本發明涉及原發性三叉神經痛藥物用途發明領域，尤其是涉及長非編碼核糖核酸(LncRNA)uc.48+小干擾RNA可用于在制備緩解原發性三叉神經痛鎮痛治療藥物中的應用，其作用機理涉及抑制三叉神經節嘌呤2X(P2X)4受體和降鈣素基因相關肽(calcitoningenerelatedpeptide,CGRP)介導的痛覺信息傳遞。
背景技術：
：：疼痛是大多數疾病具有的共同癥狀，是人類共有而個體差異很大的一種不愉快的感覺。三叉神經痛(trigeminalneuralgia,TN)是指三叉神經分布區域內反復發作的陣發性劇烈疼痛，在臨床上發病率較高，對病人的生活影響較大。疼痛發作時表現為驟然發生的閃電樣、短暫而劇烈的疼痛，常難以忍受，疼痛可以像電擊、抽痛、刀割等，每次發作持續幾秒至1-2分鐘不等，突然發作，突然停止，間歇期正常，發作反復，春季和冬季較容易發病。目前已經明確，三叉神經痛是一種慢性疼痛綜合癥，治療的方法有很多，但是還沒有可靠而有效的標準化治療方法，一般分為無創治療和手術治療。前者包括藥物治療、伽瑪刀治療和神經阻滯治療等；后者包括各種末梢神經切斷術、半月神經節和神經血管減壓術等。治療三叉神經痛首選藥物治療，對于效果不理想或者出現嚴重副作用因而不能繼續服藥的病人而言，可以考慮進行神經阻滯手術，或者采用其它手術和治療方法，但臨床上治療藥物雖然較多，可有效而副作用較小的藥很少，而且有些藥物可能一開始有效但很快產生耐藥性，給治療帶來很大困難，常無法達到理想的治療效果。手術治療效果較明顯，但適應癥少，適用范圍小，副作用大，破壞力強，影響病人生活質量，往往病人難以接受，所以臨床使用有限。三叉神經痛發作反復，疼痛劇烈，讓人難以忍受，并且臨床沒有可靠有效的治療方法，給病人及其家屬的生活都帶來極大的痛苦，因此一直以來都成為人們研究的重點。嘌呤類物質三磷酸腺苷(ATP)作為重要的信使物質參與痛覺信息傳遞。嘌呤(Purine)受體分為嘌呤1和嘌呤2(Purine1，Purine2；P1，P2)受體，ATP及其類似物作用于P2受體。P2受體分為配體門控性離子通道型受體(P2X受體)和G蛋白偶聯型受體(P2Y受體)。P2X受體有七種亞型(P2X1-7)。P2X4受體屬嘌呤受體家族中的P2X系列亞型，可以廣泛表達于腦與脊髓中的神經小膠質細胞表面。新的研究表明該受體在構建和維持神經病理性疼痛上扮演著很重要的角色。動物實驗表明在體外培養活化小膠質細胞，然后鞘內注射活化的小膠質細胞，3-5h后則誘發異常性疼痛。神經病理性疼痛的發生時，小膠質細胞中P2X4受體表達量顯著增加，敲除P2X4受體的動物痛敏現象有好轉。TN大鼠P2X4受體在三叉神經節、頸部脊髓以及眶下神經的表達都明顯高于假手術組，且使用P2X4受體表達抑制劑SSRI(選擇性血清素再攝取抑制劑)進行干預，干預組較對照組的疼痛閾值明顯升高。以上報道表明P2X4受體可能參與引起了三叉神經痛并且有著關鍵的作用降鈣素基因相關肽(calcitoningenerelatedpeptide,CGRP)是一種由降鈣素基因表達的生物活性多肽，主要在三叉神經節和背根神經節等部位的神經胞體內合成，以快速軸漿運輸形式輸送到中樞端和周圍感覺神經末梢，廣泛分布于腦內及與體表感覺有關的脊髓背角和初級傳入纖維，如感覺神經元的胞體和末梢內，參與機體許多功能的調節。CGRP作為一種傷害性刺激的遞質，在神經病理性疼痛的研究中引起研究者們的高度重視。有研究發現發現咬合創傷可引起牙髓及牙周組織中的CGRP陽性纖維增多，用三叉神經眶下神經結扎術制備小鼠TN模型，術后發現CGRP和P物質(substanceP，SP)表達逐漸升高，且明顯高于對照組。近年，大量研究證實CGRP在TN大鼠的三叉神經元上的表達上調，對三叉神經節神經元和星形膠質細胞的激活具有重要作用，CGRP從三叉神經節神經元釋放可以促進三叉神經節神經元CGRP的合成，并刺激星形膠質細胞NO和前炎癥細胞因子釋放，促進膠質細胞P2X4受體的活化。CGRP選擇性拮抗劑和膠質細胞P2X4受體的活化抑制劑或許有可能成為治療三叉神經痛的有效藥物。人類基因組測序完成以來，人類蛋白質編碼基因僅占大約1.5％的DNA或大約20,000個基因。在真核生物中，有多達90％的轉錄，因此產生大量的非編碼RNA(ncRNA)。根據轉錄后產物的長短可將非編碼RNA分為短鏈非編碼RNA(≤200bp)和長鏈非編碼RNA(>200bp)。長鏈非編碼RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)是一類轉錄后長度大于200核苷酸的功能性非編碼RNA分子。它們沒有編碼蛋白的功能，所以只能以RNA的狀態去調控基因的表達。研究顯示，lncRNA參與人類多種疾病基因調控。我們實驗室利用SOLiDTM全轉錄分析技術完成SD大鼠多組織轉錄組高通量測序構建文庫，已完成了大鼠多組織的轉錄組圖譜構建；并在神經節中發現了大量與痛覺相關聯的非編碼轉錄本，并進行非編碼基因的預測發現相應的lncRNA。我們實驗室研究發現lncRNAuc.48+(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgc？hgsid＝42796671_gIIKDUiyguaFXCbRBiWSM7gFOgqn&c＝chr2&o＝20462844&t＝20463142&g＝ct_Ultra_7128&i＝％28null％29+uc.48)與疼痛密切相關，本發明的內容就是要進行對TN大鼠lncRNAuc.48+小干擾RNA，抑制和下調三叉神經節中的CGRP和P2X4受體的活化，治療TN。目前尚無lncRNAuc.48+小干擾RNA直接治療三叉神經痛的報道，本發明涉及可用于防治三叉神經痛的lncRNAuc.48+小干擾RNA在制備治療三叉神經痛的藥物中的應用具有重要意義。技術實現要素：本發明的目的在于提供長非編碼核糖核酸uc.48+小干擾RNA治療三叉神經痛的一個新用途。本發明所述的長非編碼核糖核酸uc.48+小干擾RNA在制備用于上述疾病防治的局部或全身用藥劑型藥物中的應用。lncRNAuc.48+小干擾RNA可減輕三叉神經痛行為反應。lncRNAuc.48+小干擾RNA在治療三叉神經痛的作用機理為：可能通過抑制和下調三叉神經節中的CGRP和P2X4受體的介導的疼痛信息傳遞，產生防治疼痛的作用。附圖說明圖1為各組大鼠機械痛閾值變化的影響圖。lncRNAuc.48+小干擾RNA處理對三叉神經痛大鼠的機械痛行為具有抑制作用。實驗分組：假手術組(Sham)；三叉神經痛模型組(TN)；三叉神經痛模型+lncRNAuc.48+小干擾RNA組(TN+lncRNAuc.48+siRNA)和三叉神經痛模型+亂碼小干擾RNA組(TN+scramblesiRNA)。其中**p<0.01表示和假手術組比較，##p<0.01表示與三叉神經痛模型組比較。圖2為各組大鼠三叉神經節中CGRP的real-timePCR檢測結果圖。lncRNAuc.48+小干擾RNA處理后顯著降低三叉神經痛模型組三叉神經節中上調的CGRP水平。實驗分組：假手術組(Sham)；三叉神經痛模型組(TN)；三叉神經痛模型+lncRNAuc.48+小干擾RNA組(TN+lncRNAuc.48+siRNA)和三叉神經痛模型+亂碼小干擾RNA組(TN+scramblesiRNA)。其中**p<0.01表示和假手術組比較，##p<0.01表示與三叉神經痛模型組比較。圖3為各組大鼠三叉神經節中P2X4受體的real-timePCR檢測結果圖。lncRNAuc.48+小干擾RNA處理后顯著降低三叉神經痛模型組三叉神經節中上調的P2X4受體水平。實驗分組：假手術組(Sham)；三叉神經痛模型組(TN)；三叉神經痛模型+lncRNAuc.48+小干擾RNA組(TN+lncRNAuc.48+siRNA)和三叉神經痛模型+亂碼小干擾RNA組(TN+scramblesiRNA)。其中**p<0.01表示和假手術組比較，##p<0.01表示與三叉神經痛模型組比較。圖4為各組大鼠三叉神經節中CGRP的蛋白印跡檢測結果圖。lncRNAuc.48+小干擾RNA處理后顯著降低三叉神經痛模型組三叉神經節中上調的CGRP蛋白水平。實驗分組：假手術組(Sham)；三叉神經痛模型組(TN)；三叉神經痛模型+lncRNAuc.48+小干擾RNA組(TN+lncRNAuc.48+siRNA)和三叉神經痛模型+亂碼小干擾RNA組(TN+scramblesiRNA)。其中**p<0.01表示和假手術組比較，##p<0.01表示與三叉神經痛模型組比較。圖5為各組大鼠三叉神經節中P2X4受體的蛋白印跡檢測結果圖。lncRNAuc.48+小干擾RNA處理后顯著降低三叉神經痛模型組三叉神經節中上調的P2X4受體蛋白水平。實驗分組：假手術組(Sham)；三叉神經痛模型組(TN)；三叉神經痛模型+lncRNAuc.48+小干擾RNA組(TN+lncRNAuc.48+siRNA)和三叉神經痛模型+亂碼小干擾RNA組(TN+scramblesiRNA)。其中*p<0.05表示和假手術組比較，#p<0.05表示與三叉神經痛模型組比較。具體實施方式下面結合實施例并對照附圖對本發明作進一步詳細說明。實施例1。用本
技術領域：
：公知的方法，制成適用于涉及三叉神經痛疾病治療的局部或全身注射用lncRNAuc.48+小干擾RNA制劑。為了更好地理解本發明的實質，下面以lncRNAuc.48+小干擾RNA對三叉神經節中CGRP和P2X7受體介導的相關疾病治療作用研究的實驗和結果來證明lncRNAuc.48+小干擾的用途。一、材料和方法。1.1動物和分組。采用雄性成年的SD大鼠進行CCI-ION模型的制備，所有實驗大鼠于術前1w進行適應性訓練，用細絲刺激大鼠，刺激部位為眶下神經在面部感覺支配區域圍繞，鼻區中央的觸須部位及周圍有毛皮膚。手術當日0d和術后1，3，5d使用電子測痛儀(BME-404NO.E5489)在大鼠刺激部位行機械痛敏閾值測試(測定時間恒定于每天10:00—16:00，室溫維持在22℃±0.5℃)。二周后選取機械痛敏閾值明顯降低的大鼠進行隨機分組，第一組為假手術組(Sham)即切開皮膚暴露眶下神經，不結扎神經，即縫合皮膚；第二組為模型組(TN)，即用兩根鉻腸線結扎眶下神經；第三組為手術加lncRNAuc.48+siRNA(TN+lncRNAuc.48+siRNA)；第四組為陰性對照組(TN+scramblesiRNA)。采用局部注射，眶下孔注射的方法對TN大鼠注射lncRNAuc.48+siRNA或scramblesiRNA，持續注射5天，并對四組大鼠進行行為學的測量，觀察每組大鼠行為學的變化情況。1.2lncRNAuc.48+siRNA設計。設計uc.48+的siRNA序列3條，和一條陰性對照siRNAduplexes。將不同濃度siRNA用EntransterTM-R400轉染試劑盒轉染到離體培養的DRG神經元細胞，分別在轉染后24，48和72h收集細胞，用RT-PCR測定uc.48+基因干擾效果，最終篩選出最佳siRNA序列用于動物實驗。實驗已確定第2條干擾效果最好。采用EntransterTM-R400轉染試劑盒(Engreencompany)將篩選出最佳的siRNA進行動物三叉神經節局部注射。lncRNAuc.48+小干擾序列：5’-GGCACUACUACUUGCAGAATT-3’5’-UUCUGCAAGUAGUAGUGCCTT-3’Stablenegativecontrol序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。1.3主要儀器。電子測痛儀(BME-404NO.E5489)；消毒紗布、手巾、棉簽等，碘酒及75％酒精，手術器械包：剪刀、眼科小彎鑷、血管鉗、絲線、有齒鑷、神經剝離子等。1.4慢性三叉神經痛模型制作。10％水合氯醛(0.4ml/100g)對大鼠進行腹腔麻醉。麻醉SD大鼠，取俯臥位，固定頭部和四肢。備皮、消毒、鋪巾，手術顯微鏡下在眉弓上做一弧形切口，玻璃分針鈍性分離，顯露出顱骨、額骨和鼻骨，直至暴露眼眶，沿眶上緣將眶內容物用玻璃分針撥開，暴露眶下神經，位于眶底部內側，仔細分離眶下神經，使游離出1cm長的距離。鉻腸線(5-0)結扎眶下神經，至少結扎兩次，間隔2mm。壓迫的標準：結扎后，神經纖維直徑稍稍變細，但不影響其神經電位的傳導和血液循環的通暢。常規創口縫合，等動物蘇醒后給其正常飲食。1.5三叉神經痛大鼠機械痛敏測定。各組SD大鼠于術前ld和術后1、3、5d行機械痛敏閾值測試(測定時間恒定在每天9:00-15:00，室溫維持在23℃±1℃)。機械痛敏閾值用BME-403VonFrey細絲測定，折力分別是：0.13、0.20、0.33、0.60、1.30、3.60、5.00、7.30、9.90、20.1g，先從折力最小的開始，依次往上增加。刺激的范圍是：以大鼠鼻區為中心，觸須伸展到的區域。測定的方法是：測定前先讓大鼠安靜30min，然后慢慢地輕輕的靠近大鼠，先刺激它的非手術區，再刺激手術區，對比兩邊刺激后大鼠的反應，一般一邊刺激3次，重復6次，最后取平均值。測定過程中注意動作幅度不要太大，以免驚嚇到大鼠，影響到測定結果。刺激大鼠過程中，如果其出現如下反應中的一種或一種以上時，我們則考慮該大鼠為刺激性反應試驗陽性。一、快速后退動作。為了防止面部再次被刺激，大鼠會蜷縮著身體往籠壁上靠攏，或者極力的將自己的頭面部隱藏在身體下面，以躲避刺激。二、攻擊行為。大鼠受到刺激感受到疼痛后也可表現出反攻，抓咬刺激物，反應迅速，動作兇猛。三、不停搔抓術側面部。常常表現為洗臉的樣子，但是是單側的，手術側的，至少連續出現3次或3次以上。四、如若刺激強度等于20.1g而大鼠未出現任何一種陽性反應時，該大鼠痛敏閾值定為20.1g。對比各組大鼠術前和術后對不同刺激強度的刺激反應，進行統計分析。1.6RT-PCR。1)總RNA的提取。三叉神經節注射后第5天將大鼠迅速斷頭，取出三叉神經節(TG)放入用DPPC處理過的PBS中清洗；在分別轉移到用DEPC處理過的勻漿器，加入1ML的TRNzol充分研磨；將勻漿樣品在室溫放置5min，使核酸蛋白復合物完全分離；美觀加入0.2ML氯仿混勻2min，室溫放置3min；4℃，12000r/min離心15min，樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層；RNA主要在水相中，轉移水相(約600微升)至另一離心管中；加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置30min；4℃，12000r/min，棄上清，管底可見少許白色沉淀物。每管加75％乙醇(無核酶水配置)1ml，充分洗滌RNA沉淀；4℃，5000r/min離心3min，倒出液體，用槍頭小心吸干。室溫放置干燥RNA沉淀，約3min即可；不宜過于干燥，會導致RNA的溶解性大大降低；加入30微升無核酶水，充分溶解RNA；取10微升RNA用于鑒定，余下-20℃保存。2)總RNA的鑒定。a)分光光度儀檢測：取出2微升RNA進行1％瓊脂糖凝膠電泳，并用紫外分光光度計測量光密度(opticdensity,OD)值；OD260/OD280應該在1.8-2.0之間，表面無蛋白質污染；b)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質量：取RNA樣品5微升與RNA上樣緩沖液1:1混勻后進行1％瓊脂糖凝膠電泳，恒壓120mV，電泳約15min，紫外燈下可觀察到28S，18S，5S三條帶。3)RT-PCRa)cDNA合成：建立25微升逆轉錄反應體系：DEPC4.875μl，5×buffer5μl，Rnasin0.625μl，DNTP1.5μl，OligDT2μl，MMLV1μl，RNA樣本10μl，共25μl.b)引物序列如下lncRNAuc.48+(產物長度是193bp)FORWARD5’-GTGGCGTAAGTGAATGTCCT-3’REVERSE5’-GTTGGCAGTTCTGCAAGTAG-3’CGRP(產物長度193bp)FORWARD5’-TCCTGGTTGTCAGCATCTTG-3’REVERSE5’-TCAGCCTCCTGTTCCTCCT-3’P2X4(產物長度124bp)：Forward：5’-ACCAACACCTCTCAGCTTGG-3’Reverse：5’-TGCTCTGTGTCTGGTTCACG-3’(退火溫度：55℃)內參照引物β-actin(產物長度是240bp)：Forward：5’-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3’Reverse：5’-CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3’(退火溫度：55℃)PCR體系：25μL2×EasyTaqPCRSuperMix:12.5μL上游引物:1μl下游引物:1μlcDNA:2μlddH2O:8.5μlPCR擴增程序設置：94℃，1min30s→94℃，30s→58.5℃，30s→72℃，1min×30個循環→72℃，5min→4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳：制作1.5％的瓊脂糖凝膠，冷卻至60℃左右加入核酸染料。取10μl進行電泳。電泳30min后用多功能凝膠成像系統曝光。實驗結果用Image-ProPlus圖像分析系統分析，并Spass19.0進行統計學分析。1.7蛋白印跡(WesternBlot)1)蛋白質的提取：大鼠斷頭后，迅速取出手術側TG置于2ml勻漿器內，每個TG加0.3ml去污劑裂解液，冰上充分研磨，盡量碾碎。反復裂解30min后，移至1.5ml離心管中，4℃離心12000rpm10分鐘，取上清，各組取2μl含蛋白的上清進行蛋白定量，其余加5×凝膠上樣緩沖液，再加10％DTT，混勻后分裝，-80℃保存。2)實驗步驟：a)測漏：檢查玻璃板間的密封性是否良好，如無外漏則把水吸干備用。b)10％分離膠制備(10ml)：雙蒸水4ml，30％丙烯酰胺混合液3.3ml1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)2.5ml，10％SDS0.1ml，10％過硫酸胺(AP)0.1ml，TEMED4μl。充分混勻后，灌膠，加入6ml即可，注意不要產生氣泡，再加異丙醇壓膠。20-30min分離膠凝固后倒出異丙醇，并用濾紙把玻璃板內殘留的異丙醇吸干凈，否則會出現斷膠的現象。c)5％壓縮膠制備(5ml)：雙蒸水3.4ml，30％丙烯酰胺混合液0.83ml，1.0mol/LTris-HCl(pH6.8)0.63ml，10％SDS0.05ml，10％過硫酸胺(AP)0.05ml，TEMED5μl。混勻后迅速灌膠，約4ml，迅速插入梳子，待20-30min膠完全凝固后使用。d)上樣：將提取好的蛋白放入沸水中煮5min，使其變性，各孔上樣量根據各組蛋白定量結果進行計算，濃度不同上樣量也不同，一般不超過30μl。e)電泳：壓縮膠為90V，50min。分離膠為120V，約40min。f)轉膜：切膠，去除非目的蛋白所在部分，保留含有目的蛋白的分離膠，用事前準備好的相同大小的濾紙和膜貼于其上，擺放順序是黑板-墊子-4層濾紙-膠-PVDF膜-4層濾紙-白板。4℃，恒流300mA，1.5小時。g)封閉：將膜放在TBST中洗滌10min后，放入TBST配制的5％脫脂奶粉中封閉，室溫下平搖1-3小時，如果背景高可考慮封閉過夜或更長時間。封閉時注意正面朝下。h)一抗孵育：將膜在濾紙上稍吸干后，不洗，直接放入脫脂奶粉配制的一抗中，4℃過夜，或室溫下孵育2-4小時。i)加二抗：TBST洗10分鐘×3遍后放入脫脂奶粉配制的二抗中，室溫下平搖。1小時后用TBST洗10分鐘×4遍。j)免疫復合物檢測：顯色，曝光，顯影，定影。3)光密度分析：應用Image-ProPlus圖像分析系統分析，并比較各組三叉神經節中CGRP和P2X4蛋白表達的變化。1.8實驗數據的統計處理。各組數據以均數±標準誤表示。多組間比較用單因素方差分析，繼以最小顯著差法(LSD)行兩兩比較。用SPSS19.0軟件包進行數據處理。P<0.05為差異有顯著性。二、結果。(一)行為學結果。各組大鼠造模中均未見肢體運動障礙和自殘現象。造模前測定各組間機械縮足反射閾值的基礎值差異無顯著性(p>0.05)。機械痛敏(MWT)測定結果。術前Sham組、TN組、TN+uc.48+siRNA組、TN+scramblesiRNA組之間相比，大鼠術側眶下神經面部感覺區域內的機械痛閾值沒有顯著性差異(p>0.05)。術后1天開始，TN組的機械痛反射閾值在雙側都有所下降，但以手術側下降更為明顯。二周后選取機械痛敏閾值明顯降低的TN大鼠進行隨機分組：模型組(TN)；模型加lncRNAuc.48+siRNA組(TN+lncRNAuc.48+siRNA)；模型加陰性對照干擾組(TN+scramblesiRNA)。采用假手術組(Sham)作為正常對照組，即切開皮膚暴露眶下神經，不結扎神經，縫合皮膚。采用局部注射，眶下孔三叉神經節注射的方法對TN大鼠注射lncRNAuc.48+siRNA或scramblesiRNA，持續注射5天，對四組大鼠進行行為學的測量，觀察每組大鼠行為學的變化情況。lncRNAuc.48+siRNA3d開始，TN+lncRNAuc.48+siRNA組的術側機械痛反射閾值和TN組相比有所升高(p<0.01)，但TN+scramblesiRNA組和TN組相比無顯著性差異。(見Fig.1)。(見圖1)。(二)實時定量-聚合酶鏈式反應(Real-timePCR)。持續注射5天，取對四組大鼠TG進行CGRP和P2X4受體mRNA的測定。結果表明TN大鼠的CGRP和P2X4受體mRNA和Sham組相比顯著升高，lncRNAuc.48+小干擾RNA處理后TG的CGRP和P2X4受體mRNA表達受到抑制，顯著降低(p<0.01)，但TN+scramblesiRNA組和TN組相比無顯著性差異。(見圖2，3)。(三)蛋白印跡。持續注射5天，取對四組大鼠TG進行CGRP和P2X4受體蛋白的測定。結果表明TN大鼠的CGRP和P2X4受體蛋白和Sham組相比顯著升高，lncRNAuc.48+小干擾RNA處理后TG的CGRP和P2X4受體蛋白表達受到抑制，顯著降低(p<0.05)，但TN+scramblesiRNA組和TN組相比無顯著性差異。(見圖4,5)。發明人研究發現注射lncRNAuc.48+小干擾RNA后，可減輕三叉神經痛大鼠的痛行為反應。根據lncRNAuc.48+小干擾RNA可以減少三叉神經痛大鼠三叉神經節CGRP和P2X4受體的表達的研究結果，表明：lncRNAuc.48+小干擾RNA減輕三叉神經痛的作用機理是阻斷三叉神經節CGRP和P2X4受體介導的疼痛信息傳遞，具有防治疼痛的作用。當前第1頁1 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