一種包含喹唑啉酮并吲唑衍生物的藥物組合物的制作方法

本發明提供了一種藥物組合物，更具體而言，提供了一種包含喹唑啉酮并吲唑衍生物的可用來治療癌癥的藥物組合物，屬于藥物化學領域。

背景技術：

喹唑啉酮衍生物作為一類非常重要的含氮雜環化合物，被廣泛應用于醫藥、農業、化工等行業。目前，許多喹唑啉酮類藥物已廣泛應用于現實生活中，如抗高血壓藥哌唑嗪、利尿藥甲苯喹唑酮等。

作為喹唑啉酮衍生物中的一種，喹唑啉酮并吲唑衍生物也是一類重要的含氮稠環化合物，其具有多種特定的性能，例如：

Weiguang Yang等人(Palladium-Catalyzed Cascade Reaction of2-Amino-N’-arylbenzohydrazides with Triethyl Orthobenzoates To Construct Indazolo[3,2-b]quinazolinones，J.Org.Chem.，2015,80,482-489)中公開了一類吲唑并[3,2-b]喹唑啉酮化合物的合成方法及其所具有的熒光特性。

K.Siva Kumar等人(A new cascade reaction:concurrent construction of six and five membered rings leading to novel fused quinazolinones)公開了吲唑并喹唑啉酮化合物可用作磷酸二酯酶4(PED4)抑制劑，從而可具有用來治療哮喘、慢性肺阻塞疾病等疾病，并具有抗炎和支氣管擴張等效果，具有潛在的藥物用途。

如上所述，現有技術中公開了吲唑并喹唑啉酮化合物的一些用途，但目前這些用途大部分僅僅局限于其熒光性能和呼吸系統疾病治療領域，而沒有對于其它疾病尤其是癌癥的任何擴展應用的報道。

技術實現要素：

本發明人進行了深入的研究，在付出了大量的創造性勞動后，從而完成了本發明。

具體而言，本發明的技術方案和內容涉及一種包含喹唑啉酮并吲唑衍生物的可用來治療癌癥的藥物組合物。

在本發明的所述藥物組合物中，所述喹唑啉酮并吲唑衍生物是下式(I)的化合物：

其中，R₁、R₂各自獨立地選自H、鹵素或C₁-C₆烷基；

R₃選擇H、鹵素、C₁-C₆烷基或鹵代C₁-C₆烷基。

在本發明的所述藥物組合物中，所述鹵素的含義是指鹵族元素，非限定地例如可為F、Cl、Br或I。

在本發明的所述藥物組合物中，所述C₁-C₆烷基的含義是指具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，其包括了C₁烷基、C₂烷基、C₃烷基、C₄烷基、C₅烷基或C₆烷基，非限定性地例如可為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基或正己基等。

在本發明的所述藥物組合物中，所述鹵代C₁-C₆烷基的含義是指被所述鹵素取代的上述定義的“C₁-C₆烷基”，非限定性地例如為三氟甲基、五氟乙基、二氟甲基、氯甲基等。

在本發明的所述藥物組合物中，優選R₁為H。

在本發明的所述藥物組合物中，優選R₂為H。

在本發明的所述藥物組合物中，優選R₃為H或鹵代C₁-C₆烷基。

在本發明的所述藥物組合物中，優選R₁為H、R₂為H和R₃為鹵代C₁-C₆烷基。

在本發明的所述藥物組合物中，最優選R₁為H、R₂為H和R₃為三氟甲基。

在本發明的所述藥物組合物中，作為一種優選，所述喹唑啉酮并吲唑衍生物是下式(I-1)化合物：

在本發明的所述藥物組合物中，所述藥物組合物還包含藥學上可接受的載體、賦形劑和/或助劑。

其中，“藥學可接受的載體”是指對有機體不引起顯著刺激也不消除所施用的化合物的生物活性和特性的載體或稀釋劑。通常，這些包括了患者出于藥理學/毒理學方面的考慮，以及制藥化學家出于組合物、制劑、穩定性、患者接受度和生物利用度的物理/化學方面的考慮認為是可以接受的特性和/或物質。

其中，“賦形劑”或“助劑”是指添加到藥物組合物中從而進一步有助于化合物的施用的惰性物質，其實例包括但不局限于：碳酸鈣、磷酸鈣、多種糖和多種淀粉、纖維素衍生物(包括微晶纖維素)、明膠、植物油、聚乙二醇、稀釋劑、粒化劑、潤滑劑、粘結劑、崩解劑以及類似物。

在本發明的所述藥物組合物中，所述癌癥可為肝癌、肺癌、胃癌,宮頸癌和胰腺癌中的任意一種或任意多種，最優選為肝癌。

發明人發現，式(I)的喹唑啉酮并吲唑衍生物具有良好的抗癌活性，尤其是上式(I-1)化合物通過誘導細胞線粒體失活和阻礙Nrf2-ARE信號通路，可有效抑制肝癌細胞Hep3B的生長，且對正常肝細胞HL-7702無害。還觀測到在Hep3B細胞中Caspase-3激活、Bcl-2下降引起線粒體凋亡，同時膜蛋白VDAC1的上調導致線粒體膜電勢下降，共同作用促使線粒體失活，從而引起細胞凋亡。同時，在內源性抗氧化應激通路Nrf2-ARE中，Nrf2受到衍生物影響而下調，其下游的NQO1受到抑制，從而直接或間接損傷細胞導致細胞凋亡。通過細胞活性試驗(MTT染色法)直接說明上式(I-1)化合物對Hep3B細胞的生長具有明顯的抑制作用，而并不影響HL-7702的細胞活性，進一步表明所述化合物對肝癌細胞具有較好的抗癌活性，可作為潛在的抗肝癌藥物。

綜上所述，本發明提供了一種包含喹唑啉酮并吲唑衍生物的抗癌藥物組合物，所述組合物中的特定喹唑啉酮并吲唑衍生物具有良好的抗肝癌活性，可作為潛在的抗肝癌藥物，具有良好的應用前景和價值。

附圖說明

附圖1是式(I-1)化合物對HL-7702和Hep3B細胞調亡及相關蛋白表達的影響活力的影響。

附圖2A-2C是式(I-1)化合物對HL-7702和Hep3B細胞中線粒體膜電位和電壓依賴性陰離子通道1(VDAC1)蛋白的影響。

附圖3是式(I-1)化合物對核轉錄因子Nrf2及下游NQO1蛋白表達的影響。

附圖4A-4B是ARE-熒光素酶測定結果及下游基因的表達。

具體實施方式

下面通過具體的實例對本發明進行詳細說明，但這些例舉性實施方式的用途和目的僅用來例舉本發明，并非對本發明的實際保護范圍構成任何形式的任何限定，更非將本發明的保護范圍局限于此。

實施例1：對不同細胞系的細胞毒性GI₅₀

實驗步驟：其中所使用的Miapaca-2為胰腺癌細胞、Hela為人宮頸癌細胞和Hep3B為人肝癌細胞。分別將各個細胞于含有質量百分比含量為10％胎牛血清的DMEM培養液生長，培養液中的抗生素濃度為100μ/ml青霉素和鏈霉素100μg/ml，細胞培養是在溫度為37℃、二氧化碳體積濃度為5％的培養箱中進行。

將細胞均勻鋪板于96孔板上，細胞密度約為5×10³，每孔加入200μl完全培養液，過夜培養。待細胞順利貼壁生長，加入含有25μm藥物的不含血清DMEM培養基，處理24小時。配制MTT的PBS(磷酸緩沖液)溶液，使得MTT至濃度為5μg/m，加入無血清培養基中于37℃孵育4小時。吸棄培養基，每孔中加入100μl DMSO(二甲基亞砜)，置于搖床室中搖晃20分鐘，至沉淀溶解完全。通過酶標儀測定96孔板在490nm處吸光值，并通過軟件處理。

實驗結果：通過細胞活性試驗(MTT染色法)測量式(I-1)化合物對不同細胞系的細胞毒性GI₅₀(處理細胞光密度相對于未處理細胞光密度下降至50％時的細胞濃度，SEM為平均偏差)，結果見下表1。

表1

從中可知，(I-1)化合物對癌細胞毒性較大，尤以Hela細胞最為顯著，其次為Hep3B細胞，對Miapaca細胞毒性最小。整體看(I-1)化合物對癌細胞均有不同程度的毒害作用，其中對Hep3B非常顯著，適合作為抗肝癌藥物。

實施例2：對HL-7702和Hep3B細胞凋亡及相關蛋白表達的影響

實驗步驟：其中所使用的HL-7702為人正常肝細胞，培養條件與上述Hep3B的培養一致。

用化合物處理Hep3B和HL-7702細胞24小時，胰酶消化并收集細胞。用預冷的PBS沖洗三次，加入100μl細胞裂解液RIPA于冰上裂解30分鐘，期間不時渦旋振蕩。4℃離心后收集上清液并采用bradford法測定蛋白濃度。計算合適上樣濃度后，將蛋白樣品加入合適比例上樣緩沖液，并高溫變性5分鐘。配置分離膠質量含量為10％、濃縮膠質量含量為5％的聚丙烯酰胺凝膠，上樣跑膠，電流40mA、時間為2小時。將蛋白轉移至PVP膜，電流110mA，時間為90分鐘。將膜室溫封閉2小時后，TBST沖洗三次，加入相對應的抗體孵育過夜，TBST沖洗三次，孵育對應二抗2小時，TBST沖洗三次后曝光顯色，并采用軟件處理分析。

實驗結果見圖1，其中四幅圖的縱坐標均為“凋亡蛋白/內參蛋白的相對比率”，以及“*”表示P<0.05和“**”表示P<0.01。

細胞凋亡的發生與發展可概括為誘導細胞凋亡、調節凋亡及效果執行，在這個階段中線粒體電子傳遞鏈在細胞凋亡的起始階段發揮著重要作用。Caspase-3是凋亡執行階段的關鍵點，一旦激活將進一步誘導細胞凋亡。此外，Bcl-2控制多種凋亡基因，并同時受到caspase-3調控及影響。

從圖1中可見，式(I-1)化合物可致使Hep3B細胞中caspase-3激活。而經過與標準品相對比，發現其由35kDa激活成17kDa左右的小片段，進而Bcl-2的表達也同時降低。這進一步說明，式(I-1)化合物可誘導Hep3B細胞凋亡，而對HL-7702細胞則傷害較小。

實施例3：對HL-7702和Hep3B細胞中線粒體膜電位和電壓依賴性陰離子通道1(VDAC1)蛋白的影響

實驗步驟：采用JC-1細胞凋亡檢測試劑盒，測定細胞的線粒體膜電位(MMP)。JC＝1作為線粒體膜電位特異性熒光探針，存在兩種形態，處于低電位時為單體，發射綠色熒光；處于高電位時聚集為復合體，發射紅色熒光。完整的線粒體膜電位處于高電位，而一旦電子鏈出現損傷，即細胞發生凋亡現象，線粒體膜電勢就會降低。JC-1的熒光變化可被視為線粒體膜狀態的一個指標。

將HL-7702細胞和Hep3B細胞經藥物處理24小時后，胰酶消化細胞并收集。PBS沖洗兩次，用JC-1染劑工作液37℃避光孵育30分鐘，然后用預冷的緩沖液沖洗兩次，后懸浮于緩沖液中采用流式細胞儀分析。設置通道分別為FL1(FITC，綠色熒光)和FL2(PE，紅色熒光)進行檢測，后采用modfit軟件分析數據。

電壓依賴性陰離子通道1(VDAC1)蛋白作為線粒體膜上的電子傳遞鏈中的關鍵蛋白，可使用實施例2中的相同方法進行提取。

經流式細胞儀(結果見圖2A-2B)檢測，以及VDAC1蛋白/內參蛋白相對比率直方圖(見圖2C，其中“*”表示P<0.05)，結果見圖2A-2C。

其中，圖2C中，兩幅圖的縱坐標均為“VDAC1蛋白/內參蛋白相對比率”。

線粒體功能在細胞存活與凋亡中發揮重要作用。電壓依賴性陰離子通道1(VDAC1)蛋白是一種多功能蛋白，主要定位于線粒體外膜，調節一系列生理病理活動，例如細胞內鈣離子平衡，能量代謝和細胞凋亡。為進一步確定(I-1)化合物是否可以誘導細胞凋亡導致線粒體損傷，我們研究了線粒體膜電位變化情況及VDAC1表達情況。從圖2A-2B中可知，在正常肝細胞HL-7702中，經(I-1)化合物處理后，紅色熒光為79.4％。同時，在肝癌細胞Hep3B中，經(I-1)化合物處理后，綠色熒光為81.6％。可見，(I-1)化合物對于Hep3B細胞的線粒體膜電位影響更為突出，顯著降低了線粒體膜電位，說明化合物對于肝癌細胞存在更高的毒害作用。

此外，同正常的細胞相比，經(I-1)化合物處理后，Hep3B細胞中VDAC1蛋白的表達明顯上升，這種異常表現，有可能是導致線粒體膜電位損傷的原因。

實施例4：對核轉錄因子Nrf2及下游NQO1蛋白表達的影響

實驗步驟：提取蛋白及western blot與實例2相同。

細胞經化合物處理24小時，收集細胞提取蛋白檢測含量變化，結果見圖3，其中，所有四幅圖的縱坐標均為“Nrf2(NQO1)蛋白/內參蛋白的相對比率”，以及“*”表示P<0.05。

為闡明化合物介導細胞凋亡的分子機制，我們研究了(I-1)化合物通過Nrf2-ARE信號通路在HL-7702細胞和Hep3B細胞中發揮的作用。Nrf2-ARE信號通路用于適應氧化應激，其下游存在眾多抗氧化基因，包括NQO1、HO-1、Gclc等。在正常狀體的癌細胞中，Nrf2蛋白大量激活，導致癌細胞具有比正常細胞更強的抗氧化屬性。圖3顯示，經(I-1)化合物處理后，Hep3B細胞中Nrf2蛋白的表達明顯下降，甚至低于HL-7702中的蛋白含量。化合物(I-1)化合物對Hep3B毒害作用顯著的同時，對HL-7702細胞的影響較小。此外，下游基因NQO1也顯著下降，這一現象，對Hep3B細胞氧化應激體系產生較嚴重的損傷，進一步導致細胞凋亡。

實施例5：ARE-熒光素酶測定結果及下游基因的表達

實驗步驟：將HL-7702細胞和Hep3B細胞以3×10⁴/孔的密度接種至24孔板，待細胞鋪板約70％進行轉染。質粒購自addgene，即pARE-luc(用于檢測ARE信號通路激活)和pRL-SV40-N(攜帶renilla luc基因，用于檢測轉染效率)。質粒根據碧云天生物技術研究所購買的質粒小抽試劑盒提取，-80℃儲存備用。采用脂質體法轉染質粒，按照3:1比例，分別轉染pARE-luc質粒和pRL-SV40-N質粒。轉染6小時后吸棄培養液，加入含有25μm化合物的培養基，分別處理2小時、6小時和24小時。按照時間安排，胰酶消化細胞并收集，采用luc熒光素酶試劑盒檢測，并分析數據。

提取收集細胞的mRNA。采用Trizol試劑進行提取，具體步驟為：收集細胞并用PBS沖洗三次，離心后倒掉上清，向細胞沉淀中加入500μl Trizol試劑，渦旋細胞分散為單細胞，室溫靜置5分鐘。4℃離心，吸取上清至新管中，加入200μl氯仿，上下顛倒至混勻，室溫靜置2分鐘后離心。小心吸取分層液體中最上層至新管中，加入500μl異丙醇，上下顛倒后離心倒棄上清液，管底即為mRNA。再加入預冷的質量百分比濃度為75％的乙醇清洗mRNA，離心后揮發乙醇，加入ddH₂O，測定mRNA濃度。保存于-80℃，用于后續RT-PCR和Q-PCR實驗。

mRNA按照反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，測定濃度后，按照5μl Mix、3μl H₂O、1μl cDNA和0.5μl引物的比例進行RT-PCR實驗。按照10μl SYBR、6μl H₂O、2μl cDNA和1μl引物的比例進行Q-PCR實驗。

考察了(I-1)化合物對HL-7702和Hep3B細胞中Nrf2氧化應激信號通路的影響；實時熒光定量PCR測定Nrf2-ARE信號通路下游基因(HO-1、NQO1、Gclc)的表達情況，結果見圖4A-4B(“*”表示P<0.05和“**”表示P<0.01。)。其中圖4A中兩幅圖的縱坐標均為“熒光素酶單元表達的相對值”，圖4B中三幅圖的縱坐標均為“光相對密度”。

從圖4A中可知，經(I-1)化合物處理后，細胞Nrf2-ARE信號通路出現不同程度活化現象。處理2小時和6小時時，Hep3B細胞的Nrf2-ARE信號通路處于抑制狀態，而HL-7702細胞的Nrf2-ARE信號通路不受影響，甚至還在6小時時出現略有上升的跡象。但在24小時時，可能處理時間過長，(I-1)化合物濃度下降等原因，(I-1)化合物對細胞的影響逐漸減少，Hep3B細胞的抑制狀態基本解除，其中ARE-luc熒光明顯上升。

同時，還檢測了mRNA的變化情況，發現(I-1)化合物處理后對Hep3B的影響較大，其中尤其是下游基因NQO1和GCLC。mRNA水平的降低，直接導致蛋白的表達(見圖4B)。由于可知，(I-1)化合物對Hep3B存在較大影響，它們可以抑制氧化應激通路信號傳遞，減少Nrf2蛋白表達，從而影響下游抗氧化基因的表達，進而導致Hep3B細胞凋亡。

綜上所述，由上述所有實施例可明確看出，本發明所述的喹唑啉酮并吲唑衍生物具有良好的治療癌癥的藥物活性，尤其是對肝癌具有良好的治療效果，而不影響正常肝細胞的正常生理功能，從而在肝癌治療領域具有良好的應用前景和潛力。

應當理解，這些實施例的用途僅用于說明本發明而非意欲限制本發明的保護范圍。此外，也應理解，在閱讀了本發明的技術內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動、修改和/或變型，所有的這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的保護范圍之內。