兩親性嵌段納米膠束載拉帕替尼及腦靶向納米膠束的制備方法與流程

本發明涉及腦靶向制劑領域，具體地，涉及一種兩親性嵌段納米膠束載拉帕替尼及腦靶向納米膠束的制備方法。

背景技術：

拉帕替尼是一種口服的小分子表皮生長因子(EGFR：ErbB-1，ErbB-2)酪氨酸激酶抑制劑。臨床主要用于Her-2陽性且既往接受過包括蒽環類，紫杉醇，曲妥珠單抗(赫賽汀)治療的晚期或轉移性乳腺癌。

基于一系列臨床試驗的結果，拉帕替尼對于復發轉移、對赫賽汀耐藥的HER2陽性乳腺癌患者，均有很好的臨床效果，因此目前拉帕替尼可以作為單藥或與化療藥物聯合在臨床上應用。

拉帕替尼在晚期或轉移性Her-2陽性的乳腺癌的治療中，具有不可替代的優勢。但是，拉帕替尼的水溶性很差，在水中的溶解度僅為0.007mg/ml，難以制備水溶性注射劑，只能以口服片劑的方式給藥。不僅如此，拉帕替尼的生物利用度還很低(小于20％)，需要增加給藥劑量(單次給藥劑量達1.25g)和給藥頻次。由于該藥物價格昂貴，因此目前服用拉帕替尼極大增加了腫瘤患者的毒副作用及經濟負擔，并在一定程度上減弱了患者的依從性。

更重要的是，由于拉帕替尼很難在腦轉移病灶中達到有效劑量，對乳腺癌腦轉移瘤基本無效。因此，研發拉帕替尼水溶性注射給藥系統及具有腦靶向功能的遞藥系統，有望提高生物利用度和抗腫瘤效果，降低毒副作用，提高藥物經濟效益，具有良好的研究價值和臨床意義。

發明的內容

本發明旨在克服上述缺陷，提供了一種水溶性納米膠束載藥系統，并且在此基礎上連接親大腦內皮細胞的短肽分子Angiopep-2，使得載藥膠束具有腦靶向功能，能夠跨越血腦屏障并且到達腦轉移病灶部位，發揮療效。

本發明提供了一種腦靶向納米膠束，其特征在于：將載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束與親大腦內皮細胞的短肽分子Angiopep-2相連接。

進一步地，本發明提供的一種腦靶向納米膠束的制備方法，還具有這樣的特點：即、具體制造工序如下所示：

步驟一、在載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束溶液中投入活化劑，活化膠束外層聚合物上的羧基鍵；

步驟二、在活化好的載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束溶液中投入Angiopep-2,于10-40℃的溫度下孵化，使膠束的羧基鍵與短肽的氨基鍵連接，形成具有靶向功能的膠束；

步驟三、除去活化劑，得到純凈的腦靶向納米膠束水溶液。

進一步地，本發明提供的一種腦靶向納米膠束的制備方法，還具有這樣的特點：即、上述活化劑的添加量為拉帕替尼用量的1-10倍；優選為3-6倍。

上述Angiopep-2的用量為拉帕替尼用量的0.1-5倍；優選為0.3-0.7倍。該Angiopep-2的用量一般為活化劑添加量的0.08-0.5倍。上述用量均為質量比。

其中，上述拉帕替尼指用于制備載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束溶液的過程中所使用的拉帕替尼的量。

進一步地，本發明提供的一種腦靶向納米膠束的制備方法，還具有這樣的特點：即、在上述步驟一中，活化劑選自可活化羧基的任何試劑，最優選使用N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽。

進一步地，本發明提供的一種腦靶向納米膠束的制備方法，還具有這樣的特點：即、上述步驟一的活化時間為0.5-2小時，活化溫度為10-80℃；

上述步驟二的孵化時間為4-12小時。

此外，本發明提供的一種腦靶向納米膠束，還具有這樣的特點：即、上述載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束由拉帕替尼和聚合物通過薄膜水化法制備而成；

其中，上述聚合物選自聚乙二醇、聚乙二醇馬來酰亞胺或甲氧基聚乙二醇與聚乳酸、聚L-丙交酯-乙交酯、聚ε-己內酯、聚(DL-丙交酯-乙交酯)、聚L-丙交酯、聚L-丙交酯中的一種或幾種的共聚產物；形成如：PEG-PLA、mPEG-PLA、malePEG-PLA等等結構的聚合物；

和/或

上述聚合物選自聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇與聚乳酸、聚L-丙交酯-乙交酯、聚ε-己內酯、聚(DL-丙交酯-乙交酯)、聚L-丙交酯、聚L-丙交酯中的一種或幾種的末端進行羧基封端的共聚產物。形成如：HOOC-PEG-PLA、HOOC-mPEG-PLA等等結構的聚合物。

其中，上述共聚物中，聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇選自分子量為500-50000的聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇；優選自分子量為1000-10000范圍內的聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇；最優選自分子量為1000、2000、3000、4000、5000的聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇。

上述共聚物中，聚乳酸、聚L-丙交酯-乙交酯、聚ε-己內酯、聚(DL-丙交酯-乙交酯)、聚L-丙交酯或聚L-丙交酯選自分子量為100-50000的上述化合物；優選自分子量為200-20000范圍內的上述化合物中的一種或多種，與聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇形成的嵌段聚合的產物。

此外，本發明提供的一種腦靶向納米膠束，還具有這樣的特點：即、上述載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束的具體制備方法如下所示：

步驟一、將拉帕替尼和聚合物共同溶解于有機溶劑中；

步驟二、于10-60℃的溫度下，除去有機溶劑，得到薄膜；

步驟三、于10-60℃的恒溫水浴條件下，使薄膜全部溶解于水中，得到載藥膠束液體；水的用量根據后續反應的需要進行添加，優選為有機溶劑用量的0.5-5倍。

步驟四、通過過濾，獲得純凈的載藥膠束液體。

此外，本發明提供的一種腦靶向納米膠束，還具有這樣的特點：即、上述拉帕替尼和聚合物的質量比為1:5-20。優選為1:8-14。上述比例均指質量比。

此外，本發明提供的一種腦靶向納米膠束，還具有這樣的特點：即、上述有機溶劑選自低沸點的容易，優選為醇類溶劑，最優選為甲醇；

上述聚合物選自共聚產物和末端進行羧基封端的共聚產物；這兩種聚合物溫度混合物；

其中，上述共聚產物和末端進行羧基封端的共聚產物的質量比為10:0.1-5。

最優選自所述聚合物選自PEG-PLA和COOH-PEG-PLA＝10:0.8-2(質量比)的混合物，或malePEG-PLA和COOH-PEG-PLA＝10:0.8-2(質量比)的混合物。

此外，本發明還提供了上述的一種腦靶向納米膠束的應用，其特征在于：應用于治療晚期或Her-2陽性的乳腺癌腦轉移的病癥。

本發明的作用和效果：

在本發明中，通過制備水溶性載藥納米膠束，并在此基礎上制備連接有腦靶向功能的載藥膠束。利用氨基和羧基鍵將膠束與靶向分子Angiopep-2連接，制備成具有腦靶向功能的納米載藥膠束。經靶向載藥膠束透體外血腦屏障的能力研究實驗可知，本發明涉及的接有靶向分子的膠束具有良好的穿透血腦屏障的功能。

此外，目前膠束的制備方法主要是透析法、自組裝法、靜電作用法、化學結合法，但是，這些方法都存在各種各樣的缺點，比如：透析法靜電作用法，不適合大規模生產；自組裝法，僅依靠范德華力等非共價鍵連接，所得膠束不穩定，化學結合法對材料的要求性很高。

為了克服上述缺陷，在本發明中，采用薄膜水化法制備載拉帕替尼的水溶性膠束，利用聚合物的生物特性，形成疏水內殼包裹藥物拉帕替尼，親水外殼提供良好的水溶性，能提拉帕替尼這類水溶性極差的藥物的水溶解性能，從而能擴展該類藥物的應用。此外，經檢測該薄膜水化法制備的膠束的粒徑及電鏡圖發現，該膠束的載藥量包封率完全能滿足臨床需求。

此外，通過研究發現，載藥膠束比空白膠束的粒徑更小，能使該藥物在應用的過程中，順利的到達目標靶點位置，因此，大大提高了其臨床上的應用。

其后，該水溶性的膠束以羧基和氨基鍵形成的共價鍵連接膠束與靶向短肽分子，使得膠束具有親大腦內皮細胞功能。而載藥膠束具有的腦靶向功能，能夠跨越血腦屏障并且到達腦轉移病灶部位，發揮療效。

由此可見，采用本發明的方法獲得的腦靶向納米膠束，即能夠滿足水溶性強可注射的要求，提高生物利用度減少單次給藥劑量，降低患者經濟負擔，提高患者依從性。更重要的是，還具有腦靶向功能，可用于臨床乳腺癌腦轉移的治療，提高腦轉移患者的生存率和生活質量。

此外，本發明提供的水溶性載藥膠束，擁有良好的穩定性及生物相容性，既可以解決拉帕替尼難溶性的實際問題，又能提供了一種能夠主動靶向腦轉移病灶的遞藥系統，貢獻了一種全新的給藥劑型，解決Her-2陽性的乳腺癌腦轉移患者無藥可用的困境。

附圖說明

附圖1、實施例一涉及的載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束1#的制備流程圖；

附圖2、實施例一涉及的載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束1#的粒徑；

附圖3、實施例一涉及的載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束1#的Zeta電位圖；

附圖4、實施例二涉及的載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束2#和腦靶向納米膠束的制備流程圖。

附圖5、實施例二涉及的載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束2#的粒徑；

附圖6、實施例二涉及的載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束2#的Zeta電位圖；

附圖7、靶向載藥膠束透體外血腦屏障的能力研究圖，即、建立體外血腦屏障模型后，兩種膠束在相同時間內穿透BBB模型并進入Skbr-3細胞的定性比較圖，其中，a為載cou-6的空膠束在細胞質內的分布，b為DAPI在細胞質內的分布，c為a,b圖片疊加。

具體實施方式

實施例一、載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束1#

A.制備階段：本實施例一涉及的載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束1#采用如圖1所示的制備流程進行制備。

在本實施例中，采用薄膜水化法，使用甲醇作為溶劑，將聚合物malePEG-PLA和拉帕替尼共溶解，旋轉蒸發除盡有機溶劑并使用蒸餾水將薄膜溶于水中，形成載藥膠束，過濾得到純凈的水溶性的載拉帕替尼納米膠束。

具體工藝步驟如下：

步驟一、將4mg拉帕替尼和40mg聚合物malePEG-PLA共同溶解于6ml的甲醇中(在研究中發現，拉帕替尼在多種溶劑中均不能達到實驗所需的溶解度，而在甲醇中溶解狀態好)；

步驟二、將混合溶液用移液器轉移至250ml茄形瓶中，在40℃的恒溫水浴條件下旋轉蒸發除盡有機溶劑，得到附著于茄形瓶內的淡黃色薄膜。

步驟三、取下茄形瓶，用移液槍吸取4ml的蒸餾水，在40℃的恒溫水浴條件下使薄膜全部溶解于水中，得到淡黃色透明的載藥膠束液體。

步驟四、將所得的膠束液體過濾，除去游離藥物，得到純凈的載藥膠束液體。

B.膠束理化性能測定

B-1.膠束粒徑電位測定

加雙蒸水將載藥膠束LPTN-MIC稀釋至適當濃度，采用粒度/Zeta電位測定儀測定粒徑和Zeta電位值。

如圖2所示，載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束1#的粒徑為19.5nm，Zeta電位值為12.0mv。

此外，還采用薄膜水化法，將適量的malePEG2000-PLA200溶于甲醇后，制備成的空白膠束，其粒徑為20nm左右>載藥膠束的粒徑。

由此可以，看出，在加入拉帕替尼后，膠束粒徑反而降低了。

B-2.載藥量包封率的測定

拉帕替尼HPLC分析的色譜條件如下：

色譜柱：Dikma Diamonsil C18(4.6×250mm，5μm)

流動相：乙腈∶0.01M KH2PO4溶液(PH＝6.2)(65∶35)

流速：1.0ml/min

檢測器：紫外檢測器

檢測波長：253nm

柱溫：35℃

進樣量：20μL

精密吸取過濾后的LPTN-MIC溶液，加入定量甲醇稀釋并釋放出拉帕替尼，超聲5min使聚合物溶解完全，0.45μm微孔濾膜過濾，取溶液進樣測定。按照下式分別計算包封率(Entrapping Efficiency，EE)與載藥量(Drug Loading Capacity，DLC)：

載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束1#的載藥量DLC為7％，包封率EE為83％。

實施例二、載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束2#和腦靶向納米膠束

A.制備階段：本實施例二涉及的載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束2#和腦靶向納米膠束采用如圖4所示的制備流程進行制備。

在本實施例二中，同樣采用薄膜水化法，使用甲醇作為溶劑，將聚合物malePEG-PLA,COOH-PEG-PLA，拉帕替尼按照比例共同溶解于甲醇中，旋轉蒸發除盡有機溶劑并使用蒸餾水將薄膜溶于水中，形成載藥膠束，并利用氨基和羧基鍵將膠束與靶向分子Angiopep-2連接，制備成具有腦靶向功能的納米載藥膠束。

具體工藝步驟如下：

步驟一、將4mg拉帕替尼和40mg聚合物malePEG-PLA、4mg聚合物COOH-PEG-PLA共同溶解于6ml的甲醇中(因拉帕替尼在多種溶劑中均不能達到實驗所需的溶解度，而在甲醇中溶解狀態好)

步驟二、將混合溶液用移液器轉移至250ml茄形瓶中，在恒溫水浴條件下旋轉蒸發除盡有機溶劑，得到附著于茄形瓶內的淡黃色薄膜。

步驟三、取下茄形瓶，用移液槍吸取4ml蒸餾水，在恒溫水浴條件下使薄膜全部溶解于水中，得到淡黃色透明的載藥膠束液體。

步驟四、將所得的膠束液體過濾，除去游離藥物，得到純凈的載藥膠束液體。

步驟五、在膠束溶液中投入過量的14.2mg的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和4mg的NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)，室溫孵化0.5小時，用于活化膠束外層聚合物上的羧基鍵(COOH-)。

步驟六、在活化好的膠束溶液中投入2mg的Angiopep-2,室溫孵化6小時，使膠束的羧基鍵與短肽的氨基鍵連接，形成具有靶向功能的膠束。

步驟七、超濾除去活化劑EDC,NHS，得到純凈的靶向載藥膠束水溶液。

B.膠束理化性能測定

B-1.靶向載藥膠束的粒徑電位測定

加雙蒸水將靶向載藥膠束ANG-LPTN-MIC稀釋至適當濃度，采用粒度/Zeta電位測定儀測定粒徑和Zeta電位值。

如圖5所示，載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束2#的粒徑為19.8nm，Zeta電位值為5.7mv。

從上述數據可以看出，按本實施例二的方法制造的兩親性嵌段納米膠束2#的粒徑也小于空白膠束的粒徑。

B-2.靶向載藥膠束透體外血腦屏障的能力研究

利用Transwell細胞培養板構建體外血腦屏障模型，按照該方法制備載熒光香豆素6的兩種膠束，一種不接靶向分子，一種接載靶向分子。

利用香豆素6能進入細胞漿但不能進入細胞核，而染料DAPI主要染色細胞核的特性，觀察兩種膠束在相同時間內穿越血腦屏障模型的量。

如圖7所示，建立體外血腦屏障模型后，兩種膠束在相同時間內穿透BBB模型并進入Skbr-3細胞的定性比較。

a為載cou-6的空膠束在細胞質內的分布，b為DAPI在細胞質內的分布，c為a,b圖片疊加，可以直觀地觀察到下圖，即接有靶向分子的膠束在相同時間內對BBB的穿透能力明顯強于未接靶向分子的膠束。

由此可見，接有靶向分子的膠束具有明顯的穿透血腦屏障的能力，能夠滿足水溶性強可注射的要求，提高生物利用度減少單次給藥劑量，降低患者經濟負擔，提高患者依從性。更重要的是，具有腦靶向功能，可用于臨床乳腺癌腦轉移的治療，提高腦轉移患者的生存率和生活質量。

上述實施例一和二中，選用的PEG-PLA為PEG2000-PLA200，而研究者還通過采用不同的聚合物來合成納米膠束，并經測定發現，此類納米膠束均擁有良好的穩定性及生物相容性，既可以解決拉帕替尼難溶性的實際問題，又提供了一種能夠主動靶向腦轉移病灶的遞藥系統。

具體示例如下：

實施例三、載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束3#

在本實施例三中，將4mg拉帕替尼和40mg聚合物mPEG2000-PLA200共同溶解于6ml的甲醇中；將混合溶液用移液器轉移至250ml茄形瓶中，在40℃的恒溫水浴條件下旋轉蒸發除盡有機溶劑，得到附著于茄形瓶內的淡黃色薄膜；取下茄形瓶，用移液槍吸取4ml的蒸餾水，在40℃的恒溫水浴條件下使薄膜全部溶解于水中，得到淡黃色透明的載藥膠束液體；將所得的膠束液體過濾，除去游離藥物，得到純凈的載藥膠束液體。

實施例四、載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束4#

在本實施例四中，將4mg拉帕替尼和20mg聚合物mPEG(5000)-b-PDLG(5000)共同溶解于6ml的甲醇中；將混合溶液用移液器轉移至250ml茄形瓶中，在40℃的恒溫水浴條件下旋轉蒸發除盡有機溶劑，得到附著于茄形瓶內的薄膜；取下茄形瓶，用移液槍吸取6ml的蒸餾水，在40℃的恒溫水浴條件下使薄膜全部溶解于水中，得到透明的載藥膠束液體；將所得的膠束液體過濾，除去游離藥物，得到純凈的載藥膠束液體。

實施例五、載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束5#

在本實施例五中，將4mg拉帕替尼和80mg聚合物mPEG(2000)-b-PLGA(2000)共同溶解于8ml的甲醇中；將混合溶液用移液器轉移至250ml茄形瓶中，在40℃的恒溫水浴條件下旋轉蒸發除盡有機溶劑，得到附著于茄形瓶內的薄膜；取下茄形瓶，用移液槍吸取8ml的蒸餾水，在40℃的恒溫水浴條件下使薄膜全部溶解于水中，得到透明的載藥膠束液體；將所得的膠束液體過濾，除去游離藥物，得到純凈的載藥膠束液體。

上述載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束3#-5#的粒徑均小于20nm。

載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束的載藥量DLC為6.5-7.5％之間，包封率EE為80-85％。

實施例六、載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束6#和其腦靶向納米膠束

在本實施例六中，將4mg拉帕替尼和40mg聚合物mPEG2000-PLA200、4mg聚合物COOH-mPEG2000-PLA200共同溶解于6ml的甲醇中，將混合溶液用移液器轉移至250ml茄形瓶中，在恒溫水浴條件下旋轉蒸發除盡有機溶劑，得到附著于茄形瓶內的淡黃色薄膜。取下茄形瓶，用移液槍吸取4ml蒸餾水，在恒溫水浴條件下使薄膜全部溶解于水中，得到淡黃色透明的載藥膠束液體。將所得的膠束液體過濾，除去游離藥物，得到純凈的載藥膠束液體6#。在膠束溶液中投入過量的14.2mg的EDC和4mg的NHS，室溫孵化0.5小時。在活化好的膠束溶液中投入2mg的Angiopep-2,室溫孵化6小時，超濾除去活化劑EDC,NHS，得到純凈的靶向載藥膠束水溶液6#。

實施例七、載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束7#和其腦靶向納米膠束

在本實施例七中，將4mg拉帕替尼和18mg聚合物mPEG(2000)-b-PDLG(2000)、3mg聚合物COOH-PEG(2000)-b-PDLG(2000)共同溶解于8ml的甲醇中，將混合溶液用移液器轉移至250ml茄形瓶中，在恒溫水浴條件下旋轉蒸發除盡有機溶劑，得到附著于茄形瓶內的薄膜。取下茄形瓶，用移液槍吸取6ml蒸餾水，在恒溫水浴條件下使薄膜全部溶解于水中，得到透明的載藥膠束液體。將所得的膠束液體過濾，除去游離藥物，得到純凈的載藥膠束液體7#。在膠束溶液中投入過量的4mg的EDC和4mg的NHS，室溫孵化1小時。在活化好的膠束溶液中投入4mg的Angiopep-2,室溫孵化8小時，超濾除去活化劑EDC,NHS，得到純凈的靶向載藥膠束水溶液7#。

實施例八、載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束8#和其腦靶向納米膠束

在本實施例七中，將4mg拉帕替尼和60mg聚合物mPEG(2000)-b-PLGA(2000)、8mg聚合物COOH-PEG(2000)-b-PLGA(2000)共同溶解于6ml的甲醇中，將混合溶液用移液器轉移至250ml茄形瓶中，在恒溫水浴條件下旋轉蒸發除盡有機溶劑，得到附著于茄形瓶內的薄膜。取下茄形瓶，用移液槍吸取8ml蒸餾水，在恒溫水浴條件下使薄膜全部溶解于水中，得到透明的載藥膠束液體。將所得的膠束液體過濾，除去游離藥物，得到純凈的載藥膠束液體8#。在膠束溶液中投入過量的25mg的EDC和8mg的NHS，室溫孵化2小時。在活化好的膠束溶液中投入1mg的Angiopep-2,室溫孵化12小時，超濾除去活化劑EDC,NHS，得到純凈的靶向載藥膠束水溶液8#。

上述載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束6#-8#的粒徑均小于20nm。

載拉帕替尼的兩親性嵌段納米膠束的載藥量DLC為7.0-7.5％之間，包封率EE為81-85％。

通過上述實驗可以發現，本實施例涉及的水溶性載藥膠束均擁有良好的穩定性及生物相容性，既可以解決拉帕替尼難溶性的實際問題，又提供了一種能夠主動靶向腦轉移病灶的遞藥系統，貢獻了一種全新的給藥劑型，解決Her-2陽性的乳腺癌腦轉移患者無藥可用的困境。