均無菌生長，病毒含量分別為 1〇7· °TCID5(l/ml、107· 33TCID5(l/ml、106· 5TCID5(l/ml。
[0088] (2)滅活將檢驗合格的病毒液中加入終體積比為0. 2%的β -丙內酯，4°C滅活24 小時，37°C降解4小時獲得滅活抗原。取少量滅活后病毒液進行無菌檢驗及滅活檢驗。
[0089] (3)滅活檢驗取少量滅活病毒液接種已長成單層的PK15-B1細胞，置37°C下吸附 1小時，棄去病毒液，加入4%犢牛血清的DMEM細胞維持液（V/V)，置37°C下繼續培養2日， 無細胞病變（CPE)，連續盲傳3代后，用IFA法檢測，K13001、K13002、K13003三批PCV2SH株 抗原樣品均無綠色細胞（PCV2陽性）產生，說明滅活檢驗合格。
[0090] 3.豬繁殖與呼吸綜合征抗原液的制備及檢驗
[0091] (1)用轉瓶培養細胞，待長成良好單層后，倒去細胞液，將PRRSVR98株種毒原液按 (V/V) 2%比例接種于細胞上，輕輕旋轉細胞瓶，37°C吸附10分鐘，加上細胞維持液，置37°C 旋轉培養。每日觀察2次，記錄細胞病變情況，當病變細胞達75%以上時收獲細胞和細胞 液，在-20°C以下保存。收獲后的豬繁殖與呼吸綜合征病毒液（R98株）進行無菌檢驗及病 毒含量測定。
[0092] (2)病毒含量測定將病毒用細胞維持液做10倍系列稀釋，取10'10'1(Γ63個稀 釋度，各接種于96孔培養板Marcl45細胞單層，200 μ 1/孔，置于5% C02溫箱37°C培養5日， 觀察細胞病變，根據Reed-Muench法計算病毒TCID5(I。此次實驗得到的三批抗原NK13001、 NK13002、NK13003 病毒含量為 107.45TCID5(l/ml、107. 2TCID5(l/ml、107.45TCID5(l/ml、。
[0093] 4.配苗、分裝及凍干
[0094] 將上述滅活好的豬圓環病毒2型SH株抗原與豬繁殖與呼吸綜合征病毒R98株活 病毒抗原等量混合，在抗原混合液中加入終體積比為50%的凍干保護劑，混勻、定量分裝、 凍干。
[0095] 凍干保護劑中成分為（W/V):蔗糖為20%，脫脂奶粉為5%。
[0096] 5.疫苗稀釋液的制備
[0097] 在PBS(pH6. 8?7. 2)中加入10%的Montanide? Gel佐劑（W/V)，利用低剪切力 的磁力攪拌器乳化30分鐘，制備疫苗稀釋液。
[0098] PBS 的成分為：0· 15mol/L NaCl，0. 025mol/L Na2HP04,0 . 00 5mol/L ΚΗ2Ρ04。
[0099] 實施例2
[0100] --豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征二聯疫苗的檢驗
[0101] 以豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征二聯疫苗13001、13002、13003批為例
[0102] 1.性狀檢驗
[0103] 對按上述方法所制的三批二聯疫苗進行性狀檢驗，疫苗為微黃色海綿狀疏松團 塊，易與瓶壁脫離，加疫苗稀釋液后迅速溶解。
[0104] 2.無菌檢驗、支原體檢驗
[0105] 三批疫苗按《中國獸藥典》附錄中的方法進行檢驗，三批疫苗均無菌、無支原體生 長。
[0106] 3.安全檢驗
[0107] 將三批二聯疫苗用疫苗稀釋液分別稀釋成每毫升含10頭份，肌肉注射14?21日 齡PRRSV抗體陰性、PCV2抗體與抗原陰性健康仔豬3頭，每頭lml，觀察14日，接種豬均無 異常臨床反應。
[0108] 4.效力檢驗
[0109] (1)豬圓環病毒2型部分
[0110] 小鼠免疫試驗法用5?6周齡PCV2ELISA抗體陰性健康雌性清潔級Balb/c小鼠 (購自揚州大學比較醫學中心）（PCV2ELISA抗體不高于1:50) 25只，分成5組，每組5只。用 疫苗稀釋液將凍干疫苗稀釋至1頭份/ml，第1、2、3組分別皮下接種待檢疫苗，每只0. 2ml ; 第4組皮下接種圓環參考疫苗（SH株，本 申請人:生產的疫苗，為參考苗04)作為對照，每只 0. 2ml，兩周后按相同途徑和劑量進行第2次接種；第5組不接種，作空白對照。各組小鼠均 隔離飼養觀察。首免后5周采血，分離血清，測定血清中PCV2ELISA抗體，檢測結果顯示，陰 性對照組抗體效價均< 1:50,全部為陰性，13001、13002、13003批三批二聯凍干免疫組抗 體平均效價分別為1:3840、1:3200、1:3520,參考疫苗平均效價為1:1440 (見表1)。
[0111] 表1二聯苗豬圓環病毒2型效力試驗結果
[0112]

【權利要求】
1. 一種豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征二聯疫苗，其特征在于該疫苗為凍干疫 苗，含有豬圓環病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2)SH株滅活病毒和豬繁殖與呼吸 綜合征病毒（Porcine Reproductive Respiratory Syndrome virus，PRRSV)R98 株活病毒。
2. -種豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征二聯疫苗及其制備方法，該方法包括以 下步驟： (1) 豬圓環病毒2型抗原的制備 將豬圓環病毒2型SH株種毒按（V/V)2%?10%接種至生長成良好單層的PK15-B1細 胞瓶中，加入細胞維持液，置37°C下培養。培養4日后收獲，經凍融收獲細胞培養物； 對豬圓環病毒2型抗原進行超濾濃縮，使其病毒含量為106 5?107 5TCID5(l/ml ; 將檢驗后的豬圓環病毒2型抗原中加入終體積比為0. 05%?0. 5%的β-丙內酯，混 合均勻，4°C滅活24?36小時，37°C降解2?4小時； (2) 豬繁殖與呼吸綜合征抗原的制備 用轉瓶培養Marcl45細胞，待長成良好單層后，倒去培養液，將豬繁殖與呼吸綜合征病 毒R98株種毒原液按（V/V) 2%?10%接種于細胞上，輕輕旋轉細胞瓶，37°C吸附10分鐘， 加上細胞維持液，置37°C旋轉培養，當病變細胞達75%以上時收獲細胞和細胞液，收獲后 的豬繁殖與呼吸綜合征病毒液病毒含量為1〇 6 5?l〇7 5TCID5(l/ml ; (3) 配苗將上述滅活后的豬圓環病毒2型SH株抗原、豬繁殖與呼吸綜合征活病毒R98 株抗原等量混合，在抗原混合液中加入終體積比為30%?60%的常用凍干保護劑，混勻、 定量分裝、凍干； (4) 疫苗稀釋液的配制在ρΗ6· 8?7. 2PBS中加入10 %?20 %的Montanide? Gel佐劑 (W/V)，利用低剪切力的磁力攪拌器乳化30?60分鐘，制成疫苗稀釋液。
【文檔編號】A61K39/12GK104056265SQ201410332357
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月11日 優先權日:2014年7月11日
【發明者】繆芬芳, 何葉峰, 孫石靜, 何海蓉, 董彥鵬, 劉怡, 胡靜雅 申請人:江蘇南農高科技股份有限公司