
本發明涉及一種漢麻葉提取物及其在制備抗疲勞產品中的應用。
背景技術:
:疲勞(fatigue)是指在一定環境條件下,由于機體長時間從事繁重或緊張的體力或腦力勞動,引起作業效率明顯降低的一種生理現象。從運動生化角度而言,疲勞是指機體的生理過程不能將其機能保持在特定水平,或各器官不能維持其預定的運動強度。主觀而言,疲勞一般伴有倦怠感。疲勞幾乎可以損害一切生理能力,如力量、速度、反應時間、協調能力、決策能力或平衡能力等等,表現為注意力不集中、決策力下降、記憶力減退、反應變慢、情緒低沉、寡言少語、易怒,有時會因不能準確預知威脅存在,而更易采取冒險行動。作戰人員在作戰、訓練和執行應急任務時智能和體能消耗增加,特別在戰時,在戰斗應激等復合因素的作用下,作戰人員長時間處于高負荷狀態,極易發生疲勞。疲勞不僅會直接影響部隊戰斗力,還會增加作戰人員的意外傷亡。因此,研制抗疲勞功能基料和抗疲勞軍用食品及相關措施,對提高作戰人員體能,增強部隊戰斗力具有現實意義。越戰期間,美軍戰斗疲勞人數約占總戰傷人數的50%,其后戰斗疲勞并發癥(ptsd)的發病率約為15%;海灣戰爭期間,美軍參加沙漠風暴行動的士兵在回國6個月后,約有9%的士兵出現了嚴重ptsd并發癥。因此,在高技術條件下的局部戰爭中,如何有效保持和提高作戰人員的戰斗力,成為美軍戰時軍需保障的重要課題。為了在戰時有效地拮抗疲勞,外軍開發了大量的抗疲勞藥物和植物化合物。以往,美軍在軍用功能食品的研制中,通常是采用將成分明確的單體化合物加入軍用食品中,如在高原能量棒中加入成分單一、結構明確的銀杏黃酮。近年來,美軍首次將成分和結構不一定完全明確的植物營養素(phytonutrients)以及功能食品(functionalfood)和保健食品(nutraceuticals)納入到了抗疲勞等軍用食品的研究與應用范疇。我軍也非常關注抗疲勞領域的相關研究。這不僅是因為疲勞在部隊中的發生率較高,更重要的是疲勞也是導致部隊戰斗力下降和戰時意外傷亡的重要原因之一。當今,全球局部沖突不斷,恐怖主義活動頻繁發生,因此我軍更有必要關注抗疲勞食品與藥物等相關措施的研究。漢麻(china-hemp)為木蘭綱(magnoliopsida)蕁麻目(rosales)大麻科(cannabaceae)大麻屬(cannabis)大麻種(cannabissatival.)的一年生草本植物, 又稱大麻,線麻,火麻等。漢麻可在丘陵、山坡、灘涂等荒地種植,不與糧、棉、油爭地,其抗自然災害能力強,各種氣候均可實現穩產。2009年,我國的漢麻種植面積達10萬畝,其韌皮纖維可用于服裝加工,漢麻籽可應用于食品與保健品,但漢麻葉基本按廢棄物處理,不僅造成資源浪費,還造成環境污染,如果能對漢麻葉進行深度開發有效利用,既可提升漢麻加工品的附加值,完善漢麻產業鏈并有利于漢麻資源的綜合利用,又可實現更多農民就業與增收。技術實現要素:本發明的目的是提供一種漢麻葉提取物及其在制備抗疲勞產品中的應用。本發明提供了一種漢麻葉提取物的制備方法,依次包括如下步驟:(1)對漢麻葉進行水提,得到提取液;(2)將步驟(1)得到的提取液進行減壓濃縮。所述“水提”的方式為加熱回流。所述漢麻葉與所述“水提”中的水的質量配比為如下(a1)或(a2)或(a3):(a1)1:4-50;(a2)1:6-14;(a3)1:14。所述“水提”包括如下步驟:①取漢麻葉,加入水,加熱回流,收集液體,即為提取液a;②向步驟①的固體殘余物中加入水,加熱回流,收集液體,即為提取液b;③將提取液a和提取液b合并,得到提取液c。所述方法中,漢麻葉、步驟①中加入的水、步驟②中加入的水的質量配比為如下(b1)或(b2):(b1)1:6-24:6-24;(b2)1:8:6。所述步驟①和/或所述步驟②中,所述加熱回流的時間可為1-3小時。所述步驟①中,所述加熱回流的時間可為1小時。所述步驟②中,所述加熱回流的時間可為1小時。所述漢麻葉為漢麻葉干粉。所述漢麻葉干粉的粒度具體可為20-40目。所述減壓濃縮具體在1.5×10-4mpa的真空度下進行。所述減壓濃縮的產物的含水量具體可為50%(質量百分含量)。所述方法還包括如下步驟:在所述減壓濃縮后進行干燥。所述干燥具體可為噴霧干燥。所述噴霧干燥的參數可為:進風溫度190-180℃,出風溫度90-80℃。所述噴霧干燥的參數具體可為:進風溫度180℃,出風溫度90℃。所述噴霧干燥采用的儀器具體可為:lpg-50型試驗噴霧干燥機。以上任一所述方法制備得到的漢麻葉提取物也屬于本發明的保護范圍。本發明還保護所述漢麻葉提取物在制備抗疲勞產品中的應用。所述產品為食品、保健品或藥品。本發明還保護一種抗疲勞產品,其活性成分為所述漢麻葉提取物。所述產品為食品、保健品或藥品。以上任一所述抗疲勞產品的效果體現為如下(c1)至c12中的至少一種:(c1)降低全血中的乳酸濃度;(c2)降低運動后全血中的乳酸濃度;(c3)增加全血中乳酸脫氫酶酶活;(c4)增加運動后全血中乳酸脫氫酶酶活;(c5)增加血清中超氧化物歧化酶酶活;(c6)增加運動后血清中超氧化物歧化酶酶活;(c7)增加血清中谷胱甘肽過氧化物酶酶活;(c8)增加運動后血清中谷胱甘肽過氧化物酶酶活;(c9)增加血清中丙二醛濃度;(c10)增加運動后血清中丙二醛濃度;(c11)增加肌肉中的糖原含量;(c12)增加運動后肌肉中的糖原含量。以上任一所述抗疲勞產品可在運動前食用也可在運動過程中或運動后食用。本發明提供的漢麻葉提取物不僅無毒,還可以顯著延長機體運動耐力時間,具有顯著的抗疲勞作用,并且能夠增強機體抗氧化體系活性,具有顯著的抗氧化作用。本發明采用漢麻產業的廢棄物漢麻葉制備漢麻葉水提浸膏,原料豐富、無毒且成本較低。本發明將廢棄物漢麻葉進行了有效利用,減少了環境污染且避免了資源浪費。本發明制備的漢麻葉水提浸膏具有抗疲勞和抗氧化的作用,能夠延長機體運動耐力時間,增強機體抗氧化體系活性。因此,本發明具有重大的應用價值。附圖說明圖1為動物負重游泳實驗的結果。圖2為乳酸含量的檢測結果。圖3為乳酸脫氫酶酶活的檢測結果。圖4為超氧化物歧化酶酶活的檢測結果。圖5為丙二醛的檢測結果。圖6為谷胱甘肽過氧化物酶酶活的檢測結果。圖7為肌肉中的糖原含量的檢測結果。圖8為肝臟的糖原含量的檢測結果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發明,但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明,均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗,均設置三次重復實驗,結果取平均值。實施例中的噴霧干燥均采用lpg-50型試驗噴霧干燥機(無錫市能達干燥設備有限公司)進行,參數設置為:進口溫度180℃,出風溫度90℃。實施例中所用的漢麻采自云南省西雙版納州景紅市。實施例1、漢麻葉提取物和各個對照物的制備一、漢麻葉提取物的制備1、取新鮮漢麻葉,用自來水清洗后置于陰涼處干燥,然后粉碎,得粒度為20-40目的漢麻葉粉末。2、稱取5kg步驟1得到的漢麻葉粉末,加入40kg純凈水,加熱回流1小時,收集液體,即為提取液a。3、向步驟2的固體殘余物中加入30kg純凈水,加熱回流1小時,收集液體,即為提取液b。4、將提取液a和提取液b合并,得到提取液c,然后在1.5×10-4mpa的真空度下進行減壓濃縮,得到含水量為50%(質量百分含量)的濃縮物。5、取步驟4得到的濃縮物,進行噴霧干燥,得到粉末狀漢麻葉提取物。以漢麻葉干重計算,上述步驟制備漢麻葉提取物的得率為7.3%。二、羊肚菌發酵物的制備羊肚菌(morchellaesculenta):中國農業科學院菌種保藏中心。1、種子液的制備用打孔器從pda固體平板上打取直徑為5mm大小均一的羊肚菌菌絲體10塊接入到新鮮的種子培養基中(500ml三角瓶,裝液量100ml),在25℃、140rpm條件下振蕩培 養4d,得到種子液。種子培養基:馬鈴薯200g/l、葡萄糖20g/l、蛋白胨3g/l、kh2po41g/l、mg2so41g/l,余量為蒸餾水。2、將5ml步驟1得到的種子液接種至100ml發酵培養基,25℃、140rpm振蕩培養120小時,收集培養上清液。發酵培養基(%代表質量百分含量):葡萄糖2%、蛋白胨0.45%、kh2po40.08%、mgso4·7h2o0.1%,余量為蒸餾水。3、取步驟2得到的上清液,在0.01mpa的真空度下進行減壓濃縮至四分之一體積,得到羊肚菌發酵物。三、紅景天制劑紅景天制劑為西藏諾迪康藥業股份有限公司生產的諾迪康膠囊。實施例2、急毒試驗一、試驗一漢麻葉提取物組(20只試驗動物,雄性和雌性各10只):用漢麻葉提取物溶液(溶質為實施例1制備的漢麻葉提取物,溶劑為生理鹽水,溶質濃度為0.2g/kg)連續給藥14天,給藥方式為灌胃給藥,每天每只試驗動物給藥兩次(分別為上午10點和下午4點)、單次給藥劑量為6g/kg(即每kg試驗動物給予6g漢麻葉提取物);羊肚菌發酵物組(20只試驗動物,雄性和雌性各10只):用羊肚菌發酵物溶液(溶質為實施例1制備的羊肚菌發酵物,溶劑為生理鹽水,溶質濃度為0.2g/kg)連續給藥14天,給藥方式為灌胃給藥,每天每只試驗動物給藥兩次(分別為上午10點和下午4點)、單次給藥劑量為6g/kg(即每kg試驗動物給予6g羊肚菌發酵物)。每天觀察試驗動物的生存狀況,第15天統計試驗動物的體重(結果見表1)。表1體重檢測結果(g)試驗過程中試驗動物活動、大便較正常,第1至15天無試驗動物死亡且試驗動物體重增加。二、試驗二取20只試驗動物(雄性和雌性各10只),用漢麻葉提取物溶液(溶質為實施例1制備的漢麻葉提取物,溶劑為生理鹽水,溶質濃度為0.2g/kg)連續給藥14天,給藥方式為灌胃給藥,每天每只試驗動物給藥兩次(分別為上午10點和下午4點)、單次給藥劑量為12g/kg(即每kg試驗動物給予12g漢麻葉提取物)。第1至15天無試驗動物死亡。試驗一和試驗二的結果表明,漢麻葉提取物沒有毒性。實施例3、抗疲勞效果試驗一、分組給藥(第1至14天)漢麻葉提取物組(20只試驗動物,雄性和雌性各10只):用漢麻葉提取物溶液(溶質為實施例1制備的漢麻葉提取物,溶劑為生理鹽水,溶質濃度為0.2g/kg)連續給藥14天,給藥方式為灌胃給藥,每天每只試驗動物給藥兩次(分別為上午10點和下午4點)、單次給藥劑量為6g/kg(即每kg試驗動物給予6g漢麻葉提取物);羊肚菌發酵物組(20只試驗動物,雄性和雌性各10只):用羊肚菌發酵物溶液(溶質為實施例1制備的羊肚菌發酵物,溶劑為生理鹽水,溶質濃度為0.2g/kg)連續給藥14天,給藥方式為灌胃給藥,每天每只試驗動物給藥兩次(分別為上午10點和下午4點)、單次給藥劑量為6g/kg(即每kg試驗動物給予6g羊肚菌發酵物);紅景天組(20只試驗動物,雄性和雌性各10只):用紅景天制劑溶液(溶質為實施例1中的紅景天制劑,溶劑為生理鹽水,溶質濃度為0.2g/kg)連續給藥14天,給藥方式為灌胃給藥,每天每只試驗動物給藥兩次(分別為上午10點和下午4點)、單次給藥劑量為6g/kg(即每kg試驗動物給予6g紅景天制劑)。空白對照組(20只試驗動物,雄性和雌性各10只):用生理鹽水連續給藥14天,給藥方式為灌胃給藥,每天每只試驗動物給藥兩次(分別為上午10點和下午4點)。二、動物負重游泳實驗第15天,將各組試驗動物進行負重游泳實驗,具體如下:30℃水中負重(體重的3%,質量比)游泳直至衰竭,記錄游泳衰竭時間(動物游泳衰竭的表現:小鼠游泳力竭后沉入水中,10秒內不能上浮至水面)。小鼠游泳衰竭時間的長短可反映運動耐力的變化,運動耐力提高是抗疲勞能力加強的直接表現。結果見表2和圖1。表2不同樣品對動物負重游泳衰竭時間的影響組別游泳衰竭時間(min)空白對照組21.57±5.19紅景天組29.50±5.99*羊肚菌發酵物組22.57±6.85漢麻葉提取物組55.40±14.78**#注:“*”表示與空白對照組比較有顯著性差異,p<0.05;“**”表示與空白對照組比較 有極顯著性差異,p<0.01;“#”表示與紅景天組比較有顯著性差異,p<0.05;“##”表示與紅景天組比較有極顯著性差異,p<0.01。紅景天組動物游泳衰竭時間與空白對照組相比具有顯著性差異(p<0.05);羊肚菌發酵物組動物游泳衰竭時間與空白對照組相比無顯著性差異(p>0.05);漢麻葉提取物組動物游泳衰竭時間與空白對照組相比具有極顯著性差異(p<0.01),與紅景天組相比也有顯著性差異(p<0.05),明顯使小鼠負重游泳時間延長。結果表明,漢麻葉提取物組具有提高小鼠負重游泳力竭時間的作用,其抗疲勞效果優于紅景天。三、游泳代謝試驗第15天,將各組試驗動物進行游泳代謝試驗,具體如下:于30℃水中游泳90min,然后進行如下各項檢測:1、不同樣品對血乳酸含量的影響劇烈運動時,體內相對缺氧,糖酵解加快,會產生大量乳酸,乳酸解離出的h+降低了肌細胞中的ph值,從而導致肌肉酸痛。乳酸在體內的積累,主要取決于乳酸的產生與消除速度。因此,能減緩乳酸生成或加速乳酸消除的物質具有抗疲勞的作用。取全血,檢測其中的乳酸濃度。乳酸測定方法依據中華人民共和國衛生部2003年2月頒發的《保健食品檢驗與評價技術規范》中“緩解體力疲勞功能檢測方法”。結果見表3和圖2。紅景天組動物血乳酸含量與空白對照組相比具有顯著性差異(p<0.05);羊肚菌發酵物組動物血乳酸含量與空白對照組相比無顯著性差異(p>0.05);漢麻葉提取物組動物血乳酸含量與空白對照組相比具有極顯著性差異(p<0.01)。結果表明,漢麻葉提取物組有助于減少機體在運動時乳酸的生成。表3不同樣品對血乳酸含量的影響組別全血中的乳酸濃度(mmol/l)空白對照組1.01±0.09紅景天組0.81±0.19*羊肚菌發酵物組1.34±0.27#漢麻葉提取物組0.76±0.10**注:“*”表示與空白對照組比較有顯著性差異,p<0.05;“**”表示與空白對照組比較有極顯著性差異,p<0.01;“#”表示與紅景天組比較有顯著性差異,p<0.05;“##”表示與紅景天組比較有極顯著性差異,p<0.01。2、不同樣品對乳酸脫氫酶活力的影響乳酸脫氫生成丙酮酸進入肌細胞線粒體內參與三羧酸循環氧化功能,減少肌肉內乳酸的積累,加速乳酸的消除,所以提高血液中乳酸脫氫酶(ldh)酶活,加速乳酸的消 除也可以起到抗疲勞的作用。取全血,采用乳酸脫氫酶(ldh)測試盒微板法(貨號a020-2;南京建成生物工程研究所)檢測乳酸脫氫酶酶活。結果見表4和圖3。紅景天組動物乳酸脫氫酶活力與空白對照組相比無顯著性差異(p>0.05);羊肚菌發酵物組動物乳酸脫氫酶活力與空白對照組相比無顯著性差異(p>0.05);漢麻葉提取物組動物乳酸脫氫酶活力與空白對照組相比具有極顯著性差異(p<0.01),與紅景天組相比也具有極顯著性差異(p<0.01)。結果表明,漢麻葉提取物組動物全血的乳酸脫氫酶活力極顯著地高于空白對照組和紅景天組。表4不同樣品對乳酸脫氫酶活力的影響組別全血的乳酸脫氫酶酶活(u/l)空白對照組1558.36±69.42紅景天組1292.06±301.84羊肚菌發酵物組1265.29±222.19漢麻葉提取物組2613.78±232.57**##注:“*”表示與空白對照組比較有顯著性差異,p<0.05;“**”表示與空白對照組比較有極顯著性差異,p<0.01;“#”表示與紅景天組比較有顯著性差異,p<0.05;“##”表示與紅景天組比較有極顯著性差異,p<0.01。3、不同樣品對血清sod活性的影響生物體內超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽過氧化物酶(gsh)是兩種在細胞抗氧化防御中最重要的酶,在體內擔負著清除自由基的任務,防止自由基的損傷,所以,sod、gsh-px的含量可以反映機體抗自由基氧化的能力。自由基引起細胞的損傷主要是通過脂質過氧化途徑,mda就是主要的終末產物,通過mda的水平也可以反應生物體內脂質過氧化狀態和機體受損的程度。因此,可通過比較處理組和空白組mda的含量以及sod和gsh的活性,判定抗疲勞效果。取血清,采用超氧化物歧化酶(sod)測試盒(貨號a001-3;南京建成生物工程研究所)檢測sod活性(用單位質量蛋白質的sod活性表征,以血清中的總蛋白質含量計)。結果見表5和圖4。紅景天組動物血清中sod活性高于空白對照組;漢麻葉提取物組組動物血清中sod活性高于空白對照組。結果表明,漢麻葉提取物具有提高機體抗氧化體系的功能。表5不同樣品對血清sod活性的影響注:“*”表示與空白對照組比較有顯著性差異,p<0.05;“**”表示與空白對照組比較有極顯著性差異,p<0.01;“#”表示與紅景天組比較有顯著性差異,p<0.05;“##”表示與紅景天組比較有極顯著性差異,p<0.01。取血清,采用丙二醛(mda)測試盒(貨號a003-1;南京建成生物工程研究所)檢測mda在血清總蛋白中的濃度。結果見表6和圖5。紅景天組動物血清總蛋白中mda濃度與空白對照組相比具有極顯著性差異(p<0.01),極其顯著高于空白對照組;羊肚菌發酵物組動物血清總蛋白中mda濃度與空白對照組相比無顯著性差異(p>0.05);漢麻葉提取物組動物血清總蛋白中mda濃度與空白對照組相比具有極顯著性差異(p<0.01),極其顯著高于空白對照組。結果表明,漢麻葉提取物組血清中的mda含量顯著高于空白對照組。表6不同樣品對血清mda的影響組別mda濃度(nmol/mgprot)空白對照組9.54±2.71紅景天組27.83±6.96**羊肚菌發酵物組12.76±4.95#漢麻葉提取物組15.99±4.63**注:“*”表示與空白對照組比較有顯著性差異,p<0.05;“**”表示與空白對照組比較有極顯著性差異,p<0.01;“#”表示與紅景天組比較有顯著性差異,p<0.05;“##”表示與紅景天組比較有極顯著性差異,p<0.01。取血清,采用還原型谷胱甘肽(gsh)測定試劑盒(微板法)(貨號a006;南京建成生物工程研究所)檢測gsh-px活性(用單位質量蛋白質的gsh-px活性表征,以血清中的總蛋白質含量計)。結果見表7和圖6。紅景天組動物血清中gsh-px活性與空白對照組相比具有顯著性差異(p<0.05);羊肚菌發酵物組動物血清中gsh-px活性與空白對照組相比具有極顯著性差異(p<0.01);漢麻葉提取物組動物血清中gsh-px活性與空白對照組相比具有極顯著性差異(p<0.01),與紅景天組相比也具有顯著性差異(p<0.01)。結果表明,漢麻葉提取物具有提高動物體內抗氧化體系的功能,其抗氧化效果優于紅景天。表7不同樣品對血清中gsh-px活性的影響注:“*”表示與空白對照組比較有顯著性差異,p<0.05;“**”表示與空白對照組比較有極顯著性差異,p<0.01;“#”表示與紅景天組比較有顯著性差異,p<0.05;“##”表示與紅景天組比較有極顯著性差異,p<0.01。4、不同樣品對肌糖原含量的影響糖是機體的主要供能物質,機體內的糖主要是葡萄糖和糖原。當機體運動時,肌肉中儲存的糖原分解產生能量供給活動的需要,肌糖原儲備越充足,提供運動所需的能量就越多,運動耐力就越好,即糖原貯備的提高有利于機體耐力速度的提高。測定肌糖原和肝糖原的含量可了解受試物對小鼠肌、肝糖原儲備能力的影響。如果試驗組肌、肝糖原比對照組明顯升高,說明該受試物能夠通過增加小鼠肌、肝糖原儲備,維持機體運動時血糖水平,從而為機體提供更多的能量來達到抗疲勞的目的。因此糖原的含量能說明疲勞發生的快慢和程度,糖原的測定可作為抗疲勞的一個較敏感的指標。試驗結果顯示漢麻葉提取物組具有增加小鼠運動后的肌糖原的作用,說明漢麻葉提取物組能通過增加肝糖原、肌糖原儲備為機體提供更多的能量達到抗疲勞效果。取大腿肌肉,檢測其中的糖原含量。糖原含量測定方法依據中華人民共和國衛生部2003年2月頒發的《保健食品檢驗與評價技術規范》中“緩解體力疲勞功能檢測方法”。結果見表8和圖7。紅景天組動物肌糖原含量低于空白對照組;漢麻葉提取物組小鼠肌糖原含量高于空白對照組。結果表明,在機體運動過程中,漢麻葉提取物可能有助于提高機體肌糖原的合成與儲備,提高機體運動耐力。表8不同樣品對肌糖原含量的影響組別肌糖原(mg/g)空白對照組15.36±8.99紅景天組5.82±1.97*羊肚菌發酵物組13.35±4.98#漢麻葉提取物組17.66±5.07##注:“*”表示與空白對照組比較有顯著性差異,p<0.05;“**”表示與空白對照組比較有極顯著性差異,p<0.01;:“#”表示與紅景天組比較有顯著性差異,p<0.05;“##”表示與紅景天組比較有極顯著性差異,p<0.01。第15天,取肝臟,檢測其中的糖原含量。糖原含量測定方法依據中華人民共和國衛生部2003年2月頒發的《保健食品檢驗與評價技術規范》中“緩解體力疲勞功能檢測方法”。結果見表9和圖8。紅景天組動物肝糖原含量與空白對照組相比具有顯 著性差異(p<0.05),即紅景天組動物肝糖原含量顯著低于空白對照組,這主要是由于紅景天組動物游泳時間顯著長于空白對照組;羊肚菌發酵物組動物肝糖原含量與空白對照組相比無顯著性差異(p>0.05);漢麻葉水提浸膏組動物肝糖原含量與空白對照組相比具有極顯著性差異(p<0.01)。結果表明,由于漢麻葉提取物組動物游泳時間長,其肝糖原動員的數量較大。表9不同樣品對肝糖原含量的影響組別肝糖原(mg/g)空白對照組38.56±12.34紅景天組21.31±1.82*羊肚菌發酵物組27.92±15.63漢麻葉提取物組15.13±4.80**注:“*”表示與空白對照組比較有顯著性差異,p<0.05;“**”表示與空白對照組比較有極顯著性差異,p<0.01;“#”表示與紅景天組比較有顯著性差異,p<0.05;“##”表示與紅景天組比較有極顯著性差異,p<0.01。當前第1頁12