一種復合膠原生物膜及其制備方法與流程

本發明涉及生物醫用材料
技術領域：
，特別涉及一種復合膠原生物膜及其制備方法。
背景技術：
：膠原(Collagen)作為一種生物高分子是動物結締組織中的主要成分，也是哺乳動物體內含量最多、分布最廣的功能性蛋白，占蛋白質總量的25％～30％。與組織的形成、成熟、細胞間信息的傳遞，以及關節潤滑、傷口愈合、鈣化作用、血液凝固和衰老等有著密切的關系。膠原也是生物科技產業最具關鍵性的原材料之一，在醫學材料、化妝品、食品工業等均有著廣泛應用。在空間結構上，膠原顯示出特殊的三股螺旋纏繞的結構，三條相互獨立的膠原蛋白肽鏈依靠甘氨酸之間形成的氫鍵維系三股螺旋相互纏繞的結構。膠原這種特殊的三股螺旋結構保證了它的機械強度。膠原纖維是膠原行使生理作用的基本形態，在生物體內膠原纖維交織成富有機械強度和彈性的網狀結構成為結締組織最基本的組成成分。硬腦膜是保護腦組織的一道重要屏障，對于維護神經系統的結構及功能活動意義重大。手術修補硬膜、封閉硬膜下腔，可明顯減少或預防腦脊液漏、顱內感染、癲瘸等癥狀。因此神經外科手術后保持硬腦膜層完整是必要的。創傷、腫瘤侵蝕及手術過程硬腦膜皺縮等因素均可造成硬腦膜的缺損，使得原位關閉硬膜下腔無法完成，此外，神經外科的減壓術通常需要擴大膜下腔。此類情況通常需要使用硬腦膜替代材料完成硬膜修復。天然材料及人工合成材料作為硬腦膜替代品分為可吸收材料和不可吸收材料，此類材料容易制成需要的形狀和大小，容易消毒，不擔心傳遞疾病的風險。可吸收材料可在體內最終降解、吸收，由生成的新腦膜替代修復腦膜缺損。膠原基質通常提取于牛、豬等動物的跟腱或皮膚，可作為硬腦膜修補材料，是一種可吸收的生物材料，與人硬膜主要成分類似，其主要成分是Ⅰ型膠原蛋白。腦膜替代品目前已經以多種形態如膜、薄片、海綿進行實驗及臨床應用。來自動物的Ⅰ型膠原分子的尾肽經酶處理去除后具有極低的免疫原性，并可誘導成纖維細胞粘附增生以及膜的血管化，從而加速植入材料自體化過程。從理論上講，膠原作為一種可吸收材料是最理想的腦膜替代材料。因此，需要高質量的復合膠原生物膜作為硬腦膜和脊柱膜等的替代品。技術實現要素：為解決上述技術問題，本發明提供了一種復合膠原生物膜及其制備方法。技術方案如下：在第一方面，本發明提供了一種復合膠原生物膜，復合膠原生物膜中的膠原具有三股螺旋結構；復合膠原生物膜的厚度為0.2-0.9cm；具有三維孔徑結構，其中多孔層孔徑為60-400微米，致密層孔徑為100-900微米。在第二方面，本發明還提供了一種復合膠原生物膜的制備方法，包括以下步驟，將膠原與水混合，向其中加入第一乳酸溶液和/或第一鹽酸溶液，使膠原均勻分散，制成第一漿液；將膠原與水混合，向其中加入第二乳酸溶液和/或第二鹽酸溶液，使膠原均勻分散，制成第二漿液；膠原在第一漿液中的質量分數大于膠原在第二漿液中的質量分數；調節所述第一漿液的pH值至為4-6.5，之后對所述第一漿液進行真空脫泡，然后脫水壓縮，再預冷凍；調節所述第二漿液的pH值至5.5-6.5，之后對所述第二漿液進行真空脫泡；將第二漿液倒入已經冷凍的第一漿液上，之后冷凍干燥；采用物理和/或化學方法交聯，即獲得復合膠原生物膜。在本發明的一種優選實施方式中，所述膠原在第一漿液中的質量分數為1％-4％；所述膠原在所述第二漿液中的質量分數為0.3％-1.5％。在本發明的一種優選實施方式中，所述第一漿液的pH值為2-3，第二漿液的pH值為2.8-3.8。在本發明的一種優選實施方式中，所述冷凍干燥為在真空度為120-250毫托的條件下，4-10℃保持40min，-45--35℃保持120-210min，0℃保持20-24h，20-25℃保持2-9h。在本發明的一種優選實施方式中，所述物理交聯方法為：采用254nm的紫外線照射7-13h，或者所述物理交聯方法為：在真空條件下100-120℃脫水處理2-3天，之后降溫至50℃以下；所述化學交聯方法為：采用甲醛氣體交聯。在本發明的一種優選實施方式中，所述膠原由以下步驟制得：先對牛跟腱進行切片；再將切片的牛跟腱浸泡在無花果蛋白酶的質量分數為0.005％-0.2％的磷酸鹽緩沖液中，在4-15℃下保持12-24h；然后向所述磷酸鹽緩沖液中加入氧化劑，用水沖洗所述切片的牛跟腱；所述氧化劑選自亞氯酸鹽和過氧化氫中的至少一種；最后將所述切片的牛跟腱浸泡在氫氧化鈉摩爾濃度為1-2mol/L的鹽溶液中，在4-15℃下保持1-4天，之后調節所述鹽溶液的pH值為4-7，收集產物，對產物進行反復清洗，脫水處理，獲得膠原。在本發明的一種更優選實施方式中，所述無花果蛋白酶的質量分數為0.05％-0.1％；所述磷酸鹽緩沖液的pH值為5-7，磷酸根的摩爾濃度為0.01-0.1mol/L。在本發明的一種更優選實施方式中，所述氧化劑的加入體積為所述磷酸鹽緩沖液的1‰-5‰；所述氧化劑為過氧化氫。在本發明的一種更優選實施方式中，基于所述鹽溶液的總質量，所述鹽的質量分數為10％-30％；所述鹽溶液中的鹽選自氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉中的至少一種。本發明實施例提供的技術方案的有益效果是：本發明提供的復合膠原生物膜具有致密層和多孔層雙層復合結構，不但保持了膠原的生物學優良性能，即三股螺旋結構，機械強度高，而且具有可縫合性，可生物降解，免疫原性低，有助于組織生長，促進修復，降解可控等優點，可作為硬腦膜和脊柱膜等的替代品。附圖說明為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發明一示例性實施例示出的復合膠原生物膜的橫截面掃描電鏡圖；圖2為本發明一示例性實施例示出的復合膠原生物膜的制備方法中膠原的SDS-PAGE電泳圖；圖3為本發明一示例性實施例示出的復合膠原生物膜的制備方法中膠原的紅外光譜圖；圖4為本發明一示例性實施例示出的復合膠原生物膜的制備方法中膠原的紫外光譜圖；圖5為本發明一示例性實施例示出的復合膠原生物膜的制備方法獲得的復合膠原生物膜中致密層的掃描電鏡圖；圖6為本發明一示例性實施例示出的復合膠原生物膜的制備方法獲得的復合膠原生物膜中多孔層的掃描電鏡圖。具體實施方式為使本發明的技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明實施方式作進一步地詳細描述。在第一方面，如圖1所示，本發明提供了一種復合膠原生物膜，該復合膠原生物膜中的膠原具有三股螺旋結構；復合膠原生物膜的厚度為0.2-0.9cm，優選地，復合膠原生物膜的厚度為0.5cm；具有三維孔徑結構，其中，多孔層孔徑為60-400微米，致密層孔徑為100-900微米。本發明提供的復合膠原生物膜膠原復合生物膜由膠原密度較高的致密層和孔隙較大的多孔層復合而成，不但保持了膠原的生物學優良性能，即三股螺旋結構，機械強度高，而且可吸收，免疫原性低，有助于組織生長，促進修復，降解可控等優點，可作為硬腦膜和脊柱膜等的替代品，相對于普通的膠原生物膜可與硬腦膜縫合也可不縫合直接覆蓋，更易于手術操作。其中，在復合膠原生物膜的致密層分布著突起，突起可以為12-16個/cm2，突起的高度可以為2-5mm，突起在致密層上呈均勻分布。突起的存在使得復合膠原生物膜的機械強度更高，而且致密層與多孔層的結合更緊密。在第二方面，本發明提供了一種復合膠原生物膜的制備方法，包括以下步驟，將膠原與水混合，向其中加入第一乳酸溶液和/或第一鹽酸溶液，使膠原均勻分散，制成第一漿液；將膠原與水混合，向其中加入第二乳酸溶液和/或第二鹽酸溶液，使膠原均勻分散，制成第二漿液；膠原在第一漿液中的質量分數大于膠原在第二漿液中的質量分數；調節所述第一漿液的pH值至為4-6.5，之后對所述第一漿液進行真空脫泡，然后脫水壓縮，再預冷凍；調節所述第二漿液的pH值至5.5-6.5，之后對所述第二漿液進行真空脫泡；將第二漿液倒入已經冷凍的第一漿液上，之后冷凍干燥；采用物理和/或化學方法交聯，即獲得復合膠原生物膜。本發明提供的復合膠原生物膜的制備方法通過對第一漿液和第二漿液的pH值的調節，使得制備的復合膠原生物膜的pH值更接近于人體自身環境的pH值。并且復合膠原生物膜具有致密層和多孔層雙層復合結構，還保持了膠原三股螺旋結構，機械強度更高，而且可吸收，免疫原性低，有助于組織生長，促進修復，降解可控等優點，可作為硬腦膜和脊柱膜等的替代品，相對于普通的膠原生物膜可與硬腦膜縫合也可不縫合直接覆蓋，更易于手術操作。需要說明的是，對第一漿液進行脫水壓縮，可以放入模具中進行壓縮脫水，在脫水壓縮過程中形成致密層的突起，突起可以12-16個/cm2，突起的高度可以為2-5mm，突起在致密層上呈均勻分布。突起使得制備的復合膠原生物膜具有更高的機械強度，與多孔層結合更緊密。還有，對第一漿液進行預冷凍，可以采取將在-20℃保存4h以上來實現，冷凍后，再將第二漿液倒在第一漿液上，冷凍干燥，形成雙層復合結構。再有，若發現第一漿液或第二漿液中有不溶物質，可以對其進行過濾處理，具體可以利用40目的不銹鋼的濾布過濾兩次。此外，第一漿液的pH值優選為2-3，第二漿液的pH值優選為2.8-3.8，此pH值范圍內的第一漿液和第二漿液澄清透明度高，而且在后續調節pH值時，減少堿的用量，即鹽離子的用量和殘留，獲得高純度的免疫原性更低的復合膠原生物膜。需要進一步說明的是，可以使用低濃度氫氧化鈉溶液，如0.5mol/L的氫氧化鈉將第一漿液的pH值調節至4-6.5，和第二漿液的pH值調節至5.5-6.5，在該pH范圍內，冷凍干燥后形成的復合膠原海綿的pH值近中性，即接近人體的pH值。在實際應用中，本發明提供的膠原生物膜的制備方法的膠原可以來源于牛、豬等動物的跟腱或皮膚，優選為牛跟腱。在實際應用中，所述膠原在第一漿液中的質量分數為1％-4％；所述膠原在所述第二漿液中的質量分數為0.3％-1.5％，來實現形成致密層和多孔層的雙層結構，膠原用量的限定，可使人體組織對復合膠原生物膜的吸收速率和組織的再生速率相當。作為本發明的一種改進的實施方式，所述第一乳酸溶液和所述第二乳酸溶液中乳酸的摩爾濃度均為0.01-0.05mol/L；所述第一鹽酸溶液和所述第二鹽酸溶液中鹽酸的摩爾濃度均為0.05-0.1mol/L。第一漿液和第二漿液中的膠原呈現細長纖維狀，第一漿液和第二漿液呈現透明的狀態；選擇乳酸和鹽酸溶解膠原，即便乳酸和鹽酸在膠原生物膜上有殘留，由于乳酸是人體自身代謝物質，鹽酸在人體內能生成氯化鈉，所以二者的殘留對人體無礙。因此，本發明的膠原生物膜的制備方法符合人體的需要。在實際應用中，所述冷凍干燥優選為在真空度為120-250毫托的條件下，4-10℃保持40min，-45--35℃保持120-210min，0℃保持20-24h，20-25℃保持2-9h。在具體的實施方式中，優選地，所述物理交聯方法為：采用254nm的紫外線照射7-13h，或者所述物理交聯方法為：在真空條件下100-120℃脫水處理2-3天，之后降溫至50℃以下。真空干燥這種重度脫水的方法可以提高膠原的穩定性，防止組織膠原基質塌陷，通過脫水，縮短了膠原活性基之間的距離，導致膠原分子之間發生交聯，提高了變性溫度，降低了其自由氨基酸的含量，從而提高了膠原的機械強度。在具體的實施方式中，優選地，所述化學交聯方法為：采用甲醛氣體交聯。在實際應用中，可以采用質量分數為5％-30％的甲醛溶液發揮出的甲醛氣體對凍干后的膠原進行交聯改性，通常時間為3-5h。采用本發明提供的物理或化學交聯方法改性后，有利于提高膠原材料的拉伸強度及抗降解能力，降低其膨脹率，改善膠原的抗水性等，而且增強了復合生物膜的機械強度，不僅如此復合膠原生物膜中不會引入其他雜質，保證其純度。作為本發明的再一種改進的實施方式，所述膠原由以下步驟制得：先對牛跟腱進行切片；再將切片的牛跟腱浸泡在無花果蛋白酶的質量分數為0.005％-0.2％的磷酸鹽緩沖液中，在4-15℃下保持12-24h；然后向所述磷酸鹽緩沖液中加入氧化劑，用水沖洗所述切片的牛跟腱；所述氧化劑選自亞氯酸鹽和過氧化氫中的至少一種；最后將所述切片的牛跟腱浸泡在氫氧化鈉摩爾濃度為1-2mol/L的鹽溶液中，在4-15℃下保持1-4天，之后調節所述鹽溶液的pH值為4-7，收集產物，對產物進行反復清洗，脫水處理，獲得膠原。本發明提供的復合膠原生物膜的制備方法，先將牛跟腱切成薄片，使膠原容易從牛跟腱中釋放出來，再用無花果蛋白酶進行酶水解，去除膠原的端肽，降低炎癥反應，使緊致的切片的牛跟腱變得松散，對其中的膠原進行初步提取，無花果蛋白酶是植物來源的蛋白酶不但具有很好的提取膠原的效果，人體對其不具有排異性，而且相對于動物來源的蛋白酶避免了免疫原干擾。磷酸鹽緩沖溶液為無花果蛋白酶的活性提供適宜條件。然后用氫氧化鈉進行堿水解，一定濃度的氫氧化鈉可以去除牛跟腱自身攜帶的朊病毒等致病因素，并能進一步使膠原從牛跟腱中解離出來，一定濃度的鹽溶液使解離出的膠原處于不溶狀態，并容易與其它雜質和溶液分離，而且有效地防止膠原水解成膠原蛋白。將溫度嚴格控制在4-15℃是為了防止高溫時膠原降解。對產物反復清洗是除去膠原上的各種離子，再脫水，獲得高純度的三股螺旋結構完整的膠原。需要說明的是，在堿水解疏松的牛跟腱的過程中可以輕微振蕩或晃動，但不能用力攪拌，防止機械外力使膠原的肽鏈斷裂。需要進一步說明的是，將鹽溶液的pH值調節至4-7，優選為6-7，具體操作，向鹽溶液中滴加酸來調節pH值，摩爾濃度為0.05-2mol/L的硫酸溶液、鹽酸溶液或乙酸溶液等。在實際應用中，先對牛跟腱進行切片，再用水反復沖洗，去除水分。將牛跟腱切片是為了更容易提取其中的膠原。用水反復沖洗，是為了進一步去除切片牛跟腱含有的雜質。還有，在對牛跟腱進行切片之前，先對牛跟腱進行預處理，預處理的步驟具體可以為：用水對牛跟腱進行反復沖洗，之后用質量分數為20％-75％乙醇溶液漂洗15-45min，用水反復沖洗。對整根的牛跟腱初步進行除雜，洗去表面的血污塵土等雜質，質量分數為20％-75％乙醇溶液對血污去除效果比較好，并且還能消毒殺菌，優選為質量分數為65％-75％的乙醇溶液，更優選為質量分數75％的乙醇溶液。經過漂洗，牛跟腱會變得更白，后續獲得的膠原也會更白更純。再有，切片可以為冷凍切片，將牛跟腱于-20℃冷凍過夜，大致為7-12h，更容易將牛跟腱切成薄片。在實際操作中，可以使用切片機將牛跟腱切成厚度為1-3mm的薄片。此外，亞氯酸鹽優選為亞氯酸鈉。亞氯酸鈉更容易在后續水洗過程中去掉。為了增強無花果蛋白酶的水解效果，同時減少試劑成本，優選地，無花果蛋白酶在磷酸鹽緩沖液中的質量分數為0.05％-0.1％。為了進一步增強無花果蛋白酶的水解效果，為無花果蛋白酶發揮其酶水解作用提供更適宜的條件和環境，磷酸鹽緩沖溶液的pH值為5-7，優選為pH值5.8-6.5，更優選為pH值6.4；磷酸根的摩爾濃度為0.01-0.1mol/L，更優選為0.02-0.06，更優選為0.03mol/L。磷酸鹽緩沖液可以由磷酸二氫鉀、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鈉和磷酸一氫鈉中的至少一種配制而成。作為本發明的一種改進的實施方式，氧化劑優選為過氧化氫。過氧化氫是一種氧化性很強的氧化劑，可將無花果蛋白酶滅活，同時分解成氧氣和水，不會向膠原中引入其他離子。作為本發明的一種進一步改進的實施方式，氧化劑的加入體積為磷酸鹽緩沖液的1‰-5‰。此加入量即可使無花果蛋白酶完全滅活。作為本發明的另一種改進的實施方式，基于所述鹽溶液的總質量，所述鹽的質量分數為10％-30％。此濃度范圍，更有利于膠原從鹽溶液中析出，防止膠原發生水解而生成膠原蛋白。作為本發明的再一種改進的實施方式，鹽溶液中的鹽選自氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉中的至少一種。對本發明提供的膠原生物膜進行包裝滅菌。低溫環氧乙烷消毒滅菌具體：冷凍干燥的海綿按照要求的規格大小裁剪后雙層包裝，100％環氧乙烷滅菌處理；預真空為-50--60Kpa；滅菌濕度為55-74％RH；滅菌溫度為35-39℃；換氣次數為10次，滅菌時間3-9h，優化的滅菌時間4-8h；滅菌結束后測定無菌和環氧乙烷殘留，確認樣品無菌并且環氧乙烷殘留符合規定要求。需要說明的是，本發明所使用的水均為醫藥行業所用的純化水，滿足藥典標準。試劑和儀器試劑均市售可得。實施例1-4提取膠原實施例1選取新鮮的牛跟腱組織1kg，水沖洗6次，75％酒精漂洗20min；用剪刀剔除筋膜和雜質，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片至約1mm，備用；稱取100g腱片，純化水沖洗5次；5L的純化水室溫浸泡5h；純化水沖洗5次，濾干水分備用；清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.05％無花果蛋白酶的pH值為6的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液中，在4℃下浸泡24小時后；向其中加入體積為磷酸鹽緩沖液體積的3‰的過氧化氫混勻后靜置4h滅活無花果蛋白酶，純化水沖洗；然后在4℃條件下，1M的氫氧化鈉的氯化鈉溶液中浸泡4天，靜置中間輕輕晃動；滴加0.05mol/L的鹽酸，調整pH至6；過濾收集膠原沉淀；純化水沖洗膠原5次，4000轉/min離心20min，得到膠原樣品。如圖2所示，十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)檢測膠原的分子量約為30萬道爾頓。實施例2選取新鮮的牛跟腱組織1kg，水沖洗9次，45％酒精漂洗30min；用剪刀剔除筋膜和雜質，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片至約2mm，備用；稱取100g腱片，純化水沖洗5次；5L的純化水室溫浸泡3h；純化水沖洗5次，濾干水分備用；清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.005％無花果蛋白酶的pH值為5的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液中，在4℃下浸泡24小時后；向其中加入體積為磷酸鹽緩沖液體積的1‰的亞氯酸鈉混勻后靜置4h滅活無花果蛋白酶，純化水沖洗；然后在4℃條件下，1.5M的氫氧化鈉的氯化鈉溶液中浸泡4天，靜置中間輕輕晃動；滴加0.05mol/L的鹽酸，調整pH至5；過濾收集膠原沉淀；純化水沖洗膠原9次，4000轉/min離心20min，得到膠原樣品。十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)檢測膠原的分子量約為30萬道爾頓。實施例3選取新鮮的牛跟腱組織1kg，水沖洗3次，20％酒精漂洗40min；用剪刀剔除筋膜和雜質，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片至約3mm，備用；稱取100g腱片，純化水沖洗5次；5L的純化水室溫浸泡3h；純化水沖洗5次，濾干水分備用；清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.1％無花果蛋白酶的pH值為5的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液中，在15℃下浸泡24小時后；向其中加入體積為磷酸鹽緩沖液體積的4‰的過氧化氫混勻后靜置5h滅活無花果蛋白酶，純化水沖洗；然后在15℃條件下，1.5M的氫氧化鈉的氯化鈉溶液中浸泡4天，靜置中間輕輕晃動；滴加0.05mol/L的硫酸，調整pH至4；過濾收集膠原沉淀；純化水沖洗膠原10次，4000轉/min離心20min，得到膠原樣品。十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)檢測膠原的分子量約為30萬道爾頓。實施例4選取新鮮的牛跟腱組織1kg，水沖洗3次，65％酒精漂洗25min；用剪刀剔除筋膜和雜質，水洗后，-20℃冷凍過夜；切片機切片至約3mm，備用；稱取100g腱片，純化水沖洗5次；5L的純化水室溫浸泡3h；純化水沖洗5次，濾干水分備用；清洗后的腱片(即切片的牛跟腱)浸泡在含有0.2％無花果蛋白酶的pH值為7的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液中，在10℃下浸泡24小時后；向其中加入體積為磷酸鹽緩沖液體積的5‰的過氧化氫混勻后靜置5h滅活無花果蛋白酶，純化水沖洗；然后在10℃條件下，2M的氫氧化鈉的氯化鈉溶液中浸泡4天，靜置中間輕輕晃動；滴加0.05mol/L的硫酸，調整pH至7；過濾收集膠原沉淀；純化水沖洗膠原8次，4000轉/min離心20min，得到膠原樣品。十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)檢測膠原的分子量約為30萬道爾頓。實施例5膠原的結構檢測圖3為實施例1提取的膠原樣品的紅外光譜圖。從圖3可知，1653.9cm-1為酰胺I帶的C＝O伸縮振動吸收峰，說明樣品中都存在形成三股螺旋內氫鍵的C＝O；1552.6cm-1為酰胺II帶的N-H彎曲振動吸收峰；1239.1cm-1為酰胺III帶的N-H變形峰；1239.1cm-1～1452.2cm-1范圍存在的吸收峰表明膠原三螺旋結構的完整性；3422.8cm-1為膠原的N-H伸縮振動峰，說明肽鏈間氫鍵的存在；1239.1cm-1與1452.4cm-1的吸收峰強度比值為1.02，非常接近膠原特征值1.0。由此可見，本發明所制備的膠原主要為Ⅰ型膠原，Ⅰ型膠原的三股螺旋結構是保持較完整的。本發明提供的一種從牛跟腱中提取膠原的方法可保持膠原的三股螺旋結構的完整。實施例6膠原的純度檢測圖4為實施例1提取的I型膠原樣品的紫外吸收光譜圖。從圖4中可以看出，純化得樣品在波長217nm處有紫外光譜最大吸收峰值，峰面積為0.375。由上述實施例可知，膠原三股螺旋結構完整性好，純度高，并且膠原的提取方法簡單，無需高端設備，提取成本低。實施例7至實施例11復合膠原生物膜的制備實施例7致密層制備將膠原加入到水中，并滴加0.01M(mol/L)乳酸溶液，調節pH值為2.8，乳化泵10000rpm(轉/min)高速混勻5min，制成第一漿液，膠原在第一漿液中的質量分數為0.5％；40目不銹鋼濾布過濾兩次，去除不溶的物質；過濾后真空脫泡，緩慢滴加低濃度(0.5M)的氫氧化鈉溶液調節液體的pH至5.5；脫水壓縮后，于-20℃預冷凍4h。多孔層制備將膠原加入到水中，并滴加0.01M(mol/L)乳酸溶液，調節pH值為2.8，乳化泵6000rpm(轉/min)高速混勻5min，制成第二漿液，膠原在第二漿液中的質量分數為0.3％；40目不銹鋼濾布過濾兩次，去除不溶的物質；緩慢滴加低濃度(0.5M)的氫氧化鈉溶液調節液體的pH至5.5；過濾并真空脫泡，將制備好的第二漿液倒入已冷凍的第一漿液上，在真空度為120毫托的條件下，10℃保持40min，-45℃保持150min，0℃保持20h，20℃保持5h進行冷凍干燥，得到復合膠原海綿。用化學方法交聯，質量分數為10％的甲醛溶液所揮發的甲醛中保持4h，得到成品，即復合膠原生物膜。實施例8致密層制備將膠原加入到水中，并滴加0.02M(mol/L)乳酸溶液，調節pH值為2.8，乳化泵7000rpm(轉/min)高速混勻5min，制成第一漿液，膠原在第一漿液中的質量分數為0.8％；40目不銹鋼濾布過濾兩次，去除不溶的物質；過濾后真空脫泡，緩慢滴加低濃度(0.5M)的氫氧化鈉溶液調節液體的pH至4.5；脫水壓縮后，于-20℃預冷凍4h。多孔層制備將膠原加入到水中，并滴加0.03M(mol/L)乳酸溶液，調節pH值為3，乳化泵8000rpm高速混勻5min，制成第二漿液，膠原在第二漿液中的質量分數為0.5％；40目不銹鋼濾布過濾兩次，去除不溶的物質；緩慢滴加低濃度(0.5M)的氫氧化鈉溶液調節液體的pH至6；過濾并真空脫泡，將制備好的第二漿液倒入已冷凍的第一漿液上，在真空度為120毫托的條件下，10℃保持40min，-35℃保持120min，0℃保持22h，25℃保持9h進行冷凍干燥，得到復合膠原海綿。用化學方法交聯，質量分數為10％的甲醛溶液所揮發的甲醛中保持5h，得到成品。實施例9致密層制備膠原加入到水中，并滴加0.05M(mol/L)乳酸溶液，調節pH為3.0，乳化泵6000rpm(轉/min)高速混勻5min，制成第一漿液，膠原在第一漿液中的質量分數為1.0％；40目不銹鋼濾布過濾兩次，去除不溶的物質；過濾后真空脫泡，緩慢滴加低濃度(0.5M)的氫氧化鈉溶液調節液體的pH至4；脫水壓縮后，于-20℃預冷凍4h。多孔層制備將膠原加入到水中，并滴加0.05M(mol/L)乳酸溶液，調節pH值為3.5，乳化泵8000rpm高速混勻5min，制成第二漿液，膠原在第二漿液中的質量分數為1.0％；40目不銹鋼濾布過濾兩次，去除不溶的物質；緩慢滴加低濃度(0.5M)的氫氧化鈉溶液調節液體的pH至6.5；過濾并真空脫泡，將制備好的第二漿液倒入已冷凍的第一漿液上，在真空度為220毫托的條件下，6℃保持40min，-38℃保持180min，0℃保持24h，24℃保持7h進行冷凍干燥，得到復合膠原海綿。用化學方法交聯，氣體交聯，質量分數為10％的甲醛溶液揮發的甲醛氣體中保持5h，得到成品。實施例10致密層制備將膠原加入到水中，并滴加0.05M(mol/L)乳酸溶液，調節pH為3.2，乳化泵6000rpm(轉/min)高速混勻5min，制成第一漿液，膠原在第一漿液中的質量分數為1.2％；40目不銹鋼濾布過濾兩次，去除不溶的物質；過濾后真空脫泡，緩慢滴加低濃度(0.5M)的氫氧化鈉溶液調節液體的pH至6.5；脫水壓縮后，于-20℃預冷凍4h。多孔層制備將膠原加入到水中，并滴加0.03M(mol/L)乳酸溶液，調節pH為3.8，乳化泵8000rpm高速混勻5min，制成第二漿液，膠原在第二漿液中的質量分數為0.5％；40目不銹鋼濾布過濾兩次，去除不溶的物質；緩慢滴加低濃度(0.5M)的氫氧化鈉溶液調節液體的pH至5.8；過濾并真空脫泡，將制備好的第二漿液倒入已冷凍的第一漿液上，在真空度為150毫托的條件下，10℃保持40min，-45℃保持150min，0℃保持20h，20℃保持5h進行冷凍干燥，得到復合膠原海綿。用物理方法交聯，120℃，真空48h，得到成品。如圖1所示，約在圖1上部的1/2處為多孔層，約在圖1下部的1/2處為致密層。其中，復合膠原生物膜的致密層參見圖5，復合膠原生物膜的多孔層參見圖6。實施例11致密層制備將膠原加入到水中，并滴加0.05M(mol/L)乳酸溶液，調節pH為3.4，乳化泵10000rpm(轉/min)高速混勻5min，制成第一漿液，膠原在第一漿液中的質量分數為1.5％；40目不銹鋼濾布過濾兩次，去除不溶的物質；過濾后真空脫泡，緩慢滴加低濃度(0.5M)的氫氧化鈉溶液調節液體的pH至6.4；脫水壓縮后，于-20℃預冷凍4h。多孔層制備將膠原加入到水中，并滴加0.05M(mol/L)乳酸溶液，乳化泵8000rpm高速混勻5min，制成第二漿液，膠原在第二漿液中的質量分數為1.0％；40目不銹鋼濾布過濾兩次，去除不溶的物質；緩慢滴加低濃度(0.5M)的氫氧化鈉溶液調節液體的pH至6.2；過濾并真空脫泡，將制備好的第二漿液倒入已冷凍的第一漿液上，在真空度為150毫托的條件下，10℃保持40min，-45℃保持150min，0℃保持24h，25℃保持8h進行干燥得到復合膠原海綿。用物理方法交聯，100℃，真空72h，得到成品。對實施例7至實施例11所制備的復合膠原生物膜進行電鏡掃描檢測，結果如表1所示。表1實施例7至11的復合膠原生物膜的電鏡掃描結果實施例膠原生物膜的厚度多孔層的孔徑致密層的孔徑實施例70.5cm100-400μm200-900μm實施例80.5cm80-400μm200-800μm實施例90.5cm60-300μm150-700μm實施例100.5cm80-350μm150-600μm實施例110.5cm80-350μm100-600μm由表1和圖1可知，復合膠原生物膜總厚度約為0.2-0.9厘米，具有三維孔徑結構，多孔層孔徑大小為60-400微米，致密層孔徑大小為100-900微米。實施例12動物實驗將新西蘭兔分隨機分為a、b、c，3組，每組12只，于冠狀縫后，中線右側用電鉆磨1骨窗，暴露硬腦膜并人為造成硬腦膜缺損，a、b、c，三組中的4只兔應用實施例9制備的復合膠原生物膜，4只兔應用上市產品(integra，作為對照)進行硬膜缺損修補，4只不予修補。a、b、c三組分別于術后30天、90天、180天處死。術前及處死前采集各組靜脈血lmL進行白細胞、淋巴細胞計數。術后對動物進行臨床觀察至預定日期處死，然后擴展開窗，連同硬腦膜、修補材料和腦組織取下，進行標本大體觀察，并判斷修補材料內表面與腦組織粘連程度。將標本一部分固定于質量分數為10％的福爾馬林中1周，石蠟包埋，切片行蘇木素—伊紅染色，行組織學檢查，對比觀察植入材料局部細胞浸潤情況觀察局部蛛網膜、硬膜下腔、及腦皮質情況。結論：臨床觀察各組動物除未進行修補的樣品外無腦脊液漏發生，未發現動物出現術后并發癥，我們的產品與對照樣品有相似的修補性能。各組動物術前、處死前的白細胞總數、淋巴細胞計數無顯著差異(P>0.05)。術后30天、90天180天兩種腦膜腦粘連差異無統計學意義(P>0.05)。各組病理檢查移植物無變性、包裹、鈣化；各組動物硬膜修補局部均可見不同程度硬膜下腔及蛛網膜病理改變，各組植入材料(復合膠原生物膜)局部炎癥細胞浸潤無顯著差異(P>0.05)。以上所述僅是為了便于本領域的技術人員理解本發明的技術方案，并不用以限制本發明。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3