一種地高辛脂質微泡及其制備方法
【專利摘要】本發明提供一種地高辛脂質微泡，包括磷脂雙分子層膜、氣體和載地高辛的白蛋白納米粒，其中氣體和載地高辛的白蛋白納米粒均包裹在磷脂雙分子層膜內部。本發明具有相對較高的載藥量和包封率，可提高靶位的血藥濃度，延長藥物在靶位的作用時間，減少藥物降解，提高藥物穩定性，并且納米粒具有促進藥物的選擇性分布，利于傳遞藥物進入病變組織，可以增加藥效并減少毒副作用。本發明還公開了這種脂質微泡的制備方法，制備工藝簡單，易于工業化，制備過程不涉及化學反應，未采用毒性大的有機溶劑，安全性高，環境友好性強。
【專利說明】一種地高辛脂質微泡及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及地高辛，具體涉及地高辛脂質微泡及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 地高辛屬于強心留體類藥物，早在2000多年前，古羅馬人就用海蔥（含強心苷類 藥物的植物）提取物治療水腫。后來，歐洲人曾用洋地黃葉外用治療炎癥、膿腫等。15世紀 就有人用洋地黃制劑治療心力衰竭。地高辛，是強心苷類藥物的典型代表，是直接從毛花洋 地黃的葉中提取的到的，目前臨床主要用于各種充血性心力衰竭，房顫及心率不齊。臨床上 使用強心苷類藥物最大的問題是安全范圍小，有效劑量與中毒劑量接近。而地高辛一旦中 毒，會出現出現新的心律失常、胃納不佳或惡心、嘔吐、下腹痛、異常的無力軟弱、電解質失 調等，報道顯示還有出現視力模糊或"黃視"，中樞神經系統反應如精神抑郁或錯亂等不良 反應。
[0003] 靶向研究的出現給地高辛的大量使用帶來了新的可能性，靶向給藥的關鍵是高 效、低毒且具有良好生物相容性的藥物載體。靶向給藥系統發展的趨勢是利用脂質體作為 藥物載體，其中脂質體由于可體內降解、無毒、無免疫抑制作用等特點，作為藥物載體越來 越受到人們的重視。但是脂質體也存在很多的局限性，如靶向性不明顯，包封率較低，易滲 透。尤其是到達靶位后釋藥緩慢，往往很難達到有效治療濃度。
[0004] 隨著超生顯影技術的發展，人們發現微泡能夠顯著改善超生圖像的對比質量，由 此發展出中間含氣的超生微泡作為超生造影劑。超生造影劑作為增強心肌、肝、腦等實質器 官的二維超生顯像和血流多普勒效應，明顯提高超生對于病變區形態的分辨能力。
[0005] 盡管微泡在造影劑方面的研究日趨成熟，但是將微泡作為一種新型的藥物載體來 研究并不多見。盡管微泡在靶向給藥及促進藥物在靶部位的吸收具有獨特的優勢，但存在 很多目前無法克服的技術難題：如微泡作為藥物載體，其載藥量較低，造成輸送到靶位的藥 物濃度較低，對藥物來說不足以產生有效的藥理作用等。
【發明內容】
[0006] 針對現有技術中存在的上述缺陷，本發明提供一種地高辛脂質微泡。
[0007] 本發明的另一目的是提供一種地高辛脂質微泡的制備方法。
[0008] 本發明的目的是這樣實現的：
[0009] -種地高辛脂質微泡，其特征在于：所述脂質微泡包括磷脂雙分子層膜、氣體和載 地高辛的白蛋白納米粒；所述氣體和載地高辛的白蛋白納米粒均包裹在磷脂雙分子層膜內 部。
[0010] 所述白蛋白為牛血清白蛋白。
[0011] 發明人在研究中發現，制備的地高辛脂質微泡，容易出現外殼較硬，彈性相對差， 在超聲時空化作用效應弱，不能被低能量超聲所擊碎，倘若加大超聲能量又會造成正常組 織損傷。
[0012] 上述磷脂優選天然磷脂。
[0013] 在滿足脂質微泡容易被超聲擊破的情況下，發明人在研究中還發現，地高辛脂質 微泡中氣體的選擇有很大的講究，一旦控制不好就容易出現：微泡里的氣體擴散很快，球壁 塌陷而迅速失去聲反射性，并且不能隨血液分布全身，從而一定程度上影響地高辛的治療 效果。
[0014] 上述氣體以氮氣為佳。
[0015] 在滿足脂質微泡容易被超聲擊破的情況下，發明人還發現，若控制不好，制得的地 高辛脂質微泡在體內的傳輸效率緩慢，藥物起效時間相對較慢，從而一定程度上影響地高 辛的用藥。
[0016] 進一步，天然磷脂優選蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂和磷脂酰乙醇胺中的一種或幾種 混合。
[0017] 所述的白蛋白納米粒包括表面有修飾葉酸、甘草次酸的載地高辛白蛋白納米粒， 和表面沒有修飾的載地高辛白蛋白納米粒。
[0018] 上述地高辛脂質微泡的制備方法，包括載地高辛白蛋白納米粒混懸液的制備和包 裹載地高辛白蛋白納米粒脂質微泡的制備。
[0019] 載地高辛白蛋白納米粒混懸液的制備：
[0020] 分別配制白蛋白水溶液和地高辛的乙醇溶液，然后將地高辛乙醇溶液緩慢滴加到 白蛋白水溶液中，然后加入戊二醛，攪拌固化，旋轉蒸發除去乙醇，即得載藥白蛋白納米粒 混懸液。
[0021] 包裹載地高辛白蛋白納米粒脂質微泡的制備：
[0022] 將磷脂、甘油和磷酸鹽緩沖液按比例混合，再加入適量步驟1中制得的白蛋白納 米粒混懸液并加熱，然后充入氣體振蕩，制得包裹載藥白蛋白納米粒的脂質微泡。
[0023] 上述地高辛的用量為臨床處方量。本發明使用戊二醛為固化劑，其用量為本領域 技術人員根據實際情況確定。
[0024] 發明人在實際過程中發現，在采用上述制備方法制備脂質微泡過程中，若控制不 好，易使得制得的地高辛脂質微泡易滲漏，穩定性差，保存時間短，從而嚴重影響地高辛脂 質微泡的用藥效果。
[0025] 優選地，上述白蛋白水溶液的濃度為0. 8%?5%;戊二醛的濃度為0. 2%?0. 3%; 磷脂、甘油和磷酸鹽緩沖液的比例為55?60 : 5?8 : 100。
[0026] 進一步，在保證制得的地高辛脂質微泡不易滲漏，穩定性好的情況下，發明人在研 究中還發現，若控制不好，易出現制得的脂質微泡包封率低的技術問題。
[0027] 更優選地，上述白蛋白水溶液的濃度為0.8%?5% ;戊二醛的濃度為0.2%? 0.3%;磷脂、甘油和磷酸鹽緩沖液的比例為55?60 : 5?8 : 100;地高辛的乙醇溶液加 入到白蛋白水溶液中的滴速控制在0. 1?6mL/min。
[0028] 上述百分比為重量百分比。磷脂、甘油與磷酸鹽緩沖液的比例為質量比。
[0029] 最優選地，上述白蛋白水溶液的濃度為0. 8 %?5% ;戊二醛的濃度為0. 25% ;磷 月旨、甘油和磷酸鹽緩沖液的比例為55?60 : 5?8 : 100;地高辛的乙醇溶液加入到白蛋 白水溶液中的滴速控制在〇. 5?3mL/min。
[0030] 在保證包封效率的基礎上，發明人在研究中發現，震蕩時間與加熱時間控制不好 會帶來制得的地高辛脂質微泡的粒徑不均勻，從而一定程度上影響脂質微泡透過體內膜的 比例及效率。
[0031] 進一步，上述制備方法優選白蛋白水溶液的濃度為0. 8%?5% ;戊二醛的濃度為 0.25%;磷脂、甘油和磷酸鹽緩沖液的比例為55?60 : 5?8 : 100;地高辛的乙醇溶液 加入到白蛋白水溶液中的滴速控制在〇. 5?3mL/min ;充入氣體后震蕩的時間為5-300s ; 加熱時間為2?3h。
[0032] 具體的說，一種地高辛脂質微泡的制備方法，包括如下步驟：
[0033] 1)載地高辛白蛋白納米粒混懸液的制備：
[0034] 分別配制濃度為0. 8 %?5%白蛋白水溶液和地高辛的乙醇溶液，然后將地高辛 乙醇溶液以〇. 5?3mL/min滴加到白蛋白水溶液中，然后加入適量濃度為0. 25%的戊二醛， 攪拌固化，旋轉蒸發除去乙醇，即得載藥白蛋白納米粒混懸液。
[0035] 2)包裹載地高辛白蛋白納米粒脂質微泡的制備：
[0036] 將磷脂、甘油和磷酸鹽緩沖液按55?60 : 5?8 : 100的比例混合，再加入適量 步驟1中制得的白蛋白納米粒混懸液并加熱2?3h，然后充入氮氣機械法振蕩30s?50s， 制得包裹載藥白蛋白納米粒的脂質微泡。
[0037] 上述載地高辛白蛋白脂質微泡直徑為4?7微米。
[0038] 本發明所得的微泡可靜注用于臨床，或者制成凍干粉針劑用于臨床。
[0039] -種地高辛脂質微泡凍干粉針劑的制備方法，包括如下步驟：
[0040] 1)載地高辛白蛋白納米粒混懸液的制備：
[0041] 分別配制濃度為0. 8 %?5%白蛋白水溶液和地高辛的乙醇溶液，然后將地高辛 乙醇溶液以〇. 5?3mL/min滴加到白蛋白水溶液中，然后加入適量濃度為0. 25%的戊二醛， 攪拌固化，旋轉蒸發除去乙醇，即得載藥白蛋白納米粒混懸液。
[0042] 2)包裹載地高辛白蛋白納米粒脂質微泡的制備：
[0043] 將磷脂、甘油和磷酸鹽緩沖液按55?60 : 5?8 : 100的比例混合，再加入適量 步驟1中制得的白蛋白納米粒混懸液并加熱2?3h，然后充入氮氣機械法振蕩30s?50s， 制得包裹載藥白蛋白納米粒的脂質微泡。
[0044] 3)、預凍：把分裝好的地高辛脂質微泡放入凍干箱內隔板上，在手動界面中，設板 層溫度為OtMmin(開啟電加熱），進箱完畢后，待制品達到1°C以下保持60min ;打開兩 個壓縮機，設板溫-40°C、lmin，使制品在-35°C以下保持60min ;設板溫-11°C、60min，待制 品達-I TC時，使制品在-I TC保持60min ;設板溫-38 °C、lmin，使制品在-35 °C以下保持 60min〇
[0045] 4)、一次干燥（升華干燥）
[0046] 對后箱制冷，待后箱溫度達_40°C時，開啟真空泵，2s后開小蝶閥，對后箱抽真空。
[0047] 待后箱真空彡90Pa時，開中隔閥，待前箱真空彡12pa時，設定導熱油溫度為0°C， 有限量泄露為8 ± 2pa，對制品加熱180min，設定導熱油溫度為KTC，有限量泄露為8 ± 2pa， 至制品完全抽白。整個升華過程中，前、后箱真空度應< 30Pa，制品溫度< -20°C，冷凝器溫 度< -50°C。如出現異常情況應減慢加熱速度、停止加熱或降低板溫。
[0048] 5)、二次干燥（解析干燥）
[0049] 設定板層溫度為20°C，待制品溫度越過-25?-20°C溫度段后，打開有限量泄漏 20±5(彡30Pa)，使制品溫度迅速上升到20°C后，關閉有限量泄漏，恒溫干燥5小時以上。
[0050] 整個過程中，冷阱溫度應彡-50°C。恒溫階段前、后箱真空為彡5Pa。
[0051] 本發明的有益效果：
[0052] 本發明為載藥超聲微泡給藥系統，進入體內后，體表采用超聲輻射，使微泡定向爆 破，在體內靶部位釋放藥物；同時微泡的爆破可以造成"聲孔效應"，增強局部微血管和細胞 膜通透性，促進藥物滲透，從而實現藥物的靶向給藥。
[0053] 本發明選用的天然磷脂能清除自由基，延緩機體衰老；改善脂類代謝，防治靜動脈 硬化，參與組成細胞膜，增強免疫功能，促進神經傳導，提高大腦活力。
[0054] 本發明與將納米粒吸附或連接于微泡表面的系統相比，本發明首次制備包裹載藥 白蛋白納米粒的脂質微泡，將載藥白蛋白納米粒包裹于微泡脂膜內部，可在體表超聲輻照 下在體內精確定位爆破，釋放出其包裹的白蛋白納米粒，從而提高納米粒的革巴向給藥效率。
[0055] 本發明具有相對較高的載藥量和包封率，可提高靶位的血藥濃度，延長藥物在靶 位的作用時間，減少藥物降解，提高藥物穩定性，并且納米粒具有促進藥物的選擇性分布， 利于傳遞藥物進入病變組織，可以增加藥效并減少毒副作用。
[0056] 本發明采用的制備方法可顯著提高微泡的載藥量，降低藥物的降解，實現藥物在 靶位的緩釋，延長藥物作用時間，增加了藥物的療效；本發明制備工藝簡單，制備過程不涉 及化學反應，未采用毒性大的有機溶劑，安全性高，環境友好性強，易于工業化。
[0057] 本發明制備的地高辛脂質微泡凍干粉針極大地方便了藥物的貯藏與運輸，保存時 間大大延長。
【專利附圖】
【附圖說明】：
[0058] 圖1為本發明實施例1所制備的載地高辛白蛋白納米粒脂質微泡的光學顯微鏡 (400倍）下的圖像。
[0059] 圖2為本發明制備的載地高辛白蛋白納米粒和氮氣的脂質微泡的示意圖。
[0060] 圖3為本發明制備的包載地高辛白蛋白納米粒和氮氣的脂質微泡的粒徑分析圖。
[0061] 圖4為本發明制備的包載地高辛白蛋白納米粒和氮氣的脂質微泡的體外顯影圖。
[0062] 圖5為本發明制備的包載地高辛白蛋白納米粒和氮氣的脂質微泡的兔肝臟顯影 圖。
[0063] 圖6為本發明制備的包載地1?半白蛋白納米粒和氣氣的脂質微泡在超聲如后的 體外釋放情況。
【具體實施方式】：
[0064] 以下通過實施例對本發明進行詳細描述，但本發明并不僅限于下述實施例。
[0065] 實施例1
[0066] 1)、卵磷脂混合液的制備
[0067] 將蛋黃卵磷脂：甘油：磷酸鹽緩沖液以6 : 58 : 100的比例混合均勻，以質量百分 比計。
[0068] 2)、地高辛白蛋白納米粒的制備
[0069] 采用去溶劑化法制備地高辛白蛋白納米粒，精密稱取20mg牛血清白蛋白溶于2mL 水中，另稱取20mg地高辛溶于12mL無水乙醇中，以lmL/min的體積流量將地高辛乙醇溶 液滴加到白蛋白水溶液中，加入IOOmL濃度為0. 25%的戊二醛，避光攪拌4h固化，于35°C 旋轉蒸發除去乙醇，即得地高辛白蛋白納米粒混懸液，結果見圖1。離心法測得其包封率為 88. 48%。
[0070] 3)、載地高辛白蛋白納米粒脂質微泡的制備
[0071] 取步驟1制得的卵磷脂混合液4mL與步驟2制得的地高辛白蛋白納米粒ImL混合 均勻，加熱培養2個小時，然后充入氮氣至飽和后采用機械振蕩法震蕩30s，制得載地高辛 白蛋白納米粒的脂質微泡。將所得微泡于光學顯微鏡下觀察，結果見圖2。
[0072] 4)載藥微泡的粒徑分析
[0073] 采用馬爾文MS2000激光粒度儀測定載藥微泡的粒徑分布。
[0074] 將制備得到的地高辛脂質微泡加到裝有800ml經超聲脫氣的純化水的燒杯中，置 于MS2000激光粒度儀，2500rpm、超聲強度15、時間2min分散處理，檢測粒徑分布，所得微泡 的粒徑分布圖見圖3。
[0075] 5)、將制得的載地高辛白蛋白納米粒脂質微泡用水囊包裹，測定其顯影效果。結果 表明本發明制備的微泡具有良好的體外顯影效果（圖4)。
[0076] 6)、新西蘭大白兔肝臟顯影
[0077] 以新西蘭大白兔（新西蘭大白兔來源于重慶醫科大學實驗動物中心）為實驗對 象，應用速眠新II型（lmL/Kg)肌肉注射麻醉大白兔后，仰臥位固體，采用自身前后對照的 方法，造影前，將ImL的載地高辛白蛋白納米粒脂質微泡，經兔耳緣靜脈注入兔體內，觀察 兔肝臟部位的顯影效果。結果表明本發明制備的微泡具有良好的體內顯影效果（見圖5)。
[0078] 7)、體外超聲釋放
[0079] 應用透析袋法，考察制得的載地高辛白蛋白納米粒脂質微泡在超聲或不加超聲情 況下不同時間點的地高辛累計釋放率（見圖6)。結果表明在超聲作用下，微泡的釋藥速率 大大提高，證明該微泡具有良好的超聲響應性，在超聲作用下，脂膜破裂，釋放其包裹的地 高辛白蛋白納米粒，釋藥速率大大提高。
[0080] 對比例1
[0081] 將實施例1中的氮氣換成空氣、氧氣或六氟化硫，其余與實施例1相同。制得的脂 質微泡在超聲條件下發現，聲反應弱，24h釋藥總量不足70 %。
[0082] 實施例2-10,按照以下參數運行，其他同實施例1，所述累積釋放率實驗為加超聲 的情況下檢測。
[0083]
【權利要求】
1. 一種地高辛脂質微泡，其特征在于：所述脂質微泡包括磷脂雙分子層膜、氣體和載 地高辛的白蛋白納米粒；所述氣體和載地高辛的白蛋白納米粒均包裹在磷脂雙分子層膜內 部；所述白蛋白為牛血清白蛋白。
2. 如權利要求1所述的地高辛脂質微泡，其特征在于：所述磷脂為天然磷脂。
3. 如權利要求2所述的地高辛脂質微泡，其特征在于：所述天然磷脂為蛋黃卵磷脂、大 豆卵磷脂和磷脂酰乙醇胺中的一種或幾種混合。
4. 如權利要求1所述的地高辛脂質微泡，其特征在于：所述氣體為氮氣。
5. 如權利要求1-4任一項所述地高辛脂質微泡的制備方法，其特征在于：包括以下步 驟： 1) 載地高辛白蛋白納米粒混懸液的制備： 分別配制白蛋白水溶液和地高辛的乙醇溶液，然后將地高辛乙醇溶液緩慢滴加到白蛋 白水溶液中，然后加入戊二醛，攪拌固化，旋轉蒸發除去乙醇，即得載藥白蛋白納米粒混懸 液； 2) 包裹載地高辛白蛋白納米粒脂質微泡的制備： 將磷脂、甘油和磷酸鹽緩沖液按55?60 : 5?8 : 100的比例混合，再加入適量步驟 1)中制得的白蛋白納米粒混懸液并加熱，然后充入氣體振蕩，制得包裹載藥白蛋白納米粒 的脂質微泡，所述比例為重量百分比。
6. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述白蛋白水溶液的濃度為0. 8%? 5% ;戊二醛的濃度為0. 2%?0. 3% ;磷脂、甘油和磷酸鹽緩沖液的比例為55?60 : 5? 8 : 100。
7. 如權利要求5或6所述的制備方法，其特征在于：所述白蛋白水溶液的濃度為 0. 8%?5% ;戊二醛的濃度為0. 2%?0. 3% ;磷脂、甘油和磷酸鹽緩沖液的比例為55? 60 : 5?8 : 100;地高辛的乙醇溶液加入到白蛋白水溶液中的滴速控制在0.1?6mL/ min〇
8. 如權利要求5或6所述的制備方法，其特征在于：所述白蛋白水溶液的濃度為 0.8%?5%;戊二醛的濃度為0.25%;磷脂、甘油和磷酸鹽緩沖液的比例為55?60 : 5? 8 : 100;地高辛的乙醇溶液加入到白蛋白水溶液中的滴速控制在0.5?3mL/min。
9. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述氣體充入后震蕩的時間為5-300s。
10. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述加熱時間為2?3h。
【文檔編號】A61K47/42GK104337766SQ201410554336
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年10月9日 優先權日:2014年10月9日
【發明者】唐春林, 劉澤英, 許亞玲 申請人:唐春林