本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種銅綠假單胞菌(PA)動物體內耐藥性誘導模型及其構建方法和應用。
背景技術：
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)原稱綠膿桿菌，屬非發酵革蘭陰性桿菌，在正常人的皮膚、呼吸道和腸道以及醫院環境中廣泛存在。PA感染可引發多種疾病，如引起燒燙傷、敗血癥、腸道感染、術后傷口的化膿性感染以及引發呼吸道感染性疾病。對于具有基礎疾病、長期使用抗生素和抗腫瘤藥物的患者，因其自身免疫力弱或者免疫功能受損，更易引發PA感染性肺炎。
PA的感染通常選擇抗生素治療，但隨著抗生素的大量使用，PA極易產生耐藥，且由于PA自身結構的特殊性，使得其對多數抗菌藥物具有天然耐藥和極易產生耐藥的特點，導致治療難度極大，嚴重影響患者的健康與生活。因此，研究人員開始研究銅綠假單胞菌耐藥動物模型，以模擬臨床長期應用廣譜抗生素的患者出現PA感染的現象，為實驗研究和治療因耐藥菌引起的感染提供良好的模型。
如“不同方法建立多重耐藥銅綠假單胞菌腸道感染動物模型的比較和評價”(韓華中，楊俊，中國實驗動物學報，2014年4月第22卷第2期)中公開的采用體外分離的多重耐藥銅綠假單胞菌通過三種不同處理方法建立小鼠腸道銅綠假單胞菌感染模型，其中以多重耐藥銅綠假單胞菌菌懸液直接灌胃來獲得多重耐藥銅綠假單胞菌腸道感染動物模型。然而上述的動物模型還存在一定的缺陷：第一，上述動物模型是用于PA腸道感染的模型，并不適用于呼吸道感染PA的模型；第二，上述的動物模型與臨床長期應用廣譜抗生素的患者出現PA感染有一定的差距，因為上述的動物模型是通過體外分離的耐藥菌灌入動物體內，而該體外分離的耐藥菌大多是通過在含有多種抗生素的培養基中培養篩選出的具有抗多種抗生素的耐藥菌，其培養的環境過于簡單，而動物體內的環境又非常復雜，進而該耐藥菌的產生耐藥性的環境與動物體內的銅綠假單胞菌產生耐藥性的環境具有極大的不同，又由于產生耐藥性的環境不同，體外分離的耐藥菌和在動物體內產生的耐藥菌對于動物機體的感染和對治療藥物的反應截然不同，因而使用體外分離的耐藥菌來構建多重耐藥銅綠假單胞菌腸道感染動物模型不能更好的模擬臨床長期應用廣譜抗生素的患者出現PA感染的現象，不能較接近的模擬機體中細菌耐藥性的發展規律，對于抗細菌耐藥的藥物治療的研究有限。第三，該動物模型采用小鼠的體重變化、結腸炎癥評分以及炎癥因子濃度來評價動物模型，然而小鼠體重每天的變化非常微小，需要長時間的觀察，才能夠觀察出明顯的變化，延長了動物造模的周期，效率低，而采用結腸炎癥評分，需要對小鼠的結腸組織進行HE染色觀察，步驟繁瑣，同樣延長了動物造模的周期，且采用HE染色觀察評分不明顯，無法定量，評分結果不精確，而采用炎癥因子的濃度來評價動物模型同樣不精確，因為在小鼠感染PA后由于免疫力降低，在此期間還可能感染其他病菌或是并發癥引發炎癥因子濃度的增大，即炎癥因子的增大并不一定都是PA引起的，因此采用炎癥因子濃度來評價動物模型也是不精確的。為此，本發明提供了一種PA動物體內耐藥性誘導模型及其構建方法和應用。
由于現有多采用體外環境中耐藥菌研究該菌在動物體內耐藥性變化，不能較接近的模擬機體中細菌耐藥性的發展規律。鑒于體內研究細菌耐藥性變化的方法受限，本發明觀察銅綠假單胞菌在小鼠體內耐藥性發展變化的規律，以期達到模擬機體中該菌的變化。同時應用該方法，檢測本課題組正在研發的芪歸銀顆粒在該模型中的作用。
技術實現要素：
因此，本發明要解決的技術問題在于現有技術中缺乏銅綠假單胞菌呼吸道感染動物體內模型，不能夠模擬機體呼吸道中銅綠假單胞菌耐藥性的發展規律，以及模型評價標準不精確的缺陷，從而提供一種PA動物體內耐藥性誘導模型及其構建方法和應用。
為此，本發明提供了一種PA動物體內耐藥性誘導模型的構建方法，包括如下步驟：
(1)取健康小鼠若干只，雌雄各半，隨機分成空白對照組、未誘導耐藥模型組A1、未誘導耐藥模型給藥組A2、誘導耐藥模型組B1和誘導耐藥模型給藥組B2，備用；所述未誘導耐藥模型組A1和未誘導耐藥模型給藥組A2合稱為A組，所述誘導耐藥模型組B1和誘導耐藥模型給藥組B2合稱為B組；
(2)對所述A組和B組的小鼠以PA敏感菌菌液感染至少一次，備用；
(3)對所述步驟(2)中所述B組第一次感染后，對所述小鼠給予低濃度的左氧氟沙星進行誘導耐藥造模，備用；所述空白對照組和A組在所述B組誘導造模期間每天以相同條件下給予蒸餾水，備用；
(4)對步驟(3)中的所述A2組和B2組給予治療劑量的所述左氧氟沙星進行給藥治療；所述空白對照組、A1組和B1組在上述A2組和B2組給藥治療期間每天以相同條件下給予蒸餾水，備用；
(5)在給藥治療后，分別對步驟(4)中的所述空白對照組、A組和所述B組中的小鼠稱重并記錄體重，然后處死小鼠進行取材，取肺部稱重并記錄肺濕重，然后按照下述公式(1)計算小鼠的肺指數，
計算得到所述空白對照組、A組和所述B組的肺指數，采用T值檢驗法比較所述B1組是否構建成功，包括如下步驟：
S1、采用T值檢測法，將所述A1組和B1組分別與所述空白對照組的肺指數進行比較，若兩者的P值均為P<0.05，則所述PA敏感菌菌液感染所述A組和B組中的所述健康小鼠；反之，則沒有；
S2、采用T值檢測法，將所述A2組與所述A1組進行比較，若P<0.05，則所述治療劑量的所述左氧氟沙星具有治療PA感染的功效；反之，則沒有；
S3、在S1步驟中和S2步驟中的P值均為P<0.05時，采用T值檢測法，將所述B1組與所述B2組的肺指數進行比較，若P＞0.05，則所述B1組構建成功，即所述PA動物體內耐藥性誘導模型構建成功；反之，則沒有。
所述的方法，還包括分別將計算得到的所述A組和B組的肺指數代入下述公式(2)中計算得到A2組小鼠的肺指數抑制率和B2組的肺指數抑制率，通過比較不同誘導造模時間的所述A2組小鼠和B2組小鼠的肺指數抑制率，獲得所述B2組的PA耐藥程度以及PA耐藥變化規律，
所述的構建方法，還包括利用小鼠肺組織中外排泵基因mexC表達量來驗證所述PA動物體內耐藥性誘導模型是否構建成功的步驟：
Q1、采用T值檢測法，將所述A1組與所述空白對照組的mexC基因表達量進行比較，若P>0.05，則所述PA敏感菌菌液是敏感菌；反之，則不是；
Q2、在Q1步驟中的P>0.05時，采用T值檢測法，將所述B1組與所述A1組的mexC基因表達量進行比較得到P<0.05，且將所述B1組與所述A1組的mexC基因表達量進行比較得到B1/A1＞5，則所述B1組構建成功，即所述PA動物體內耐藥性誘導模型構建成功；反之，則不成功。
所述的構建方法，所述步驟如下，將所述A組和B組的mexC基因表達量分別代入下述公式(3)計算得到所述A2組小鼠的基因表達量抑制率和所述B2組的基因表達量抑制率，通過比較不同誘導造模時間的所述A2組小鼠和B2組小鼠的所述基因表達量抑制率，獲得所述B2組的PA耐藥程度以及PA耐藥變化規律，
所述構建方法中，采用實時熒光定量RT-PCR檢測所述mexC基因表達量的方法包括如下步驟：
1)采集所述小鼠的肺組織并提取RNA，備用；
2)取步驟1)中提取的RNA，采用銅綠假單胞菌mexC基因的特異性上下游引物以及作為內參基因的看家基因rpsL的特異性上下游引物進行一步法實時熒光PCR反應，分析PCR過程各檢測樣本的Ct值；
所述mexC基因的特異性上下游引物如下：
mexC-F：5′-GTACCGGCGTCATGCAGGGTTC-3′；
mexC-R：5′-TTACTGTTGCGGCGCAGGTGACT-3′；
所述看家基因rpsL的特異性上下游引物如下：
rpsL-F：5′-GCAAGCGCATGGTCGACAAGA-3′
rpsL-R：5′-CGCTGTGCTCTTGCAGGTTGTGA-3′；
3)根據上述CT值計算各檢測樣本mexC基因的相對表達量和相對表達倍數。
所述實時熒光定量PCR擴增體系如下：
樣本RNA，15μg/ml，2μl；
One Step SYBR GREEN，16.4μl；
mexC-F引物液，10pmol，0.8μl；
mexC-R引物液，10pmol，0.8μl；
rpsL-F引物液，10pmol，0.8μl；
rpsL-R引物液，10pmol，0.8μl；
所述擴增體系反應體積為20μl。
所述實時熒光PCR的擴增程序如下：
95℃滅活30sec，95℃變性20sec，60℃退火20sec，72℃延伸30sec，共40個循環。
所述mexC基因的相對表達量的計算方法如下：以rpsL作為內對照，任意選擇一個樣本Con作為Calibrator，Con△Ct＝Con Ct－Con rpsL Ct；樣本△Ct＝樣本Ct－樣本rpsL Ct；樣本△△Ct＝樣本△Ct－Con△Ct；2-ΔΔCt數值代表樣本mexC基因表達相對Calibrator的表達倍數；所述樣本mexC基因的相對表達量＝2-ΔΔCt×100％。
所述的構建方法，在所述步驟(2)中，對所述A組和B組的小鼠用乙醚麻醉，以1×109cfu/ml濃度的PA敏感菌菌液滴鼻感染麻醉的小鼠，每只50μl，備用；所述誘導耐藥組自第一次感染后到取材之前，每隔3天對上述小鼠進行感染一次。
所述的構建方法，在所述步驟(3)中，在所述步驟(2)中所述B組第一次感染1小時后，對每只所述小鼠按照27mg/kg/d的給藥量灌胃給予左氧氟沙星進行誘導耐藥造模，在誘導造模期間，每天1次。
所述的構建方法，在所述步驟(4)中，對所述步驟(3)中的所述A2組和B2組的每只小鼠按92mg/kg/d的給藥量灌胃給予左氧氟沙星進行給藥治療，每天1次，連續3天。
本發明提供了一種由上述的PA動物體內耐藥性誘導模型的構建方法構建得到所述的PA動物體內耐藥性誘導模型。
本發明提供了一種由所述的PA動物體內耐藥性誘導模型構建方法或所述的PA動物體內耐藥性誘導模型在篩選具有抗細菌耐藥性作用或延緩細菌耐藥性作用的藥物的應用。
所述的應用，包括所述的PA動物體內耐藥性誘導模型在篩選芪歸銀顆粒是否具有抗細菌耐藥性作用或延緩細菌耐藥性作用的應用。
本發明還提供了一種利用所述的PA動物體內耐藥性誘導模型檢測芪歸銀顆粒抗細菌耐藥性的方法，包括如下步驟：
a)按照上述的PA動物體內耐藥性誘導模型的構建方法構建待測藥物的PA動物體內耐藥性誘導模型，構建了空白對照組、未誘導耐藥模型組A1、未誘導耐藥模型給藥組A2、誘導耐藥模型組B1、誘導耐藥模型給藥組B2和所述待測藥物的誘導耐藥模型給藥組C；
b)采用T值檢驗法，將所述B2組的肺指數和所述的B1組的肺指數比較得到P>0.05，且將所述C組的肺指數和所述的B1組的肺指數比較得到P<0.05，則所述待測藥物具有抗細菌耐藥性的作用或延緩細菌耐藥性作用；反之，則沒有。
所述的方法，在所述PA動物體內耐藥性誘導模型的構建方法的所述步驟(3)中，對所述C組誘導造模時，對所述小鼠給予低濃度左氧氟沙星后，同時給予所述待測藥物。
所述的方法，還包括通過小鼠肺組織中外排泵基因mexC表達量來驗證所述待測藥物是否具有抗細菌耐藥性作用或延緩細菌耐藥性作用的步驟：
采用T值檢測法，將所述B1組與所述B2組的mexC基因表達量進行比較得到P>0.05時，然后采用T值檢測法，將所述C組與所述B1組的mexC基因表達量進行比較得到P<0.05，且將所述C組與所述A1組的mexC基因表達量進行比較得到C/A1<5，則所述待測藥物具有抗細菌耐藥性的作用或延緩細菌耐藥性作用；若以上任一條件未滿足，則沒有。
還包括將所述A組肺指數代入上述公式(2)中計算得到所述A2組小鼠的肺指數抑制率，將所述B1組和C組的肺指數代入上述公式(2)中計算得到所述C組小鼠的肺指數抑制率，通過比較不同誘導造模時間的所述A2組小鼠和C組小鼠的所述肺指數抑制率，獲得所述C組的PA耐藥程度以及PA耐藥變化規律。
所述的方法，還包括將所述A組mexC基因表達量分別代入上述公式(3)中計算得到所述A2組小鼠的基因表達量抑制率，將所述B1組和C組的mexC基因表達量代入上述公式(3)中計算得到所述C組小鼠的基因表達量抑制率，通過比較不同誘導造模時間的所述A2組小鼠和C組小鼠的所述基因表達量抑制率，獲得所述C組的PA耐藥程度以及PA耐藥變化規律。
本發明技術方案，具有如下優點：
(1)本發明所述的PA動物體內耐藥性誘導模型的構建方法，包括如下步驟：(1)取健康小鼠若干只，雌雄各半，隨機分成空白對照組、未誘導耐藥模型組A1、未誘導耐藥模型給藥組A2、誘導耐藥模型組B1和誘導耐藥模型給藥組B2，備用；所述未誘導耐藥模型組A1和未誘導耐藥模型給藥組A2合稱為A組，所述誘導耐藥模型組B1和誘導耐藥模型給藥組B2合稱為B組；(2)對所述A組和B組的小鼠以PA敏感菌菌液感染至少一次，備用；(3)對所述步驟(2)中所述B組第一次感染后，對所述小鼠給予低濃度的左氧氟沙星進行誘導耐藥造模，備用；所述空白對照組和A組在所述B組誘導造模期間每天以相同條件下給予蒸餾水，備用；(4)對步驟(3)中的所述A2組和B2組給予治療劑量的所述左氧氟沙星進行給藥治療；所述空白對照組、A1組和B1組在上述A2組和B2組給藥治療期間每天以相同條件下給予蒸餾水，備用；(5)在給藥治療后，分別對步驟(4)中的所述空白對照組、A組和所述B組中的小鼠稱重并記錄體重，然后處死小鼠進行取材，取肺部稱重并記錄肺濕重，然后按照下述公式(1)計算小鼠的肺指數，計算得到所述空白對照組、A組和所述B組的肺指數，采用T值檢驗法比較所述B1組是否構建成功，包括如下步驟：S1、采用T值檢測法，將所述A1組和B1組分別與所述空白對照組的肺指數進行比較，若兩者的P值均為P<0.05，則所述PA敏感菌菌液感染所述A組和B組中的所述健康小鼠；反之，則沒有；S2、采用T值檢測法，將所述A2組與所述A1組進行比較，若P<0.05，則所述治療劑量的所述左氧氟沙星具有治療PA感染的功效；反之，則沒有；S3、在S1步驟中和S2步驟中的P值均為P<0.05時，采用T值檢測法，將所述B1組與所述B2組的肺指數進行比較，若P＞0.05，則所述B1組構建成功，即所述PA動物體內耐藥性誘導模型構建成功；反之，則沒有；通過所述方法構建的模型能更好的模擬臨床長期應用廣譜抗生素的患者出現PA感染的現象，尤其是患者呼吸道感染PA的現象，可以觀察銅綠假單胞菌在小鼠體內耐藥性發展變化的規律，以期達到模擬機體中該菌的變化，便于對抗細菌耐藥的藥物治療的研究，同時該動物模型采用肺指數評價動物模型更加直觀，評價結果精確，造模周期短，效率高。
(2)本發明所述的PA動物體內耐藥性誘導模型的構建方法，通過采用實時熒光定量RT-PCR檢測mexC基因表達量來驗證所構建的模型是否成功，在實驗過程中，發現當動物體內PA產生耐藥性時，其mexC基因表達量增大，因此以mexC基因是否大量表達來驗證構建的PA動物體內耐藥模型是否成功，驗證結果精確，效率高。
(3)本發明所說的利用所述的PA動物體內耐藥性誘導模型篩選藥物抗細菌耐藥性的方法，檢測藥物抗細菌耐藥性結果精確，周期短。
具體實施方式
下述實施例中所使用的PA敏感菌菌株購自美國ATCC，-80℃冰箱保存，現用現配；
ICR小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；
電子天平購自上海越平科學儀器有限公司，型號YP1002(稱體重)；梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號AL204(稱肺重)；
實時熒光定量PCR儀購自Thermo公司，型號PikoReal Real-Time型；
所述PA敏感菌菌液按照常規方法進行培養，具體為如下方法培養獲得：取滅菌后的10ml MH肉湯培養基中，然后接種10μl的濃度為1.5×108cfu/ml銅綠假單胞菌菌液，將含有菌液的培養基置于恒溫振蕩培養箱(由哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司提供，型號HZQ-F160)中，37℃下培養24h，振蕩頻率為65rpm。培養結束后，采用比濁法，將菌液稀釋到1×109CFU/ml，即得所述PA敏感菌菌液。
所述MH肉湯培養基購自OXOID公司，1583507。在使用前對其滅菌，步驟如下：稱取所述MH肉湯培養基21.0g，加熱溶解于1000ml蒸餾水中，121℃高壓滅菌15分鐘，備用。
所使用的芪歸銀顆粒由北京中醫藥大學中藥學院中藥研究室提供，由如下原料藥組成：生黃芪60g、當歸15g、金銀花15g、青蒿10g和虎杖10g。左氧氟沙星，由第一三共制藥(北京)有限公司提供。
實施例1
本實施例提供了一種PA動物體內耐藥性誘導模型的構建方法，包括如下步驟：
(1)取健康ICR小鼠200只，雌雄各半，體重14±1g，隨機分組，誘導造模期分別設置為3天、5天、7天、9天，每個誘導造模期設置空白對照組、未誘導耐藥模型組A1、未誘導耐藥模型給藥組A2、誘導耐藥模型組B1和誘導耐藥模型給藥組B2，總共20個小組(見下表2)，每組10只，備用；所述未誘導耐藥模型組A1和未誘導耐藥模型給藥組A2合稱為A組，所述誘導耐藥模型組B1和誘導耐藥模型給藥組B2合稱為B組；
(2)對所述A組和B組的小鼠用乙醚麻醉，以1×109cfu/ml濃度的PA敏感菌菌液滴鼻感染麻醉的小鼠，每只50μl，備用；所述A組和所述B組自第一次感染后到取材(處死小鼠)之前，每隔3天對上述各組的每只小鼠進行感染一次；
(3)對所述步驟(2)中所述B組第一次感染1小時后，對所述B組的每只小鼠灌胃給予低濃度左氧氟沙星進行誘導耐藥造模，按照27mg/kg/d(每1kg小鼠每天給予27mg左氧氟沙星)給小鼠灌胃給予左氧氟沙星，灌胃體積為0.2ml/10g體重/次(每10g小鼠每次給予0.2ml/左氧氟沙星)，在誘導造模期，每天一次，備用；所述空白對照組和A組在所述B組誘導造模期間每天在相同條件下給予蒸餾水，備用；
(4)對步驟(3)中A2組和B2組給予治療劑量的左氧氟沙星進行給藥治療，按照92mg/kg/d(每1kg小鼠每天給予92mg左氧氟沙星)給小鼠灌胃給予左氧氟沙星，灌胃體積為0.2ml/10g體重/次(每10g小鼠每次給予0.2ml/左氧氟沙星)，連續給藥治療3天，每天一次；所述空白對照組和A1組以及B1組在上述A2組和B2組給藥治療期間每天相同條件下給予蒸餾水，備用；
(5)在給藥治療后，分別對步驟(4)中的所述空白對照組、A組和所述B組中的小鼠稱重并記錄體重，然后處死小鼠進行取材，取肺部稱重并記錄肺濕重，然后按照下述公式(1)計算小鼠的肺指數，結果見下表2，
計算得到所述空白對照組、A組和所述B組的肺指數，采用T值檢驗法比較所述B1組是否構建成功，包括如下步驟：
S1、采用T值檢測法，將所述A1組和B1組分別與所述空白對照組的肺指數進行比較，若兩者的P值均為P<0.05，則所述PA敏感菌菌液感染所述A組和B組中的所述健康小鼠；反之，則沒有；
S2、采用T值檢測法，將所述A2組與所述A1組進行比較，若P<0.05，則所述治療劑量的所述左氧氟沙星具有治療PA感染的功效；反之，則沒有；
S3、在S1步驟中和S2步驟中的P值均為P<0.05時，采用T值檢測法，將所述B1組與所述B2組的肺指數進行比較，若P＞0.05，則所述B1組構建成功，即所述PA動物體內耐藥性誘導模型構建成功；反之，則沒有；
分別將計算得到的所述A組和B組的肺指數代入下述公式(2)中計算得到A2組小鼠的肺指數抑制率和B2組的肺指數抑制率，通過比較不同誘導造模時間的所述A2組小鼠和B2組小鼠的肺指數抑制率，獲得所述B2組的PA耐藥程度以及PA耐藥變化規律，結果見下表2，
本實施例還提供了利用上述構建的所述的PA動物體內耐藥性誘導模型在篩選芪歸銀顆粒是否具有抗細菌耐藥性作用或延緩細菌耐藥性作用的應用，步驟如下：
a)按照所述的PA動物體內耐藥性誘導模型的構建方法構建所述芪歸銀顆粒的PA動物體內耐藥性誘導模型，構建了不同誘導造模期的空白對照組、未誘導耐藥模型組A1、未誘導耐藥模型給藥組A2、誘導耐藥模型組B1、誘導耐藥模型給藥組B2和所述待測藥物的誘導耐藥模型給藥組C；在上述實施例所述的PA動物體內耐藥性誘導模型構建方法基礎上，還設置所述芪歸銀顆粒的誘導耐藥模型給藥組C，所述C組與B2組相同，區別僅在于在所述的PA動物體內耐藥性誘導模型的構建方法的所述步驟(3)中，對所述C組誘導造模時，對所述小鼠給予低濃度左氧氟沙星同時給予所述待測藥物；即取健康ICR小鼠120只，雌雄各半，體重14±1g，隨機分組見下表1，誘導造模時間分別為3天、5天、7天、9天，每個誘導造模時間設置所述芪歸銀顆粒的大、中、小劑量組(即芪歸銀顆粒的大劑量組C1、芪歸銀顆粒的中劑量組C2和芪歸銀顆粒的小劑量組C1)，所述芪歸銀顆粒的大、中、小劑量組的給藥量依次為220g生藥/60kg/d、110g生藥/60kg/d和55g生藥/60kg/d，總共12個小組，每組10只小鼠，按照所述誘導耐藥模型給藥組B2的構建方法依次進行感染、誘導造模、給藥治療和肺指數、肺指數抑制率計算，其中在誘導造模時，對所述小鼠灌胃給予低濃度左氧氟沙星的同時，灌胃給予相應劑量的所述芪歸銀顆粒，在誘導造模期間，每天1次；
b)采用T值檢驗法，將所述B2組的肺指數和所述的B1組的肺指數比較得到P>0.05，且將所述C組的肺指數和所述的B1組的肺指數比較得到P<0.05，則所述待測藥物具有抗細菌耐藥性的作用或延緩細菌耐藥性作用；反之，則沒有；
還包括將所述A組肺指數代入上述公式(2)中計算得到所述A2組小鼠的肺指數抑制率，將所述B1組和C組的肺指數代入上述公式(2)中計算得到所述C組小鼠的肺指數抑制率，通過比較不同誘導造模時間的所述A2組小鼠和C組小鼠的所述肺指數抑制率，獲得所述C組的PA耐藥程度以及PA耐藥變化規律，結果見表2。
表1分組情況
表2芪歸銀顆粒對低濃度左氧氟沙星誘導致小鼠體內產生耐藥的延緩作用
注：與空白對照組比較，##P<0.01；
與未誘導耐藥模型組A1比較**P<0.01，*P<0.05；
與誘導耐藥模型組B1比較▽P<0.05，▽▽P<0.01。
如表2結果顯示，如誘導造模期為3天的所述PA動物體內耐藥性誘導模型：采用銅綠假單胞菌敏感株感染健康的ICR小鼠后，未誘導耐藥模型組A1和誘導耐藥模型組B1的小鼠肺指數均明顯增高，兩者與空白對照組比較均有顯著性差異(##P<0.01)，說明所述PA敏感菌菌液感染了所述A組和B組中的所述健康ICR小鼠；未誘導耐藥模型給藥組A2的小鼠肺指數明顯降低，未誘導耐藥模型給藥組A2和未誘導耐藥模型組A1的肺指數比較具有顯著性差異(*P<0.05)，說明所述治療劑量的所述左氧氟沙星具有治療PA感染的功效；所述誘導耐藥模型給藥組B2的小鼠肺指數無明顯降低，所述誘導耐藥模型組B1和誘導耐藥模型給藥組B2的小鼠肺指數比較沒有顯著性差異(P>0.05)，說明誘導造模期為3天的所述誘導耐藥模型組B1構建成功，即所述PA動物體內耐藥性誘導模型構建成功；如誘導造模期為3天的所述芪歸銀顆粒干預的誘導耐藥給藥組C，所述誘導耐藥給藥組B2對小鼠肺指數無明顯降低作用，與誘導耐藥模型組B1比較無顯著性差異(P>0.05)，所述芪歸銀顆粒大劑量組C1和芪歸銀顆粒中劑量組C2對小鼠肺指數有明顯降低作用，與誘導耐藥模型組B1比較有顯著性差異(▽▽P<0.01)，說明大、中劑量的芪歸銀顆粒對誘導超過3天的誘導耐藥模型(PA動物體內耐藥誘導模型)有抗細菌耐藥性或延緩細菌耐藥性的作用，所述芪歸銀顆粒小劑量組C3對小鼠肺指數無明顯降低作用，與誘導耐藥模型組B1比較沒有顯著性差異(▽P>0.05)，說明小劑量的芪歸銀顆粒對誘導超過3天的誘導耐藥模型(PA動物體內耐藥模型)無抗細菌耐藥性或延緩細菌耐藥性的作用。再如誘導造模期為7天的所述芪歸銀顆粒的誘導耐藥給藥組C，所述誘導耐藥給藥組B2對小鼠肺指數無明顯降低作用，與誘導耐藥模型組B1比較無顯著性差異(P>0.05)，而所述芪歸銀顆粒劑量組C1、C2和C3對小鼠肺指數也無明顯降低作用，與誘導耐藥模型組B1比較無顯著性差異(P>0.05)，說明大、中、小劑量的芪歸銀顆粒對誘導超過7天的誘導耐藥模型(PA動物體內耐藥誘導模型)抗細菌耐藥性或延緩細菌耐藥性的作用降低或沒有。
比較不同誘導造模期的未誘導耐藥模型給藥組A2、誘導耐藥模型給藥組B2和所述芪歸銀顆粒的誘導耐藥給藥組C的肺指數抑制率，發現隨著誘導造模期的增加，未誘導耐藥模型給藥組A2的肺指數抑制率逐漸降低，對于感染PA菌時間短具有明顯的治療效果，對于感染PA菌時間長沒有有明顯的治療效果，誘導耐藥模型給藥組B2的肺指數抑制率逐漸降低，說明所述PA菌誘導耐藥時間越長，左氧氟沙星治療PA感染的效果逐漸降低，沒有效果，即使用左氧氟沙星治療PA感染的時間越長，PA菌對其產生耐藥性越強；所述芪歸銀顆粒大劑量組C1、中劑量組C2對于誘導造模時間為3天的誘導耐藥模型具有顯著的抑制PA菌耐藥的作用，而小劑量組沒有抑制細菌耐藥的作用，說明在臨床上使用芪歸銀顆粒大劑量組C1和中劑量組C2結合左氧氟沙星治療PA菌感染，芪歸銀顆粒大劑量組C1和中劑量組C2抑制PA菌對左氧氟沙星等抗生素耐藥顯著；所述芪歸銀顆粒中劑量組C2對于誘導造模時間為5天的誘導耐藥模型具有顯著的抑制PA菌耐藥的作用，而所述C1組和C3組具有相當的抑制PA菌耐藥作用，說明在臨床上稍長期使用芪歸銀顆粒中劑量組C2結合左氧氟沙星治療PA菌感染，芪歸銀顆粒中劑量組C2對于抑制PA菌對左氧氟沙星等抗生素耐藥效果顯著，在臨床稍長期使用芪歸銀顆粒大劑量組C1或小劑量組C3結合左氧氟沙星治療PA菌感染，能夠抑制PA菌對左氧氟沙星等抗生素耐藥，而在誘導造模期為7天或9天中觀察，C1組、C2組和C3組對于結合左氧氟沙星治療PA菌感染，芪歸銀顆粒對于抑制PA菌對左氧氟沙星等抗生素耐藥效果低。
實施例2
本實施例在實施例1的基礎上，利用小鼠肺組織中外排泵基因mexC表達量來驗證所述PA動物體內耐藥性誘導模型是否構建成功的步驟，采用實時熒光定量RT-PCR檢測所述mexC基因表達量的方法包括如下步驟：
1)采集實施例1中各組所述小鼠的肺組織作為樣本置于研缽中，加入液氮，研磨細后，收集于1.5ml離心管中，每個樣本加入1ml Trizol，提取RNA；將加入1ml Trizol Reagent的EP管輕彈管底，使混合樣品重懸，室溫放置20min，4℃，12000rpm，離心10min；移澄清上清液入一新的EP管中，加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋，用力搖動15s，室溫孵育2-3min，4℃，12000rpm，離心15min；移上清液到新的EP管中，加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫孵育30min，4℃，12000rpm，離心10min；棄上清，用1ml 75％乙醇(含DEPC)洗沉淀(應使白色或半透明的沉淀飄起)，4℃，7500rpm，離心5min；棄上清(用移液器吸棄)，通風櫥內干燥5-10min；用DEPC水溶解沉淀，﹣80℃保存或進入下一步PCR。
2)取步驟(1)中提取的RNA，采用銅綠假單胞菌mexC基因的特異性上下游引物以及作為內參基因的看家基因rpsL的特異性上下游引物進行一步法實時熒光定量PCR反應，分析PCR過程各檢測樣本的Ct值，使用實時熒光定量PCR儀中的PikoRealTM Software 2.1軟件分析PCR過程各檢測樣本的Ct(Threshold of cycle)值；
所述mexC基因的特異性上下游引物(所述引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成)，參見SEQ ID NO：1-2，如下：
mexC-F：5′-GTACCGGCGTCATGCAGGGTTC-3′；
mexC-R：5′-TTACTGTTGCGGCGCAGGTGACT-3′；
所述看家基因rpsL的特異性上下游引物(所述引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成)，參見SEQ ID NO：3-4，如下：
rpsL-F：5′-GCAAGCGCATGGTCGACAAGA-3′
rpsL-R：5′-CGCTGTGCTCTTGCAGGTTGTGA-3′；
所述實時熒光定量PCR擴增體系如下：
樣本RNA，2μl；
One Step SYBR GREEN，16.4μl；
mexC-F引物液，10pmol，0.8μl；
mexC-R引物液，10pmol，0.8μl；
rpsL-F引物液，10pmol，0.8μl；
rpsL-R引物液，10pmol，0.8μl；
所述擴增體系反應體積為20μl；
所述實時熒光定量PCR的擴增程序如下：
95℃滅活30sec，95℃變性20sec，60℃退火20sec，72℃延伸30sec，共40個循環；
3)根據上述CT值計算各檢測樣本mexC基因的相對表達量，所述mexC基因的相對表達量的計算方法如下：以rpsL作為內對照，任意選擇一個樣本Con作為Calibrator，Con△Ct＝Con Ct－Con rpsL Ct；樣本△Ct＝樣本Ct－樣本rpsL Ct；樣本△△Ct＝樣本△Ct－Con△Ct；2-ΔΔCt數值代表樣本mexC基因表達相對Calibrator的表達倍數；所述樣本mexC基因的相對表達量＝2-ΔΔCt×100％；相對表達倍數＝各組樣本mexC基因表達量均值/未誘導耐藥模型組樣本mexC基因表達量均值，結果見表3；
采用T值檢測法，將所述B1組與所述B2組的mexC基因表達量進行比較得到P>0.05時，然后采用T值檢測法，將所述C組與所述B1組的mexC基因表達量進行比較得到P<0.05，且將所述C組與所述A1組的mexC基因表達量進行比較得到C/A1<5，則所述待測藥物具有抗細菌耐藥性的作用或延緩細菌耐藥性作用；若以上任一條件未滿足，則沒有。
將所述A組mexC基因表達量分別代入上述公式(3)中計算得到所述A2組小鼠的基因表達量抑制率，將所述B1組和C組的mexC基因表達量代入上述公式(3)中計算得到所述C組小鼠的基因表達量抑制率，通過比較不同誘導造模時間的所述A2組小鼠和C組小鼠的所述基因表達量抑制率，獲得所述C組的PA耐藥程度以及PA耐藥變化規律，結果見表3，
表3芪歸銀顆粒對銅綠假單胞菌感染正常小鼠肺組織中外排泵基因表達量的影響
注：與空白對照組比較，##P<0.01，#P<0.05；
與未誘導耐藥模型組A1比較*P<0.05；
與誘導耐藥模型組B1比較▽▽P<0.01,▽P<0.05；
如表3結果顯示：不同誘導造模期的未誘導耐藥模型組A1采用銅綠假單胞菌敏感株感染正常小鼠后，未誘導耐藥模型組A1的小鼠肺組織中mexC基因表達無明顯變化，與空白對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)，而所述誘導耐藥模型組B1小鼠肺組織中mexC基因表達明顯增高，與所述未誘導耐藥模型組A1比較具有顯著性差異(*P<0.05)，且較未誘導耐藥模型組A1小鼠肺組織中mexC基因表達倍數依次為8.57、7.93、12.13、8.47，均大于5，驗證了不同誘導造模期的所述誘導耐藥模型組B1構建成功。如誘導造模期為3天的所述芪歸銀顆粒的誘導耐藥給藥組C，所述誘導耐藥給藥組B2對小鼠mexC基因表達與誘導耐藥模型組B1比較無顯著性差異(P>0.05)，所述芪歸銀顆粒劑量組C2可顯著降低小鼠肺組織中mexC基因表達水平，與誘導耐藥模型組B1比較有顯著性差異(▽P<0.05)，且較未誘導耐藥模型組A1小鼠肺組織中mexC基因表達倍數為1.23倍，小于5倍，說明芪歸銀顆粒中劑量組對誘導超過3天的誘導耐藥模型(PA動物體內耐藥模型)有抗細菌耐藥性或延緩細菌耐藥性的作用。再如誘導造模期為7天的所述芪歸銀顆粒的誘導耐藥給藥組C，所述誘導耐藥給藥組B2對小鼠mexC基因表達水平與誘導耐藥模型組B1比較無顯著性差異(P>0.05)，而所述芪歸銀顆粒劑量組C1、C2和C3對小鼠mexC基因表達水平與誘導耐藥模型組B1比較無顯著性差異(P>0.05)，但基因表達量較誘導耐藥模型組低，說明大、中、小劑量的芪歸銀顆粒對誘導超過7天的誘導耐藥模型(PA動物體內耐藥模型)作用降低。
比較不同誘導造模期的誘導耐藥模型給藥組B2和所述芪歸銀顆粒的誘導耐藥給藥組C的基因表達抑制率，發現隨著誘導造模期的增加，誘導耐藥模型給藥組B2的基因表達抑制率逐漸降低，說明所述PA菌誘導耐藥時間越長，左氧氟沙星治療PA感染的效果逐漸降低，即使用左氧氟沙星治療PA感染的時間越長，PA菌對其產生耐藥性越強，所述芪歸銀顆粒大劑量組C1、中劑量組C2、小劑量組C3對于誘導造模時間為3天的誘導耐藥模型具有顯著的抑制PA菌耐藥的作用，說明在臨床上使用芪歸銀顆粒大劑量組C1、中劑量組C2和小劑量組C3結合左氧氟沙星治療PA菌感染，芪歸銀顆粒大劑量組C1、中劑量組C2和小劑量組C3抑制PA菌對左氧氟沙星等抗生素耐藥顯著，所述芪歸銀顆粒中劑量組C2對于誘導造模時間為5天的誘導耐藥模型具有顯著的抑制PA菌耐藥的作用，而所述C1組和C3組具有相當的抑制PA菌耐藥作用，說明在臨床上稍長期使用芪歸銀顆粒中劑量組C2結合左氧氟沙星治療PA菌感染，芪歸銀顆粒中劑量組C2對于抑制PA菌對左氧氟沙星等抗生素耐藥效果顯著，在臨床稍長期使用芪歸銀顆粒大劑量組C1或小劑量組C3結合左氧氟沙星治療PA菌感染，能夠抑制PA菌對左氧氟沙星等抗生素耐藥，而在誘導造模期為7天和9天中觀察，C1組、C2組和C3組對于結合左氧氟沙星治療PA菌感染，芪歸銀顆粒對于抑制PA菌對左氧氟沙星等抗生素耐藥效果降低，說明長期使用芪歸銀顆粒其抑制PA菌耐藥作用降低。
顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明創造的保護范圍之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 首都醫科大學附屬北京中醫醫院
<120> 一種PA動物體內耐藥性模型及其構建方法和應用
<130> HA201602458
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gtaccggcgt catgcagggt tc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ttactgttgc ggcgcaggtg act 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gcaagcgcat ggtcgacaag a 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
cgctgtgctc ttgcaggttg tga 23