紅細胞膜包封聚酯類載三氧化二砷納米粒及其制備方法與流程

本發明涉及制藥技術領域，具體涉及一種紅細胞膜包封聚酯類載三氧化二砷納米粒及其制備方法。

背景技術：

三氧化二砷(arsenictrioxide,ato)是一種已被fda批準的治療急性早幼粒細胞白血病(apl)的礦物藥，它可通過誘導細胞分化和凋亡、降解pml-rarα、清除lic、抑制腫瘤細胞增殖和抑制血管生成等多條途徑發揮抗腫瘤作用。其用于治療apl已有20余年，臨床研究表明完全緩解率可達90％，與常用藥之間無交叉耐藥性，因此，as2o3已成為復發難治apl的首選藥物。已上市的針對apl的as2o3劑型有“亞砷酸氯化鈉注射液”、“三氧化二砷注射劑”、“注射用三氧化二砷凍干粉針劑”。但現存的劑型具有以下不足：三氧化二砷直接靜脈注射毒性較大，主要表現為消化道不適、肝腎功能損害、心臟毒性、漿膜腔積液、末梢神經炎、皮膚色素沉著和皮疹等。毒副作用的產生主要是因為靜脈注射治療時血漿砷含量會快速升高，作用到各個器官上產生不良反應。近年來，出現了一些針對三氧化二砷的納米劑型研究，如letiziadasacco(letiziadasacco,andreamasotti.mar.drugs.8,2010)使用甲殼素和殼聚糖作為納米載體包封三氧化二砷，zi-yuwang(zi-yuwang,jiansong,dong-shengzhang.worldjgastroenterol.15,24,2009.)使用fe2o3磁性納米粒載三氧化二砷實現靶向給藥，xuechengxiao(xuechengxiao,yangyangliu,manmanguo,nanotechnologyinbiomaterials,31,1,2016)使用納米介孔硅封裝三氧化二砷，以ph觸發藥物緩釋，haimeichen(haimeichen,robertc,macdonald.j.am.chem.soc,128,2006.)將三氧化二砷包載于脂質體中的研究。

上述研究都在一定程度上降低了三氧化二砷的瞬時血藥濃度，從而毒性得到一定的降低，但同時也存在著制備過程復雜，使用的載體材料生物相容性不佳等不足。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種紅細胞膜包封聚酯類載三氧化二砷納米粒及其制備方法。將生物相容性良好的紅細胞膜和聚酯類可降解載體材料相結合，提供具有緩釋作用的紅細胞膜-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(rbcm-plga-np)、聚乳酸-羥基乙酸-聚乙二醇共聚物(rbcm-plga-peg-np)、聚己內酯-聚乙二醇共聚物(rbcm-pcl-peg-np)、聚乳酸-聚乙二醇共聚物(rbcm-pla-peg-np)納米遞藥系統，對這些納米粒進行粒徑、pdi和包封率、載藥量表征。并對紅細胞膜-聚乳酸羥基乙酸共聚物(rbcm-plga-np)進行tem、confocal、體外釋放、體外紅細胞毒性研究。通過紅細胞膜的包裹作用，可提高小分子水溶性藥物在高聚物納米粒中的包封率，且制得的紅細胞膜-聚乳酸羥基乙酸共聚物(rbcm-plga-np)在體外釋放實驗中與游離藥物相比釋放時間顯著延長，無靜脈注射毒性。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

本發明提供了一種紅細胞膜包封聚酯類載三氧化二砷納米粒，所述納米粒以紅細胞膜為外殼，聚酯類材料為核心；所述聚酯類材料負載有三氧化二砷。

優選地，所述納米粒的粒徑為160-250nm。

優選地，所述聚酯類材料包括聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)、聚乳酸-羥基乙酸-聚乙二醇共聚物(plga-peg)、聚己內酯-聚乙二醇共聚物(pcl-peg)、聚乳酸-聚乙二醇共聚物(pla-peg)中的至少一種。

本發明還提供了一種紅細胞膜包封聚酯類載三氧化二砷納米粒的制備方法，包括以下步驟：

將聚酯類材料溶解在有機溶劑中，形成有機相；將三氧化二砷溶于水形成內水相；

s2、將內水相加入到有機相中，超聲或高速勻漿機攪拌至形成均相；

s3、將上述均相在磁力攪拌的條件下緩慢加入到含乳化劑的外水相中，磁力攪拌或高速勻漿機攪拌乳化后，除去有機溶劑，形成納米乳；

s4、低滲透析法制備紅細胞膜；

s5、在納米乳中加入制備好的紅細胞膜，超聲，得納米液；

s6、將納米液進行透析，即得所述紅細胞膜包封聚酯類載三氧化二砷納米粒。

優選地，所述有機溶劑包括二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯中的至少一種；所述的乳化劑包括泊洛沙姆188、聚乙烯醇、聚乙二醇中的至少一種。

優選地，所述的聚酯類材料、三氧化二砷、乳化劑的質量比為20-75:1-10:15-50。

優選地，所述紅細胞膜的制備方法包括以下步驟：心臟穿刺取大鼠全血，分離血清和白細胞，低滲edta溶液破壁多次，離心、清洗后即得所述紅細胞膜。

優選地，所述紅細胞膜與聚酯類材料的用量為：1ml所述大鼠全血提取的紅細胞膜對應1-8mg聚酯類材料。

優選地，所述內水相與有機相的體積比為：1:10-1:15，有機相與外水相的體積比為1:5-1:10。

優選地，所述的超聲條件為功率70-100w，時間1-10min；高速勻漿機攪拌條件為20000-80000r/min，2-15min；磁力攪拌條件為100-500r/min，2-5h。

本發明還提供了一種紅細胞膜包封聚酯類載三氧化二砷納米粒在制備毒性抗腫瘤藥物制劑中的應用。

與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：

1)本發明制備得到的紅細胞膜包封聚酯類載三氧化二砷納米粒分布均勻，粒徑在200nm左右，球形圓整，且該納米粒具有明顯體外緩釋作用，沒有溶血作用，可用于靜脈注射。

2)本發明的遞藥系統與游離藥物相比具有顯著的緩釋作用，可以解決毒性藥物如三氧化二砷靜脈注射后，血藥濃度快速升高的問題，因3～400nm大小物質一般不會從腎臟或排異系統排出，有利于其在血液系統的循環，達到被動靶向的效果，有利于減小毒性藥物的血藥濃度，從而減輕毒性。為毒性抗腫瘤藥物制劑的開發提供了新的策略。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、目的和優點將會變得更明顯：

圖1為本發明實施例制備的納米粒粒徑圖；其中：圖1a為實施例3制備的納米粒；圖1b為實施例4制備的納米粒；圖1c為實施例5制備的納米粒；圖1d為實施例6制備的納米粒；

圖2本發明實施例制備的納米粒的穩定性實驗圖；其中：圖2a為粒徑變化圖；圖2b為pdi變化圖；

圖3為rbcm-plga-ato-np納米粒的共聚焦顯微鏡圖；其中：圖3a為細胞核熒光標記圖；圖3b為紅細胞膜熒光標記圖；圖3c為plga熒光標記圖；圖3d為各部分熒光重疊圖；

圖4為不同放大倍數的rbcm-plga-ato-np透射電鏡圖；

圖5為ato、plga-ato-np、rbcm-plga-ato-np體外釋放曲線；

圖6為rbcm-plga-ato-np溶血性試驗圖；其中：圖6a為孵育3小時后的溶血結果；圖6b為靜置48小時后的溶血結果。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變化和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。

實施例1.紅細胞膜制備(制備出的紅細胞膜對應等體積的全血)：

(1)取大鼠，稱體重，按照100g/0.7ml腹腔注射水合氯醛麻醉，心臟穿刺取全血；

(2)將血液分裝至含有0.05ml肝素鈉的ep管中，每管1ml，3800r/min，10min，4℃離心去掉上清和白細胞層，并用pbs溶液定容至1ml，混勻,3800r/min，7min，4℃重復清洗兩次，最后用pbs定容至1ml。

(3)將上述步驟(2)定容得到的混液每管分裝到4個含有0.01ml肝素鈉的ep管中，再加入0.9mledta溶液，混勻。輕輕吹打破壁，加入0.1ml10倍濃度pbs混勻,13200r/min，10min，4℃離心清洗，去掉上清液，重復此過程三遍以上，直至上清液無色；

(4)去上清后加入0.9mledta溶液，混勻，13200r/min，10min，4℃清洗；

(5)去上清后，將兩管細胞合為一管，并用edta溶液定容至0.5ml，裝入自封袋，注明日期、血量、細胞膜體積、名字等，-80℃保存。

實施例2.納米粒材料、油相溶劑篩選

復乳法制備：取1ml10mg/ml聚酯類材料溶液，磁力攪拌的條件下緩慢加入到10ml含乳化劑的外水相中，超聲2min，磁力攪拌3h揮去有機溶劑，形成納米乳。制得的納米乳裝入透過分子量為30000的透析袋中，透析2h去掉游離藥物，得到納米粒懸液。用馬爾文激光粒度儀測定粒徑大小和多分散性指數(pdi)。按以上相同的制備方法，分別按下表1考察各材料的型號和溶劑：

表1

從表1的單因素法篩選結果可知，plga與plga-peg的分子量對pdi影響不大,粒徑隨分子量增大而增大，但均在要求范圍內，因分子量越大黏性越大,因此最好是選擇分子量較大的plga和plga-peg，有利于藥物的物理包封，二氯甲烷作為油相溶劑時，pdi過大，因此選擇丙酮作為油相溶劑。pcl-peg分子量對pdi影響不大,粒徑隨分子量增大而增大，但均在要求范圍內，二氯甲烷作為溶劑時pdi較大，因此選用乙酸乙酯作為溶劑。pla分子量對pdi影響不大，粒徑隨分子量增大而增大，但均在要求范圍內，丙酮作為溶劑時pdi較大，因此選用二氯甲烷作為溶劑。

實施例3.rbcm-plga-ato-np制備

在plga丙酮溶液中加入2ml的三氧化二砷水溶液，超聲至形成均相，磁力攪拌的條件下緩慢加入到含有乳化劑的外水相中，磁力攪拌揮去有機溶劑，形成納米乳。旋轉蒸發至1-2ml，加入制備好的紅細胞膜，超聲，將納米液裝入透析袋(mw3000),透析2h去掉游離藥物，得到紅細胞膜包封的納米粒懸液。

所述plga分子量為3000-95000，乳酸:羥基乙酸聚合比例為50:50；plga用量為10mg；plga丙酮溶液的體積為1ml；

所述三氧化二砷的用量為1mg，內水相體積0.1ml；

所述乳化劑為帕洛沙姆188，用量為3mg，所述含有乳化劑的外水相的體積為10ml；

所述紅細胞膜的加入量為：1ml實施例1大鼠全血提取的紅細胞膜對應0.5mg聚酯類材料。

所述的超聲條件為功率70-100w，時間1-10min；磁力攪拌條件為100-500r/min，2-5h。

用馬爾文激光粒度儀測定粒徑大小和多分散性指數(pdi)。另測定不包封紅細胞膜的plga-as2o3-np納米粒的粒徑和pdi，各測定10批樣品，由圖1a的數據，粒徑儀測得的rbcm-plga-ato-np的平均粒徑為233.59nm，plga-ato-np平均粒徑為216.36nm，相差17.23nm，紅細胞膜厚度7-8nm，直徑之差與紅細胞膜相符。

實施例4.rbcm-plga-peg-ato-np制備

在plga-peg丙酮溶液中加入三氧化二砷溶液，超聲至形成均相，磁力攪拌的條件下緩慢加入到含有乳化劑的外水相中，磁力攪拌揮去有機溶劑，形成納米乳。旋轉蒸發至1-2ml，加入制備好的紅細胞膜，超聲，將納米液裝入透析袋(mw3000),透析2h去掉游離藥物，得到紅細胞膜包封的納米粒懸液。

所述plga-peg分子量為30000-70000，乳酸:羥基乙酸聚合比例為50:50-5000；plga-peg用量為15mg；plga-peg丙酮溶液的體積為1.5ml；

所述三氧化二砷的用量為2mg，內水相體積0.1ml；

所述乳化劑為聚乙烯醇，用量為10mg，所述含有乳化劑的外水相的體積為15ml；

所述紅細胞膜的加入量為：1ml實施例1大鼠全血提取的紅細胞膜對應0.5mg聚酯類材料。

所述的超聲條件為功率70-100w，時間1-10min；磁力攪拌條件為100-500r/min，2-5h。

用馬爾文激光粒度儀測定粒徑大小和多分散性指數(pdi)。另測定不包封紅細胞膜的納米粒plga-peg-ato-np的粒徑和pdi，各測定10批樣品，由圖1b的數據，粒徑儀測得的rbcm-plga-peg-ato-np的平均粒徑為207.53nm，plga-peg-ato-np平均粒徑為192.45nm，相差15.08nm，直徑之差與紅細胞膜相符。

實施例5.rbcm-pcl-peg-ato-np制備

在pcl-peg乙酸乙酯溶液中加入三氧化二砷溶液，高速勻漿機攪拌至形成均相，磁力攪拌的條件下緩慢加入到含有乳化劑的外水相中，高速勻漿機攪拌乳化后，磁力攪拌揮去有機溶劑，形成納米乳。旋轉蒸發至1-2ml，加入制備好的紅細胞膜，超聲，將納米液裝入透析袋(mw3000),透析2h去掉游離藥物，得到紅細胞膜包封的納米粒懸液。

所述pcl-peg分子量為15000-95000，pcl-peg用量為15mg；pcl-peg乙酸乙酯溶液的體積為3ml；

所述三氧化二砷的用量為3mg，內水相體積0.3ml

所述乳化劑為帕洛沙姆188，用量為10mg，所述含有乳化劑的外水相的體積為30ml；

所述紅細胞膜的加入量為：1ml實施例1大鼠全血提取的紅細胞膜對應0.5mg聚酯類材料。

所述的超聲條件為功率70-100w，時間1-10min；高速勻漿機攪拌條件為20000-80000r/min，2-15min；磁力攪拌條件為100-500r/min，2-5h。

用馬爾文激光粒度儀測定粒徑大小和多分散性指數(pdi)。另測定不包封紅細胞膜的納米粒pcl-peg-ato-np的粒徑和pdi，各測定10批樣品，由圖1c的數據，粒徑儀測得的rbcm-pcl-peg-ato-np的平均粒徑為255.51nm，pcl-peg-ato-np平均粒徑為241.74nm，相差13.77nm，直徑之差與紅細胞膜相符。

實施例6.rbcm-pla-peg-ato-np制備

在pla-peg二氯甲烷溶液中加入三氧化二砷溶液，高速勻漿機攪拌至形成均相，磁力攪拌的條件下緩慢加入到含有乳化劑的外水相中，高速勻漿機攪拌乳化后，后磁力攪拌揮去有機溶劑，形成納米乳。旋轉蒸發至1-2ml，加入制備好的紅細胞膜，超聲，將納米液裝入透析袋(mw3000),透析2h去掉游離藥物，得到紅細胞膜包封的納米粒懸液。

所述pla-peg分子量為17000-55000，pla-peg用量為4mg；pla-peg二氯甲烷溶液的體積為2ml；

所述三氧化二砷的用量為0.2mg，內水相體積為0.2ml；

所述乳化劑為聚乙烯醇，用量為10mg，所述含有乳化劑的外水相的體積為15ml；

所述紅細胞膜的加入量為：1ml實施例1大鼠全血提取的紅細胞膜對應0.5mg聚酯類材料。

所述的超聲條件為功率70-100w，時間1-10min；高速勻漿機攪拌條件為20000-80000r/min，2-15min；磁力攪拌條件為100-500r/min，2-5h。

用馬爾文激光粒度儀測定粒徑大小和多分散性指數(pdi)。另測定不包封紅細胞膜的納米粒pla-peg-ato-np的粒徑和pdi，各測定10批樣品，由圖1d的數據，粒徑儀測得的rbcm-pla-peg-ato-np的平均粒徑為237.92nm，pla-peg-ato-np平均粒徑為222.66nm，相差15.25nm，直徑之差與紅細胞膜相符。

實施例7.納米粒穩定性考察

將制備好的納米粒懸液常溫儲存，每隔一天定時用馬爾文激光粒度儀測定粒徑和多分散性指數，測量半個月，考察納米懸液穩定性。由圖2可看出,15天以內納米粒的粒徑和pdi變動均不大,且pdi均小于0.3。

實施例8.納米粒包封率、載藥量測量

使用電感耦合等離子體法測量透析液中砷濃度，按照式子：包封率＝(投入砷量-透析液中砷量)/投入砷量x100％；載藥量＝(投入砷量-透析液中砷量)/(投入砷量-透析液中砷量+plga質量)計算包封率和載藥量，計算得到實施例3制備的rbcm-plga-as2o3-np納米粒的包封率為6.31％，載藥量2.87％；實施例4制備的rbcm-plga-peg-as2o3-np納米粒的包封率為10.56％，載藥量為4.80％；實施例5制備的rbcm-pcl-peg-as2o3-np納米粒的包封率為12.78％，載藥量為5.81％；實施例6制備的rbcm-pla-peg-as2o3-np納米粒的包封率為5.74％，載藥量為2.61％。

電感耦合等離子體儀器參數如下：

icp儀器條件：高頻發生器頻率：27.12mhz；rf功率：1150w；冷卻氣流量：1.0l/min；輔助氣流量：0.5l/min；載氣流量：0.5l/min；垂直觀測高度：15.0mm；沖洗泵速：50rmp/min；分析泵速：50rmp/min；泵穩定時間：5s；沖洗時間30s；積分時間：短波15s；長波5s。標準溶液為美國spex多元素混標液(1000μg/ml)。

實施例9：共聚焦顯微鏡驗證紅細胞膜包封效果

(1)人胚腎細胞293t培養：于-80℃冰箱中取一管細胞，37℃水浴快速融化，1000r/min離心10min，去上清液；加入1ml培液(基礎培養基+12％胎牛血清)，吹打后加入培養皿中，培養24h；棄掉培液，用2mlpbs清洗一遍，用1.5ml胰酶消化1min，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞變圓后即可；加入1.5ml培液終止消化，吹打后轉移至離心管中，1500r/min，3min，離心去上清液；在離心管中加入適量培液，并轉移至培養皿中，輕微搖晃后放入培養箱。

(2)紅細胞膜染色：取適量did儲備液，用甲醇乙醇混合液稀釋10倍作為工作液(濃度為1μm)，取0.5ml紅細胞膜，解凍后加入0.5mldid工作液，37℃，避光，恒溫孵育40min，用0.5mlpbs洗4次，離心4000r/min4℃8min，最后沉淀用0.5mlpbs溶解備用。

(3)plga染色：取1ml10mg/mlplga丙酮溶液，加0.02mldio工作液(濃度為1μm)，混勻備用。

(4)納米制備：用染色后的紅細胞膜和plga依實施例3的方法制備rbcm-plga-as2o3-np。

(5)細胞給藥：取一個培養皿的傳代293t細胞，胰酶消化，培液終止，離心去上清后，加入2ml培液，吹打后接種于24孔板，24孔板中放置細胞爬片，一孔40μl細胞懸液，再加500μl培液，放入孵箱孵育約24h。一孔給0.12mlrbcm-plga-ato-np液，再加0.38ml培液，孵育4h；棄掉培液，pbs洗兩次；0.5ml4％多聚甲醛固定15min后pbs洗三次；0.5mldapi染核5min后pbs洗三次；將爬片倒置在載玻片上，緩沖甘油封片后再共聚焦顯微鏡下觀察。

(6)由圖3可看出，紅細胞膜(b)和納米粒(c)在細胞核(a)周圍基本重合(d)，說明細胞膜成功包裹納米粒。

實施例10：透射電鏡觀察納米粒形態，膜核結構

取實施例3制得的rbcm-plga-ato-np液，稀釋至plga的濃度為0.1mg/ml，將銅網置于一片放于帶蓋培養皿的定量濾紙上，取10μl于銅網上，室溫干燥2min，再滴10μl1％磷鎢酸，室溫干燥2min，再滴一滴超純水，至于照燈下干燥后，在透射電鏡下觀察。圖4顯示，納米粒粒徑分布均勻，形狀圓整，具有明顯的膜殼結構。

實施例11：體外釋放曲線

配置濃度為as2o31mg/ml的游離藥物as2o3溶液(ato)、plga-ato-np懸液、rbcm-plga-ato-np懸液，作為待測物。分別取1ml待測物，裝入透析袋(mw3000)中，封口后放于50ml溶出介質中，樣品置于恒溫震蕩箱(37℃)中，分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、14h在溶出介質中取1ml液體作為待測溶液，同時添加等量的pbs溶液。采用電感耦合等離子法(icp)測量待測液中藥物濃度。藥物釋放率結果如圖5所示，由圖5可知，紅細胞膜包封的納米粒的釋放時間明顯比載藥納米粒和藥物溶液的釋放時間長，說明紅細胞膜的包封起到了緩釋作用，緩釋時間為65h。

實施例12：體外溶血與凝聚試驗

取無菌脫纖維綿羊血2ml，生理鹽水離心洗滌4次，2000r/min，5min，再配制成2％(v/v)的紅細胞懸液，在試管中加入不同濃度等體積的rbcm-plga-as2o3-np納米粒，并以生理鹽水組作為陰性對照，超純水作為陽性對照，37℃孵育3小時，觀察現象。由圖6a可看出，給藥組(藥物濃度：1,0.035mg/ml；2,0.07mg/ml；3,0.14mg/ml)上清液無色澄明，與陰性對照組(陰)無明顯差異，溶液中無棕紅色絮狀沉淀，進一步在倒置相差顯微鏡下觀察，無紅細胞聚集現象。因此說明該藥物rbcm-plga-ato-np納米粒不會引起紅細胞的溶血和凝集，可以用于靜脈注射。且由圖6b可知，靜置48h后，1，2號均出現溶血和凝聚，因此，3號的0.14mg/ml劑量最安全，對紅細胞的毒性可以忽略不計。

以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變化或修改，這并不影響本發明的實質內容。在不沖突的情況下，本申請的實施例和實施例中的特征可以任意相互組合。