本發明屬于生物制藥中抗體治療劑領域，具體涉及鴨坦布蘇病毒卵黃抗體中病毒的滅活工藝。
背景技術：
：雞卵黃抗體(eggyolkim-munoglobulin)是存在于卵黃中的免疫球蛋白，它是由母雞血清中的免疫球蛋白轉移而來。卵黃抗體可以應用于臨床疾病的治療，如雞傳染性法氏囊病、新城疫、鴨瘟、小鵝瘟、豬瘟等等。在臨床實踐中，卵黃抗體的預防和治療效果非常理想，同時卵黃抗體的制造工藝簡單價廉，幾年前在養禽業生產中用量很大，發揮過十分重要的作用。但是，沒有經過病原微生物滅活的抗體類治療劑存在十分明顯的問題。其原因在于制備抗體采用的禽極易攜帶垂直傳播性病原，如大腸桿菌、沙門氏菌、減蛋綜合征病毒、禽流感病毒等；另外，由于一些企業生產條件簡單，生產過程中容易混雜入一些外源性病毒。鑒于這些情況，脫脂卵黃抗體必須進行禽源、外源性病原微生物的滅活處理，防止使用卵黃抗體后造成傳播病原的擴散甚至疾病的爆發。β-丙內酯(bpl)是一種雜環化合物，對病毒具有很強的滅活作用，比福爾馬林作用強25倍，但對病毒抗原影響或破壞作用較小。其作用機制通過與嘌呤堿基(主要是鳥嘌呤)反應改變病毒核酸結構達到滅活病毒的目的，蛋白不發生反應，不影響抗體的效價。β-丙內酯雖是一種致癌物，但極易水解，37℃2小時可以完全水解，水解后形成人體脂肪代謝產物β-羥基丙酸，對人體無害，在國外已廣泛用于各種疫苗的滅活。將bpl用于卵黃抗體外源型病毒滅活，具有安全的和不影響抗體效價等優點。但是滅活劑β-丙內酯成本較高，在國內的實際生產中應用較少，多數使用甲醛滅活。有研究報道，bpl的濃度和反應時間與滅活效果存在一定關系。所以優選出bpl的最佳滅活條件，在合理節約的條件下，獲得良好的滅活效果是關鍵。此外，由于獸用高免卵黃液價格低廉和針對地方變異病原株的特殊性要求，在我國現有條件下，絕大多數生產廠家只能使用非spf蛋。所以除了病毒以外，高免卵黃液中還容易攜帶垂直傳播性的細菌性病原，比如沙門氏菌、大腸桿菌等。此外，在制備的過程中也可能帶來一些細菌的污染。60coγ射線具有較強的穿透力，在生物體中能均勻地產生作用，主要是通過作用于病毒核酸(dna、rna)而造成病毒失活，可以完全殺滅高免卵黃液中的大腸桿菌、沙門氏菌和霉形體，且不影響卵黃抗體的效價和理想性質。60coγ射線對微生物有較強的殺滅作用，不同類型的病毒對60coγ射線的敏感性是有較大差別的。控制輻射的劑量和劑量率，在滅活微生物的同時不影響卵黃抗體的效價和理化性質是關鍵。本發明采用bpl聯合使用60coγ射線滅活鴨坦布蘇病毒中的外源病毒，來獲得更安全、有效、穩定的產品。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種鴨坦布蘇病毒卵黃抗體中病毒的滅活工藝。本發明所采取的技術方案是：鴨坦布蘇病毒卵黃抗體中病毒的滅活工藝，是利用β-丙內酯加入到脫脂卵黃抗體中，混合作用，再以60coγ射線進行照射，滅活卵黃中的病毒。優選的，脫脂卵黃抗體的制備方法為：按照卵黃與酸化水為1：(4-8)的體積比加入酸化水并降溫至2-8℃，攪拌均勻，2-8℃靜置4-6小時，酸化完成后，加入終濃度為0.2％正辛酸，攪拌并在室溫放置3-5小時，分離上清液，取上清液即為脫脂卵黃抗體。優選的，脫脂卵黃抗體的制備方法為：按照卵黃與酸化水為1：6的體積比加入酸化水并降溫至2-8℃，攪拌均勻，2-8℃靜置5小時，酸化完成后，加入終濃度為0.2％正辛酸，攪拌并在室溫放置3-5小時，分離上清液，取上清液即為脫脂卵黃抗體。優選的，.酸化水為純化水利用鹽酸調節ph為4.0-5.0得到的。優選的，酸化水為純化水利用鹽酸調節ph為4.5得到的。優選的，加入終濃度為0.02％-0.06％的β-丙內酯，與脫脂卵黃抗體混合后，在4℃反應24-36小時。優選的，利用37℃反應2小時終止β-丙內酯的滅活后，再以60coγ射線進行照射。優選的，60coγ射線所用的劑量為2.5-6.5kgy，劑量率為12-15gy/min。在輻射損傷的整個發展過程中，吸收劑量相同時，吸收劑量率高，所需照射時間就短，在單位時間內病毒或細菌的核酸分子被破壞的幾率增高，且在較短時間內又不利于病毒或細菌本身修復，因此滅活效果好。本發明的有益效果是：本發明采用β-丙內酯聯合使用60coγ射線滅活鴨坦布蘇病毒中的外源病毒，來獲得更安全、有效、穩定的產品。其中β-丙內酯的使用量最低只需0.02％即可，加上劑量為3.0kgy的60coγ射線，經過充分的滅活反應，所獲得的產品經過盲傳三代，仍然安全可靠。本發明方法安全，因為β-丙內酯極易水解，水解后形成人體脂肪代謝產物β-羥基丙酸，對人體無害；60coγ射線不會殘留，經過60coγ射線照射后的抗體穩定無菌。本發明方法簡單、易于操作：操作相對比較簡便，沒有復雜的程序。本發明的滅活方法不影響效價：β-丙內酯、60coγ射線滅活都不直接作用于病毒蛋白，不影響抗體效價，對抗體的治療效果沒影響。具體實施方式l、材料1.1滅活劑β-丙內酯：(β-propionolactone，bpl)，深圳邁瑞爾化學技術有限公司進口分裝，cas號69-65-7。1.2鈷源華南農業大學生物技術開發公司。1.3正辛酸，廣東中鵬化工有限公司，批號：520168。1.4指示病毒：鴨坦布蘇病毒0.25ml。劑型：凍干毒。廣東農科院。1.5spf雞胚：10日齡雞胚購自廣東永順生物制藥有限公司。2、方法1)脫脂卵黃的制備：采集鴨坦布蘇滅活疫苗免疫后高免蛋，經檢驗消毒后，采取手工或機械方式分離蛋清和卵黃。將雞蛋用清水洗去污物，再放入含0.5％新潔爾滅溶液浸泡20min，然后晾干。用75％酒精棉擦拭蛋殼，無菌操作打開蛋殼，將蛋清和蛋黃分開，把蛋黃放于滅菌燒杯中，按照卵黃與酸化水1：6體積加入酸化水(用1mol/l鹽酸調ph值至4.5)并降溫至2-8℃，攪拌均勻，2-8℃靜置5小時，酸化完成后，加入適量正辛酸溶液，所添加的辛酸終濃度為體積百分比m，其中0<m≤1％；攪拌并在室溫(15-25℃)放置3-5小時，分離上清液，取上清液即為脫脂卵黃抗體。2)β-丙內酯滅活：將β-丙內酯加入上述制備的脫脂卵黃抗體，β-丙內酯添加的終濃度為0.01％-0.06％。震蕩30min，置4℃，作用20-36小時，然后在37℃水浴中水解2h。3)60coγ射線照射將第2)步所得卵黃抗體60coγ射線進行照射滅活病毒和殺滅細菌，60coγ射線所用的劑量為2.5-6.5kgy，劑量率為12-15gy/min。4)滅活結果的檢驗。下面利用實施例進一步闡述本發明，但不限于此。β-丙內酯滅活鴨坦布蘇病毒試驗中：在卵黃抗體中加入指示病毒nd，使病毒終濃度為106eid50/0.1ml。隨后分為三組，每組300ml，加入適量的β-丙內酯，邊加邊搖，使其充分混合。根據所加入β-丙內酯終濃度不同分別得到實施例1-6。然后將胚液倒于另一滅菌容器中。置4℃下進行滅活反應20-36小時，每小時振搖1次。于20小時、24小時、30小時、36小時分別取樣，于37℃水浴中水解2h。實施例1-6的β-丙內酯終濃度分別為0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％。進一步以60coγ射線進行照射，60coγ射線所用的劑量為3.0kgy，劑量率為12-15gy/min。然后進行盲傳，做滅活檢驗。ha<4為陰性，即病毒被滅活。對所獲產品進行效果檢測一、hi效價檢測滅活檢驗：將滅活后的卵黃抗體接種spf雞胚，0.1m1/枚接種尿囊腔，5枚為一組，盲傳三代。分別取脫脂卵黃(未滅活)和滅活36小時+60coγ射線照射后卵黃，檢測鴨坦布蘇病毒抗體hi效價為例，比較抗體損失情況。結果見表1。表1滅活前后鴨坦布蘇病毒抗體hi效價表1結果顯示：脫脂卵黃原hi效價為7，分別加入0.01％-0.06％β-丙內酯后，檢測hi效價均為7。滅活前后h9n2抗體效價沒有損失。二、ha效價/胚體病變檢測β-丙內酯聯用60coγ射線滅活結果見表2。表2β-丙內酯聯用60coγ射線滅活結果注：ha>4為陽性，ha<4為陰性。表2顯示β-丙內酯濃度在0.02％-0.06％，20-36h作用后，盲傳三代，ha<4。即β-丙內酯濃度在0.02％-0.03％，4℃作用20小時并以3.0kgy的60coγ射線進行照射后可將病毒完全滅活。表2中也反應了β-丙內酯對于病毒的滅活效果與劑量和時間相關，如果僅僅利用β-丙內酯進行滅活，劑量太低達不到滅活的效果，劑量過高會大大破壞卵黃液中的蛋白質，使抗體失去應有的效價。三、蛋白質含量檢測以nd為例，測定以不同濃度β-丙內酯，并在3.0kgy的60coγ射線進行照射滅活后卵黃抗體中蛋白質含量。表3蛋白質含量檢測結果(g/l)劑量00.01％0.02％0.03％0.04％0.05％0.06％含量平均7.767.697.787.797.717.687.80表3結果表明，卵黃抗體添加0.01％-0.06％濃度β-丙內酯，并在3.0kgy的60coγ射線進行照射后，卵黃液中蛋白質含量無明顯變化。四、其他相關檢測滅活卵黃抗體液通過嚴格的無菌檢驗、支原體檢驗、安檢和攻毒防治試驗，表明β-丙內酯加上60coγ射線輻照工藝生產的卵黃液完全符合獸醫生物制品的要求。本實驗中污染卵黃液nd病毒含量為為106eid50/0.1ml，都己接近復壯毒的滴度，雖然自然污染物中的病毒粒子數是無法得知的，但根據文獻推測在自然污染條件下，一般不會超過這個濃度，所以這一試驗對一般感染條件下是適用的。對比實驗一其他條件同實施例，對比例添加的β-丙內酯終濃度分別為0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％，然后將胚液倒于另一滅菌容器中。置4℃下進行滅活反應20-36h，每小時振搖1次。20小時、24小時、30小時、36小時分別取樣，于37℃水浴中水解2h。不同之處在于，不進行60coγ射線的照射。進行盲傳，做滅活檢驗。ha<4為陰性，即病毒被滅活。結果見表4。表4β-丙內酯滅活結果表4結果顯示，如果不聯用60coγ射線滅活處理，在低濃度0.01％的β-丙內酯滅活處理下，盲傳三代后，病毒容易恢復毒性，從而β-丙內酯不能起到完全滅活的作用。對比實驗二其他同實施例，不同之處在于，去掉β-丙內酯滅活的步驟，僅利用2.0-4.0kgy的60coγ射線的照射進行滅活處理。結果見表5表560coγ滅活結果表5結果顯示，如果不聯用bpl滅活處理，僅利用2.0-4.0kgy的60coγ滅活處理下，盲傳三代后，病毒未能完全滅活。終上所述，從時間和成本方面綜合，經過0.02％-0.03％β-丙內酯反應20h，聯合3.0kgy的60coγ射線照射可以完全可以將卵黃抗體中的nd病毒降低6個滴度，起到很好的滅活作用。本發明的設計是根據“人用血液制品去除/滅活病毒技術方法及驗證指導原則”而進行的，用生物制品的檢驗標準核心思路在于添加一定的指示病毒，經過滅活處理后，然后進行該幾種病毒的毒力檢測，以病毒毒力單位降低6個單位為標準，大于等于6且盲傳三代不發病則表明該滅活方法有效。本發明經過0.02％-0.03％β-丙內酯聯合3.0kgy的60coγ射線照射可以完全將卵黃抗體中的nd病毒降低6個滴度，達到滅活外源性病毒的目的。所用β-丙內酯劑量低，所花費的時間短且節省成本，而且β-丙內酯、60coγ射線不與抗體反應，加入卵黃中，抗體效價不變，不影響抗體效價，對抗體的治療效果沒影響。當前第1頁12