乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體在制備或篩選治療腫瘤的藥物中的用途的制作方法

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體在制備或篩選治療腫瘤的藥物中的用途，所述治療腫瘤的藥物為口服給藥藥物。

背景技術：

80年代以來，在世界各地癌癥研究領域大量研究表明乙酰膽堿酶酶(ache)和丁酰膽堿酯酶(bche)在癌癥相關組織中表達量降低或活性降低。在各種癌癥中如神經系統，呼吸道，消化道，肝，胰腺相關癌癥中都伴隨乙酰膽堿酯酶表達量下降或活性降低；生殖泌尿系統如腎，膀胱，宮頸，卵巢，乳房，前列腺癌，皮膚，軟組織和血液系統相關腫瘤，ache或bche酶活性或其基因結構功能是缺損的；血液腫瘤病人組織中ache，bche酶活性越低，病人預后越差。

近年研究表明乙酰膽堿除了神經遞質的功能外還是一種內源性的生長激素，乙酰膽堿受體的過量表達或激動效應會誘導癌癥的發生，這一現象在吸煙引發的癌癥中尤其顯著，這提示我們乙酰膽堿過分積累或乙酰膽堿受體的過分激動效應會引發癌癥。

乙酰膽堿酯酶在神經遞質乙酰膽堿的循環過程中起到了非常重要的作用，可以迅速水解神經突觸中積累的乙酰膽堿從而維持正常的神經傳遞功能；近代的研究表明乙酰膽堿酯酶參與了眾多的細胞功能，如細胞黏附、細胞分化和細胞增殖等；乙酰膽堿酯酶是一種細胞凋亡的標志物，提示乙酰膽堿酯酶可能參與了細胞的凋亡；通過基因敲減的方式降低乙酰膽堿酯酶表達可以增強腫瘤細胞的抗凋亡和增殖活性；乙酰膽堿酯酶的抑制劑可以降低細胞凋亡和促進增殖，這些研究結果表明乙酰膽堿酯酶在細胞的凋亡和增殖過程中起到了非常重要的作用。乙酰膽堿酯酶是一個抑癌基因，在很多癌種細胞系中表達乙酰膽堿酯酶可以抑制癌細胞的增殖并誘導凋亡。乙酰膽堿酯酶參與凋亡小體的形成，2004年，park等人揭示了乙酰膽堿酯酶在凋亡小體的形成過程中的作用。

基于以上事實，2008年沈等人提出乙酰膽堿酯酶表達量降低或活性降低導致乙酰膽堿在不同的組織和器官中積累引起微環境的平衡失調可能是造成癌癥發生的原因。因此，通過補充外源性的乙酰膽堿酯酶來調整乙酰膽堿的平衡來達到預防和治療癌癥的方法是科學的和可驗證的。乙酰膽堿酯酶價格昂貴，并且只能通過靜脈注射；本發明提出一種利用殼聚糖納米顆粒作為表達乙酰膽堿酯酶的載體，通過口服的方式來達到預防和治療癌癥的方法，價格便宜，通過口服的方式提高了病人的依從性。

現有技術中有利用病毒將乙酰膽堿酯酶在動物體內進行表達，從而對腫瘤有抑制的作用。但是通過病毒引進外源基因表達，需要將基因在動物體內的染色體內進行重組插入，從而存在破壞動物體自身基因，甚至引發動物致癌基因突變的可能性。同時，病毒作為基因載體，有很多不安全的因素，例如免疫原性、病毒傳染性，病毒重組性等問題。

技術實現要素：

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體在制備或篩選治療腫瘤的藥物中的用途，所述治療腫瘤的藥物為口服給藥藥物，用于解決現有技術中的問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明第一方面提供乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體在制備或篩選治療腫瘤的藥物中的用途，所述治療腫瘤的藥物為口服給藥藥物。

乙酰膽堿酯酶在臨床上顯示出和腫瘤惡性程度有很強的相關性，同時現有技術中也有文章表明在體內增加乙酰膽堿酯酶可以起到預防和治療腫瘤的效果。但是由于乙酰膽堿酯酶蛋白的極度不穩定，所以體內基因表達的方式成為了唯一可以增加蛋白量的途徑。現有技術中通過病毒的方式把乙酰膽堿酯酶基因引入小鼠體內并觀察到了腫瘤的抑制。但是，病毒因為其感染性，免疫原性，重組性等問題，被認為不是一個好的基因載體。本發明將乙酰膽堿酯酶基因克隆到表達載體中，并通過口服的方式在體內進行表達，提供了一種更安全，方便的給藥方式。

本發明所提供的用途中，治療一詞包括可導致欲求的藥學和/或生理效果的防止性(即，預防性)、治愈性或緩和性處置。該效果較佳是指醫療上可減少腫瘤的一種或多種癥狀或者完全消除腫瘤，或阻滯、延遲腫瘤發生(即腫瘤臨床表現前的階段)和/或降低腫瘤發展或惡化的風險。

本發明所提供的用途中，口服給藥是指藥物經口服后被胃腸道吸收入血，通過血液循環到達局部或全身組織，達到治療疾病的目的。對于口服藥物，藥物吸收可以始于口腔和胃，但大部分由小腸吸收，藥物必須通過小腸壁及肝臟方能進入全身血循環。口服給藥藥物具有使用簡便、費用低廉等優點，通常也最安全。

具體的，所述乙酰膽堿酯酶的突變體指與乙酰膽堿酯酶具有80％以上同源性，優選具有90％以上同源性，更優選具有95％以上同源性，且具有乙酰膽堿酯酶的功能、或更優于乙酰膽堿酯酶的功能的多肽。

具體的，所述丁酰膽堿酯酶的突變體指與丁酰膽堿酯酶具有80％以上同源性，優選具有 90％以上同源性，更優選具有95％以上同源性，且具有丁酰膽堿酯酶的功能、或更優于乙酰膽堿酯酶的功能的多肽。

由于天然的乙酰膽堿酯酶的活性在部分腫瘤細胞上沒法滿足腫瘤的完全消退，所以本領域技術人員可以對乙酰膽堿酯酶進行突變體的篩選，選取活性更高的突變體，以獲得更好的腫瘤預防和抑制的效果。

本發明所提供的用途中，所述用途更具體為乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體的重組表達載體在制備或篩選治療腫瘤的藥物中的用途。

乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體的重組表達載體為包含有對應的乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體編碼序列的表達載體。所述表達載體可選用各種適用于乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體的基因表達的表達載體。具體可適用的表達載體包括但不限于帶有cmv/pgk/ef-1等啟動子、sv40/orip等真核復制起點、原核復制起點(來源于puc、pbr322ori等)的非整合型載體(episomalplasmid)，例如pgs、prccmv。本領域技術人員可選擇合適的載體，或進一步對現有的載體進行修飾改造，以構建所述乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體的重組表達載體，從而獲得適用于口服給藥、并能夠達到期望的表達水平的乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體的重組表達載體。所述期望的表達水平可以是更高的蛋白表達水平，以達到更好的腫瘤抑制效果，也可以是一個相對合理的蛋白表達水平，以針對不同個體給予合理的給藥量。

具體的，所述腫瘤選自非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌、腦膠質瘤、頭頸癌、血液瘤等腫瘤。

本發明第二方面提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包括治療有效量的乙酰膽堿酯酶、乙酰膽堿酯酶突變體、丁酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶突變體的重組表達載體，所述藥物組合物為口服制劑。

治療有效量對應于治療腫瘤的目的，具體指一用量在經過適當的給藥期間后，能夠達到治療腫瘤的欲求效果。在本文中，若能減少一或多個病征或臨床指標即代表該治療是“有效”的。

更具體的，所述治療腫瘤的藥物還包括藥學上可接受的載體。

具體的，藥學上可接受的載體指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在remington'spharmaceuticalsciences(mackpub.co.，n.j.1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學上可 接受的載體可包括液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如崩解劑、潤濕劑、乳化劑、ph緩沖物質、海藻膠、果膠、羧甲基纖維素鈉(cmc)、黃原膠、結冷膠、瓜爾膠、卡拉膠、蔗糖、麥芽糖醇、甜菊糖苷等。

優選的，所述載體為各種能夠輔助消化道吸收的藥學上可接受的載體。在本發明一實施例中，所述藥學上可接受的載體為殼聚糖溶液，更具體為季銨鹽殼聚糖的pbs溶液。

本發明所提供的藥物組合物中，所述表達載體可選用各種適用于乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶或他們的突變體的基因表達的表達載體。具體可適用的表達載體包括但不限于帶有cmv/pgk/ef-1等啟動子、sv40/orip復制起點等、原核復制起點(來源于puc、pbr322ori等)的非整合型載體(episomalplasmid)，例如pgs、prccmv。

具體的，所述藥物組合物用于治療腫瘤，所述腫瘤選自非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌、腦膠質瘤、頭頸癌、血液瘤等腫瘤。

本發明第三方面提供一種腫瘤的治療方法，通過將所述藥物組合物通過口服給藥的方式施用于個體，抑制腫瘤的增殖。

所述個體是指可接受所述藥物組合物和/或治療方法的動物(包括人類)，在此涵蓋了雄性與雌性兩種性別，除非另有具體說明。因此，所述個體至少包含任何哺乳類動物，包括但不限于：人類、非人類的靈長類，如哺乳動物、狗、貓、馬、羊、豬、牛等，其可因利用所述藥物組合物進行治療而獲益。

具體的，所述腫瘤選自非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌、腦膠質瘤、頭頸癌、血液瘤等腫瘤。

本發明利用乙酰膽堿酯酶質粒、丁酰膽堿酯酶質粒口服的方式，將乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶基因游離在動物體染色體外進行表達，從而提高了安全性、方便性，并有更好的腫瘤預防和治療的效果。從體外細胞和體內動物實驗可以看到乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶表達對非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌、腦膠質瘤、頭頸癌、血液瘤等腫瘤細胞株都有抑制的效果。此外，本發明進一步通過引入乙酰膽堿酯酶的活性突變體，提高了所表達的乙酰膽堿酯酶的活性，從而大大提高了其在體外腫瘤細胞生長抑制和體內動物核瘤實驗中的藥效。

附圖說明

圖1顯示為本發明實施例1中乙酰膽堿酯酶對12株腫瘤細胞系增殖實驗示意圖。

圖2顯示為本發明實施例2中丁酰膽堿酯酶對5株腫瘤細胞系增殖實驗示意圖。

圖3顯示為本發明實施例3中乙酰膽堿酯酶/丁酰膽堿酯酶腫瘤生長抑制實驗示意圖。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發明的精神下進行各種修飾或改變。

在進一步描述本發明具體實施方式之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍；在本發明說明書和權利要求書中，除非文中另外明確指出，單數形式“一個”、“一”和“這個”包括復數形式。

當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本發明。

除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術領域常規的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養、重組dna技術及相關領域的常規技術。這些技術在現有文獻中已有完善說明，具體可參見sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

實施例1

乙酰膽堿酯酶在腫瘤細胞系中的過表達實驗：

將乙酰膽堿酯酶-pgs載體在如下細胞系(u87mg、cal27、a549、hepg2、mcf7、mda-mb-468、sw620、ht29、rko、u373、k562、lncap)中過表達，72小時后測試細胞增殖(celltiterglo,promega)，計算乙酰膽堿酯酶過表達對細胞增殖的抑制。將上述12株細胞，按照4000細胞/孔接種于96孔培養板中過夜培養(cal27、rko、sw620、lncap、k562細胞培養在1640培養基+10％胎牛血清，5％co2培養箱中；u87mg、a549、ht29、mcf7、u373、mda-mb-468細胞培養在dmem高糖培養基+10％胎牛血清，5％co2培養箱)；將乙酰膽堿酯酶-pgs載體(將ache(transcriptvariant5nm_001302622)通過pcr的方法在兩段接上hindiii和xbai酶切位點后，將乙酰膽堿酯酶酶切片段通過分子克隆的方法鏈接至pgs載體，構建成ache-pgs)按照300ng，100ng，30ng，10ng每孔量，通過脂質體轉染(lipofectimine3000，lifetechnology)方式瞬時轉染至目的細胞株中。培養72小時后，向培養板加入50ul/孔celltiterglo檢測細胞的增殖狀況，具體結果如圖1所示。圖1中，每四個柱形條對應一種細胞系的實驗結果，各組柱形條中，從左至右四個柱形條分別對應300ng、100ng、30ng、10ng乙酰膽堿酯酶-pgs載體/孔的加入量。

實施例2

丁酰膽堿酯酶在腫瘤細胞系中的過表達實驗：

將丁酰膽堿酯酶-prccmv載體在如下細胞系(a549、hela、hct116、u87mg、rko)中過表達，48小時后檢測細胞增殖(celltiterglo,promega)，計算丁酰膽堿酯酶過表達對細胞增殖的抑制。將上述5株細胞，按照4000細胞/孔接種于96孔培養板中過夜培養(a549、hela、u87mg培養在dmem培養基+10％胎牛血清，5％co2培養箱中；hct116、rko細胞培養在1640培養基+10％胎牛血清，5％co2培養箱中)，將丁酰膽堿酯酶-prccmv載體(將丁酰膽堿酯酶bche(nm_000055)通過pcr方法向兩端添加bglii和bamhi酶切位點，將丁酰膽堿酯酶酶切片段通過分子克隆的方法鏈接至prccmv載體，構建成bche-prccmv)按照300ng，100ng，30ng，10ng每孔量，通過脂質體轉染的方式瞬時轉染至目的細胞株中。培養72小時后，向培養板中加入50ul/孔celltiterglo檢測細胞的增殖狀況，具體結果如圖2所示。圖2中，每四個柱形條對應一種細胞系的實驗結果，各組柱形條中，從左至右四個柱形條分別對應300ng、100ng、30ng、10ng丁酰膽堿酯酶-prccmv載體/孔的加入量。

實施例3

乙酰膽堿酯酶腫瘤生長抑制實驗：

雄性balb/c裸鼠(四周大，16-20g)通過皮下接種5*10⁶個a549細胞，當腫瘤體積達到 100mm³，取出腫瘤剪成大小均一的組織塊，將腫瘤組織塊接種至新的裸鼠，接種后裸鼠隨機分組saline(生理鹽水)、achegroup(乙酰膽堿酯酶處理組)、bchegroup(丁酰膽堿酯酶處理組)每組8只；當腫瘤體積達到100mm³時，通過灌胃方式給予ache-pgs、bche-prccmv殼聚糖混合物(季銨鹽殼聚糖溶于pbs，配制成0.5％(w/v)溶液，ph7.6；ache和bche質粒溶于te緩沖液，配制成0.1mg/ml溶液；將殼聚糖溶液和質粒溶液按照體積比1：1配制)，每日400ul，連續給藥4周，每周測量體重和腫瘤體積變化，具體實驗結果如圖2所示。

綜上所述，本發明有效克服了現有技術中的種種缺點而具高度產業利用價值。

上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。