一種工頻電磁場發生裝置與鉑類藥物的組合方法與流程

本發明屬于生物技術與醫療技術領域，涉及物理學、生物學與醫學交叉領域，尤其涉及一種工頻電磁場發生裝置與鉑類藥物的組合方法。

背景技術：

低頻電磁場頻率在300千赫(kHz)之內，不具有熱效應但具有生物學效應，其機制尚不明，可能與作用于帶電荷的大分子并改變其功能狀態有關。磁場對腫瘤的抑制作用已有廣泛報道(參見Artacho-Cordón Francisco等，2013，Int J Mol Sci；Tofani S，2015，Curr Topics in Med Chem)。歐盟與美國FDA已批準腫瘤治療性磁場發生設備(以色列Novocure公司)用于多形性神經膠質母細胞瘤的臨床治療，該技術特征是采用100-300kHz的磁場(參見美國專利US8019414，US8019414，US8406870)。中國專利中也提出了多種具有腫瘤抑制效應的磁場加載方法，其中包括大于0.4特斯拉(T)的強磁場(參見中國專利90100152.X)和脈沖磁場(參見中國專利94111668.9)。在該領域的研究和應用中，電磁場自身屬性與作用對象、方式不同，包括時間、強度、脈沖頻率、載波頻率、間隔時間等參數不同，會產生不同的生物效應。而且磁場的生物物理作用機制復雜，并非單一分子通路起作用，故對磁場的生物學效應，包括抑制腫瘤細胞的效應，并沒有統一的和完整的認識。具體效果需針對某種特定的磁場加載方式和特定的作用對象來進行甄別驗證。

有一種特殊的加載方式，將直流電產生的靜態磁場與超低頻交流電產生的交變磁場疊加。在理論上，這種疊加磁場對自由基孤對電子單線態-三線態躍遷的影響最大，可能增加躍遷幾率，延長自由基的半衰期，擴大其生物效應(參見Tofani S,1999，Physica Medica；Barnes FS等，2015，Bioelectromagnetics)。

目前腫瘤治療通常采用有創的手術治療以及無創的放化療。放療可為全身性或局部性。化療分為靶向與非靶向。對于放化療抵抗并且目前沒有有效靶向藥物的病例，臨床上亟待發現新的治療方法，尤其是無創、低毒副作用的方法。在低頻電磁場作用于動物和人類的過程中，尚未發現明顯的全身性毒副作用(參見Tofani S等,2002,IEEE Transactions on Plasma Science；Ronchetto F等，2004，Bioelectromagnetics)。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種工頻電磁場發生裝置與鉑類藥物的組合方法，組合使用產生的效應大于鉑類藥物與磁場單獨使用時。

本發明提供的工頻電磁場發生裝置與鉑類藥物的組合方法，通過以下步驟實現：

構建工頻電磁場發生裝置，采用工頻50/60Hz電源，通過直流與交流自耦變壓器不斷改變電壓，從而在輻照部件內部產生疊加的靜態(來自DC)與交變(來自AC)電磁場，加載磁場平均強度為5.5毫特斯拉(mT)，對于輻照部件上受照物每天總輻照時間為60-120分鐘；將鉑類藥物施于輻照部件上的受照物，鉑類藥物選用順鉑、卡鉑、奧沙利鉑等其它鉑類藥物，使用方式和劑量為：體外作用濃度為500nM，每天加藥一次，體內作用劑量為20mg/kg，每周給藥3次，此為在順鉑有效劑量范圍內選取的較低劑量。

所述工頻電磁場發生裝置，由工頻電源1、第一自耦變壓器2(交流AC)、第二自耦變壓器3(直流DC)、第一二極管電橋4、第二二極管電橋5，第一組線圈6、第二組線圈7、輻照部件8、電壓檢測部件9、磁場檢測部件10、測溫部件11和終端電腦12組成，工頻電源1分別與第一自耦變壓器2和第二自耦變壓器3的一端連接，第一自耦變壓器2和第二自耦變壓器3的另一端分別與第一二極管電橋4和第二二極管電橋5連接，第一二極管電橋4的另一端與第一組線圈6連接，第二二極管電橋5的另一端與第二組線圈7連接，輻照部件8置于第一組線圈6和第二組線圈7之間，電壓檢測部件9一端分別與第一組線圈6和第二組線圈7連接，另一端與終端電腦12連接，磁場檢測部件10和測溫部件11各自一端分別與輻照部件8相連，各自的另一端分別與終端電腦12相連。

輻照部件有兩種，第一種為細胞輻照平臺，針對細胞培養板和培養皿設計，由隔板一、隔板二、以及位于兩個隔板之間的載物臺組成，細胞培養板放置于載物臺之上，隔板一和隔板二間距為12.9厘米，載物臺高度可調，保證細胞培養板底部位于輻照區域正中位置。第二種輻照部件為動物輻照平臺，主要針對小鼠設計，由隔板一、隔板二、以及位于兩個隔板之間的6個動物輻照小室組成，組成動物輻照小室的部件包括前擋板、后擋板、中間隔板、以及小室隔板一、小室隔板二、小室隔板三、小室隔板四，其中前擋板和后擋板鉆多個小孔作為透氣孔，以免動物發生缺氧，隔板一和隔板二間距為12.9厘米，6個輻照小室位于輻照區域正中位置，每輪輻照可處理6只小鼠。輻照部件的材料選用透明樹脂板，可以清洗與紫外消毒。

所述的通過直流與交流自耦變壓器不斷改變電壓，在輻照部件內部產生直流與交流疊加的電磁場，具體通過以下步驟實現：分為T1-T8共8個時間段，T1時間段直流電壓為3毫伏(mV)，產生靜態電磁場強度為2.97毫特斯拉(mT)，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；T2時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為2.5mV，產生交變電磁場平均強度為2.47mT；T3時間段直流電壓為3mV，產生靜態電磁場強度為2.97mT，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；T4時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為2.5mV，產生交變電磁場平均強度為2.47mT；T5時間段直流電壓為3mV，產生靜態電磁場強度為2.97mT，交流電壓平均值為1mV，產生交變電磁場平均強度為1.08mT；T6時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；T7時間段直流電壓為3mV，產生靜態電磁場強度為2.97mT，交流電壓平均值為1mV，產生交變電磁場平均強度為1.08mT；T8時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；輻照區域內部不同位置總磁場強度相同，T1至T8時間段平均磁場強度為5.5mT；T1-T8時間段每次改變電壓持續輻照3.5-10分鐘，每輪輻照時間累計30-90分鐘，每天輻照2-4輪，對于細胞和動物每天總輻照時間為60-120分鐘。

本發明方法通過體內外實驗，發現腫瘤治療性電磁場與鉑類化療藥物如順鉑聯用，可增強抗腫瘤效果，而非簡單疊加。

因此，本發明具有如下有益效果：(1)裝置采用獨特的工頻，并將靜態(直流)與交變(交流)電磁場同時加載，裝置產生的磁場強度均勻，高度可控，實施方便；(2)生物體所受干擾小，無創傷；(3)可增強鉑類化療藥物的療效，對多種腫瘤具有顯著的抑制作用；(4)可降低順鉑的劑量，降低毒副作用。

附圖說明

圖1是本發明磁場發生裝置結構示意圖。

圖2是本發明裝置輻照部件之一，置于磁場中的細胞輻照平臺示意圖。

圖3是本發明裝置輻照部件之二，置于磁場中的動物輻照平臺示意圖。

圖4是本發明電磁場加載方式的主要參數，即直流與交流電壓變化方案與產生的對應電磁場強度，其中交流電壓為平均值。

圖5是本發明針對體外培養的腎母細胞瘤細胞系G401的效果圖。

圖6是本發明針對體外培養的神經母細胞瘤細胞系CHLA255的效果圖。

圖7是本發明針對體內生長腎母細胞瘤G401的效果圖。

圖8是本發明針對腎母細胞瘤G401模型小鼠肝腎功能影響的效果圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的說明。

實施例1，本發明磁場發生裝置與鉑類藥物組合方法

本方法通過以下步驟實現：構建工頻電磁場發生裝置，采用工頻50/60Hz電源，通過直流與交流自耦變壓器不斷改變電壓，從而在輻照部件內部產生疊加的靜態(來自DC)與交變(來自AC)電磁場，加載磁場平均強度為5.5毫特斯拉(mT)，對于輻照部件上受照物每天總輻照時間為60-120分鐘；將鉑類藥物施于輻照部件上的受照物，鉑類藥物選用順鉑、卡鉑、奧沙利鉑等其它鉑類藥物，使用方式和劑量為：體外作用濃度為500nM，每天加藥一次，體內作用劑量為20mg/kg，每周給藥3次，此為在順鉑有效劑量范圍內選取的較低劑量。

參見圖1，工頻電磁場發生裝置，由一個工頻電源1、第一自耦變壓器2(交流AC)、第二自耦變壓器3(直流DC)、第一二極管電橋4、第二二極管電橋5，第一組線圈6、第二組線圈7、輻照部件8、電壓檢測部件9、磁場檢測部件10、測溫部件11和終端電腦12組成，工頻電源1分別與第一自耦變壓器2和第二自耦變壓器3的一端連接，第一自耦變壓器2和第二自耦變壓器3的另一端分別與第一二極管電橋4和第二二極管電橋5連接，第一二極管電橋4的另一端與第一組線圈6連接，第二二極管電橋5的另一端與第二組線圈7連接，輻照部件8置于第一組線圈6和第二組線圈7之間，電壓檢測部件9一端分別與第一組線圈6和第二組線圈7相連，另一端與終端電腦12相連，磁場檢測部件10和測溫部件11各自一端分別與輻照部件8相連，各自的另一端分別與終端電腦12相連。

參見圖2、圖3，輻照部件8有兩種，第一種為細胞輻照平臺，針對細胞培養板和培養皿設計，由隔板一13、隔板二14、以及位于兩個隔板之間的載物臺15組成，細胞培養板放置于載物臺之上，隔板一13和隔板二14間距為12.9厘米，載物臺高度可調，保證細胞培養板底部位于輻照區域正中位置。

具體磁場加載方式采取如圖2所示方案，采用工頻50/60Hz電源，通過直流與交流自耦變壓器不斷改變電壓，在輻照部件內部產生直流與交流疊加的電磁場，具體通過以下步驟實現：分為T1-T8共8個時間段，T1時間段直流電壓為3毫伏(mV)，產生靜態電磁場強度為2.97毫特斯拉(mT)，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；T2時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為2.5mV，產生交變電磁場平均強度為2.47mT；T3時間段直流電壓為3mV，產生靜態電磁場強度為2.97mT，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；T4時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為2.5mV，產生交變電磁場平均強度為2.47mT；T5時間段直流電壓為3mV，產生靜態電磁場強度為2.97mT，交流電壓平均值為1mV，產生交變電磁場平均強度為1.08mT；T6時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；T7時間段直流電壓為3mV，產生靜態電磁場強度為2.97mT，交流電壓平均值為1mV，產生交變電磁場平均強度為1.08mT；T8時間段直流電壓為4mV，產生靜態電磁場強度為3.95mT，交流電壓平均值為1.5mV，產生交變電磁場平均強度為1.48mT；輻照區域內部不同位置總磁場強度相同，T1至T8時間段平均磁場強度為5.5mT；T1-T8時間段每次改變電壓持續輻照3.5-10分鐘，將鉑類藥物施于輻照部件8上的受照物，鉑類藥物選用順鉑、卡鉑、奧沙利鉑等，每輪輻照時間累計30-90分鐘，每天輻照2-4輪，對于細胞和動物每天總輻照時間為60-120分鐘。所述受照物選用細胞或動物。

本實例作為聯用藥物選用順鉑，其化學式如下：

其它鉑類藥物，包括卡鉑，奧沙利鉑等與腫瘤治療性磁場聯用，亦屬于本專利保護范圍之內。

實施例2，本發明作用于培養的腎母細胞瘤細胞G401，對照組、輻照組、順鉑組、聯用組分別處理，每個處理條件3個復孔，每天收集前一天處理的細胞，用活細胞計數儀計數，根據讀數計算細胞數目，做出細胞增殖曲線和電磁場對細胞的抑制曲線。

具體實施過程如下：

細胞系和培養方法：腎母細胞瘤細胞G401，此細胞為貼壁細胞，用含10％胎牛血清的McCoy培養基培養于37℃孵箱，含5％二氧化碳和飽和水蒸氣。

主要設備：工頻電磁場發生裝置，細胞培養箱，活細胞計數儀。

細胞活力實驗：將腎母細胞瘤細胞G401以1×10^5個/孔的密度接種于6孔板，輻照組使用圖1所示裝置，按照圖4所述方案處理細胞，每次改變電壓作用3.5分鐘，每輪作用時間共約30分鐘，每天處理4輪，共2小時電磁場輻照時間；順鉑組加入順鉑(江蘇豪森藥業股份有限公司)，給藥濃度為500nM，每天給藥1次；聯用組為輻照與順鉑聯合使用，輻照加載方式與順鉑給藥方式與單用組相同；對照組將細胞置于沒有加載電磁場的線圈之間的置物臺，每天2小時，并且加入與順鉑組同等體積的生理鹽水；每天收集前一天處理的細胞，用活細胞計數儀計數，根據讀數計算細胞數目，做出細胞增殖曲線和電磁場對細胞的抑制曲線。

統計分析：每種輻照條件重復3次，每次3個復孔，結果以平均值±標準誤表示，結果做T檢驗，以P<0.05作為具有顯著性差異指標。

如圖5所示，左側圖為G401細胞增殖曲線，其中X軸為細胞處理天數，Y軸為細胞數，曲線一為對照組細胞增殖曲線，曲線二為輻照組細胞增殖曲線，曲線三為順鉑組細胞增殖曲線，曲線四為聯用組細胞增殖曲線；右側圖為細胞抑制曲線，其中X軸為細胞處理天數，Y軸為細胞抑制率(％)，曲線一為輻照組細胞抑制率曲線，曲線二為順鉑組細胞抑制率曲線，曲線三為聯用組細胞抑制率曲線；圖中結果顯示輻照組、順鉑組、聯用組細胞增殖均減慢，細胞抑制率增加，其中聯用組細胞增殖率最慢，抑制率最高。

實施例3，本發明作用于培養的神經母細胞瘤細胞CHLA255，對照組、輻照組、順鉑組、聯用組分別處理，每個處理條件3個復孔，每天收集前一天處理的細胞，用活細胞計數儀計數，根據讀數計算細胞數目，做出細胞增殖曲線和電磁場對細胞的抑制曲線。

具體實施過程如下：

細胞系和培養方法：神經母細胞瘤細胞CHLA255，此細胞為貼壁細胞，用含10％胎牛血清的McCoy培養基培養于37℃孵箱，含5％二氧化碳和飽和水蒸氣。

主要設備：工頻電磁場發生裝置，細胞培養箱，活細胞計數儀。

細胞活力實驗：將神經母細胞瘤細胞CHLA255以1×10∧5個/孔的密度接種于6孔板，輻照組使用圖1所示裝置，按照圖4所述方案處理細胞，每次改變電壓作用3.5分鐘，每輪作用時間共約30分鐘，每天處理4輪，共2小時電磁場輻照時間；順鉑組加入順鉑(江蘇豪森藥業股份有限公司)，給藥濃度為500nM，每天給藥1次；聯用組為輻照與順鉑聯合使用，輻照加載方式與順鉑給藥方式與單用組相同；對照組將細胞置于沒有加載電磁場的線圈之間的置物臺，每天2小時，并且加入與順鉑組同等體積的生理鹽水；每天收集前一天處理的細胞，用活細胞計數儀計數，根據讀數計算細胞數目，做出細胞增殖曲線和電磁場對細胞的抑制曲線。

統計分析：每種輻照條件重復3次，每次3個復孔，結果以平均值±標準誤表示，結果做T檢驗，以P<0.05作為具有顯著性差異指標。

如圖6所示，左側圖為CHLA255細胞增殖曲線，其中X軸為細胞處理天數，Y軸為細胞數，曲線一為對照組細胞增殖曲線，曲線二為輻照組細胞增殖曲線，曲線三為順鉑組細胞增殖曲線，曲線四為聯用組細胞增殖曲線；右側圖為細胞抑制曲線，其中X軸為細胞處理天數，Y軸為細胞抑制率(％)，曲線一為輻照組細胞抑制率曲線，曲線二為順鉑組細胞抑制率曲線，曲線三為聯用組細胞抑制率曲線；圖中結果顯示輻照組、順鉑組、聯用組細胞增殖均減慢，細胞抑制率增加，其中聯用組細胞增殖率最慢，抑制率最高。

實施例4，在裸鼠體內建立G401腎母細胞瘤模型，將動物隨機分為4組，每組8只，對照組、輻照組、順鉑組、聯用組分別處理，周期為15天，處理結束后3天處死動物，稱量瘤重，并取動物血分析相關生化指標，判斷藥物與輻照的肝腎毒性；

腫瘤模型建立方法：雄性裸鼠3-4周齡，腋下接種腎母細胞瘤細胞G401，數量為5×10∧6/只，體積為200微升，接種一周后可觸及腫瘤，將動物隨機分組，對照組、輻照組、順鉑組、聯用組分別處理。

主要設備：低頻電磁場發生裝置，動物輻照平臺，全自動生化免疫分析儀(美國Beckman Coulter Au5800)。

體內生長腫瘤抑制實驗：將裸鼠隨機分為4組，對照組，輻照組，順鉑組，聯合組，每組8只，輻照組按照圖4所示方案，每次改變電壓作用10分鐘，每輪作用時間共約90分鐘，每天處理1輪，共處理14天；順鉑組給予順鉑(江蘇豪森藥業股份有限公司)20mg/kg，腹腔注射，每周3次，共給藥6次；聯合組給予順鉑與輻照同時處理；對照組將動物置于沒有加載電磁場的線圈之間的動物輻照部件，每天90分鐘，并且腹腔注射與順鉑組同等體積的生理鹽水；所有動物處理3天之后脫頸處死，挖眼球取全血，EDTA抗凝，離心后取血漿做生化指標測定，取出腋下生長腫瘤，稱量瘤重，組織冷凍保存。

統計分析：每組8只動物，結果以平均值±標準差表示，結果做T檢驗，以P<0.05作為具有顯著性差異指標。

如圖7所示，*表示P<0.05，與對照組相比具有顯著性差異，瘤重顯著性差異出現在聯合組與對照組之間，而輻照組、順鉑組瘤重與對照組未出現顯著性差異，說明輻照與順鉑聯用對體內生長腫瘤的抑制效果優于輻照或順鉑單用。

如圖8所示，*表示P<0.05，與對照組相比具有顯著性差異，在反映肝功能的血漿白蛋白、球蛋白、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶，以及反映腎功能的血肌酐、尿素氮這些指標中，僅僅在血漿球蛋白一項，順鉑組與聯用組比對照組明顯降低，此改變主要與順鉑的肝毒性有關，而在本實驗所使用的電磁場輻照條件下，未發現動物產生肝腎損傷，可初步證明輻照的全身毒性較低。