具有增強記憶，改善抑郁情緒作用的中藥散劑及其制備方法與應用與流程

老年癡呆癥(另譯阿爾茨海默癥)與抑郁癥，是神經病變中較受社會關注的兩大類疾病。老年癡呆癥，是一種進行性發展的致死性神經退行性疾病，臨床表現為認知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進行性減退，并有各種神經精神癥狀和行為障礙。全世界有2400萬病患，早期最顯著的癥狀為健忘，通常表現為逐漸增加的短期記憶缺失。隨著病情的加重，病人的語言能力、空間辨別能力、認知能力會逐步衰退。調查顯示，80歲以后15％的人有罹患癡呆性疾患的危險。親族中有阿茲海默病患者的場合患病的幾率也相對要高。其中，更有13歲的年輕小女孩罹患老人癡呆癥的紀錄。抑郁癥，是一種以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征的病癥，同時伴有失眠，記憶缺失，飲食失調等癥狀，嚴重者可出現自殺念頭和行為。多數病例有反復發作的傾向，每次發作大多數可以緩解，部分可有殘留癥狀或轉為慢性。據報道，人群中有16％的人在一生的某個時期會出現抑郁癥癥狀。若患者出現這些癥狀持續兩周以上，并且沒有明顯改善，可確診為抑郁癥。據世界衛生組織統計,抑郁癥已成為世界第4大疾患，并且預計到2020年,可能成為僅次于冠心病的第二大疾病。最為嚴重的是，抑郁癥患者不能適應社會，注意力下降，是自殺的高危人群。目前，臨床研究發現，在老年人患者中，經常出現抑郁癥與老年癡呆癥并發的現象，多表現為發病初期以抑郁癥狀為主，隨著疾病的發展，出現記憶缺失等老年癡呆癥的癥狀。這兩種疾病，不僅嚴重影響了老年人的生活質量，還給老齡化社會帶來沉重的經濟負擔與社會負擔

老年癡呆癥與抑郁癥的發病機理雖尚未完全明了，但對其發病機理的認識趨于統一，即都可以歸結為神經退行性疾病，均與神經元退化死亡密切相關。具體可歸結為如下幾種假說：(1)神經元突觸間隙內神經遞質五羥色胺(serotonin)，去甲腎上腺素(norepinepherine)，多巴胺(dopamine)含量降低,導致記憶缺失與情緒低落；(2)下丘腦-垂體-腎上腺-海馬通路(Hypothalamus-pituitary-adrenal gland pathway，HPA axis)調控紊亂，致使主管情緒與記憶的下丘腦(hypothalamus)與海馬神經元(Hippocampus)損傷，壞死；(3)神經生長因子(NGF)與腦源性神經營養因子(BDNF)分泌不足導致神經元生長異常，最終壞死。(4)腦中出現類淀粉斑以及神經纖維糾結，致使神經元壞死。

目前針對老年癡呆癥的藥物，臨床主要有(1)改善膽堿神經傳遞藥物，如他克林，安理申，艾斯能，加蘭他敏等；(2)改善腦血液循環和腦細胞代謝的藥物，如腦復康等；(3)自由基清除劑和抗氧劑，如維生素E，維生素C等。這些藥物的靶標主要是抑制膽堿酯酶以提高乙酰膽堿的在突觸中的相對含量，抑制自由基對神經的傷害等。針對抑郁癥，現在普遍用于治療抑郁癥的藥物，均依據神經遞質假說，抑制神經遞質再攝取與抑制其在神經元突觸間隙降解，以提高其在神經突觸間隙的含量為靶標，進行藥物設計與開發。當前臨床上常用的治療抑郁癥的藥物，包括：(1)三環類抗抑郁藥(TCAs)，如米帕明等(2)五羥色胺攝取抑制劑(SSRI)，如氟西汀等；(3)單胺氧化酶抑制劑(MAOI)。但是，用于治療老年癡呆癥與抑郁癥的藥物都存在許多副作用，如體重增加、性功能降礙、嗜睡、虛弱等，對心臟毒性較大，可引起心肌損害，并且需要長期用藥。同時，由于這兩種疾病發病機理復雜，現有的藥物往往效果較差。例如現有的用于抗抑郁的神經遞質攝取抑制劑，至少有30％的抑郁癥病人無效。更為嚴重的是，一些抗抑郁藥物，例如氟西汀，長期使用后病人易于產生自殺傾向。另外，由于兩種疾病多呈伴生狀態，病人往往同時需要服用兩種不同的藥物，不僅用藥不便，更帶來沉重的經濟負擔。種種不便，使醫學界更為迫切的希望在傳統草藥中尋找可從多靶點，多環節起作用的有效治療方法與藥物，用于同時治療老年癡呆癥與抑郁癥。

技術實現要素：

發明目的：本發明的目的在于提供一種增強記憶，改善抑郁情緒作用的中藥散劑。本發明的另一目的是提供上述中藥散劑的制備方法和應用。

技術方案：為了實現以上目的，本發明采取的技術方案為：

一種具有增強記憶，改善抑郁情緒作用的中藥散劑，它由麋鹿角粉碎制成。

一種具有增強記憶與改善抑郁情緒作用的中藥散劑，其特征在于，它由麋鹿角經過水提取或有機溶劑提取得到。

作為優選方案，所述的具有增強記憶與改善抑郁情緒作用的中藥散劑，其特征在于，所述的有機溶劑為乙醇，提取方法為回流、浸漬或滲漉。

本發明所述的具有增強記憶，改善抑郁情緒作用的中藥散劑的制備方法，它包括以下步驟：

(1)取麋鹿角藥材，洗凈烘干。

(2)取步驟(1)中洗凈烘干的麋鹿角藥材，以粉碎機粉碎，過篩，即得。

作為優選方案，所述的烘干條件為：烘干溫度60℃，時間為8小時；步驟(2)所述的過篩條件為：100目。

本發明所述的具有增強記憶，改善抑郁情緒作用的中藥散劑的制備方法，它包括以下步驟：

(1)取麋鹿角藥材，加入6～15倍量的水或乙醇提取1～3次，每次2～8小時；

(2)取步驟(1)中提取物濃縮、干燥，即得。

本散劑來自麋鹿角藥材的新用途認識，在動物模型上均可有效改善神經退行性癡呆癥與抑郁癥的主要病理環節，增強動物記憶能力，改善抑郁情緒；降低血液中β淀粉樣蛋白含量，降低tau蛋白的磷酸化水平，增強皮層神經營養因子的表達，降低乙酰膽堿酯酶活性，提高腦組織SOD水平。在細胞模型上表現出增加神經膠質細胞內神經營養因子的表達。上述研究表明本發明提供的中藥散劑對神經退行性癡呆與抑郁癥有顯著的改善作用，可用于制備具有改善神經退行性癡呆癥與抑郁癥的藥品或保健品，適合神經退行性癡呆癥與抑郁癥的患者。

本發明所述的具有增強記憶，改善抑郁情緒作用的中藥散劑在制備神經退行性癡呆癥與抑郁癥中的應用，可結合藥學上可接受的載體制成散劑、片劑、丸劑、湯劑、顆粒劑、煎膏劑或浸膏劑劑型的藥物。

附圖說明

圖1為中藥散劑對多因素神經損傷小鼠潛伏期的影響的柱狀圖。

圖2為中藥散劑對多因素神經損傷小鼠腦內膽堿酯酶活性測試結果的柱狀圖。

圖3為中藥散劑對多因素神經損傷小鼠腦內SOD活性測試結果的柱狀圖。

圖4為中藥散劑對多因素神經損傷小鼠腦內神經營養因子表達影響的柱狀圖。

圖5為中藥散劑對血管癡呆大鼠潛伏期的影響的柱狀圖。

圖6為中藥散劑對血管癡呆大鼠腦內神經營養因子表達影響的柱狀圖。

圖7為中藥散劑對CUMS小鼠糖水消耗量的影響的柱狀圖。

圖8為中藥散劑對CUMS小鼠強迫游泳不動時間影響的柱狀圖。

圖9為中藥散劑對CUMS小鼠腦內BDNF表達影響的柱狀圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例進一步闡明本發明，應理解這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，在閱讀了本發明之后，本領域技術人員對本發明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權利要求所限定的范圍。

實施例1 一種具有增強記憶，改善抑郁情緒作用的中藥散劑的制備方法，包括如下步驟：

(1)取麋鹿角藥材，洗凈，于60℃烘干8小時；

(2)取步驟(1)中的麋鹿角藥材，以粉碎機粉碎，過100目篩即得。

實施例2 一種具有增強記憶，改善抑郁情緒作用的中藥散劑的制備方法，它包括以下步驟：

(1)取麋鹿角藥材，加入10倍量的水回流提取3次，每次2小時；

(2)取步驟(1)中提取物濃縮、干燥，即得。

實施例3 一種具有增強記憶，改善抑郁情緒作用的中藥散劑的制備方法，它包括以下步驟：

(1)取麋鹿角藥材，加入10倍量的乙醇回流提取2次，每次6小時；

(2)取步驟(1)中提取物濃縮、干燥，即得。

實施例4 抗神經退行性癡呆癥實驗研究

一、實驗材料與藥物

1.藥物和試劑

氯化鋁、硫酸亞鐵、氫溴酸東莨菪堿、D-半乳糖酶，石杉堿甲，均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。小鼠膽堿酯酶(ChE)試劑盒(A023)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(A001-3)，均購自南京建成生物工程研究所。

2.實驗儀器

水迷宮行為測試儀(上海吉量儀器有限公司)；酶標儀(美國Perkin-Elmer公司)；BT125型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；Anke GL-16GII型離心機(上海安亭科學儀器廠)。

3.實驗動物

SPF級雄性昆明種小鼠，體重18～22g。購自南京中醫藥大學實驗動物中心。

二、實驗方法

1.造模與給藥

健康小鼠適應性喂養5d后，隨機分為空白組、模型組、陽性對照組和實施例1制備得到的中藥散劑低、高濃度劑量組，每組8只，經稱重顯示各組間體重差異無統計學意義。除空白組外，其余各組用多因素損傷造成記憶損傷，具體方式為小鼠每天腹腔注射D-半乳糖(120mg/kg)與東莨菪堿(1.0mg/kg)，口服灌胃氯化鋁(10mg/kg)與硫酸亞鐵(150mg/kg)，連續4周。模型組給以等體積生理鹽水。陽性組給以石杉堿甲(4mg/kg)。中藥散劑低劑量組為2g·kg^-1，高劑量組給藥劑量為4g·kg^-1，10d，給藥10天后，利用水迷宮實驗進行行為學測試。

2.藥效評價方法

(1)行為學測試方法

30d多因素復合損傷造模結束后，進行連續4天的Morris水迷宮定位航行實驗，以測試其空間記憶能力。將水迷宮內水溫調到25±℃，水深約20cm，保持學習、訓練和測試時水迷宮平臺和周圍物體位置固定不變。讓小鼠在水迷宮內自由游120s,然后引導其找到水下平臺，讓其處于平臺上10s。此操作一天進行2次，時間間隔2h以上。每天訓練2個象限，訓練共4天。第5天開始正式測試。讓小鼠從平臺所在象限對側象限的最遠點背對平臺入睡，拍攝記錄小鼠找到平臺的全過程。共測試2天，每天測試2次。以各組小鼠自水迷宮起點游至平臺終點所需的時間(潛伏期)與上臺次數為衡量小鼠學習獲得與記憶鞏固能力的指標。

(2)生化指標測試

水迷宮測試結束后，取小鼠腦組織勻漿測定膽堿酯酶(ChE)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，另用ELISA法測定皮層神經營養因子的表達。

3.統計學處理

所有實驗數據均采用SPSS18.0統計處理軟件進行統計學處理，結果以x±s表示，組間差異采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

三、實驗結果

1.行為學測試結果

多因素復合損傷30d，給予本發明實施例1制備得到的中藥散劑10天后，進行水迷宮實驗測試。由圖1可以看出小鼠經多重因素神經損傷后，潛伏期顯著延長(P<0.01)，經服用中藥散劑后，潛伏期顯著縮短(見圖1)。表明本發明實施例1制備得到的中藥散劑具有很好的對抗神經損傷，增強記憶的作用。

2.膽堿酯酶活性測試結果

小鼠進行完行為學測試后，處死取腦，制得勻漿，依據膽堿酯酶試劑盒的操作方法，測量小鼠腦內膽堿酯酶活性。由圖2可以看出，模型組小鼠經多重因素損傷后，腦內膽堿酯酶活性顯著增高(P<0.01)。給以本發明提供的中藥散劑后，膽堿酯酶活性顯著降低(P<0.01)，其作用趨勢與陽性藥石杉堿甲作用相當。表明本發明所提供的中藥散劑具有很好的降低膽堿酯酶活性，改善受損膽堿能神經功能的作用。

3.SOD活性測試結果

小鼠進行完行為學測試后，處死取腦，制得勻漿，依據SOD試劑盒的操作方法，測量小鼠腦內SOD活性。由圖3可以看出，模型組小鼠經多重因素損傷后，腦內SOD活性顯著降低(P<0.01)。給以本發明中藥散劑后，SOD活性顯著增加(P<0.01)，其作用趨勢與陽性藥石杉堿甲作用相當。表明本發明所提供的中藥散劑具有很好的抗氧化作用。

4.NGF測試結果

小鼠進行完行為學測試后，處死取腦，分取大腦皮層，制得勻漿，利用western blotting技術，測量小鼠大腦皮層神經營養因子(NGF)表達。由圖4可以看出，模型組小鼠經多重因素損傷后，大腦皮層NGF表達顯著降低(P<0.01)。給以本發明提供的中藥散劑后，NGF表達顯著增加(P<0.01)，其作用趨勢與陽性藥石杉堿甲作用相當。表明本發明所提供的中藥散劑具有很好的增強NGF表達，營養膽堿能神經元，對抗神經退行性癡呆的作用。

實施例5抗神經退行性癡呆癥實驗研究

一、實驗材料與藥物

1.藥物和試劑

氯化鋁、硫酸亞鐵、氫溴酸東莨菪堿、D-半乳糖酶，石杉堿甲，均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。大鼠NGF ELISA試劑盒(LF-EK50289)購自Abfrontier公司。

2.實驗儀器

動物行為測試系統，購自上海吉量軟件科技有限公司。Western blotting蛋白印跡分析系統購自Bio-RAD公司。酶標儀購自美國Perkin-Elmer公司)。BT125型電子天平購自賽多利斯科學儀器有限公司)。KQ-250E型超聲波清洗器購自昆山禾創超聲儀器有限公司)。Anke GL-16GII型離心機購自上海安亭科學儀器廠。

3.實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體重180～220g。購自南京中醫藥大學實驗動物中心。

二、實驗方法

1.造模與給藥

健康大鼠適應性喂養5d后，隨機分為空白組、模型組、陽性對照組和實施例1制備得到的中藥散劑低、高濃度劑量組，每組8只，經稱重顯示各組間體重差異無統計學意義。除空白組外，其余各組均用雙側頸總動脈結扎模型造成記憶，具體方式為將大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位，頸部正中切口，分離雙側頸總動脈并結扎。術后1周為恢復期。而后，模型組給以等體積生理鹽水。陽性組給以石杉堿甲(0.6mg/kg)。中藥散劑低劑量組為2g·kg^-1，高劑量組給藥劑量為4g·kg^-1，10d。給藥10天后，利用水迷宮實驗進行行為學測試。

2.藥效評價方法

(1)行為學測試方法

大鼠血管性癡呆造模結束后，進行連續4天的Morris水迷宮定位航行實驗，以測試其空間記憶能力。將水迷宮內水溫調到25±℃，水深約20cm，保持學習、訓練和測試時水迷宮平臺和周圍物體位置固定不變。讓大鼠在水迷宮內自由游120s,然后引導其找到水下平臺，讓其處于平臺上10s。此操作一天進行2次，時間間隔2h以上。每天訓練2個象限，訓練共4天。第5天開始正式測試。讓大鼠從平臺所在象限對側象限的最遠點背對平臺入睡，拍攝記錄大鼠找到平臺的全過程。共測試2天，每天測試2次。以各組小鼠自水迷宮起點游至平臺終點所需的時間(潛伏期)與上臺次數為衡量大鼠學習與記憶鞏固能力的指標。

(2)生化指標測試

水迷宮測試結束后，取大鼠腦組織勻漿測定皮層神經營養因子的表達。

3.統計學處理

所有實驗數據均采用SPSS18.0統計處理軟件進行統計學處理，結果以x±s表示，組間差異采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

三、實驗結果

1.行為學測試結果

頸動脈結扎造模后，給予中藥散劑10天后，進行水迷宮實驗測試。由圖1與圖2可以看大鼠雙側頸總動脈結扎后，與正常組動物比較，潛伏期顯著延長(P<0.01)，提示模型組動物記憶力受損。經服用中藥散劑后，潛伏期顯著縮短(見圖5)。表明本中藥散劑具有很好的對抗神經損傷與血供減少，增強記憶的作用。

2.NGF測試結果

大鼠進行完行為學測試后，處死取腦，分取大腦皮層，制得勻漿，利用ELISA測量大鼠大腦皮層神經營養因子(NGF)表達。由圖6可以看出，模型大鼠大腦皮層NGF表達顯著降低(P<0.01)。給以實施例中中藥散劑后，NGF表達顯著增加(P<0.01)，其作用趨勢與陽性藥石杉堿甲作用相當。表明本發明所提供的中藥散劑具有很好的增強NGF表達，營養膽堿能神經元，對抗神經退行性癡呆的作用。

實施例6 抗抑郁癥實驗研究

一、實驗材料與藥物

1.藥物和試劑

蔗糖、氟西汀均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。小鼠BDNF ELISA試劑盒(LF-EK50009)購自Abfrontier公司。

2.實驗儀器

動物行為測試系統，購自上海吉量軟件科技有限公司。Western blotting蛋白印跡分析系統購自Bio-RAD公司。酶標儀購自美國Perkin-Elmer公司)。BT125型電子天平購自賽多利斯科學儀器有限公司)。KQ-250E型超聲波清洗器購自昆山禾創超聲儀器有限公司)。Anke GL-16GII型離心機購自上海安亭科學儀器廠。

3.動物

ICR小鼠(全雄，20-22g)，購自南京青龍山動物繁殖場。動物飼養于SPF級環境中，自由飲食進水。

二、實驗方法

1.慢性應激壓力抑郁小鼠模型構建

所有小鼠適應環境5d后，綜合體重、曠場和糖水基礎測試評分，選取評分相近的60只小鼠，隨機選取10只作為正常組，每籠5只飼養，其余50只小鼠均單籠孤養。

正常組小鼠不給予任何刺激。孤養的小鼠每天隨機給予兩種刺激，刺激因素包括：禁食24h，禁水24h，傾斜12h，束縛2h，230-240r.min^-1震蕩30min，光照24h，足部電擊(5次，每次2mA)。造模過程中，每周進行糖水消耗量測試1次，監測抑郁表型。待4周抑郁表型出現后，將50只刺激后的孤養小鼠隨機分為5組，即模型組、陽性藥組、中藥散劑低劑量組與高劑量組。正常組和模型組小鼠每天灌胃20mL·g^-1的蒸餾水，陽性組給予氟西汀(7.2mg·kg^-1)，中藥散劑低劑量組為2g·kg^-1，高劑量組給藥劑量為4g·kg^-1。按上述方法給藥7d后，用糖水消耗實驗與強迫游泳實驗評價各組小鼠行為學得分，評價抗抑郁效果。

2.藥效評價方法

(1)行為學測試方法

a.糖水偏嗜實驗

糖水消耗實驗于慢性壓力應激后4周進行。正式測試前72小時，首先給以小鼠1％的蔗糖水兩瓶各200ml。24小時后，將其中1瓶1％的蔗糖水替換為白開水。然后將各籠小鼠禁食禁水24小時。正式實驗開始，同時給予各籠小鼠1％蔗糖水與白開水各200ml，并稱取蔗糖水與白開水重量。3小時后，統計各籠小鼠的飲水量。糖水偏嗜度＝糖水消耗量/(白開水消耗量+糖水消耗量)x 100％。

b.強迫游泳實驗

糖水偏好實驗結束24小時后，將小鼠放入高20cm、直徑14cm的圓柱型玻璃缸中，每缸1只，缸中水深10cm，水溫25℃。強迫游泳時間共計6min，待小鼠游泳2min后，統計后4min內的不動時間(小鼠在水中停止掙扎，或呈漂浮狀態時間)。

3.生化指標測試

水迷宮測試結束后，取小鼠大腦海馬勻漿測定皮層腦源性神經營養因子(BDNF)的表達。

三、實驗結果

1.行為學測試結果

由圖7所示，經過4周的慢性應激刺激后，模型組小鼠體重與正常組比較，顯著下降，糖水偏嗜度明顯低于正常組(p<0.01)，提示出現抑郁樣行為。給予陽性藥氟西汀與中藥散劑7天后，四組小鼠體重與模型組比較，均有增加，糖水攝入量均明顯高于模型組(p<0.01)，表現出抗抑郁作用。由圖8所示，統計強迫游泳實驗中動物不動時間，模型組與正常組比較，漂浮時間顯著增加(p<0.01)，提示出現了明顯的抑郁行為。而給予氟西汀的治療組與中藥散劑組，漂浮時間均顯著縮短(p<0.01)，顯示出明顯的改善抑郁作用。

2.BDNF測試結果

大鼠進行完行為學測試后，處死取腦，分取大腦皮層，制得勻漿，利用ELISA測量小鼠大腦海馬腦源性神經營養因子(BDNF)表達。由圖9可以看出，模型小鼠大腦海馬BDNF表達顯著降低(P<0.01)。給以實施例中中藥散劑后，BDNF表達顯著增加(P<0.01)，其作用趨勢與陽性藥氟西汀作用相當。表明本發明所提供的中藥散劑具有很好的增強BDNF表達，對抗抑郁癥的作用。

以上實驗結果表明，本發明提供的中藥散劑具有顯著的對抗多因素所致的記憶損傷、改善抑郁情緒等功能，表明本發明提供的中藥散劑具有很好的對抗神經退行性癡呆癥與抑郁癥的作用。與現有的對抗神經退行性癡呆癥與抑郁癥的化學藥物相比，該散劑具有多靶點的作用特點，可改變現有技術藥物僅作用于膽堿酯酶或氧化損傷等單一靶點，尤其還具有顯著的神經營養功能，取得了很好的預料不到的技術效果。麋鹿角增強記憶，緩解抑郁情緒的功效未見報道。因此，該中藥散劑具有較高的創新性與藥物開發價值。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。