一種降低血壓以及保護心臟的多肽的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種降低血壓以及保護心臟的多肽，其序列如SEQ ID NO：1-2所示。該多肽具有較好的治療高血壓的效果，同時使用該肽還具有保護心臟的作用。
【專利說明】一種降低血壓以及保護心臟的多肽 發明領域
[0001] 本發明屬于生物技術藥品和生物醫藥領域，具體涉及一種降低血壓以及保護心臟 的多肽，以及該多肽在治療原發性高血壓以及防止心臟疾病等方面的作用。
[0002] 發明背景
[0003] 高血壓是嚴重危害人類健康的世界性問題，中國高血壓患病率18. 8% (2002年）， 目前全國有近2億高血壓患者。高血壓是心腦血管病的主要危險因素，中國腦卒中發病率 約250/10萬人，冠心病發病率約50/10萬人，積極控制高血壓是預防腦卒中和冠心病的重 要措施。目前中國門診高血壓患者治療控制率30. 6 %，而中國高血壓治療總體控制率僅 6. 1%。
[0004] 治療和預防高血壓是當前社會十分重要的課題。肽是一類重要的降血壓藥物，新 發現的與高血壓相關的活性多肽主要有以下幾種：
[0005] ( 一）Apelin心血管活性多肽
[0006] Apel in是日本學者Tatemoto等利用"孤兒受體策略"于1998年用反向藥理學方法 首次從牛胃分泌物中提取到的新的活性多肽，是G蛋白耦聯受體APJ的內源性配體。Apelin 參與多種生理功能和病理過程的調節，尤其在血壓調節、心血管功能、中樞神經系統功能等 多方面起重要調節作用。近年來，Apelin已被證實參與了血壓的調節，Apelin不僅可以 改變動脈壓力，還可以在體內發揮內皮依賴性的血管擴張作用以及對離體心臟的正性肌力 作用。Apelin作為一種利尿神經肽，通過抑制精氨酸血管加壓素（argininevasopressin， AVP)神經元的活性及AVP的釋放來抑制AVP的生物學作用，從而調節血壓及維持體液平衡。 另外，它還可通過N0/L-精氨酸途徑引起血管擴張，表明內皮依賴性的機制介導了 apelin 的血管舒張反應。Apelin-血管緊張素樣受體-I (AGTRLl)系統對于體液穩態和血壓調節具 有重要作用。目前，應用大規模家系的研究策略首次在基因水平上發現Apelin和AGTRLl 基因多態性與高血壓或相關表型有關，推測位于啟動子區的SNPs及單倍型變異可能會導 致產生新的轉錄調節因子結合域，從而影響基因的轉錄，繼而影響蛋白的表達。反過來，蛋 白表達水平的改變又可以影響高血壓的發病進程以及表型的改變。Apelin變化水平與原發 性高血壓的病情程度密切相關，可能對于預測原發性高血壓患者不良事件的發生以及病情 變化具有重要的臨床意義，為今后預測、診斷高血壓及高血壓病高危人群進行早期篩選提 供了一條新思路。
[0007] (二）ADM2
[0008] ADM2是最近克隆出來的降鈣素基因相關肽（CGRP)超家族成員，其結構類似于 CGRP、腎上腺髓質素，通過降鈣素受體樣受體/受體活性修飾蛋白起作用。頂D/ADM2是一種 內源性心臟-腎臟保護因子，作為循環激素和旁/自分泌因子在多種組織中發揮廣泛生物 學功能，具有降低血壓、擴張冠脈、抗心臟缺血/再灌注損傷、調節水和電解質平衡、調節垂 體激素分泌等生物學效應。有文獻報告，在CRLR表達豐富的腦干孤束核（NTS)給予MD微 灌注后，可引起動脈血壓和心率明顯上升。由于NTS是包括心血管系統在內的外周器官壓 力感受器傳入纖維的終止部位，是傳入信息的初級中樞，提示NTS的內源性MD調節全身血 流動力學需要通過自主神經系統才能發揮作用頂D可顯著降低小鼠血壓，且作用較AMD強； 可呈劑量依賴性地使平均動脈壓降低；可降低大鼠總外周阻力，降低血壓，舒張大鼠的容量 血管。另外，頂D作為一種強效血管擴張肽，對器官具有保護性作用。MD在腎臟有豐富的 表達，推測MD作為一種內源性調節肽，其減少可能在高血壓患者腎損傷的發展中起重要 作用。
[0009] (三）尾加壓素II(urotensinII，UII)新近發現的尾加壓素II是迄今所知最強的 縮血管物質，它最早是在硬骨魚的脊髓尾部神經分泌系統分離出來的一種生長抑素環肽， Ames首次在人體中發現一種孤立的G蛋白偶聯受體GPR14,研究表明其為ni的特異性受 體，主要存在于心血管系統。UII與受體結合后引起多種生物學效應。近年來在人體內發 現的UII及其受體成為醫學界研究的熱點，它的主要生物學效應是介導血管收縮、心肌缺 血，促血管平滑肌細胞及心臟成纖維細胞增殖，促心肌細胞肥大等，其結果是心臟和血管的 重構。最近，有研究發現ni還能夠促進血管外膜成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉變，促 進膠原合成，促進外膜成纖維細胞遷移。另有研究報道高血壓患者血漿ni水平明顯高于 血壓正常人群；頸動脈斑塊及其內、中膜厚度，收縮壓等，高血壓組亦明顯高于正常組，而且 UII對斑塊形成的作用遠高于已知的年齡、血壓、血脂等其它危險因素，表明血漿UII水平 增高可能作為獨立危險因素參與原發性高血壓患者慢性AS的發展過程，也是高血壓病血 管重塑過程中重要因素。最近發現，血漿ni水平的升高往往發生在內皮功能障礙性疾病 如高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化，UII通過刺激內皮細胞表達血管細胞粘附分子1和細胞 間粘附分子-1，上調酰基轉移酶A加速泡沫細胞形成，通過誘導產生活性氧（ROS)，以及氧 化低密度脂蛋白和血清素的協同作用刺激血管平滑肌細胞的增殖。血漿UII水平的升高和 高血壓患者頸動脈粥樣硬化的嚴重程度呈正相關。
[0010] (四）兒茶酚抑素（Catestatin)兒茶酚抑素（catestatin)為21個氨基酸組成 的內源性多肽，來源于腎上腺嗜鉻細胞和腎上腺能神經元胞漿中的嗜鉻顆粒蛋白A。有效 抑制交感腎上腺系統兒茶酚胺的釋放刺激肥大細胞釋放組胺，擴張血管、降低血壓、降低心 肌收縮力。原發性和繼發性高血壓患者血漿兒茶酚抑素明顯降低、尿腎上腺素排泄顯著 增加。研究發現，血漿Catestatin的水平可以先于血壓的升高預測高血壓的發生，而且 Catestatin在臨床出現高血壓之前發生明顯的下降，推斷其可能參與了高血壓的起病過 程。Catestatin可以抑制交感活性，降低血壓。Catestatin的降壓作用還與其抑制兒茶酚 胺分泌有關。Catestatin對血壓及心臟功能有強大的調節作用，可能成為新的心血管標志 物及藥物治療靶點，但目前有關Catestatin的基礎和臨床研究尚少，作用機制和臨床價值 都有待進一步深入的探討。
[0011] (五）偶聯因子 6 (CouplingFactor6)
[0012] 偶聯因子 6 (CouplingFactor6)是線粒體 ATP 合酶（ATPsynthase，ATPsyn)的一 個亞單位，存在于線粒體，心肌中含量最高，是線粒體能最代謝的重要組分。CF6是一個強 烈的血管收縮肽，能抑制胞漿磷脂酶A2的活性，減少質膜花生四烯酸釋放從而影響前列環 素12 (PGI2)合成，是迄今已知的體內唯一的內源性PGI2合成抑制因子，可能參與高血壓、 心肌缺血和血栓形成等的發病過程。研究發現人類血管內皮細胞中在CF6作用下ADMA的 釋放增加，而NO活性減少。因此推測，CF6血漿水平的增加，使ADMA釋放增加，NO生成減 少，從而升高血壓。另有研究發現2型糖尿病患者血漿CF6顯著增加，與血漿PGI2水平呈 負相關并與血糖和血脂呈正相關。血液中的CF6水平可能是內皮細胞受損的明顯標志，可 作為促進血管損傷新的危險因素，也可能是使糖尿病患者血壓升高的一個因素。偶聯因子6 可通過細胞酸中毒誘發高血壓，而細胞酸中毒與活性氧的產生有關。最近有研究者，在偶聯 因子6過表達的轉基因鼠上研究了高鹽飲食對心功能的影響以及活性氧的產生，發現高鹽 飲食后，偶聯因子6可上調心臟煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶，而導致心臟收縮功能異常， CF6可能是高血壓所引起的心功能異常的一個誘發因素。綜上，多種體液因素或血管活性物 質之間的網絡調節異常和平衡失調而導致高血壓的發生和發展，有時不僅是單一種激素分 泌增多引起，也可能存在著多種血管活性物質的分泌和調節異常。因此，目前對小分子肽中 某一單一分子的研究或單一靶點的治療均不足以闡明高血壓發病機制及控制其發生發展， 因此必須對這些分子形成的網絡調節進行"整合"研究。然而迄今復雜體系的建立、網絡調 節的研究非常困難，目前功能蛋白質組學的研究方法很難適合于這類物質，由于缺少高通 量的研究技術，還無法建立小分子肽復雜體系的研究模式。可通過建立相對簡單的、初級的 網絡體系，通過研究該家系內部成員之間的相互關系，進而向更為復雜的不同'家系'間的、 甚至整個機體的調節網絡研究過渡，從而更加深入認識高血壓的發病機制，為高血壓的預 防和診治提供理論依據。
[0013] 在現有技術中，肽降血壓的作用靶點通常是抑制血管緊張素轉化酶 (angiotensin-converting enzyme,ACE)的活性。血管緊張素轉化酶可將不具活性的十肽 血管緊張素I轉化為具有強烈收縮血管作用的八肽血管緊張素II，從而使血壓升高，因此 抑制ACE活性可有效控制高血壓。多肽是一類重要的ACE抑制劑，天然蛋白質的酶解肽是 ACE抑制劑肽的主要來源。血管緊張素轉化酶對于機體血壓和心血管功能起著重要的調節 作用，因此抑制ACE活性的藥物在心血管、心力衰竭等疾病的治療中發揮重要作用。多肽類 的ACE抑制劑在降血壓的同時不會引起常見降壓藥物的干咳等副作用。
【發明內容】
[0014] 本發明的目的是提供多肽在降血壓以及保護心臟中的應用；多肽具有降血壓活 性，能夠作為高血壓、心臟病和心血管病的藥物應用。
[0015] 為實現上述目的，本發明所述多肽其具有序列表SEQ ID N0:1中氨基酸序列；所 述多肽為降血壓藥物以及提供心臟保護的藥物的活性成份，其中可添加藥物學上可接受的 載體或輔料。
[0016] SEQ ID NO :1序列為：KRNNFKLVSSMAPAPKVLPVP，是具有降血壓活性的多肽，單鏈線 性結構，白色粉末狀，易溶于水，對ACE活性具有很強的抑制作用。
[0017] 本發明與現有技術相比，具有如下有益效果：
[0018] 本發明提供了一種生物活性多肽，該多肽作為治療高血壓以及心臟保護的藥物藥 物具有較好的應用前景。
【具體實施方式】
[0019] 實施例I SEQ ID NO :1多肽的制備
[0020] 采用常規的多肽合成方法，合成得到相應的多肽，通過質譜檢測，證實合成成功。
[0021] 同時合成現有技術中的已知的對高血壓有治療作用的多肽：SEQ ID NO :2 : VYNEGLPAP，通過質譜檢測，證實合成成功。
[0022] 實施例2多肽的ACE抑制活性檢測
[0023] ACE在37°C、PH8. 3的條件下催化分解血管緊張素I的模擬底物Hippuryl-L-His tidyl-L-Leucine (HHL)產生馬尿酸，該物質在228nm處有特征紫外吸收峰。當加入ACE抑 制物時，ACE對HHL的催化作用受到抑制，馬尿酸的生成量會減少。通過測定加入抑制劑前 后的馬尿酸紫外吸收值可以計算出抑制活性的大小。
[0024] 反應體系
[0025] 緩沖液為 0? 05M，PH8. 3 硼酸鹽緩沖液；底物為 Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucin 6(冊1^)，麗 429.47，用上述緩沖液配成51111;40￡(31^；[(^6118；[11-(3011￥61'1：；[1^6112：71116)用上 述緩沖液配成0. iu/ml。0DA(對照組，為不存在抑制劑但存在酶時的吸光值）：50iil緩 沖液+50ulHHL+50 ill緩沖液于37°C水浴5min，然后加入50 iUACE，37°C水浴30min，加入 200111，說的11(：1終止反應，再加入11111乙酸乙酯萃取產物馬尿酸，振蕩155,35001'/1^11離 心5min，取0. 8ml上清，90°C水浴干燥15min，重溶于0. Sml蒸餾水中，228nm處檢測吸光值 為ODA。ODB (樣品組，為存在抑制劑和酶時的吸光值）：50 ill樣品+50 iilHHL+50 ill緩沖 液于37°C水浴5min，然后加入50 iilACE，37°C水浴30min，加入200 iil，IM的HCl終止反應， 再加入Iml乙酸乙酯萃取產物馬尿酸，振蕩15S，3500r/min離心5min，取0. 8ml上清，90°C 水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸餾水中，228nm處檢測吸光值為0DB。
[0026] 0DC(空白組，為不存在抑制劑和酶時的吸光值）：50 ill緩沖液+50 iUHHL+50 ill 緩沖液于37°C水浴5min，然后加入50 ill緩沖液，37°C水浴30min，加入200 yl，IM的HCl 終止反應，再加入Iml乙酸乙酯萃取產物馬尿酸，振蕩15S，3500r/min離心5min，取0. 8ml 上清，90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸餾水中，228nm處檢測吸光值為0DC。
[0027] ACE 抑制率（％) = (ODA-ODB) AODA-ODC) X 100%
[0028] 分別用 0? 5mg/ml，0? lmg/ml，0? 0 lmg/ml，0? 00 lmg/ml，0? 000 lmg/ml 的濃度，按上 述方法進行ACE抑制活性檢測。結果如下表：
[0029]
【權利要求】
1. 一種降低血壓以及保護心臟的多肽，其序列為SEQ ID NO :1或2所示。
2. -種藥物組合物，包括治療有效量的權利要求1中任一所述的多肽和藥學上可接受 的載體或稀釋劑。
3. 權利要求2所述的藥物組合物在制備用于治療高血壓的藥物中的運用。
4. 權利要求2所述的藥物組合物在制備用于治療高血壓同時保護心臟的藥物中的運 用。
【文檔編號】A61P9/12GK104356209SQ201410449896
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年8月28日 優先權日:2014年8月28日
【發明者】趙志敬, 官浩, 葛煦 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學