秦皮素在制備治療疫病結腸癌的藥物中的應用的制作方法

本發明屬于醫藥生物技術領域，具體涉及一種中藥的用途，即秦皮素具有抗結腸癌作用的用途。

背景技術：

大腸癌(包括結腸癌和直腸癌)，是臨床上常見的消化系統惡性腫瘤之一。在我國，近30年來，結直腸癌發病率年均上升3％～4％，結直腸癌發病率和死亡例數分別占到全世界發病和死亡例數的18.6％和20.1％，均居第一位。盡管從二十世紀九十年代中期開始，大腸癌的全球發生率逐年下降，但是自1992年起，大腸癌在50歲以下人群中的發生率卻在以每年1.8％的比例升高。因此，大腸癌治療仍然是全球腫瘤研究的重要方向。

傳統腫瘤治療方案專注于去除腫瘤部位細胞。以往的研究中合成了許多作用明確的化學抗癌藥，但是由于化學藥品的開發費用昂貴，且毒副作用大，往往制約了藥物的進一步應用。中草藥、植物藥等天然產物中存在著廣泛的生物活性物質，其抗腫瘤活性越來越受醫藥界重視。并且，隨著中藥藥理學、免疫學、細胞生物學、分子生物學等多學科研究方法和技術手段的發展，中藥抗腫瘤的分子機制逐漸被揭示。中藥能通過誘導腫瘤細胞凋亡、調節機體免疫功能、逆轉癌細胞多重耐藥作用等多種機制發揮抗腫瘤作用。

秦皮素(Fraxetin,FR)是一種天然香豆素類化合物，主要來源于木犀科大葉白蠟樹、小葉白蠟樹的樹皮，化學名稱為7,8-二羥基-6-甲氧基香豆素，其結構式見圖1。已有研究報道，秦皮素具有抗菌、抗氧化和抗骨質疏松等多種生理活性，目前在臨床上用于治療兒童急性菌痢。

趙婧暉等人發現，秦皮素能夠通過抑制表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，簡稱為EGFR)及其下游的AKT信號通路抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖及遷移。EGFR是上皮生長因子(EGF)細胞增殖和信號傳導的受體，其作用非常廣泛，在細胞的生長、增殖和分化等多種生理過程中發揮重要的作用(趙婧暉,謝鯤鵬,隋佳琪,等.秦皮素通過抑制EGFR及其下游AKT信號通路抑制MCF-7細胞增殖及遷移[J].中國生物化學與分子生物學報,2016(1):56-63.)。在許多實體腫瘤中存在EGFR的高表達或異常表達，EGFR與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑制有關。秦皮素抑制EGFR產生的影響大而廣泛，缺少明確的靶點；其次，由于EGFR在正常細胞中同樣也有表達，因此有可能同樣對正常細胞產生影響，其作用的選擇性不明確。

英國科學家Hickman J A首次提出可以將誘導腫瘤細胞凋亡作為以后腫瘤治療研究的主要目標和手段，隨后誘導腫瘤細胞凋亡成為篩選抗癌藥物的新靶點和新熱點。(Hickman J A.Apoptosis induced by anticancer drugs[J].Cancer and Metastasis Reviews,1992,11(2):121-139.)

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種具有抗結腸癌作用的藥物，該藥物通過誘導腫瘤細胞凋亡進而抑制結腸癌細胞生長，從而達到具有治療結腸癌的目的。

相對于秦皮素通過抑制EGFR信號通路發揮抗乳腺癌作用，本發明提供的秦皮素抗腫瘤機制更加具體，靶點更加明確。

本發明保護的是秦皮素在制備治療疫病結腸癌的藥物中的應用。

秦皮素(標準品，純度98％)購于江蘇省食品藥品檢驗所，為淡黃色片狀結晶。本發明中，將DMSO作為秦皮素的溶劑，配制2mg/mL的溶液，并將其保存于-20℃環境中。根據實驗需求，利用RPMI-1640培養基將原溶液稀釋到不同濃度(終濃度分別為3.75、7.5、10、15、20、30、40、60、80、120μM)進行實驗。

本發明中，首先利用MTT法檢測了秦皮素對人結腸癌HCT116細胞的體外生長抑制活性，并計算得到其對HCT116的IC50值為40μM，確定了秦皮素對人結腸癌細胞具有良好的抑制活性；同時，利用顯微鏡拍照技術，觀察了給藥后細胞形態的變化，發現秦皮素在15μM時即對細胞形態產生影響，具體表現為細胞皺縮，邊緣不清晰，貼壁細胞數明顯減少。為了檢測秦皮素對結腸癌細胞的抑制作用是否具有時間以及劑量依賴性，發明人利用不同濃度(20、40、80μM)的秦皮素分別作用不同時間(24、48、72h)，觀察細胞的存活率。實驗發現，秦皮素對人結腸癌HCT116細胞的抑制作用具有明顯的時間和劑量依賴性，即相同時間條件下，秦皮素劑量越高抑制效果越好；相同劑量條件下，秦皮素作用時間越長抑制效果越好。在充分確定了秦皮素對結腸癌細胞的抑制作用后，發明人又對其作用機制進行了研究。具體為，利用流式細胞術檢測了不同劑量秦皮素對腫瘤細胞凋亡的影響。流式結果圖顯示，秦皮素能夠誘導腫瘤細胞凋亡，且具有劑量依賴性，即秦皮素劑量越高，凋亡細胞比例越高。由此，確定了秦皮素抑制結腸癌細胞的作用機制，即通過誘導腫瘤細胞凋亡發揮抗腫瘤作用。最后，為了確定秦皮素是否對正常細胞具有毒性，發明人利用小鼠脾淋巴細胞進行實驗，加入不同濃度秦皮素(0、3.75、7.5、15、30、60μM)觀察小鼠脾細胞的存活率。實驗結果顯示，秦皮素在60μM范圍內，對正常小鼠的脾細胞沒有明顯毒性，即證明秦皮素對正常哺乳動物細胞的毒性很小。由此說明，秦皮素的作用具有選擇性，在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常細胞的毒性極小。

本發明公開秦皮素主要應用于醫藥生物領域，具體為秦皮素具有明顯的抑制人結腸癌細胞生長的作用，可用來作為/制備抗結腸癌藥物。

本發明中發現，秦皮素主要通過誘導腫瘤細胞凋亡發揮其抗結腸癌的作用。細胞凋亡在多種正常生理過程中可起到調節作用，若此功能出現異常或缺失則可導致一系列病理情況發生。腫瘤細胞的特征之一就是缺乏這種程序性的死亡過程。

結腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，發病率占胃腸道腫瘤的第3位，死亡率僅次于肺癌和肝癌，占我國惡性腫瘤第三位。目前常用的治療手段為放療和化療，其中五氟尿嘧啶為最主要的化療藥物。近幾年，免疫治療也作為一種治療手段進入人們視野，其中誘導腫瘤細胞凋亡作為一種免疫治療手段備受關注。本發明中提供的秦皮素即通過誘導腫瘤細胞凋亡從而發揮其抗結腸癌的作用。

針對趙婧暉等人的研究，即秦皮素通過抑制EGFR及其下游的AKT信號通路來發揮抗乳腺癌的作用，鑒于EGFR作用的廣泛性，該研究中所述秦皮素的作用靶標并不明確且并未探討秦皮素對于正常細胞的作用。因此，相對于秦皮素通過抑制EGFR信號通路發揮抗乳腺癌作用，本發明提供的秦皮素抗腫瘤機制更加具體，靶點更加明確，即通過誘導腫瘤細胞凋亡發揮抗腫瘤作用，且該發明提供了秦皮素在發揮誘導腫瘤細胞凋亡作用的同時，對正常哺乳動物細胞的毒性極小。

有益效果：所述秦皮素抗人結腸癌HCT116細胞的效果明顯，其量效關系顯著；在低劑量15μM時即對腫瘤細胞形態產生影響；對人結腸癌HCT116細胞的抑制作用具有明顯的時間和劑量依賴關系，可以通過加大劑量和延長作用時間更好地抑制腫瘤細胞生長；誘導人結腸癌HCT116細胞凋亡作用明顯，在40μM時，凋亡細胞比例達到20％；在60μM以內，對原代小鼠脾細胞沒有明顯毒性，即本發明的秦皮素對哺乳動物細胞的毒性極小，在殺傷腫瘤細胞時，對正常細胞的殺傷不明顯，說明其作用具有選擇性。

附圖說明

圖1是秦皮素的化學結構式

圖2是秦皮素對人結腸癌HCT116細胞的體外生長抑制作用

圖3是秦皮素對人結腸癌HCT116細胞形態的影響

圖4是秦皮素對人結腸癌HCT116細胞抑制作用的量效和時效關系

圖5是秦皮素對人結腸癌HCT116細胞凋亡的影響

圖6是秦皮素對原代小鼠脾細胞的毒性

具體實施方式

下面結合實施例，對本發明作進一步說明。

實施例1：秦皮素對人結腸癌HCT116細胞的體外生長抑制作用

胰酶消化對數生長期的人結腸癌HCT116細胞(上述細胞使用含有10％FBS的RPMI-1640培養基培養)，用培養基調整細胞濃度為5×10⁴個/mL的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔加入細胞懸液100μL，每組設6個復孔。置于37℃、5％CO₂細胞培養箱中繼續培養24h。待細胞貼壁后，實驗組加入用培養基稀釋的不同濃度的秦皮素10μL/孔(終濃度分別為7.5、15、30、60、120μM)。實驗設置含RPMI-1640全培養基對照和未給予藥物作用的空白對照。37℃、5％CO₂培養48h后，每孔加入5mg/mL的MTT 15μL，置于37℃、5％CO₂細胞培養箱中繼續培養4h。離心，小心吸去上清，每孔加入150μL DMSO，輕輕振蕩使甲臜完全溶解，在490nm波長處用酶標儀測吸光值并計算細胞存活率。

結果見圖2，圖2表明，在120μM濃度范圍內秦皮素對人結腸癌HCT116細胞有明顯的抑制作用，且量效關系明顯，即藥物濃度越高，抑制效果越好。根據圖2數據計算得到秦皮素對HCT116細胞的IC50值為40μM，該數值較低，說明秦皮素對人結腸癌HCT116的抑制作用明顯。

實施例2：秦皮素對人結腸癌HCT116細胞體外形態學變化影響

取對數生長期的HCT116細胞，用含有10％FBS的RPMI-1640培養基調整細胞濃度為5×10⁴個/mL，均勻鋪至96孔培養板中，每孔加入細胞懸液100μL，置于37℃、5％CO₂細胞培養箱中培養24h。待細胞貼壁后，加入用培養基稀釋的不同濃度秦皮素10μL/孔(終濃度分別為0、3.75、7.5、15、30、60、120μM)，培養液調零，37℃、5％CO₂培養箱繼續培養48h。培養結束后，置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，并拍照。

按照上述方法，結果如附圖3所示，秦皮素在15μM之后即對細胞形態產生明顯的變化。具體表現為：細胞皺縮，邊緣不清晰，貼壁細胞數明顯減少。

實施例3：秦皮素對人結腸癌HCT116細胞體外生長抑制的時間和劑量依賴關系

取對數生長期的人結腸癌HCT116細胞，用含有10％FBS的RPMI-1640培養基調整細胞濃度為5×10⁴個/mL，于96孔培養板中加入細胞懸液100μL，并加入用培養基稀釋的不同濃度的秦皮素10μL/孔(終濃度分別為0、10、20、40μM)，培養液調零，37℃、5％CO₂培養不同時間(24h、48h、72h)，培養結束后，每孔加入5mg/mL的MTT 15μL，繼續培養4h。離心，小心吸去上清，每孔加入150μL DMSO，輕輕振蕩以使甲臜完全溶解，在490nm波長處用酶標儀測吸光值，計算細胞活率。

結果如圖4所示，表明秦皮素對人結腸癌HCT116細胞的抑制作用具有明顯的時間和劑量依賴關系。隨著時間增加，相同劑量下秦皮素對HCT116細胞的抑制作用加強。在相同時間下，隨著劑量增加，秦皮素對HCT116細胞的殺傷作用明顯增強。

實施例4：秦皮素對人結腸癌HCT116細胞凋亡的影響

取對數生長期的HCT116細胞，用含有10％FBS的RPMI-1640培養基調整細胞濃度為5×10⁴個/mL，均勻鋪至6孔培養板中，每孔加入細胞懸液2mL，并加入用培養基稀釋的不同濃度的秦皮素20μL/孔(終濃度分別為0、10、20、40μM)，培養液調零，37℃、5％CO₂培養48h。培養結束后，小心吸去上清，用不含EDTA的胰酶消化，300g，4℃離心5min收集細胞。用預冷的PBS洗滌細胞兩次，每次均在300g，4℃離心5min。收集5×10⁵細胞。加入100μL 1×Binding Buffer重懸細胞。加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI staining solution，輕輕混勻，避光，室溫反應10min。加入400μL 1×Binding Buffer，混勻，用流式細胞儀進行檢測并計算凋亡細胞比例。

結果如圖5所示，圖5表明秦皮素體外對人結腸癌HCT116細胞殺傷作主要是通過誘導其凋亡。流式細胞儀檢測結果表明，秦皮素在10μM之后，誘導HCT116細胞凋亡作用明顯，且具有明顯的劑量依賴關系，即藥物濃度越高，凋亡細胞越多。

實施例5：秦皮素對原代小鼠脾細胞的影響

取ICR雄性小鼠一只，頸部脫臼處死，無菌制備脾淋巴細胞懸液，用含有10％FBS的RPMI-1640培養液重懸，置細胞瓶中培養過夜，于24h后，取上層懸浮細胞，離心后調整細胞濃度為5×10⁶個/mL，接種于96孔培養板中，每孔100μL細胞懸液，然后加入各濃度梯度藥物(終濃度分別為0、3.75、7.5、15、30、60μM)，置于37℃、5％CO₂細胞培養箱中繼續培養。48h后每孔加入5mg/mL的MTT 15μL，繼續培養4h。離心棄上清，每孔加入150μL DMSO，酶標儀490nm處測吸光值。

結果見圖6，圖6表明低濃度(60μM以內)秦皮素對原代小鼠脾細胞無明顯毒性，即低濃度秦皮素對哺乳動物細胞的殺傷很小。