與具有處于穩定的超飽和狀態之雷帕霉素的合成納米顆粒相關的方法和組合物與流程
相關申請
本申請根據35u.s.c.§119要求2014年11月5日提交的美國臨時申請62/075,864和2014年11月5日提交的62/075,866的權益，其全部內容通過引用并入本文。
本發明涉及合成納米載體，其包含疏水性聚酯載體材料和穩定的超飽和量的雷帕霉素。優選地，這些合成納米載體最初是可無菌過濾的，并且在一些實施方案中表現出體內效力。
發明概述
已經令人驚訝地發現，在合成納米載體形成期間，制劑中雷帕霉素的相對于所述制劑中雷帕霉素的溶解度極限的濃度可以對所得合成納米載體誘導免疫耐受性的能力具有顯著影響。此外，這些雷帕霉素如何通過合成納米載體分散可以影響所得合成納米載體是否最初可無菌過濾。具體地，提供了在導致雷帕霉素濃度超過其在形成的納米載體懸浮液中的溶解度的條件下產生的合成納米載體的組合物和相關方法。這樣的合成納米載體可以提供更持久的免疫耐受性，并且最初可無菌過濾。
在一個方面，提供了包含合成納米載體的組合物，所述合成納米載體包含疏水性聚酯載體材料和雷帕霉素，其中所述雷帕霉素以穩定的超飽和量存在于所述合成納米載體中，所述量基于雷帕霉素的重量相對于疏水性聚酯載體材料的重量為小于50重量％
在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，重量是在合成納米載體配制期間組合的材料的配方重量。在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，重量是所得合成納米載體組合物中材料的重量。
在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以小于45重量％的穩定的超飽和量存在。在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以小于40重量％的穩定的超飽和量存在。在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以小于35重量％的穩定的超飽和量存在。在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以小于30重量％的穩定的超飽和量存在。在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以小于25重量％的穩定的超飽和量存在。在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以小于20重量％的穩定的超飽和量存在。在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以小于15重量％的穩定的超飽和量存在。在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以小于10重量％的穩定的超飽和量存在。在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以大于7重量％的穩定的超飽和量存在。
在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，疏水性聚酯載體材料包含pla、plg、plga或聚己內酯。在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，疏水性聚酯載體材料還包含pla-peg、plga-peg或pcl-peg。
在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，合成納米載體中疏水性聚酯載體材料的量為：疏水性聚酯載體材料/總固體為5-95重量％。在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，合成納米載體中的疏水性聚酯載體材料的量為：疏水性聚酯載體材料/總固體為60-95重量％。
在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，合成納米載體還包含hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑。在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑包含山梨聚糖酯、脂肪醇、脂肪酸酯、乙氧基化脂肪醇、泊洛沙姆、脂肪酸、膽固醇、膽固醇衍生物或膽汁酸或鹽。在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑包含span40、span20、油醇、硬脂醇、棕櫚酸異丙酯、單硬脂酸甘油酯、brij52、brij93、pluronicp-123、pluronicl-31、棕櫚酸、十二烷酸、三棕櫚酸甘油酯或三亞油酸甘油酯。在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑為span40。
在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑包封在合成納米載體中，存在于合成納米載體的表面上，或兩者皆有。在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑的量為：hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑/疏水性聚酯載體材料為≥0.1但≤15重量％。在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑的量為：hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑/疏水性聚酯載體材料為≥1但≤13重量％。在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑的量為：hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑/疏水性聚酯載體材料≥1但≤9重量％。
在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，組合物最初可通過0.22μm過濾器無菌過濾。
在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，使用動態光散射獲得的合成納米載體粒度分布的平均值為直徑大于120nm。在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，直徑大于150nm。在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，直徑大于200nm。在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，直徑大于250nm。在本文提供的任何組合物和方法的一個實施方案中，直徑小于300nm。在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，直徑小于250nm。在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，直徑小于200nm。
在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，雷帕霉素包封在合成納米載體中。
在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，組合物還包含抗原。在本文提供的任何一種組合物和方法的一個實施方案中，抗原與組合物中的合成納米載體混合。
在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，組合物還包含可藥周的載體。
在另一方面，提供了包含本文提供的任何一種組合物的藥盒。在提供的任何一種藥盒的一個實施方案中，藥盒用于本文提供的任何一種方法。在提供的任何一種藥盒的一個實施方案中，當組合物不包含抗原時，藥盒還包含抗原。在提供的任何一種藥盒的一個實施方案中，組合物和抗原包含在分開的容器中。在提供的任何一種藥盒的一個實施方案中，組合物和抗原包含在同一容器中。在提供的任何一種藥盒的一個實施方案中，藥盒還包含使用說明書。在提供的任何一種藥盒的一個實施方案中，使用說明書包含對本文提供的任何一種方法的描述。
在另一方面，提供了這樣的方法，其包括向對象施用本文提供的任何一種組合物。在本文提供的任何一種方法的一個實施方案中，當組合物不包含抗原時，所述方法還包括向對象施用抗原。在本文提供的任何一種方法的一個實施方案中，抗原包含在不同的合成納米載體中。在本文提供的任何一種方法的一個實施方案中，抗原不與任何合成納米載體偶聯。在本文提供的任何一種方法的一個實施方案中，施用是通過皮內、肌內、靜脈內、腹膜內或皮下進行施用。
另一方面，提供了用于制備合成納米載體的方法，所述合成納米載體包含疏水性聚酯載體材料和雷帕霉素，所述方法包括獲得或提供疏水性聚酯載體材料，獲得或提供超過雷帕霉素飽和極限的量的雷帕霉素，將所述疏水性聚酯載體材料和所述雷帕霉素組合，以及形成合成納米載體，使得雷帕霉素處于穩定的超飽和量。
另一方面，提供了用于制備合成納米載體的方法，所述合成納米載體包含疏水性聚酯載體材料和雷帕霉素，所述方法包括獲得或提供疏水性聚酯載體材料，獲得或提供超過雷帕霉素飽和極限的量的雷帕霉素，將所述疏水性聚酯載體材料和所述雷帕霉素組合，以及使所述雷帕霉素穩定。
在任何一種制備方法的一個實施方案中，在hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑的存在下形成合成納米載體，或者通過添加hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑使雷帕霉素穩定。
在任何一種制備方法的一個實施方案中，在溶劑存在下，利用組合的疏水性聚酯載體材料和雷帕霉素的快速溶劑蒸發來形成合成納米載體或使雷帕霉素穩定。
在任何一種制備方法的一個實施方案中，利用固體熔融法和/或冷卻注射成型來形成合成納米載體或使雷帕霉素穩定。
在任何一種制備方法的一個實施方案中，所述方法還包括確定疏水性聚酯載體材料中雷帕霉素的飽和極限。在任一種制備方法的一個實施方案中，使用本文提供的任何一種公式進行所述確定。
在任何一種制備方法的一個實施方案中，所述方法還包括過濾所得組合物。在任何一種制備方法的一個實施方案中，過濾包括通過0.22μm過濾器的過濾。
在另一方面，提供了通過本文提供的任何一種制備方法制備的組合物。
在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以超飽和量存在，所述量為疏水性聚酯載體材料中雷帕霉素的飽和極限以上至少1％。在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以超飽和量存在，所述量為疏水性聚酯載體材料中雷帕霉素的飽和極限以上至少5％。在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以超飽和量存在，所述量為疏水性聚酯載體材料中雷帕霉素的飽和極限以上至少10％。在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以超飽和量存在，所述量為疏水性聚酯載體材料中雷帕霉素的飽和極限以上至少15％。在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以超飽和量存在，所述量為疏水性聚酯載體材料中雷帕霉素的飽和極限以上至少20％。在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以超飽和量存在，所述量為疏水性聚酯載體材料中雷帕霉素的飽和極限以上至少25％。在本文提供的任何一種組合物或方法的一個實施方案中，雷帕霉素以超飽和量存在，所述量為疏水性聚酯載體材料中雷帕霉素的飽和極限以上至少30％。
在本文提供的任何一種組合物或方法的另一個實施方案中，雷帕霉素的量超過飽和極限至少1％。在另一個實施方案中，雷帕霉素的量超過飽和極限至少5％。在另一個實施方案中，雷帕霉素的量超過飽和極限至少10％。在另一個實施方案中，雷帕霉素的量超過飽和極限至少15％。在另一個實施方案中，雷帕霉素的量超過飽和極限至少20％。在另一個實施方案中，雷帕霉素的量超過飽和極限至少25％。在另一個實施方案中，雷帕霉素的量超過飽和極限至少30％。
在另一方面，提供了一些實施例中所提供的任何一個公式。本文提供的任何一種方法可以包括使用所提供的任何一種公式確定雷帕霉素的濃度的步驟。在本文提供的任何一種方法的一個實施方案中，所述公式用于確定疏水性聚酯載體材料中雷帕霉素的飽和極限。
在另一方面，提供了任何一個實施例的組合物。
在另一方面，提供了制備本文提供的任何一種組合物(例如實施例的任何一種組合物)的方法。
在另一方面，提供了制備本文提供的任何一種組合物或藥盒的方法。在任何一種這些方法中的一個實施方案中，制備方法包括本文提供的任何一種方法的步驟。在任何一種這些方法中的另一個實施方案中，制備方法包括本文提供的任何一種方法(例如實施例中提供的任何一種方法)的步驟。
在另一方面，提供了本文提供的任何一種組合物或藥盒在制備用于在對象中促進免疫耐受性之藥物中的用途。在本文提供的任何一種用途的另一個實施方案中，所述用途用于實現本文提供的任何一種方法。
在另一方面，本文提供的任何一種組合物或藥盒可用于本文提供的任何一種方法。
在另一方面，提供了制造旨在促進免疫耐受性的藥物的方法。在一個實施方案中，藥物包含本文提供的任何一種組合物。
附圖簡述
圖1示出了雷帕霉素損失和回收分析的結果，其例證了超飽和量的雷帕霉素的測定。
圖2示出了施用如本文所述的具有超飽和量雷帕霉素之合成納米載體情況下的igg水平。
圖3示出了施用如本文所述的具有超飽和量雷帕霉素之合成納米載體情況下的igg水平。
圖4示出了使用具有合成納米載體之施用方案的抗體滴度，所述合成納米載體是利用本文所述的快速溶劑蒸發法和低hlb表面活性劑制備的。
圖5示出了多種容器中標準乳液的溶劑蒸發速率。50ml燒杯(樣品1，菱形)；125mm皿(樣品4，正方形)。結果表明，在具有更大表面積的容器中，蒸發可以更快速。
圖6示出了共同施用納米載體和klh(keyholelimpethemocyanin，匙孔血藍蛋白)以及雷帕霉素(rapa)誘導耐受性的能力的結果。在每次klh攻擊后分析小鼠的血清中針對klh的抗體。
圖7示出了證明具有低hlb表面活性劑的納米載體的持久抗體滴度降低的結果。縮寫“tsip”是指如所述的納米載體。
圖8示出了證明在小鼠中相比于游離雷帕霉素+klh，合成納米載體+klh之功效的結果。抗klhec50：用合成納米載體+klh處理或未處理之小鼠的第35天和42天的抗體滴度(2或3次klh單獨攻擊后)(符號表示幾何平均值±95％ci)。縮寫“nc”是指如所述的納米載體。
圖9示出了實施例7的處理方案。縮寫“nc”是指所述的納米載體。
圖10示出了小鼠中的合成納米載體+klh抗原特異性。抗ovaec50：用合成納米載體+klh處理或未處理之小鼠的第65天的抗體滴度(條表示幾何平均值±95％ci)。縮寫“nc”是指如所述的納米載體。
發明詳述
在詳細描述本發明之前，應當理解，本發明不限于特別示例的材料或工藝參數，因為其當然可以變化。還應當理解，本文使用的術語僅用于描述本發明的特定實施方案的目的，并不意在限制使用替代術語來描述本發明。
本文引用的所有出版物、專利和專利申請，無論是上文還是下文，均通過引用整體并入本文以用于所有目的。
如本說明書和所附權利要求中所使用的，未用數量詞限定的名詞包括復數指示物，除非另有明確規定。例如，提及“聚合物”包括兩種或更多種這樣的分子的混合物或不同分子量的單一聚合物種類的混合物，提及“合成納米載體”包括兩種或更多種這樣的合成納米載體的混合物或多種這樣的合成納米載體等。
如本文所使用的，術語“包括”或其變化形式如“包含”或“含有”應解讀為表明包括任何所列舉的整體(例如特征、元件、特性、屬性、方法/過程步驟或限制)或整體(例如特征、元件、特性、屬性、方法/過程步驟或限制)的組，但不排除任何其他整體或整體的組。因此，如本文所使用的，術語“包括”是包含性的，并且不排除額外的未列舉的整體或方法/過程步驟。
在本文提供的任何一種組合物和方法的實施方案中，“包含”可以用“基本上由...組成”或“由...組成”代替。短語“基本上由...組成”本文中用于要求指定的整體或步驟以及不實質性影響要求保護之發明的特征或功能的那些。如本文所使用的，術語“由...組成”用于表示只存在列舉的整體(例如特征、元件、特性、屬性、方法/加工步驟或限制)或整體(例如特征、元件、特性、屬性、方法/加工步驟或限制)的組。
a.引言
已經發現，具有超飽和量雷帕霉素的合成納米載體可以促進抗原特異性免疫耐受性，甚至持久的抗原特異性免疫耐受性。然而，在一些實施方案中，為了產生具有這樣量的合成納米載體，需要雷帕霉素的穩定并入。在這樣的實施方案中，沒有穩定并入，則合成納米載體可能表現出雷帕霉素損失，并且可能難以通過0.22μm過濾器無菌過濾。雖然不希望受任何特定理論的約束，但是通常，不能穩定地并入合成納米載體中的雷帕霉素可形成聚集體，其可阻塞用于從合成納米載體組合物中去除細菌的過濾器。這種去除對于產生具有期望細菌水平并因此產生更加無菌的組合物是重要的，這是用于體內施用的組合物的有益特征。因此，重要的是在合成納米載體中超飽和量的雷帕霉素是穩定的，以便實現有益的體內效應并且最初可無菌過濾。
令人驚奇的是，如一些實施例中所證實的，可以產生具有穩定的超飽和量雷帕霉素的合成納米載體組合物，并且這種合成納米載體可以在對象中提供持久的抗原特異性耐受性。產生這種合成納米載體的方法包括使用低hlb表面活性劑，以及通過例如涉及快速溶劑蒸發的合成納米載體的制備方法。許多實施例的結果表明，用這種方法生產的合成納米載體可以產生具有超飽和量雷帕霉素的合成納米載體，其最初可無菌過濾。在一些實施例中，這些合成納米載體也已經表現為產生這樣的合成納米載體組合物，其能夠在對象中表現出持久的抗原特異性耐受性。
因此，本文提供了包含穩定的超飽和量雷帕霉素的合成納米載體組合物的組合物和相關方法。優選地，此類合成納米載體最初可無菌過濾。此外，在一些實施方案中，優選地，本文提供的合成納米載體組合物不僅可以促進抗原特異性免疫耐受性，而且可以在相對于雷帕霉素不以穩定的超飽和量存在的合成納米載體的增強水平下如此作用。
現在將在下面更詳細地描述本發明。
b.定義
“施用”(“administering”或“administration”或“administer”)是指以藥理學有用的方式向對象提供材料。在一些實施方案，該術語旨在包括導致施用(causingtobeadministered)。“導致施用”意味著直接或間接地導致、督促、鼓勵、協助、誘導或指導另一方施用所述材料。
“混合”是指將一種組分(如抗原)與另一種組分(如合成納米載體)在組合物中混合。混合的組分是獨立制備或獲得的，并放置在一起。因此，除了一起放在組合物中時可能發生的可能的非共價相互作用之外，組分不彼此偶聯。
在用于向對象施用之組合物或劑量的情況下，“有效量”是指在對象中產生一種或更多種期望應答(例如產生抗原特異性致耐受性免疫應答)的組合物或劑量的量。在一些實施方案中，有效量是藥效學有效量。因此，在一些實施方案中，有效量是產生本文提供的一種或更多種期望的治療效果和/或免疫應答的本文提供的組合物或劑量的任何量。該量可用于體外或體內目的。對于體內目的，該量可以是臨床醫生認為可能對需要抗原特異性免疫耐受的對象具有臨床益處的量。本文提供的任何一種組合物可以是有效量的。
有效量可以涵蓋降低不期望的免疫應答的水平，盡管在一些實施方案中，其涵蓋完全阻止不期望的免疫應答。有效量還可以涵蓋延遲不期望的免疫應答的發生。有效量也可以是產生期望治療終點或期望治療結果的量。在另一些實施方案中，有效量可以涉及增強期望應答(例如治療終點或結果)的水平。有效量優選地導致對象對抗原的致耐受性免疫應答。可以通過常規方法來監測上述任何一項的實現。
有效量當然取決于：進行治療的特定對象；病癥、疾病或障礙的嚴重程度；個體患者參數，包括年齡、身體狀況、體型和體重；治療的持續時間；并存治療(如果有的話)的性質；健康從業者的知識和專業知識內的具體施用途徑等因素。這些因素是本領域普通技術人員所熟知的，并且可以僅僅通過常規實驗來解決。通常優選使用最大劑量，即根據健康醫學判斷的最高安全劑量。然而，本領域普通技術人員將理解，由于醫療原因、心理原因或實際上任何其他原因，患者可能堅持使用較低劑量或可耐受劑量。
通常，本發明組合物中組分的劑量是指組分的量。或者，所述劑量可以基于提供期望量的合成納米載體的數量來施用。
“抗原”是指b細胞抗原或t細胞抗原。“抗原類型”是指具有相同或基本上相同的抗原特征的分子。在一些實施方案中，抗原可以是蛋白質、多肽、肽、脂蛋白、糖脂、多核苷酸、多糖，或在細胞中包含或表達。在一些實施方案中，例如當抗原沒有明確定義或表征時，抗原可以包含在細胞或組織制備物、細胞碎片、細胞外排體(cellexosome)、條件培養基等中。
“抗原特異性”是指由抗原或其部分的存在而產生的，或者產生特異性識別的或結合抗原的分子的任何免疫應答。例如，當免疫應答是抗原特異性抗體產生時，產生特異性結合抗原的抗體。又例如，在免疫應答是抗原特異性b細胞或cd4+t細胞增殖和/或活性的情況下，增殖和/或活性來自單獨的或與mhc分子、b細胞等復合的抗原或其部分的識別。
除非另有說明，否則本文使用的“平均值”是指算術平均值。
“確定”是指確定事實關系。確定可以以多種方式實現，包括但不限于進行實驗或進行投射。在一些實施方案中，“確定”包括“導致確定”。“導致確定”意味著導致、督促、鼓勵、協助、誘導或指導或與實體協作進行，以使實體確定事實關系；這包括直接或間接，明示或暗示。
“包封”是指將物質的至少一部分封裝在合成納米載體內。在一些實施方案中，物質完全封裝在合成納米載體內。在另一些實施方案中，包封的物質的大部分或全部不暴露于合成納米載體外部的局部環境。在另一些實施方案中，不超過50％、40％、30％、20％、10％或5％(重量/重量)暴露于局部環境。包封不同于吸附(absorption)，后者是將大部分或全部物質放置在合成納米載體的表面上，并使物質暴露于合成納米載體外部的局部環境。在本文提供的任何一種組合物或方法的實施方案中，雷帕霉素和/或親水-親油平衡值(hlb)值小于或等于10的非離子表面活性劑包封在合成納米載體中。
“疏水性聚酯載體材料”是指可以遞送一種或更多種分子(例如，雷帕霉素和hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑)、包含一種或更多種聚酯聚合物或其單元并具有疏水特性的任何可藥用的載體。聚酯聚合物包括但不限于pla、plga、plg和聚己內酯。疏水性聚酯載體材料包括可以形成合成納米載體或其一部分，并且可以包含或負載一種或更多種分子(例如，雷帕霉素和hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑)的材料。一般，載體材料可以允許將一種或更多種分子(例如，雷帕霉素和hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑)遞送至靶位點或靶細胞，受控的釋放所述一種或更多種分子，以及其他期望活性。“疏水性”是指基本上不參與與水的氫鍵鍵合的材料。這樣的材料通常是非極性的、主要是非極性或電荷中性的。適合于本文所述組合物的載體材料可以基于其表現的某些水平的疏水性而被選擇。因此，疏水性聚酯載體材料是整體疏水的那些，并且可以完全由疏水性聚酯或其單元組成。然而，在一些實施方案中，疏水性聚酯載體材料是整體疏水的，但包含與其他聚合物或其單元組合的疏水性聚酯或其單元。這些其他聚合物或其單元可以具有疏水性但不一定如此。這樣的載體材料可以包括一種或更多種其他聚合物或單元，條件是聚合物或其單元的基質被認為是疏水的。
“最初可無菌過濾”是指以前未過濾但可以通過過濾器(如0.22μm過濾器)過濾的合成納米載體的組合物，所述過濾器的通過量為至少50克納米載體/m2濾膜表面積。在本文提供的任何一種組合物或方法的一些實施方案中，如下確定通過量：取9ml體積的合成納米載體懸浮液并將其置于具有本文提供的任何一種過濾器的10ml注射器中。然后將合成納米載體懸浮液推過過濾器，直至不再有懸浮材料通過過濾器。然后可以基于推動通過過濾器的材料和注射器中剩余的懸浮材料來計算通過量。在本文提供的任何一種組合物或方法的一些實施方案中，最初可無菌過濾組合物是非無菌的和/或不適于體內施用的(即，不是充分純的，并且包含不太期望用于體內施用的可溶性組分)。在本文提供的任何一種組合物或方法的另一些實施方案中，最初可無菌過濾組合物包含已經制備但尚未進一步加工以生產臨床級材料的合成納米載體。在本文提供的任何一種組合物或方法的一些實施方案中，最初可無菌過濾組合物先前未過濾但可以通過過濾器(如0.22μm過濾器)過濾，其通過量為至少60、70、80、90、100、120、130、140、160、200、250、300、350、500、750、1000或1500克納米載體/m2濾膜表面積。所述0.22μm過濾器可以是任何具有0.22μm孔徑的過濾器。這樣的過濾器可以由多種材料制成，例如聚乙烯砜、聚偏氟乙烯、混合纖維素酯、無溶劑醋酸纖維素、再生纖維素、尼龍等。過濾器的具體實例包括milliporeslgpm33r、milliporeslgvm33rs、milliporeslgsm33ss、sartorius16534、sartorius17764、sartorius17845等。
“合成納米載體的最大尺寸”是指沿合成納米載體的任何軸測量的納米載體的最大尺寸。“合成納米載體的最小尺寸”是指沿著合成納米載體的任何軸測量的合成納米載體的最小尺寸。例如，對于球狀合成納米載體，合成納米載體的最大和最小尺寸將基本上相同，并且是其直徑的大小。類似地，對于立方形合成納米載體，合成納米載體的最小尺寸將是其高度、寬度或長度中的最小尺寸，而合成納米載體的最大尺寸將是其高度、寬度或長度中最大的尺寸。在一個實施方案中，基于樣品中合成納米載體的總數，樣品中至少75％，優選至少80％，更優選至少90％的合成納米載體的最小尺寸等于或大于100nm。在一個實施方案中，基于樣品中合成納米載體的總數，樣品中至少75％，優選至少80％，更優選至少90％的合成納米載體的最大尺寸等于或小于5μm。優選地，基于樣品中合成納米載體的總數，樣品中至少75％，優選至少80％，更優選至少90％的合成納米載體的最小尺寸大于110nm，更優選大于120nm，更優選大于130nm，更優選大于150nm。根據該實施方案，合成納米載體的最大和最小尺寸的縱橫比可以變化。例如，合成納米載體的最大尺寸與最小尺寸的縱橫比可以在以下范圍變化：1∶1至1,000,000∶1，優選1∶1至100,000∶1，更優選1∶1至10,000∶1，更優選1∶1至1000∶1，甚至更優選1∶1至100∶1，然而更優選1∶1至10∶1。
優選地，基于樣品中合成納米載體的總數，樣品中至少75％，優選至少80％，更優選至少90％的合成納米載體的最大尺寸等于或小于3μm，更優選等于或小于2μm，更優選等于或小于1μm，更優選等于或小于800nm，更優選等于或小于600nm，甚至更優選等于或小于500nm。在優選實施方案中，基于樣品中合成納米載體的總數，樣品中至少75％，優選至少80％，更優選至少90％的合成納米載體的最小尺寸等于或大于100nm，更優選等于或大于120nm，更優選等于或大于130nm，更優選等于或大于140nm，甚至更優選等于或大于150nm。在一些實施方案中，可以通過將合成納米載體懸浮在液體(通常為水性)介質中并使用動態光散射(dynamiclightscattering，dls)(例如使用brookhavenzetapals儀器)來獲得對合成納米載體尺寸(例如有效直徑)的測量。例如，可以將合成納米載體的懸浮液從水性緩沖液稀釋到純水中，以達到約0.01至0.5mg/ml的最終合成納米載體懸浮液濃度。稀釋的懸浮液可以在合適的比色皿中直接制備或轉移到其中來進行dls分析。然后可以將比色皿放置在dls中，允許平衡至受控溫度，然后掃描足夠的時間以基于對介質的黏度和樣品的折射指數的適當輸入來獲得穩定和可重復的分布。然后報告有效直徑或分布的平均值。確定高縱橫比或非球形合成納米載體的有效尺寸可能需要放大技術(例如電子顯微法)，以獲得更精確的測量。合成納米載體的“尺寸”或“大小”或“直徑”是指例如使用動態光散射獲得的粒度分布的平均值。
本文所用的“hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑”或“低hlb表面活性劑”是指具有包含至少一個疏水尾部與親水頭部的結構或具有疏水基團或區域與親水基團或區域的非離子兩親性分子。表面活性劑的尾部一般由烴鏈組成。表面活性劑可以基于親水頭部或基團或區域的電荷特性進行分類。如本文所用，“hlb”是指表面活性劑的親水性-親油性平衡或親水-親油平衡，并且是表面活性劑的親水性質或親油性質的量度。
本文提供的任何一種表面活性劑的hlb可以使用griffin法(griffin’smethod)或davie法(davie’smethod)進行計算。例如，使用griffin法，表面活性劑的hlb是表面活性劑的親水部分的分子量除以整個表面活性劑的分子量乘以20的乘積。hlb值的范圍為0至20，0對應于完全疏水(親脂)分子，20對應于完全親水(疏脂)分子。在一些實施方案中，本文提供的任何一種組合物或方法的表面活性劑的hlb為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(例如，由griffin法或davie法測定)。用于本文提供的任何一種組合物和方法的這樣的表面活性劑的實例包括但不限于山梨聚糖酯，如span40、span20；脂肪醇，如油醇、硬脂醇；脂肪酸酯，如棕櫚酸異丙酯、單硬脂酸甘油酯；乙氧基化脂肪醇，如brij52、brij93；泊洛沙姆，如pluronicp-123、pluronicl-31；脂肪酸，如棕櫚酸、十二烷酸；三酸甘油酯，如三棕櫚酸甘油酯、三亞油酸甘油酯；膽固醇；膽固醇衍生物，如膽固醇硫酸鈉，膽固醇十二酸酯；以及膽汁鹽或酸，如石膽酸、石膽酸鈉。此類表面活性劑的其他實例包括山梨聚糖單硬脂酸酯(span60)、山梨聚糖三硬脂酸酯(span65)、山梨聚糖單油酸酯(span80)、山梨聚糖倍半油酸酯(span83)、山梨聚糖三油酸酯(span85)、山梨聚糖倍半油酸酯(arlacel83)、山梨聚糖二棕櫚酸酯、脂肪酸的單和雙甘油酯、聚氧乙烯山梨聚糖三油酸酯(tween85)、聚氧乙烯山梨聚糖六油酸酯(g1086)、山梨聚糖單異硬脂酸酯(montane70)、聚氧乙烯醇、聚氧乙烯二醇烷基醚、聚氧乙烯(2)油基醚(brij93)、聚氧乙烯十六烷基醚(brij52)、聚乙二醇十二烷基醚(brijl4)；1-單十四酰基-外消旋-甘油；甘油單硬脂酸酯；甘油單棕櫚酸酯；乙二胺四元四醇(ethylenediaminetetradkistetrol)(tetronic90r4，tetronic701)、聚氧乙烯(5)壬基苯基醚(igepalca-520)、merpola表面活性劑、merpolse表面活性劑和聚(乙二醇)山梨糖醇六油酸酯。對于本領域普通技術人員而言，其他實例也是明顯的。
“可藥用的賦形劑”或“可藥用的載體”是指與藥物活性物質一起使用以配制組合物的藥理學無活性材料。可藥用的賦形劑包含本領域已知的多種材料，包括但不限于糖類(如葡萄糖、乳糖等)，防腐劑如抗微生物劑、重建助劑、著色劑、鹽水(如磷酸鹽緩沖鹽水)和緩沖劑。
“提供”是指個人執行的動作或一組動作，其提供用于實施本發明的所需事項或一組事項或方法。可以直接或間接采取動作或動作的組。
“快速溶劑蒸發”是指任何這樣的溶劑蒸發步驟，當其用作合成納米載體配制過程的一部分時，可以產生包含穩定的超飽和量雷帕霉素的合成納米載體。在本文提供的任何一種方法的一些實施方案中，這樣的步驟是其中至少98％的溶劑(如二氯甲烷)在與本文提供的疏水性聚酯載體材料和雷帕霉素組合的45分鐘內蒸發的步驟。在本文提供的任何一種方法的另一些實施方案中，這樣的步驟是其中至少90％的溶劑在與本文提供的疏水性聚酯載體材料和雷帕霉素組合的30分鐘內蒸發的步驟。在本文提供的任何一種方法的另一些實施方案中，這樣的步驟是其中至少90％的溶劑在與本文提供的疏水性聚酯載體材料和雷帕霉素組合的15分鐘內蒸發的步驟。本文在一些實施例中提供了在形成合成納米載體中的此類步驟和使用此類步驟之方法的實例。配制合成納米載體(其可以包括一個或更多個溶劑蒸發步驟)的方法包括乳液法(例如雙重乳液法(doubleemulsionprocess))、納米沉淀、噴霧干燥、轉子系統和超臨界流體法(例如超臨界co2)。又例如，所述方法可以是包括低溫研磨(cryomilling)的方法。例如，可以將一定量的可導致超飽和的雷帕霉素量溶解在具有溶劑的大量聚合物中，并且蒸發溶劑。然后可以將所得材料磨碎以產生期望尺寸的合成納米載體。其他方法也是本領域普通技術人員已知的。
如本文所用的“飽和極限”是指預期溶劑不能溶解或吸收更多溶質的點。如果將超過飽和極限的額外溶質加入到溶劑中，則其可作為分離相(例如沉淀物)出現。在特定條件下，溶劑中溶質的飽和極限可以根據溶質的溶解度計算。在一些實施方案中，飽和極限可以指固相的飽和極限。例如，可以通過從兩種或更多種組分的均勻混合物固化來形成固體，但高于一定材料比例(即，飽和極限)，在正常或平衡條件下形成分子均相的能力可以被超越。確定合成納米載體的雷帕霉素飽和極限的實例可以在一些實施例中找到。當提及高于其飽和極限的雷帕霉素時，雷帕霉素(溶質)的量高于預期分散在疏水性聚酯載體材料或合成納米載體組合物(溶劑)中的雷帕霉素的量。用于確定雷帕霉素的飽和極限的公式可以在下面的一些實施例中找到。
“溶劑”是指可以溶解溶質(例如本文提供的合成納米載體的任何一種或更多種組分)的物質。在一些實施方案中，溶劑是可用于形成合成納米載體的溶劑，例如在乳液法(例如，雙重乳液法)中。此類溶劑的實例包括二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿和碳酸丙烯酯。實例還包括作為低水溶性有機溶劑和水混溶性溶劑(如丙酮、乙醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、甲酰胺等)之組合的溶劑混合物。本領域普通技術人員已知其他實例。
“對象”是指動物，包括溫血哺乳動物，如人類和靈長類；鳥類；家養或農場動物，如貓、狗、綿羊、山羊、牛、馬和豬；實驗動物，如小鼠、大鼠和豚鼠；魚；爬行類；動物園和野生動物；等等。
“超飽和”是指其中含有比在平衡條件下可溶解的更多的溶質(例如，雷帕霉素)的組合物(例如，合成納米載體組合物)。換言之，具有超飽和濃度的組合物具有超過飽和濃度的濃度。在一些實施方案中，雷帕霉素可以高于其對于疏水性聚酯載體材料(例如，單獨或與配制過程的水相中的溶劑組合)的飽和極限。可以通過本領域已知的任何方法將組合物中雷帕霉素的量確定為超飽和，例如通過測定組合物中分子的濃度并將所述濃度與預測的飽和濃度進行比較(例如參見一些實施例，其中可以使用方法、材料和數量等的細節來計算雷帕霉素的超飽和水平)。
用于確定雷帕霉素是否處于超飽和量的其他方法包括鑄膜(filmcasting)、x射線散射和電子顯微術。電子顯微術的形式包括但不限于掃描電子顯微術(scanningelectionmicroscopy，sem)、透射電子顯微術(transmissionelectionmicroscopy，tem)和低溫透射電子顯微術(cryo-tem)。也可以在合成納米載體形成期間用物理觀察確定超飽和度，其中當揮發性有機溶劑幾乎完全蒸發時，含有疏水性聚酯載體材料和雷帕霉素的混濁乳液將變得更透明，并且隨著雷帕霉素濃縮成納米載體制劑，溶液變得更渾濁。又例如，干燥的合成納米載體材料可以分散在揮發性有機溶劑如丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯等中，使得所有的材料都可溶解形成透明溶液，并放置在載玻片上干燥。如果超飽和，則雷帕霉素與疏水性聚酯載體材料分離。可用于確定超飽和的另一種方法可以涉及通過在萃取隨后用hplc方法分析樣品的一部分以量化存在的雷帕霉素的量。載體材料可以用質子nmr或其他正交方法如maldi-ms等鑒定和/或一旦用hplc鑒定即可定量。然后可以通過實驗來確定疏水性聚酯載體材料中雷帕霉素的飽和極限。
在一些實施方案中，本文提供的任何一種組合物可以包含超飽和量(例如超飽和濃度)的雷帕霉素。在一些實施方案中，組合物的超飽和程度為雷帕霉素超過組合物的飽和極限至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或更多。在本文提供的任何一種組合物的一些實施方案中，合成納米載體中超飽和量的雷帕霉素為：雷帕霉素/疏水性聚酯載體材料為≥6但≤50重量％。在本文提供的任何一種組合物的其他一些實施方案中，這樣的量為：雷帕霉素/疏水聚酯載體材料為≥6但≤45、≥6但≤40、≥6但≤35、≥6但≤30、≥6但≤25、≥6但≤20、≥6但≤15重量％。在本文提供的任何一種組合物的其他實施方案中，這樣的量為：雷帕霉素/疏水聚酯載體材料為≥7但≤45、≥7但≤40、≥7但≤35、≥7但≤30、≥7但≤25、≥7但≤20、≥7但≤15重量％。在本文提供的任何一種組合物的另一些實施方案中，這樣的量為：雷帕霉素/疏水性聚酯載體材料為≥8但≤24重量％。在本文提供的任何一種組合物的一些實施方案中，這樣的量為：雷帕霉素/疏水聚酯載體材料為6、7、8、9、10、12、15、17、20、22、25、27、30、35、45或更多重量％。
超飽和量的雷帕霉素優選是“穩定的”。在一些實施方案中，如果合成納米載體在懸浮液中保留這樣的量，則超飽和量的雷帕霉素在合成納米載體中是穩定的。優選地，具有穩定的超飽和量雷帕霉素的合成納米載體最初可無菌過濾，并且最初無菌過濾能力可以用作對合成納米載體中超飽和量的雷帕霉素穩定性的測試。在一些實施方案中，當在體內施用時，當合成納米載體可用于有益的抗原特異性致耐受性作用時，則認為合成納米載體中超飽和量的雷帕霉素是穩定的。具有超飽和量雷帕霉素的合成納米載體的實例可以在全部實施例中找到。有許多方法可以使合成納米載體中的超飽和量的雷帕霉素穩定化。這樣的方法包括在合成納米載體的制備中使用hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑、包括使用一個或更多個快速溶劑蒸發步驟的合成納米載體形成方法，以及可以包括使用固體熔融和/或冷卻注射成型的合成納米載體形成方法。
“表面活性劑”是指可以降低兩種液體之間或液體和固體之間的表面張力的化合物。表面活性劑可用作去垢劑、潤濕劑、乳化劑、發泡劑和分散劑，并且可用于形成如本文所提供的合成納米載體。在一些實施方案中，表面活性劑是hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑。
“合成納米載體”是指在自然界中沒有發現，并且具有至少一個尺寸小于或等于5微米大小的離散物體。如本文所提供的，合成納米載體包含疏水性聚酯載體材料。因此，合成納米載體可以是但不限于包含疏水性聚酯納米顆粒的合成納米載體。合成納米載體可以是多種不同的形狀，包括但不限于球形、立方形、棱錐形、橢圓體形、圓柱體形、環形(toroidal)等。根據本發明的合成納米載體包含一個或更多個表面。在實施方案中，合成納米載體可具有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或大于1∶10的縱橫比。
具有等于或小于約100nm，優選等于或小于100nm的最小尺寸的根據本發明的合成納米載體不包含具有羥基(其激活補體)的表面，或者替代地包含基本上由不是羥基(其激活補體)的部分組成的表面。在優選的實施方案中，具有等于或小于約100nm，優選等于或小于100nm的最小尺寸的根據本發明的合成納米載體不包含顯著激活補體的表面，或者替代地包含基本上由基本不激活補體的部分所組成的表面。在一個更優選的實施方案中，具有等于或小于約100nm，優選等于或小于100nm的最小尺寸的根據本發明的合成納米載體不包含激活補體的表面，或替代地包含基本上由不激活補體的部分組成的表面。
“總固體”是指包含在合成納米載體的組合物或懸浮液中的所有組分的總重量。在本文提供的任何一種組合物或方法的一些實施方案中，總固體的量被確定為每ml懸浮液的總干納米載體質量。這可以通過重量法來確定。
“重量％”是指一個重量與另一個重量的比乘以100。例如，重量％可以是一種組分的重量與另一種組分的重量的比乘以100或者一種組分的重量與超過一種組分的總重量的比乘以100。一般而言，將重量％測量為合成納米載體群體的平均值或組合物或懸浮液中的合成納米載體的平均值。
c.組合物和相關方法
本文提供了包含合成納米載體的組合物和相關方法，所述合成納米載體包含疏水性聚酯載體材料和穩定的超飽和量雷帕霉素。這樣的組合物和相關方法可導致產生抗原特異性致耐受性作用。因此，所提供的組合物和相關方法可用于需要抗原特異性免疫耐受性的任何對象。如上所述，發現在合成納米載體中遞送超飽和量的雷帕霉素可提供更持久的抗原特異性免疫耐受性。然而，也已經發現超飽和量的雷帕霉素一般不穩定。在合成納米載體中使雷帕霉素穩定可以有助于在形成過程中在合成納米載體中保留適當的量，這些量已表現為有效。合成納米載體中穩定的超飽和量雷帕霉素也導致產生這樣的合成納米載體組合物，其具有另外的最初可無菌過濾的有益效果。
令人驚奇的是，已經發現在具有疏水性聚酯載體材料的合成納米載體中，某些表面活性劑(親水親油平衡值(hlb)值小于或等于10的非離子表面活性劑)使雷帕霉素穩定，并且允許改善初始無菌過濾能力。如一些實施例所示，當將表面活性劑如span40并入到合成納米載體制劑中時，在最初通過0.22μm過濾器時，發現包含雷帕霉素的合成納米載體制劑的通過量增加。還如一些實施例中所示，許多這樣的利用親水親油平衡(hlb)值小于或等于10的非離子表面活性劑配制的合成納米載體也能夠在對象中提供持久的抗原特異性耐受性。
還已經發現在本文提供的合成納米載體中hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑的優化量。在本文提供的任何一種組合物或方法的一些實施方案中，合成納米載體中hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑的量為：hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑/疏水性聚酯載體材料為≥0.01但≤20重量％。在本文提供的任何一種組合物或方法的一些實施方案中，合成納米載體中hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑的量為：hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑/疏水性聚酯載體材料為≥0.1但≤15、≥0.5但≤13、≥1但≤9或10重量％。在本文提供的任何一種組合物或方法的另一些實施方案中，合成納米載體中hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑的量為：hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑/疏水性聚酯載體材料為≥0.01但≤17、≥0.01但≤15、≥0.01但≤13、≥0.01但≤12、≥0.01但≤11、≥0.01但≤10、≥0.01但≤9、≥0.01但≤8、≥0.01但≤7、≥0.01但≤6、≥0.01但≤5等重量％。仍在本文提供的任何一種組合物或方法的另一些實施方案中，合成納米載體中hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑的量為：hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑/疏水性聚酯載體材料為≥0.1但≤15、≥0.1但≤14、≥0.1但≤13、≥0.1但≤12、≥0.1但≤11、≥0.1但≤10、≥0.1但≤9、≥0.1但≤8、≥0.1但≤7、≥0.1但≤6、≥0.1但≤5等重量％。仍在本文提供的任何一種組合物或方法的另一些實施方案中，合成納米載體中hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑的量為：hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑/疏水性聚酯載體材料為≥0.5但≤15、≥0.5但≤14、≥0.5但≤13、≥0.5但≤12、≥0.5但≤11、≥0.5但≤10、≥0.5但≤9、≥0.5但≤8、≥0.5但≤7、≥0.5但≤6、≥0.5但≤5等重量％。仍在本文提供的任何一種組合物或方法的另一些實施方案中，合成納米載體中hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑的量為：hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑/疏水性聚酯載體材料為≥1但≤9、≥1但≤8、≥1但≤7、≥1但≤6、≥1但≤5等重量％。仍在本文提供的任何一種組合物或方法的另一些實施方案中，合成納米載體中hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑的量為：hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑/疏水性聚酯載體材料為≥5但≤15、≥5但≤14、≥5但≤13、≥5但≤12、≥5但≤11、≥5但≤10、≥5但≤9、≥5但≤8、≥5但≤7、≥5但≤6等重量％。在本文提供的任何一種組合物或方法的一些實施方案中，合成納米載體中hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑的量為：hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑/疏水性聚酯載體材料為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20重量％。本文提供的任何hlb值可以使用griffin法或davie法來確定。
同樣，也已經發現，利用快速溶劑蒸發制備合成納米載體的方法也可以產生包含穩定的超飽和量雷帕霉素的合成納米載體。當這樣的蒸發迅速發生時，雷帕霉素穩定地并入合成納米載體中并且可以導致如本文所述的有益結果。例如，如一些實施例所表明，用這種方法生產的合成納米載體最初可無菌過濾，并且當在體內施用時獲得有益的免疫效果。在一些實施例中提供了制備這樣的合成納米載體的具體方法。這樣的方法的其他實例包括具有一個或更多個溶劑蒸發步驟的任何方法。可以包括一個或多個溶劑蒸發步驟的方法包括乳液法(例如雙重乳液法)、納米沉淀、噴霧干燥和超臨界流體法。對于本領域的普通技術人員來說，其他方法也是明顯的。
此外，本文提供的合成納米載體也可以使用包括固體熔融和冷卻注射成型的方法制備。其他方法也是本領域技術人員已知的。
如本文所提供的，合成納米載體中雷帕霉素的量可以被優化和穩定，以使得當向對象施用合成納米載體時，該量導致有效的結果(例如持久的抗原特異性耐受性)。在本文提供的任何一種組合物的一些實施方案中，包含穩定的超飽和量雷帕霉素的合成納米載體包含≥6但≤50重量％的雷帕霉素/疏水性聚酯載體材料。在本文提供的任何一種組合物的一些實施方案中，合成納米載體包含≥6但≤45、≥6但≤40、≥6但≤35、≥6但≤30、≥6但≤25、≥6但≤20、≥6但≤15重量％的雷帕霉素/疏水性聚酯載體材料。在本文提供的任何一種組合物的另一些實施方案中，合成納米載體包含≥7但≤45、≥7但≤40、≥7但≤35、≥7但≤30、≥7但≤25、≥7但≤20、≥7但≤15重量％的雷帕霉素/疏水性聚酯載體材料。在本文提供的任何一種組合物的另一些實施方案中，合成納米載體包含≥8但≤24重量％的雷帕霉素/疏水性聚酯載體材料。在本文提供的任何一種組合物的一些實施方案中，合成納米載體包含6、7、8、9、10、12、15、17、20、22、25、27、30、35、45或更多重量％的雷帕霉素/疏水性聚酯載體材料。
此外，還確定了合成納米載體組合物中疏水性聚酯載體材料的優化量。優選地，在本文提供的任何一種組合物的一些實施方案中，合成納米載體組合物中的疏水性聚酯載體材料的量為：疏水性聚酯載體材料/總固體為5-95重量％。在本文提供的任何一種組合物的另一些實施方案中，合成納米載體中的疏水性聚酯載體材料的量為：疏水性聚酯載體材料/總固體為10-95、15-90、20-90、25-90、30-80、30-70、30-60、30-50等重量％。在本文提供的任何一種組合物的另一些實施方案中，合成納米載體中的疏水性聚酯載體材料的量為：疏水性聚酯載體材料/總固體為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95重量％。
對于本文提供的任何一種組合物，本文所列舉的組分或材料的量可以使用本領域普通技術人員已知的方法或本文另有提供的方法來確定。例如，hlb值小于或等于10的非離子表面活性劑的量可以通過萃取然后通過hplc方法定量來測量。疏水性聚酯載體材料的量可以使用hplc來測定。在一些實施方案中，可以遵從使用質子nmr或其他正交方法(例如maldi-ms等)來確定疏水性聚酯載體材料的身份，以確定這樣的量。可以使用類似的方法來確定本文提供的任何一種組合物中的雷帕霉素的量。在一些實施方案中，使用hplc確定雷帕霉素的量。用于確定組分或材料量的方法的另一些實例如本文其他地方(例如在一些實施例中)所提供。對于本文提供的任何一種組合物或方法，組分或材料的量也可以基于納米載體制劑的配方重量來確定。因此，在本文提供的任何一種組合物或方法的一些實施方案中，本文提供的任何一種組分的量是在配制合成納米載體期間水相中組分的量。在本文提供的任何一種組合物或方法的一些實施方案中，任何一種組分的量均為所制備的和作為配制過程之結果的合成納米載體組合物中的組分的量。
本文提供的合成納米載體材料包含疏水性聚酯載體材料。這樣的材料包含聚酯，其可以包括含有乳酸和乙醇酸單元的共聚物，如聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)，在本文中統稱為“plga”；和包含乙醇酸單元的均聚物，在本文中稱為“pga”，以及包含乳酸單元的均聚物，如聚-l-乳酸、聚-d-乳酸、聚-d，l-乳酸、聚-l-丙交酯、聚-d-丙交酯和聚-d，l-丙交酯，在本文中統稱為“pla”。在一些實施方案中，示例性聚酯包括例如：聚羥基酸；peg共聚物以及丙交酯和乙交酯的共聚物(例如pla-peg共聚物、pga-peg共聚物、plga-peg共聚物及其衍生物)。在一些實施方案中，聚酯包括例如聚(己內酯)、聚(己內酯)-peg共聚物、聚(l-丙交酯-共-l-賴氨酸)、聚(絲氨酸酯)、聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-l-乙醇酸]及其衍生物。
在一些實施方案中，聚酯可以是plga。plga是乳酸和乙醇酸的生物相容性和生物可降解的共聚物，多種形式的plga通過乳酸∶乙醇酸的比來表征。乳酸可以是l-乳酸、d-乳酸或d，l-乳酸。plga的降解速率可以通過改變乳酸∶乙醇酸比來調節。在一些實施方案中，根據本發明使用的plga通過以下乳酸∶乙醇酸比表征：約85∶15、約75∶25、約60∶40、約50∶50、約40∶60、約25∶75或約15∶85。
本文提供的疏水性聚酯載體材料可以包含一種或更多種非聚酯疏水性聚合物或其單元和/或非疏水性的聚合物或其單元，條件是總體上疏水性聚酯載體材料是疏水性的并且含有一種或更多種聚酯或其單元。
本文提供的疏水性聚酯載體材料可以包含一種或更多種作為非甲氧基封端的pluronic聚合物或其單元的聚合物。“非甲氧基封端的聚合物”是指具有至少一個以甲氧基以外的部分結束之末端的聚合物。在一些實施方案中，聚合物具有至少兩個以甲氧基以外的部分結束的末端。在另一些實施方案中，聚合物不具有以甲氧基結束的末端。“非甲氧基封端的pluronic聚合物”是指除了兩個末端均為甲氧基的線性pluronic聚合物之外的聚合物。
在一些實施方案中，疏水性聚酯載體材料可以包含聚羥基鏈烷酸酯、聚酰胺、聚醚、聚烯烴、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、硅酮、氟聚合物或其單元。可以包含在本文提供的疏水性聚酯載體材料中的聚合物的其他實例包括聚碳酸酯、聚酰胺或聚醚，或其單元。在另一些實施方案中，疏水性聚酯載體材料的聚合物可以包含聚(乙二醇)(peg)、聚丙二醇或其單元。
在一些實施方案中，優選地疏水性聚酯載體材料包含生物可降解的聚合物。因此，在這樣的實施方案中，疏水性聚酯載體材料的聚合物可以包含聚醚、例如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其單元。此外，聚合物可以包含聚醚和生物可降解聚合物的嵌段共聚物，使得聚合物是生物可降解的。在另一些實施方案中，聚合物不僅包含聚醚或其單元，例如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其單元。
適用于本發明的聚合物的其他實例包括但不限于聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1，3-二噁烷-2酮))、聚酐(例如聚(癸二酸酐))、聚富馬酸丙酯(polypropylfumerate)、聚酰胺(例如聚己內酰胺)、聚縮醛、聚醚、聚酯(例如聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-共-乙交酯、聚己內酯、聚羥基酸(例如聚(β-羥基鏈烷酸酯)))、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯和聚胺、聚賴氨酸、聚賴氨酸-peg共聚物和聚(乙烯亞胺)、聚(乙烯亞胺)-peg共聚物。
可以包含在疏水性聚酯載體材料中的聚合物的其他實例包括丙烯酸聚合物，例如丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚物、聚氰基丙烯酸酯，或包含一種或更多種前述聚合物的組合。
在一些實施方案中，合成納米載體的聚合物締合以形成聚合物基質。用于從其形成聚合物基質的多種聚合物和方法通常是已知的。在一些實施方案中，包含疏水性聚酯基質的合成納米載體在合成納米載體內產生疏水環境。
在一些實施方案中，可以用一種或更多種部分和/或官能團修飾聚合物。根據本發明可以使用多種部分或官能團。在一些實施方案中，聚合物可以用聚乙二醇(peg)、用碳酸酯和/或用衍生自多糖的無環聚縮醛進行修飾(papisov，2001，acssymposiumseries，786：301)。某些實施方案可以使用gref等的美國專利no.5543158或vonandrian等的wo公開wo2009/051837的一般性教導來實施。
在一些實施方案中，聚合物可以用脂質或脂肪酸基團修飾。在一些實施方案中，脂肪酸基團可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生四烯酸、山萮酸或木蠟酸中的一種或更多種。在一些實施方案中，脂肪酸基團可以是棕櫚油酸、油酸、反型異油酸、亞油酸、α-亞油酸、γ-亞油酸、花生四烯酸、鱈油酸(gadoleic)、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸或芥子酸中的一種或更多種。
在一些實施方案中，優選地聚合物是生物可降解的。在一些實施方案中，根據本發明的聚合物包括由美國食品和藥品管理局(fda)在21c.f.r.§177.2600下批準用于人的聚合物。
聚合物可以是天然的或非天然的(合成的)聚合物。聚合物可以是包含兩種或更多種單體的均聚物或共聚物。就序列而言，共聚物可以是隨機的、嵌段的或包含隨機序列和嵌段序列的組合。通常，根據本發明的聚合物是有機聚合物。
在一些實施方案中，聚合物可以是直鏈或支鏈聚合物。在一些實施方案中，聚合物可以是樹枝狀聚合物。在一些實施方案中，聚合物可以彼此充分交聯。在一些實施方案中，聚合物可以基本上不交聯。在一些實施方案中，聚合物可以根據本發明使用，而不經歷交聯步驟。還應當理解，合成納米載體可以包含任何前述和其他聚合物的嵌段共聚物、接枝共聚物、共混物、混合物和/或加合物。本領域技術人員將認識到，本文所列的聚合物表示可以根據本發明使用的聚合物的示例性但非全面的列表，只要聚合物滿足期望的標準即可。
這些和其他聚合物的性質及其制備方法是本領域熟知的(見例如美國專利6,123,727；5,804,178；5,770,417；5,736,372；5,716,404；6,095,148；5,837,752；5,902,599；5,696,175；5,514,378；5,512,600；5,399,665；5,019,379；5,010,167；4,806,621；4,638,045；和4,946,929；wang等，2001，j.am.chem.soc.，123：9480；lim等，2001，j.am.chem.soc.，123：2460；langer，2000，acc.chem.res.，33：94；langer，1999，j.control.release，62：7；和uhrich等人，1999，chem.rev.，99：3181)。更一般地，用于合成某些合適聚合物的多種方法描述在如下中：conciseencyclopediaofpolymerscienceandpolymericaminesandammoniumsalts，goethals編，pergamonpress，1980；odian，johnwiley&sons的principlesofpolymerization，第四版，2004；contemporarypolymerchemistryallcock等，prentice-hall，1981；deming等，1997，nature，390：386；以及美國專利6,506,577、6,632,922、6,686,446和6,818,732。
根據本發明可以使用多種合成納米載體。在一些實施方案中，合成納米載體是球體或球狀。在一些實施方案中，合成納米載體是平的或平板狀。在一些實施方案中，合成納米載體是立方體或立方形。在一些實施方案中，合成納米載體是橢圓體或橢圓形。在一些實施方案中，合成納米載體是圓柱體、錐體或棱錐形。
在一些實施方案中，期望使用在大小或形狀方面相對均勻的合成納米載體群體，使得每個合成納米載體具有相似的性質。例如，基于合成納米載體的總數，至少80％、至少90％或至少95％的合成納米載體可以具有落在合成納米載體的平均直徑或平均尺寸的5％、10％或20％以內的最小尺寸或最大尺寸。
根據本發明的組合物可以包含與可藥用的賦形劑組合的元素，如防腐劑、緩沖劑、鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水。組合物可以使用常規的藥物制備和復合技術以獲得有用的劑型。在一個實施方案中，將組合物(例如包含合成納米載體的組合物)與防腐劑一起懸浮在無菌鹽水溶液中以用于注射。
在一些實施方案中，本文提供的合成納米載體的任何組分可以是分離的。分離的是指元素與其天然環境分離，并且以足夠的量存在以允許其識別或使用。這意味著例如元素可以通過色譜或電泳純化。分離的元素可以但不一定是基本上純的。因為分離的元素可以在藥物制劑中與可藥用的賦形劑混合，所以元素可以僅占制劑的小的重量百分比。盡管如此，元素是分離的，因為其已經與在生命系統中可能與其締合的物質分離，即與其他脂質或蛋白質分離。本文提供的任何元素可以是分離的，并包括在組合物中或者以分離形式用于方法中。
d.制備和使用組合物的方法及相關方法
可以使用本領域已知的多種方法制備合成納米載體。例如，合成納米載體可以通過例如以下的方法形成：納米沉淀、使用流體通道的流動聚焦、噴霧干燥、單和雙重乳液溶劑蒸發、溶劑萃取、相分離、研磨(包括冷磨)、超臨界流體(例如超臨界二氧化碳)處理、微乳液加工、微米制備、納米制備、犧牲層、簡單和復合凝聚以及本領域普通技術人員公知的其他方法。作為替代或補充，已經描述了用于單分散半導體、導電、磁性、有機和其他納米材料的水性和有機溶劑合成(pellegrino等，2005，small，1：48；murray等，2000，ann.rev.mat.sci.，30：545；和trindade等，2001，chem.mat.，13：3843)。在文獻中已經描述了另外的方法(見例如doubrow編，“microcapsulesandnanoparticlesinmedicineandpharmacy，”crcpress，bocaraton，1992；mathiowitz等，1987，j.control.release，5：13；mathiowitz等，1987，reactivepolymers，6：275；andmathiowitz等，1988，j.appl.polymersci.，35：755；美國專利5578325和6007845；p.paolicelli等，“surface-modifiedplga-basednanoparticlesthatcanefficientlyassociateanddelivervirus-likeparticles”nanomedicine.5(6)：843-853(2010))。
可以使用多種方法將多種材料包封在合成納米載體中，包括但不限于：c.astete等，“synthesisandcharacterizationofplgananoparticles”j.biomater.sci.polymeredn，第17卷，第3期，第247-289頁(2006)；k.avgoustakis“pegylatedpoly(lactide)andpoly(lactide-co-glycolide)nanoparticles：preparation，propertiesandpossibleapplicationsindrugdelivery”currentdrugdelivery1：321-333(2004)；c.reis等，“nanoencapsulationi.methodsforpreparationofdrug-loadedpolymericnanoparticles”nanomedicine2：8-21(2006)；p.paolicelli等，“surface-modifiedplga-basednanoparticlesthatcanefficientlyassociateanddelivervirus-likeparticles”nanomedicine.5(6)：843-853(2010)。可以使用適合于將材料包封在合成納米載體中的其他方法，包括但不限于2003年10月14日授予unger的美國專利6,632,671中公開的方法。
在某些實施方案中，通過納米沉淀工藝或噴霧干燥制備合成納米載體。可以改變用于制備合成納米載體的條件以產生期望尺寸或性質(例如，疏水性、親水性、外部形態、“黏性”、形狀等)的顆粒。制備合成納米載體的方法和使用的條件(例如，溶劑、溫度、濃度、空氣流速等)可以取決于待包括在合成納米載體中的材料和/或載體基質的組成。
如果通過任何上述方法制備的合成納米載體具有在期望范圍之外的尺寸范圍，則可以例如使用篩來篩選這樣的合成納米載體的尺寸。
在一些實施方案中，合成納米載體可以與抗原或其他組合物通過在相同的載劑或遞送系統中混合而組合。
本文提供的組合物可以包含無機或有機緩沖劑(例如，磷酸、碳酸、乙酸或檸檬酸的鈉鹽或鉀鹽)和ph調節劑(例如，鹽酸、氫氧化鈉或氫氧化鉀、檸檬酸鹽或乙酸鹽、氨基酸及其鹽)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、α-生育酚)、表面活性劑(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚氧乙烯9-10壬基酚、脫氧膽酸鈉)、溶液和/或低溫/冷凍穩定劑(例如，蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖)、滲透調節劑(例如，鹽或糖)、抗菌劑(例如，苯甲酸、苯酚、慶大霉素)、消泡劑(例如，聚二甲基硅氧烷(polydimethylsilozone))、防腐劑(例如，硫柳汞，2-苯氧基乙醇、edta)聚合物穩定劑和黏度調節劑(例如，聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆488、羧甲基纖維素)和助溶劑(例如，甘油、聚乙二醇、乙醇)。
根據本發明的組合物可以包含可藥用的賦形劑。組合物可以使用常規的藥物制備和復合技術以獲得有用的劑型。適合于實施本發明的技術可以在以下中找到：handbookofindustrialmixing：scienceandpractice，edwardl.paul，victora.atiemo-obeng，和suzannem.kresta編，2004johnwiley&sons，inc.；和pharmaceutics：thescienceofdosageformdesign，第2版，m.e.auten編，2001，churchilllivingstone。在一個實施方案中，將組合物與防腐劑一起懸浮在無菌鹽水溶液中以用于注射。
應當理解，本發明的組合物可以以任何合適的方式制備，本發明決不限于可使用本文所述的方法制備的組合物。選擇合適的制備方法可能需要注意所關聯的特定元素的特性。
在一些實施方案中，組合物在無菌條件下制備或在最初或最后滅菌。這可以確保所得組合物是無菌的和非感染性的，因此與非無菌組合物相比提高了安全性。這提供了有價值的安全措施，特別是當接受組合物的對象具有免疫缺陷、患有感染和/或易感染時。在一些實施方案中，組合物可以凍干并以懸浮液或凍干粉末的形式儲存，這取決于用于延長期限而不損失活性的配制策略。
根據本發明的施用可以通過各種途徑，包括但不限于皮內、肌內、皮下、靜脈內和腹膜內途徑。本文所述的組合物可以制造和制備成使用常規方法施用。
本發明的組合物可以以有效量施用，例如本文別處描述的有效量。劑型的劑量可以包含不同量的根據本發明的元素。存在于本發明劑型中的元素的量可以根據其性質、待實現的治療益處和其他此類參數而不同。在一些實施方案中，可以進行劑量范圍研究以確認劑型中所存在的最佳治療量。在一些實施方案中，在向對象施用時，元素以產生期望效果和/或降低的免疫應答的有效量存在于劑型中。可以在對象中使用常規劑量范圍研究和技術來確定實現期望結果的量。本發明的劑型可以以多種頻率施用。在一個實施方案中，本文提供的組合物的至少一次施用足以產生藥理學相關應答。
本公開的另一方面涉及藥盒。在一些實施方案中，藥盒包含本文提供的任何一種組合物。在所提供的任何一種藥盒的一些實施方案中，藥盒包含含有穩定的超飽和量雷帕霉素的合成納米載體。在所提供的任何一種藥盒的一些實施方案中，合成納米載體最初也可無菌過濾。在所提供的任何一種藥盒的另一些實施方案中，藥盒包含本文提供的任何一種量的疏水性聚酯載體材料和本文提供的任何一種量的雷帕霉素。在所提供的任何一種藥盒的一些實施方案中，這種藥盒還包含本文提供的任何一種量的親水-親油平衡(hlb)值小于或等于10的非離子表面活性劑。在所提供的任何一種藥盒的一些實施方案中，藥盒還包含抗原。在所提供的任何一種藥盒的一些實施方案中，組合物或其元素可以包含在藥盒中分開的容器中或同一容器中。在所提供的任何一種藥盒的一些實施方案中，容器是小瓶或安瓿。在所提供的任何一種藥盒的一些實施方案中，組合物或其元素包含在與容器分開的溶液中，使得可以在隨后的時間將組合物或其元素加入到容器中。在所提供的任何一種藥盒的一些實施方案中，組合物或其元素以凍干形式各自分開在容器中或在同一容器中，使得其可以在隨后的時間重構。在所提供的任何一種藥盒的一些實施方案中，藥盒還包括用于重構、混合、施用等的說明書。在所提供的任何一種藥盒的一些實施方案中，說明書包括本文所述方法的描述。說明書可以是任何合適的形式，例如印刷的插入物或標簽。在本文提供的任何一種藥盒的一些實施方案中，藥盒還包含可以在體內將合成納米載體遞送至對象的一個或更多個注射器或其他裝置。
實施例
實施例1-具有超飽和量雷帕霉素的合成納米載體
使用水包油乳液蒸發法合成含有聚合物plga(3∶1丙交酯∶乙交酯，比濃對數黏度0.39dl/g)和pla-peg(5kdapeg嵌段，比濃對數黏度0.36dl/g)以及試劑雷帕霉素(rapa)的納米載體組合物。通過將聚合物和rapa溶解在二氯甲烷中形成有機相。通過在含有表面活性劑聚乙烯醇(pva)的水相中使有機相均化來形成乳液。然后將乳液與更大量的水性緩沖液合并并混合以使溶劑蒸發。改變不同組合物中的rapa含量，使得當rapa含量增加時，組合物越過系統的rapa飽和極限。使用rapa在水相和在分散的納米載體相中的溶解度，計算組合物飽和極限下的rapa含量。對于在水相中含有pva作為主要溶質的組合物，發現rapa在水相中的溶解度與pva濃度成比例，使得rapa在與溶解的pva的質量比為1∶125下可溶。對于含有所述plga和pla-peg作為納米載體聚合物的組合物，發現rapa在分散納米載體相中的溶解度為7.2％wt/wt。以下公式可用于計算在組合物中飽和極限下的rapa含量：
rapa含量＝v(0.008cpva+0.072cpol)
其中cpva是pva的質量濃度，cpol是聚合物的組合質量濃度，v是蒸發結束時納米載體懸浮液的體積。
對于1、2和3，其一致的不能回收60％的rapa，這表明水相和有機相之間的亞飽和平衡狀態(regime)。對于含有較高量的rapa的其余納米載體，其一致的不能回收6.8mgrapa。這種一致的絕對質量損失表明系統處于過飽和狀態(即，在一個或多個相中是超飽和的)。
實施例2-具有超飽和雷帕霉素的合成納米載體消除或延遲抗體產生
使用實施例1中所述的水包油乳液蒸發法合成包含聚合物plga(3∶1丙交酯∶乙交酯，比濃對數黏度0.39dl/g)和pla-peg(5kdapeg嵌段，比濃對數黏度0.36dl/g)以及試劑rapa的納米載體組合物。改變不同組合物中的rapa含量，使得當rapa含量增加時，組合物越過系統的rapa飽和極限。
為了評估組合物誘導免疫耐受性的能力，將小鼠用共同施用的納米載體和匙孔血藍蛋白(klh)每周靜脈內注射三次，然后每周僅用klh進行攻擊。然后在klh攻擊后分析小鼠血清中的klh的抗體。在超飽和狀態下制備的并且具有8％或更高的最終rapa負載的組合物導致不存在針對klh的抗體或所述抗體產生的延遲，其程度大于在飽和或低于飽和度下產生的并且具有5％或更低的最終rapa負載的組合物。
實施例3-具有超飽和量雷帕霉素的合成納米載體
使用實施例1中所述的水包油乳液蒸發法合成含有聚合物pla(比濃對數黏度0.41dl/g)和pla-peg(5kdapeg嵌段，比濃對數黏度0.50dl/g)以及試劑rapa的納米載體組合物。改變不同組合物中的rapa含量，使得當rapa含量增加時，組合物越過系統的rapa飽和極限。使用實施例1中所述的方法計算組合物飽和極限下的rapa含量。對于含有所述pla和pla-peg作為納米載體聚合物的組合物，發現rapa在分散的納米載體相中的溶解度為8.4％wt/wt。以下公式可用于計算組合物飽和極限下的rapa含量：
rapa含量＝v(0.008cpva+0.084cpol)
其中cpva是pva的質量濃度，cpol是聚合物的組合質量濃度，v是蒸發結束時納米載體懸浮液的體積。所有納米載體批次在形成結束時通過0.22μm過濾器過濾。
盡管向納米載體12-15中添加了增加量的rapa，但納米載體中的最終rapa含量并未增加，而過濾器通過量降低。這表明組合物的rapa過飽和，并且過量的rapa在洗滌和/或過濾期間被除去。
實施例4-具有超飽和量雷帕霉素的合成納米載體以比具有飽和量雷帕霉素的合成納米載體以更大的程度延遲抗體產生
使用水包油乳液蒸發法合成含有聚合物pla(比濃對數黏度0.41dl/g)和pla-peg(5kdapeg嵌段，比濃對數黏度0.50dl/g)以及試劑rapa的納米載體組合物。改變不同組合物中的rapa含量，使得一種組合物在系統的rapa飽和極限下制成，并且一種組合物在33％過飽和下制成。在每種情況下，將一半材料通過0.22μm滅菌過濾器過濾，一半保留未過濾。
為了評估組合物誘導免疫耐受性的能力，將小鼠用共同施用的納米載體和klh每周靜脈內注射三次，然后每周僅用klh進行攻擊。然后在三次klh攻擊后分析小鼠血清中的klh抗體。在超飽和狀態下制備的組合物比在飽和下產生的組合更大程度地延遲抗體產生。此外，無論組合物過濾或未過濾，重復攻擊后滴度的延遲和降低都很明顯。
實施例5-更快速的溶劑蒸發和低hlb表面活性劑導致產生具有超飽和量雷帕霉素的也可最初無菌過濾的合成納米載體
材料和方法
比濃對數黏度為0.41dl/g的pla購自evonikindustriesag(rellinghauserstraβe1-11，essen德國)，產品代碼100dl4a。約5,000da的具有甲基醚封端peg嵌段且整體比濃對數黏度為0.50dl/g的pla-peg-ome嵌段共聚物購自evonikindustriesag(rellinghauserstraβe1-11，essen德國)，產品代碼100dlmpeg50005ce。雷帕霉素購自concordbiotechlimited，1482-1486trasadroad，dholka382225，ahmedabad印度。產品代碼sirolimus。
對于樣品1，如下制備溶液：
溶液1：通過將18.75mg/mlpla、6.25mg/mlpla-peg-ome和4.7mg/ml雷帕霉素溶解在二氯甲烷中來制備聚合物和雷帕霉素混合物。溶液2：在100mmph8磷酸鹽緩沖液中以50mg/ml制備pva。
通過將溶液1(1.0ml)和溶液2(3.0ml)在小玻璃壓力管中合并來制備o/w乳液，渦旋混合10秒，然后使用branson數字超聲儀250將浸入冰水浴中的壓力管以30％振幅超聲處理1分鐘。然后將乳液加入到含有dpbs(30ml)的開口的500ml燒杯中。使用與上述相同的材料和方法制備第二o/w乳液，然后添加到含有第一乳液和dpbs的同一容器中。然后將其在室溫下攪拌2小時，以使二氯甲烷蒸發并形成納米載體。通過將納米載體懸浮液轉移到離心管中，在75,600×g和4℃下離心50分鐘，除去上清液，并將沉淀重新懸浮在含有0.25％w/vpva的dpbs中來洗滌一部分納米載體。重復洗滌步驟，然后將沉淀重新懸浮在含有0.25％w/vpva的dpbs中，以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/ml的納米載體懸浮液。在不同的500ml燒杯中制備相同的制劑，進行相同處理，并在即將無菌過濾前與第一制劑合并。然后使用33mm直徑的0.22μmpes膜注射器過濾器(millipore部件號slgp033rb)過濾納米載體懸浮液。然后將過濾的納米載體懸浮液保存在-20℃。
對于樣品2，如下制備溶液：
溶液1：通過將75mg/mlpla、25mg/mlpla-peg-ome和16mg/ml雷帕霉素溶解在二氯甲烷中制備聚合物和雷帕霉素混合物。溶液2：通過將span40以20mg/ml溶解在二氯甲烷中制備山梨聚糖單棕櫚酸酯混合物。溶液3：在100mmph8磷酸鹽緩沖液中以50mg/ml制備聚乙烯醇。溶液4：使用0.20μmptfe膜注射器過濾器(vwr部件號28145-491)過濾二氯甲烷。
通過將溶液1(0.5ml)、溶液2(0.125ml)和溶液4(0.375ml)和溶液3(3.0ml)在小玻璃壓力管中合并制備o/w乳液，渦旋混合10秒，然后使用branson數字超聲儀250將浸入冰水浴中的壓力管以30％振幅超聲處理1分鐘。然后將乳液添加到含有dpbs(30ml)的50ml燒杯中。使用與上述相同的材料和方法制備第二o/w乳液，然后添加到含有第一乳液和dpbs的相同燒杯中。然后以與樣品1相同的方式處理納米載體懸浮液。
對于樣品3，如下制備溶液：
溶液1：通過將37.5mg/mlpla、12.5mg/mlpla-peg-ome和8mg/ml雷帕霉素溶解在二氯甲烷中制備聚合物和雷帕霉素混合物。溶液2：在100mmph8磷酸鹽緩沖液中以75mg/ml制備聚乙烯醇。
通過將溶液1(1ml)和溶液2(3.0ml)在小玻璃壓力管中合并來制備o/w乳液，渦旋混合10秒，然后使用branson數字超聲儀250將浸入冰水浴中的壓力管以30％振幅超聲處理1分鐘。使用與上述樣品1相同的方法形成o/w乳液。在通過超聲處理乳化后，將乳液添加到含有dpbs(30ml)的50ml燒杯中。使用與上述相同的材料和方法制備第二o/w乳液，然后添加到相同的溶劑蒸發容器中。將乳液攪拌2小時以使有機溶劑蒸發并形成納米載體。然后通過將納米載體懸浮液轉移到離心管中并以75,600×g離心50分鐘，除去上清液，并將沉淀重新懸浮在pbs中來洗滌一部分納米載體。重復洗滌步驟，然后將沉淀物重新懸浮在pbs中，以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/ml的納米載體懸浮液。然后使用33mm直徑的0.22μmpes膜注射器過濾器(millipore部件號slgp033rb)過濾納米載體懸浮液。然后將過濾的納米載體懸浮液保存在-20℃。
通過動態光散射確定納米載體尺寸。通過hplc分析測定納米載體中雷帕霉素的量。通過重量法測定每ml懸浮液的總干納米載體質量。
在第0、7和14天用與200μlklh(匙孔血藍蛋白)(其以1mg/ml溶解在pbs中)混合的納米載體靜脈內處理6周齡的c57bl/6雌性小鼠。在第21、28、35和42天，用200μgklh加強小鼠。在第26、40和47天讀取抗klhigg滴度。結果示出在圖4中，并且證明包含穩定的超飽和量雷帕霉素的合成納米載體無論是用快速溶劑蒸發還是用低hlb表面活性劑制備，都顯著降低體內抗原特異性抗體產生。
實施例6-更快速的溶劑蒸發導致合成納米載體提高的過濾能力
材料和方法
對于樣品1、2和4，如下制備溶液：
溶液1：通過將18.8mg/mlpla、6.25mg/mlpla-peg-ome和4.7mg/ml雷帕霉素溶解在二氯甲烷中制備聚合物和雷帕霉素混合物。溶液2：在100mmph8磷酸鹽緩沖液中以50mg/ml制備聚乙烯醇。
以與上述實施例5樣品1類似的方式形成o/w乳液。超聲處理之后，將乳液添加到含有dpbs(30ml)的燒杯中。使用與上述相同的材料和方法制備第二o/w乳液，然后添加到含有第一乳液和dpbs的同一容器中。樣品1使用50ml燒杯，樣品2使用250ml燒杯，樣品4使用125mm蒸發皿。對于每個批次，使用相同尺寸和類型的新溶劑蒸發容器重復雙重單乳液，并在洗滌步驟之后與第一個合并。然后以與實施例5樣品1相同的方式處理納米載體懸浮液。
通過動態光散射確定納米載體尺寸。通過hplc分析測定納米載體中雷帕霉素的量。通過重量法測定每ml懸浮液的總干納米載體質量。通過0.22μm的過濾器，將以g/m2計的納米載體質量測量為過濾器通過量。另外，在加入制劑中的聚合物的標稱濃度為10mg/ml時，該溶液可能僅通過一個具有4.5cm的過濾器表面積的33mm0.22μmpes膜注射器過濾器。通過測量經過與制劑相同時間(2小時)，從含有36mlse緩沖液的相同溶劑蒸發容器中損失的水來計算從燒杯蒸發的溶劑的百分比。然后從制劑中測量的損失中減去水損失(g)，以計算二氯甲烷有機溶劑的蒸發。
實施例7-確定超飽和度的方法
材料和方法
比濃對數黏度為0.41dl/g的pla購自evonikindustriesag(rellinghauserstraβe1-11，essen德國)，產品代碼100dl4a。雷帕霉素購自concordbiotechlimited，1482-1486trasadroad，dholka382225，ahmedabad印度。產品代碼sirolimus。
如下制備溶液：
溶液1：通過將pla以100mg/ml溶解在二氯甲烷中來制備聚合物溶液。溶液2：通過將雷帕霉素以100mg/ml溶解在二氯甲烷溶解來制備雷帕霉素溶液。
用70％異丙醇清洗玻璃顯微鏡載玻片，使其在化學通風櫥的干凈平坦表面上干燥。通過將100μl溶液1與100μl二氯甲烷在具有耐溶劑螺旋蓋的玻璃小瓶中混合并通過渦旋混合來制備混合物1。使用與混合物1相同的方法，用100μl溶液1、33.3μl溶液2和66.7μl二氯甲烷制備混合物2。使用與混合物1相同的方法，用100μl溶液1、66.7μl溶液2和33.3μl二氯甲烷制備混合物3。接下來，將50μl的每種混合物施加到干凈的玻璃載片上的分開的位置，并使其在通風櫥中在室溫下干燥過夜。拍攝每張干膜的數字圖像，并使用圖像分析軟件進行分析。歸一化的平均強度增加可以示出，膜在飽和點以上變得不透明。
實施例8-低hlb表面活性劑sm提高rapa負載和合成納米載體過濾能力
使用水包油乳液蒸發法，在添加或不添加低hlb表面活性劑山梨聚糖單棕櫚酸酯(sorbitanmonopalmitate，sm)的情況下合成包含聚合物pla(比濃對數黏度(inherentviscosity)為0.41dl/g)和pla-peg(5kdapeg嵌段，比濃對數黏度為0.50dl/g)以及疏水性藥物雷帕霉素(rapa)的納米載體組合物。通過將聚合物和rapa溶解在二氯甲烷中形成有機相。通過使用探針尖超聲儀將含有表面活性劑pva的水相中的有機相均化來形成乳液。然后將乳液與更大量的水性緩沖液合并并且混合以允許溶解和溶劑蒸發。將所得納米載體洗滌并通過0.22μm過濾器過濾。所有組合物含有100mg聚合物。不同組合物的rapa含量不同。
對于不包含表面活性劑sm的組合物(樣品1、2和3)，隨著rapa的添加量的增加，觀察到將rapa完全并入納米載體組合物中的能力受限的幾個跡象。在不存在sm的情況下，較高rapa配制水平下過濾前后納米載體尺寸之間增加的差異表明在洗滌和/或過濾過程期間存在被除去的較大顆粒(單個顆粒或聚集體)。堵塞前降低的過濾器通過量也表明了這一點。最后，向沒有sm的納米載體組合物中加入增加量的rapa不會導致增加的rapa負載(例如，樣品1與樣品3相比)，表明額外的rapa可與納米載體本體分離，并在洗滌和/或過濾步驟中除去。
相比之下，含有表面活性劑sm的組合物容易并入增加量的rapa。納米載體尺寸不受過濾的影響，并且增加添加到組合物中的rapa的量導致納米載體的rapa負載增加。在最高負載水平(樣品6)觀察到過濾器通過量的一些降低，但這可能是由于固有地較大的納米載體尺寸。總之，sm的并入有助于提高合成納米載體組合物的rapa負載和過濾能力。
實施例9-sm和膽固醇增加rapa負載和過濾能力
使用如實施例8所述的材料和方法制備納米載體組合物。制備含有聚合物和rapa的納米載體，其具有不同的rapa負載水平。另外，也使用賦形劑——表面活性劑sm或膽固醇，以賦形劑：rapa質量比為3.2∶1來制備rapa高度負載的納米載體。
在不存在賦形劑的情況下制備的納米載體的樣品(樣品7和8)證明，超過表觀納米載體飽和點的rapa負載的增加傾向于導致過濾器通過量的降低。添加sm或膽固醇導致產生更大的rapa負載，同時保持穩定性(樣品9和10)。
為了評估組合物誘導免疫耐受的能力，用共同施用的納米載體和klh(匙孔血藍蛋白)以相同的rapa劑量對小鼠每周靜脈內注射三次，然后每周僅用klh進行攻擊。然后在每次klh攻擊后，分析小鼠的血清中klh的抗體(圖6)。
雖然接受rapa納米載體治療的所有小鼠接受相同劑量的rapa，但不同組對klh顯示不同程度的耐受性。接受具有最低負載的納米載體組合物(樣品7)的所有5只小鼠在第三次klh攻擊后(第40天)具有可定量滴度的抗khl抗體。與僅接受pbs的小鼠相比，該組小鼠產生的抗klh抗體滴度降低，但與其他納米載體組相比表現出最小的耐受性。在不存在賦形劑(sm或膽固醇)(樣品8)的情況下，增加納米載體的rapa負載顯著改善耐受性，5只小鼠中僅有2只在3次klh攻擊后(第40天)表現出可定量滴度。含有膽固醇作為賦形劑的組合物(樣品10)盡管納米載體的rapa負載量高，但導致五只小鼠中的四只在僅僅兩次攻擊之后(第33天)表現出顯著的抗klh抗體滴度。含有sm的納米載體組合物(樣品9)表現出制備中的高通過量0.22μm過濾器通過量和優異的耐受性，其中五只小鼠中只有一只在三次klh攻擊后(第40天)表現出可定量的抗klh抗體滴度。該研究的結果表明，兩種賦形劑(sm和膽固醇)都能夠提高納米載體的負載，與耐受性誘導性能和通過過濾通過量指示的加工有利性一致。低hlb表面活性劑sm提供了提高納米載體穩定性所需的特征，并表現出較高的性能。
實施例10-低hlb表面活性劑對rapa負載和過濾能力的影響
材料和方法
比濃對數黏度為0.41dl/g的pla購自lakeshorebiomaterials(756tommartindrive，birmingham，al35211)，產品代碼100dl4a。約5,000da的具有甲基醚封端peg嵌段且整體比濃對數黏度為0.50dl/g的pla-peg-ome嵌段共聚物購自lakeshorebiomaterials(756tommartindrive，birmingham，al35211)，產品代碼100dlmpeg50005ce。雷帕霉素購自concordbiotechlimited(1482-1486trasadroad，dholka382225，ahmedabad印度)，產品代碼sirolimus。
對于樣品11，如下制備溶液：
溶液1：通過將75mg/mlpla、25mg/mlpla-peg-ome和16mg/ml雷帕霉素溶解在二氯甲烷中制備聚合物和雷帕霉素混合物。溶液2：通過將80mg/ml聚山梨酯80溶解在二氯甲烷中制備聚山梨醇酯80混合物。溶液3：在100mmph8磷酸鹽緩沖液中以50mg/ml制備聚乙烯醇。
通過將溶液1(0.5ml)、溶液2(0.1ml)、二氯甲烷(0.4ml)和溶液3(3.0ml)在小玻璃壓力管中合并，渦旋混合10秒，然后使用branson數字超聲儀250將浸入在冰浴中的壓力管以30％振幅超聲處理1分鐘來制備o/w乳液。然后將乳液加入到含有dpbs(30ml)的50ml燒杯中。使用與上述相同的材料和方法制備第二o/w乳液，然后加入到含有第一乳液和dpbs的同一容器中。然后將其在室溫下攪拌2小時，以使二氯甲烷蒸發并形成納米載體。通過將納米載體懸浮液轉移到離心管中并在75,600×g和4℃下離心50分鐘，除去上清液，并將沉淀重新懸浮在含有0.25％w/vpva的dpbs中來洗滌一部分納米載體。重復洗滌步驟，然后將沉淀重新懸浮在含有0.25％w/vpva的dpbs中，以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/ml的納米載體懸浮液。然后使用0.22μmpes膜注射器過濾器(millipore部件號slgp033rb)過濾納米載體懸浮液。然后將過濾的納米載體懸浮液保存在-20℃。
對于樣品12-25，如下制備溶液：
溶液1：通過將75mg/mlpla、25mg/mlpla-peg-ome和16mg/ml雷帕霉素溶解在二氯甲烷中制備聚合物和雷帕霉素混合物。溶液2：通過將5.0mg/mlhlb表面活性劑溶解在二氯甲烷中制備hlb混合物。hlb表面活性劑包括span20、span40、span60、span80、辛基β-d-吡喃葡糖苷、油酸、棕櫚酸異丙酯、brij52、brij93、pluronicl-31、pluronicp-123、棕櫚酸、dl-α-棕櫚酸甘油酯和三棕櫚酸甘油酯。溶液3：在100mmph8磷酸鹽緩沖液中以62.5mg/ml制備聚乙烯醇。
通過將溶液1(0.5ml)、溶液2(0.5ml)和溶液3(3.0ml)在小玻璃壓力管中合并，渦旋混合10秒，然后使用branson數字超聲儀250將浸入在冰浴中的壓力管以30％振幅超聲處理1分鐘來制備o/w乳液。然后將乳液加入到含有dpbs(30ml)的50ml燒杯中。使用與上述相同的材料和方法制備第二o/w乳液，然后加入到含有第一乳液和dpbs的同一容器中。然后將其在室溫下攪拌2小時，以使二氯甲烷蒸發并形成納米載體。通過將納米載體懸浮液轉移到離心管中并在75,600×g和4℃下離心50分鐘，除去上清液，并將沉淀重新懸浮在含有0.25％w/vpva的dpbs中來洗滌一部分納米載體。重復洗滌步驟，然后將沉淀重新懸浮在含有0.25％w/vpva的dpbs中，以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/ml的納米載體懸浮液。然后使用0.22μmpes膜注射器過濾器(millipore部件號slgp033rb)過濾納米載體懸浮液。然后將過濾的納米載體懸浮液保存在-20℃。
對于大部分低hlb表面活性劑，hlb是使用可公開獲得的信息確定的。對于dl-α-棕櫚酸甘油酯，使用下式計算hlb：mw＝330.5g/mol，親水部分＝119.0g/mol；hlb＝119.0/330.5＊100/5＝7.2。對于棕櫚酸甘油酯，使用下式計算hlb：mw＝807.3g/mol，親水部分＝173.0g/mol；hlb＝173.0/807.3＊100/5＝4.3。對于棕櫚酸異丙酯，使用下式計算hlb：mw＝298.5g/mol，親水部分＝44.0g/mol；hlb＝44.0/298.5＊100/5＝2.9。對于油醇，使用下式計算hlb：mw＝268.5g/mol，親水部分＝17.0g/mol；hlb＝17.0/268.5＊100/5＝1.3。此外，通過萃取后經由hplc方法進行定量來測定低hlb表面活性劑的負載。
在注入動物之前，將批量納米載體懸浮液在室溫水浴中解凍30分鐘。用dpbs稀釋納米載體以達到278μg/ml雷帕霉素的期望濃度。在第0、7和14天對6周齡的c57bl/6雌性小鼠用與130μl10xklh(匙孔血藍蛋白)混合的納米載體(1.17ml)靜脈內處理。在第21、28、35和42天，用200μgklh對小鼠加強。在第40、47和61天讀取抗klhigg滴度(通過elisa測量)。結果表明，低hlb表面活性劑可以導致產生顯著的雷帕霉素負載和合成納米載體過濾能力。此外，如圖7所示，所有具有低hlb表面活性劑的納米載體導致抗體滴度降低至少40和47天。
實施例11-低hlb表面活性劑對合成納米載體過濾能力的影響
材料和方法
約5,000da的具有甲基醚封端peg嵌段且整體比濃對數黏度為0.50dl/g的pla-peg-ome嵌段共聚物購自evonikindustries(rellinghauserstraβe1-1145128essen，德國)，產品代碼100dlmpeg50005ce。比濃對數黏度為0.41dl/g的pla購自evonikindustries(rellinghauserstraβe1-1145128essen德國)，產品代碼100dl4a。雷帕霉素購自concordbiotechlimited，1482-1486trasadroad，dholka382225，ahmedabad印度，產品代碼sirolimus。山梨聚糖單棕櫚酸酯購自croda(315cherrylanenewcastledelaware19720)，產品代碼span40。二氯甲烷購自spectrum(14422ssanpedrogardenaca，90248-2027)。部件號m1266。
如下制備溶液：
溶液1：通過將50mg/1mlpla-peg-ome(100dlmpeg50005ce)和150mg/mlpla(100dl4a)溶解在二氯甲烷中來制備聚合物混合物。溶液2：將雷帕霉素以160mg/1ml溶解在二氯甲烷中。溶液5：將山梨聚糖單棕櫚酸酯(span40)以50mg/ml溶解在二氯甲烷中。溶液6：使用0.2μmptfe膜注射器過濾器(vwr部件號28145-491)進行無菌過濾的二氯甲烷。溶液7：通過將聚乙烯醇(
對于樣品26，通過將溶液1(0.5ml)、溶液2(0.1ml)、溶液5(0.1ml)和溶液6(0.30ml)在小玻璃壓力管中合并來制備o/w乳液。通過重復移液將溶液混合。接下來，添加溶液7(3.0ml)，將制劑渦旋混合10秒。然后在壓力管浸入在冰浴中的情況下將制劑以30％振幅超聲處理1分鐘。然后將乳液加入到含有lonzadpbs(30ml)的開口的50ml燒杯中。然后將其在室溫下攪拌2小時，以使二氯甲烷蒸發并形成納米載體。通過將納米載體懸浮液轉移到離心管中，在75,600×g和4℃下離心50分鐘，除去上清液，并將沉淀重新懸浮在溶液8中來洗滌一部分納米載體。重復洗滌步驟，然后將沉淀重新懸浮在溶液8中，以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/ml的納米載體懸浮液。使用0.22μmpes膜注射器過濾器(millex部件號slgp033rs)過濾納米載體制劑。測量納米載體溶液過濾器通過量的質量。然后將過濾的納米載體溶液儲存在-20℃。
對于樣品27，通過將溶液1(0.5ml)、溶液2(0.1ml)和溶液6(0.40ml)在小玻璃壓力管中合并來制備o/w乳液。通過重復移液將溶液混合。接下來，加入溶液7(3.0ml)，將制劑渦旋混合10秒。然后在壓力管浸入在冰浴中的情況下將制劑以30％振幅超聲處理1分鐘。然后將乳液加入到含有lonzadpbs(30ml)的開口的50ml燒杯中。然后將其在室溫下攪拌2小時，以使二氯甲烷蒸發并形成納米載體。通過將納米載體懸浮液轉移到離心管中，在75,600×g和4℃下離心50分鐘，除去上清液，并將沉淀重新懸浮在溶液8中來洗滌一部分納米載體。重復洗滌步驟，然后將沉淀重新懸浮在溶液8中，以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/ml的納米載體懸浮液。使用0.22μmpes膜注射器過濾器(millex部件號slgp033rs)過濾納米載體制劑。測量納米載體溶液過濾器通過量的質量。然后將過濾的納米載體溶液儲存在-20℃。
通過動態光散射確定納米載體尺寸。通過hplc分析測定納米載體中的雷帕霉素的量。通過重量法測定每ml懸浮液的總干納米載體質量。通過穿過第一過濾器的濾液量來評估過濾能力。
數據顯示，對于雷帕霉素，將span40并入合成納米載體導致合成納米載體組合物的過濾能力提高。
實施例12-span40大大提高了包含聚酯聚合物的合成納米載體的過濾能力
材料和方法
比濃對數黏度為0.41dl/g的pla(100dl4a)購自evonikindustriesag(rellinghauserstraβe1-11，essen德國)，產品代碼100dl4a。約5,000da的具有甲基醚封端peg嵌段且整體比濃對數黏度為0.50dl/g的pla-peg-ome嵌段共聚物購自evonikindustriesag(rellinghauserstraβe1-11，essen德國)，產品代碼100dlmpeg50005ce。雷帕霉素購自concordbiotechlimited(1482-1486trasadroad，dholka382225，ahmedabad印度)，產品代碼sirolimus。
對于樣品1、3、5和7，如下制備溶液：
溶液1：將50mg/mlpla-peg-ome、10mg/mlspan40和32mg/ml雷帕霉素溶解在二氯甲烷中。溶液2：將100dl4a以150mg/ml溶解在二氯甲烷中。溶液3：將5050dlg2.5a以150mg/ml溶解在二氯甲烷中。溶液4：將7525dlg4a以150mg/ml溶解在二氯甲烷中。溶液5：將pcl以150mg/ml溶解在二氯甲烷中。溶液6：在100mmph8磷酸鹽緩沖液中以75mg/ml制備pva。
通過將溶液1(0.5ml)轉移到厚壁玻璃壓力管中制備o/w乳液。向其中第1批加入溶液2(0.5ml)，第3批加入溶液3(0.5ml)，第5批加入4(0.5ml)，第7批加入溶液5(0.5ml)。然后通過重復移液將兩種溶液混合。接下來，加入溶液6(3.0ml)，將管渦旋混合10秒，然后在壓力管浸入在冰水浴中的情況下通過使用branson數字超聲儀250以30％振幅超聲處理1分鐘來進行乳化。然后將乳液加入到含有dpbs(30ml)的50ml燒杯中。然后將其在室溫下攪拌2小時，以使二氯甲烷蒸發并形成納米載體。通過將納米載體懸浮液轉移到離心管中并以75,600×g離心50分鐘，除去上清液，將沉淀重新懸浮在dpbs中來洗滌一部分納米載體。重復洗滌步驟，然后將沉淀重新懸浮在dpbs中，以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/ml的納米載體懸浮液。然后使用0.22μmpes膜注射器過濾器(millipore部件號slgp033rb)過濾納米載體懸浮液，并且如果需要，使用0.45μmpes膜注射器過濾器(pall部件號4614)和/或1.2μmpes膜注射器過濾器(pall部件號4656)來過濾。然后將過濾的納米載體懸浮液儲存在-20℃。
通過動態光散射確定納米載體尺寸。通過hplc分析測定納米載體中雷帕霉素的量。通過將第一無菌0.22μm過濾器的流量的重量與產率進行比較，以確定在阻塞過濾器之前所通過的納米載體的實際質量，或通過第一且唯一的過濾器的總量，從而來確定過濾能力。通過重量法測定每ml懸浮液的總干納米載體質量。
對于樣品2、4、6和8，如下制備溶液：
溶液1：通過將50mg/mlpla-peg-ome和32mg/ml雷帕霉素溶解在二氯甲烷中來制備聚合物和雷帕霉素混合物。溶液2：將100dl4a以150mg/ml溶解在二氯甲烷中。溶液3：將5050dlg2.5a以150mg/ml溶解在二氯甲烷中。溶液4：將7525dlg4a以150mg/ml溶解在二氯甲烷中。溶液5：將pcl以150mg/ml溶解在二氯甲烷中。溶液6：在100mmph8磷酸鹽緩沖液中以75mg/ml制備pva。
通過將溶液1(0.5ml)轉移到厚壁玻璃壓力管中制備o/w乳液。向其中第2批加入溶液2(0.5ml)，第4批加入溶液3(0.5ml)，第6批加入4(0.5ml)，第8批加入溶液5(0.5ml)。然后通過重復移液將兩種溶液混合。pva溶液的添加、洗滌、過濾和儲存與上述相同。
納米尺寸的評估與上述相同。
結果顯示，在合成納米載體中，包含span40的含有聚酯聚合物的合成納米載體的過濾能力顯著提高。
實施例13-具有低hlb表面活性劑和顯著的rapa負載的合成納米載體導致產生持久的抗原特異性耐受性
材料和方法
比濃對數黏度為0.41dl/g的pla購自lakeshorebiomaterials(756tommartindrive，birmingham，al35211)，產品代碼100dl4a。約5,000da的具有甲基醚封端peg嵌段且整體比濃對數黏度為0.50dl/g的pla-peg-ome嵌段共聚物購自lakeshorebiomaterials(756tommartindrive，birmingham，al35211)，產品代碼100dlmpeg50005ce。雷帕霉素購自concordbiotechlimited(1482-1486trasadroad，dholka382225，ahmedabad印度)，產品代碼sirolimus。山梨聚糖單棕櫚酸酯購自sigma-aldrich(3050sprucest.，st.louis，mo63103)，產品代碼388920。
如下制備溶液：
溶液1：通過將37.5mg/mlpla、12.5mg/mlpla-peg-ome、8mg/ml雷帕霉素和2.5山梨聚糖單棕櫚酸酯溶解在二氯甲烷中來制備聚合物、雷帕霉素和山梨聚糖單棕櫚酸酯混合物。溶液2：在100mmph8磷酸鹽緩沖液中以50mg/ml制備聚乙烯醇。
通過將溶液1(1.0ml)和溶液2(3ml)在小玻璃壓力管中合并、渦旋混合10秒來制備o/w乳液。然后通過以30％振幅超聲處理將制劑均化1分鐘。然后將乳液加入到含有dpbs(30ml)的開口燒杯中。使用與上述相同的材料和方法制備第二o/w乳液，然后加入到含有第一乳液和dpbs的相同燒杯中。然后將合并的乳液在室溫下攪拌2小時，使二氯甲烷蒸發并形成納米載體。通過將納米載體懸浮液轉移到離心管中，在75,600×g和4℃下離心50分鐘，除去上清液，并將沉淀重新懸浮在含有0.25％w/vpva的dpbs中來洗滌一部分納米載體。重復洗滌步驟，然后將沉淀重新懸浮在含有0.25％w/vpva的dpbs中，以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/ml的納米載體懸浮液。然后使用0.22μmpes膜注射器過濾器(millipore部件號slgp033rb)過濾納米載體懸浮液。然后將過濾的納米載體懸浮液儲存在-20℃。
通過動態光散射確定納米載體尺寸。通過hplc分析測定納米載體中雷帕霉素的量。通過重量法測定每ml懸浮液的總干納米載體質量。
評估合成納米載體與游離雷帕霉素相比誘導針對模型抗原klh的持久性免疫耐受性的能力。在第0、7和14天，用pbs(組1)、單獨或與klh混合的50μg(～2mg/kg)游離雷帕霉素(分別為組2和組3)，或者單獨(組6)或與klh混合(組7和8)的包封在合成納米載體中的50μg雷帕霉素向幼稚c57bl/6小鼠組(每組n＝10)靜脈內給藥(圖8)。為了確定長期雷帕霉素施用的效果，組4從第0天至第20天每周5次接受單獨的游離雷帕霉素(50μg/天)或者每周一次與klh組合施用(組5)。隨后在第21、28和35天用200μgklh對所有組進行攻擊。在第35和42天(分別在2次和3次注射后)收集血清，并測定抗klh抗體應答。如通過elisa測定的，將效力評估為抗klh抗體滴度的ec50。圖9示出了方案。
在第35天和第42天，分別為klh的2和3次攻擊注射后，對照pbs處理的小鼠產生高水平的抗klh抗體。在不存在klh的情況下，用游離雷帕霉素(每周或每日)處理的小鼠產生與pbs處理組相似水平的抗klh抗體。僅用合成納米載體或每日用游離雷帕霉素和klh處理的小鼠與pbs對照組相比顯示延遲的應答，但每次用klh攻擊時滴度均升高。這些結果表明，僅使用合成納米載體處理不誘導長期免疫抑制，并且在klh與每日的游離雷帕霉素共同施用的情況下，即使5倍的在合成納米載體中施用之雷帕霉素的總每周劑量下，也不誘導持久的免疫耐受性。
相比之下，即使在接受每周三次的處理后klh攻擊(總計6klh注射)后，用含有顯著量雷帕霉素的合成納米載體+klh(組7和8)處理的小鼠也幾乎沒有或沒有可檢測的抗klh抗體，表明持久性免疫耐受。兩批次的合成納米載體效果類似。除了用合成納米載體+klh處理的那些組外，所有組在第42天出現了過敏反應。這些結果表明，通過用包含顯著量雷帕霉素的合成納米載體和klh處理所誘導的針對klh的耐受阻止了超敏反應的發生。
為了評估對klh的耐受性的抗原特異性，在第49和56天在后肢用ova+cpgs.c.(35μg+20μg)攻擊所有動物。圖10顯示所有動物產生了針對ova的類似水平的滴度，表明抗原與合成納米載體的伴隨施用可以產生免疫耐受性，并且合成納米載體處理不誘導長期免疫抑制。這些結果表明納米載體包封的(而不是游離的)雷帕霉素(當大量存在時)在與靶抗原伴隨施用時誘導持久和抗原特異性的免疫耐受。
實施例14-span40提高雷帕霉素的過濾能力
材料和方法
比濃對數黏度為0.41dl/g的pla購自evonikindustriesag(rellinghauserstraβe1-11，essen德國)，產品代碼100dl4a。約5,000da的具有甲基醚封端peg嵌段且整體比濃對數黏度為0.50dl/g的pla-peg-ome嵌段共聚物購自evonikindustriesag(rellinghauserstraβe1-11，essen德國)，產品代碼100dlmpeg50005ce。雷帕霉素購自concordbiotechlimited(1482-1486trasadroad，dholka382225，ahmedabad印度)，產品代碼sirolimus。
如下制備溶液。溶液1：通過溶解150mg/mlpla和50mg/mlpla-peg-ome制備聚合物和雷帕霉素混合物。溶液2：在二氯甲烷中以100mg/ml制備雷帕霉素溶液。溶液6：通過將span40以50mg/ml溶解在二氯甲烷中制備山梨糖醇單棕櫚酸酯溶液。溶液7：在100mmph8磷酸鹽緩沖液中以75mg/ml制備聚乙烯醇。
通過將溶液1(0.5ml)加入到厚壁壓力管中制備o/w乳液。對于批次1，將其與溶液6(0.1ml)和二氯甲烷(0.28ml)合并。然后將第1批與這些以及溶液2(0.12ml)合并。以類似的方式，將批次2與二氯甲烷(0.38ml)合并，然后將第2批與溶液2(0.12ml)合并。因此，對于每個單獨的批次，有機相的總體積為1ml。通過重復移液將合并的有機相溶液混合。接下來，加入溶液7(3.0ml)，將壓力管渦旋混合10秒，然后使用branson數字超聲儀250將浸入冰水浴中的壓力管以30％振幅超聲處理1分鐘。然后將乳液加入到含有dpbs(30ml)的50ml燒杯中。然后將其在室溫下攪拌2小時，以使二氯甲烷快速蒸發以形成納米載體。通過將納米載體懸浮液轉移到離心管中并且在75,600×g和4℃下離心50分鐘，除去上清液，并將沉淀重新懸浮在含有0.25％w/vpva的dpbs中來洗滌一部分納米載體。重復洗滌步驟，然后將沉淀重新懸浮在含有0.25％w/vpva的dpbs中，以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/ml的納米載體懸浮液。然后使用0.22μmpes膜注射器過濾器(millipore部件號slgp033rb)過濾納米載體懸浮液。然后將過濾的納米載體懸浮液保存在-20℃。
結果表明，在合成納米載體中并入span40增加了雷帕霉素的過濾能力。
實施例15-顯示組分的量對雷帕霉素負荷和合成納米載體過濾能力的影響材料和方法
約5,000da的具有甲基醚封端peg嵌段且整體比濃對數黏度為0.50dl/g的pla-peg-ome嵌段共聚物購自evonikindustries(rellinghauserstraβe1-1145128essen，德國)，產品代碼100dlmpeg50005ce。比濃對數黏度為0.41dl/g的pla購自evonikindustries(rellinghauserstraβe1-1145128essen德國)，產品代碼100dl4a。雷帕霉素購自concordbiotechlimited，1482-1486trasadroad，dholka382225，ahmedabad印度。產品代碼sirolimus。山梨聚糖單棕櫚酸酯購自croda(315cherrylanenewcastledelaware19720)，產品代碼span40。二氯甲烷購自spectrum(14422ssanpedrogardenaca，90248-2027)。部件號m1266。
如下制備溶液：
聚合物溶液：通過以pla-peg比pla的1∶3的比率，將pla-peg-ome(100dlmpeg50005ce)和pla(100dl4a)以指定的mg/1ml溶解在二氯甲烷中來制備聚合物混合物。雷帕霉素溶液：將雷帕霉素以指示的mg/ml溶解在二氯甲烷中。span40溶液：將山梨聚糖單棕櫚酸酯(span40)以指示的mg/ml溶解在二氯甲烷中。ch2cl2溶液：使用0.2μmptfe膜注射器過濾器(vwr部件號28145-491)無菌過濾二氯甲烷(ch2cl2)。pva溶液：通過將聚乙烯醇(
通過將聚合物溶液、雷帕霉素溶液、span40溶液和/或ch2c12溶液在厚壁玻璃壓力管中合并(總體積1-2ml)來制備o/w乳液。通過重復移液將溶液混合。接下來，加入pva溶液(3至6ml)(作為具有1ml有機相和3mlpva水溶液的單一乳液，或作為依次制備的兩個單一乳液)。將制劑渦旋混合十秒鐘，然后在壓力管浸入在冰浴中的情況下以30％振幅超聲處理1分鐘。然后將乳液加入到含有lonzadpbs(30ml)的開口的50ml燒杯中。然后將其在室溫下攪拌2小時，以使二氯甲烷蒸發并形成納米載體。通過將納米載體懸浮液轉移到離心管中并在75,600×g和4℃下離心50分鐘，除去上清液，并將沉淀重新懸浮在dpbspva溶液中來洗滌一部分納米載體。重復洗滌步驟，然后將沉淀重新懸浮在dpbspva溶液中，以獲得基于聚合物的標稱濃度為10mg/ml的納米載體懸浮液。使用0.22μmpes膜注射器過濾器(millex部件號slgp033rs)過濾納米載體制劑。測量納米載體溶液過濾器通過量的質量。然后將過濾的納米載體溶液儲存在-20℃。
過濾能力以所測量的通過一個33mmpes膜0.22μm注射器過濾器(來自millipore，部件號slgp033rb)之納米載體的g/m2濾膜表面積給出。
結果表明，許多合成納米載體中的多種組分的量可導致產生具有預期體內有效量之雷帕霉素的初始可無菌過濾的合成納米載體。
a這些制劑以2ml有機相、6mlpva溶液制備。
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