本發明屬于醫學生物工程領域，具體涉及一種miRNA-71抑制劑及其用途。
背景技術：
：棘球蚴病俗稱包蟲病，是由棘球絳蟲的中絳期幼蟲寄生在哺乳動物臟器內引起的嚴重人畜共患病，多見于肝部和肺部。我國西部為該疾病流行區域，直接受威脅人口高達八千萬。棘球絳蟲種類較多，在我國包蟲病患者人群中，最常見的是細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲這兩種。目前臨床上治療包蟲病的手段主要有手術治療和藥物治療，其中治療藥物主要為苯并咪唑類衍生物。該類藥物雖在一定程度上可提高患者生活質量，延長存活時間，但其不論是用于全身化療還是局部治療，大多僅起到抑制寄生蟲生長的左右，效果十分有限。并且長時間服用該類藥物可引起多系統的嚴重藥物不良反應，甚至死亡。因此，目前臨床急需尋找一種全新的靶向治療藥物。MicroRNA(miRNA)是真核生物中廣泛存在的一種長約22個核苷酸的非編碼小RNA分子，其對細胞發育、分化、增殖和凋亡至關重要，調控并影響了整個生命活動的過程。miRNA-71表達于所有的棘球絳蟲，也常表達于一些寄生性吸蟲和線蟲體內。研究發現，該分子不僅在棘球絳蟲中為表達豐度最高的miRNA之一，且持續表達于棘球絳蟲的各個生命周期，對棘球絳蟲的正常生長發育等極為重要。值得指出的是，人體組織細胞中不表達miRNA-71(也不存在與miRNA-71類似的小RNA序列)，使用miRNA-71抑制劑不會與人體自身的miRNA序列發生拮抗作用，因此具有靶向性和安全性的雙重優勢，極有可能成為包蟲防治領域的新型有效手段。技術實現要素：本發明的目的在于克服現有藥物治療的缺點，提供一種miRNA-71抑制劑，該抑制劑在制備防治包蟲病藥物的用途。本發明的目的通過以下技術方案來實現：一種miRNA-71抑制劑，所述抑制劑為RNA單鏈，其特征在于，所述抑制劑的序列如下：5’-UCUCACUACCAUCGUCUUUCA-3’，其中每個核苷酸被2’-OMe修飾，5’端的前兩個堿基和3’端的前4個堿基被磷硫酰鍵修飾，且3’端修飾有膽固醇基團。miRNA-71抑制劑在制備防治寄生蟲病藥物的用途。所述寄生蟲病為包蟲病。miRNA-71抑制劑通過抑制miRNA-71的表達達到抑制棘球絳蟲生長發育和殺死棘球絳蟲的作用。本發明的核酸序列被2’-OMe和磷硫酰鍵修飾的作用是為了提高合成分子對核糖核酸酶的抵抗性，達到可以穩定的競爭性抑制目的分子miRNA-71的作用；3’端修飾有膽固醇基團用于促進細胞對miRNA-71抑制劑的吸收作用，使該分子更易于在肝臟富集，并能延長其在血清中的半衰期。本發明具有以下優點：本發明提供的miRNA-71靶向抑制劑可特異性靶向抑制棘球絳蟲中miRNA-71的表達，從而影響棘球絳蟲正常生長發育并促進其死亡。本發明通過實驗證明，在體外培養的含細粒棘球蚴原頭節培養液中，加入本發明的miRNA-71抑制劑，可有效殺死其中的原頭蚴。在包蟲病小鼠動物模型中，使用本發明的miRNA-71抑制劑，對小鼠細粒棘球蚴原頭節具有明顯的抑制作用，其可為制備預防及治療包蟲病的藥物提供基礎。附圖說明圖1為熒光定量PCR檢測細粒棘球蚴原頭節中miRNA-71表達的結果示意圖；圖2為不同濃度miRNA-71抑制劑作用后細粒棘球蚴原頭節活力曲線示意圖；圖3為miRNA-71抑制劑處理原頭節24h后的Caspase-3酶活性變化示意圖。具體實施方式下面結合附圖及實施例對本發明做進一步的描述，本發明的保護范圍不局限于以下所述。實施例1：通過體外培養細粒棘球蚴原頭節檢測本發明的miRNA-71抑制劑對miRNA-71表達的抑制作用1.合成本發明的miRNA-71抑制劑將5'-O-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-甲基胞苷-3'-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基)(5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2’-O-methyl-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl))修飾的RNA亞磷酰胺單體A、G、C、U，使用DNA合成儀對本發明miRNA-71抑制劑(示意圖中簡稱Skm-71)進行化學合成，miRNA-71抑制劑的RNA序列為5’-UCUCACUACCAUCGUCUUUCA-3’。在控孔玻璃固相載體(controlled-poreglasssolidsupport)中進行RNA與膽固醇基團的連接修飾。在miRNA-71抑制劑的合成過程中，指定位置的磷硫酰鍵的修飾是通過亞磷酸鹽和苯乙酰二硫化物(PADS)的氧化反應完成的。在控孔玻璃固相載體中對miRNA-71抑制劑進行切落和脫保護后，合成的miRNA-71抑制劑使用反相高效液相色譜法進行純化。純化后的miRNA-71抑制劑經凍干后保存于-80℃備用。2.合成miRNA-71抑制劑的陰性對照化合物設計一段miRNA-71抑制劑的陰性對照序列，該RNA序列為5’-AGUGACUAAGAUCGUAUGCAGUUGC-3’。其中每個核苷酸被2’-OMe修飾，5’端的前兩個堿基和3’端的前4個堿基被磷硫酰鍵修飾，且3’端修飾有膽固醇基團。該陰性對照化合物的合成過程與miRNA-71抑制劑的制備方法相同。本發明中，該陰性對照化合物命名為Skm-negative(示意圖中簡稱Control)。3.細粒棘球蚴原頭節收集及體外培養取新鮮的自然感染細粒棘球蚴的綿羊肝臟，先用自來水清洗干凈表面污漬，再用75％酒精浸泡消毒10秒后放入超凈工作臺內。用一次性無菌注射器抽取包囊中含原頭節的囊液，移入50ml無菌離心管中，靜置待原頭節沉淀后將上清棄掉，然后加入PBS清洗，靜置待原頭節沉淀后將上清棄掉，重復3～5次。用0.1％伊紅染液做染色排斥實驗，確定存活率≥98％。最后用含100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素和10％小牛血清的RPMI1640培養基將原頭節混勻，置于37℃、5％CO2恒溫培養箱中進行培養，每2～3天更換一次培養液。4.實驗分組收集原頭節于倒置顯微鏡下計數，確定原頭節密度后，按每孔約2000個原頭節接種于六孔板中。設立對照組(示意圖中簡稱Control)，原頭節培養液中加入終濃度為50nM，100nM和200nM的miRNA-71抑制劑陰性對照。設立實驗組(示意圖中簡稱Skm-71)，原頭節培養液中加入終濃度為50nM，100nM和200nM的miRNA-71抑制劑。同時還設立空白組(示意圖中簡稱BLANK)，除培養液外不加任何試劑。每孔3天更換一次培養液，并重新加入miRNA-71抑制劑或陰性對照。5.Q-PCR檢測細粒棘球蚴原頭節中miRNA-71表達情況收集加入miRNA-71抑制劑或陰性對照后培養第三天和第六天的原頭節，用PBS洗滌三次，然后使用試劑盒mirVanamiRNAIsolationKit進行操作提取總miRNA(購自Ambion公司)。將提取的總miRNA進行miRNA-71反轉錄，使用AppliedBiosystems公司的MicroRNAAssays試劑盒來進行操作，首先按表1加入以下體積加入相關試劑和樣品。表1：反轉錄加入的試劑及用量然后按表2條件在PCR儀器中進行反應，4℃表示反應完成。.表2：反轉錄反應條件StepTypeTime(min)Temperature(℃)HOLD3016HOLD3042HOLD585HOLD∞4最后對上述步驟獲得的反轉錄樣品進行miRNA-71的熒光定量PCR檢測，首先按表3中的體積加入相關試劑和樣品。表3：熒光定量PCR反應加入的試劑及用量然后按表4的條件在熒光定量PCR儀器中進行反應。表4：熒光定量PCR反應條件6.實驗結果實驗數據均使用X±S表示，和空白組間比較用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。如圖1所示，通過2-ΔΔCt法進行分析，Q-PCR結果顯示在第三天和第六天，miRNA-71在實驗組原頭節中的表達相比對照組和空白組均受到顯著抑制(P<0.05)，因此證實本發明的miRNA-71抑制劑可特異性抑制原頭節中miRNA-71分子的表達水平。實施例2：用伊紅染色法檢測miRNA-71抑制劑對細粒棘球蚴原頭節活力的影響1.伊紅染色從細粒棘球蚴原頭節培養液中加入miRNA-71抑制劑或陰性對照第一天開始，每組每天均勻抽取200ul培養液(含原頭節約100個)，用0.1％伊紅染色15min，倒置顯微鏡下觀察原頭節的活力。具有活力的原頭節拒染、不著色，而死亡或活力減弱的原頭節會著染紅色，實驗每次重復三次，計算每組每天平均存活率，存活率＝(活原頭節數/總原頭節數)X100％，連續觀察10天，結果用活力曲線圖進行表示。實驗數據均使用X±S表示，和空白組間比較用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。2.實驗結果如圖2所示，活力曲線圖結果顯示實驗組原頭節的活力隨著時間逐漸減少，并且高濃度miRNA-71抑制劑相比低濃度抑制劑的殺傷和抑制作用要更為明顯(P<0.05)，證實本發明的miRNA-71抑制劑對細粒棘球蚴原頭節具有顯著的殺傷和抑制作用，且具有劑量依耐性和時間依耐性。實施例3：細粒棘球蚴原頭節中Caspase-3酶活性檢測1.Caspase-3酶活性檢測在細粒棘球蚴原頭節培養液中加入miRNA-71抑制劑或陰性對照處理24h后，收集原頭節，用PBS清洗3次，再參照使用說明書用Caspase-3活性檢測試劑盒(購自APPLYGEN公司)進行操作。首先對原頭節進行稱量，每3mg原頭節加入150ul裂解液，用超聲粉碎儀粉碎后，冰上裂解，4℃低溫離心吸取上清，按說明書反應體系加入到96孔酶標板，放置于37℃避光孵育，最后使用酶標儀檢測A405值，計算酶活力單位，每組實驗重復三次。實驗數據均使用X±S表示，和空白組間比較用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。2.實驗結果如圖3所示，酶聯免疫吸附檢測(ELISA)結果顯示細粒棘球蚴原頭節經過本發明的miRNA-71抑制劑處理后，Caspase-3酶活性相比陰性對照組和空白對照組明顯增強(P<0.05)，證實其可引起原頭節的細胞凋亡。此外，高濃度miRNA-71抑制劑相比低濃度抑制劑的誘導凋亡作用要更為明顯(P<0.05)。實施例4：miRNA-71抑制劑處理后小鼠細粒棘球蚴原頭節囊濕重及抑囊率1.建立細粒棘球蚴病小鼠模型從新鮮的自然感染細粒棘球蚴的綿羊肝臟中收集原頭節，0.1％伊紅染色確定存活率≥98％。用含250IU/ml青霉素和鏈霉素雙抗的無菌PBS稀釋成含有原頭節1000個/0.1ml的懸液，吸取0.2ml懸液(2000個原頭節)經腹腔注射到6～8周齡大的Balb/c小鼠體內。感染6個月后，隨機選取一只進行剖檢，無菌操作打開腹腔，可見囊泡樣結構形成，證實動物模型構建成功。2.實驗分組使用細粒棘球蚴感染成功的Balb/c小鼠，設立對照組(圖表中簡稱Control)接受50mg/kg/天或100mg/kg/天的陰性對照化合物腹膜腔注射治療。設立實驗組(圖表中簡稱Skm-71)接受50mg/kg/天或100mg/kg/天的miRNA-71抑制劑腹膜腔注射治療。設立空白組(圖表中簡稱Blank)接受同劑量生理鹽水的腹膜腔注射。對照組和實驗組每種劑量的小鼠數量均為3例，空白組小鼠數量為3例。3.檢測細粒棘球蚴囊濕重及計算抑囊率連續注射12天后，解剖小鼠，剝離細粒棘球蚴形成的囊泡并稱重，即為囊濕重，每只小鼠均檢測3次以上。抑囊率＝(A-B)/A，A為空白組細粒棘球蚴囊濕重，B為注射miRNA-71抑制劑或陰性對照組細粒棘球蚴囊濕重。實驗數據均使用X±S表示，和空白組間比較用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。4.實驗結果解剖發現每組實驗小鼠均成功感染細粒棘球蚴。如表5所示，結果顯示兩種劑量的miRNA-71抑制劑均對小鼠細粒棘球蚴原頭節有抑制作用，抑囊率在50％～75％，均有較好的抑囊趨勢，與空白組和對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。表5.miRNA-71抑制劑處理后小鼠細粒棘球蚴原頭節囊濕重及抑囊率SEQUENCELISTING<110>成都仕康美生物科技有限公司<120>一種miRNA-71抑制劑及其用途<130>1<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21<212>RNA<213>人工序列<400>1ucucacuaccaucgucuuuca21當前第1頁1 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