一種脫細胞肺支架及其制備方法與流程

本發明涉及組織工程人工肺領域，具體地說，是一種脫細胞肺支架及其制備的方法。

背景技術：

目前，由于環境因素、遺傳因素、個人因素等原因，慢性阻塞性肺疾病(copd)、特發性肺纖維化(ipf)、ɑ-1抗胰蛋白酶缺乏，肺動脈高壓等肺疾病越來越多，對于這些病人來說，肺移植是唯一效果肯定的治療方法。但由于供體嚴重缺乏、免疫排斥反應、疾病傳播、遠期生存率低等原因制約了肺移植的開展。目前每年肺移植全球僅不足3700例，遠遠達不到需求。隨著組織工程學和再生醫學的發展，特別是組織工程皮膚、血管、膀胱、氣管等在臨床上已經成功應用，極大地鼓舞了組織工程人工肺的研究，為肺移植帶來了新的方向。

構建組織工程人工肺的大致流程是首先獲取理想的支架，然后通過種植宿主細胞，進行細胞培養，最后移植到宿主體內，形成一個具有氣體交換功能的人工肺。獲取理想的支架對于后面的細胞種植和體內移植至關重要。

目前，獲取支架的來源有：脫細胞支架、天然支架、人工合成支架、3d打印支架等。其中，脫細胞支架已經廣泛應用于臨床，且不需要服用任何免疫抑制劑，最有前景。

制備脫細胞支架目前常用有震蕩法和灌注法。震蕩法過于劇烈，嚴重破壞了組織的三維結構，不適合結構組織疏松的肺臟。而灌注法是通過灌注去垢劑來制備脫細胞肺支架，最為合適，廣泛應用于組織工程學。目前常用的去垢劑很難充分的去除肺內細胞，同時完美的保留肺臟的三維結構。細胞殘留過多移植后會導致嚴重的免疫排斥反應。另一方面，構成脫細胞支架的內部成分是細胞外基質蛋白，細胞外基質蛋白丟失過多，也會使支架喪失了天然結構和功能，影響細胞化和血管化；呼吸膜破嚴重，氣體交換能力難以維持；移植到體內，受體難以長期存活。

綜上所述，可見對于尋求理想的去垢劑是制備脫細胞肺支架的關鍵之處。

技術實現要素：

為了克服上述技術問題，本發明提供了一種脫細胞肺支架。

本發明的另一目的在于提供一種脫細胞肺支架的制備方法。

為了制備出理想的脫細胞肺支架，本發明是通過以下技術方案來實現的：使用langendorff灌注系統灌注新型去垢劑：十二烷基醚硫酸鈉(sodiumlaurylethersulfate，sles)，同時聯合灌注dnaseⅰ溶液。本發明首次利用去垢劑sles制備肺支架，同時對dnaseⅰ的應用方法做了改進。

為了實現上述目的，本發明所述一種脫細胞肺支架，其采用十二烷基醚硫酸鈉(sodiumlaurylethersulfate，sles)聯合dnaseⅰ溶液進行灌注處理而成。

其中，所述十二烷基醚硫酸鈉(sodiumlaurylethersulfate，sles)的體積濃度為0.1-1％(ml/ml)。

所述dnaseⅰ溶液的濃度為20-30ug/ml。

十二烷基醚硫酸鈉(sodiumlaurylethersulfate，sles)溶液與dnaseⅰ溶液的用量體積比約為10-20:1。

優選地，所述脫細胞肺支架采用先經0.1-1％sles的處理2-3小時；然后再在25℃下將20-30ug/mldnaseⅰ溶液以流速為1-2ml/min處理0.5-1h。

所述0.1％sles的用量為0.6-9ml，dnaseⅰ溶液的總用量約為0.6-3.6mg。

具體地說，本發明的脫細胞肺支架采用如下方法制成：

1)先將離體處理后的肺支架進行肝素化的pbs溶液灌洗；

2)然后采用0.1％-1％sles進行灌洗，并再用去離子水進行灌洗；

3)隨后采用20-30ug/ml的dnaseⅰ溶液進行灌洗處理，并用去離子水進行灌洗；

4)最后用含抗生素的pbs溶液灌洗。

進一步，本發明的脫細胞肺支架，依次灌注以下溶液處理而成：

1)肝素化的pbs：pbs即磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersaline)，ph值為7.3-7.4；肝素濃度為10u/ml，即1mlpbs中加入普通肝素的量為10u，室溫，流速為5ml/min，灌注15min。pbs用量100ml以內。

2)0.1％-1％sles：用去離子水稀釋，即每100ml去離子水中加入0.1-1ml的sles，室溫，流速為5ml/min，灌注2-3h，sles總用量約0.6-9ml。去離子水的用量約600-900ml。

3)去離子水：室溫，流速為5ml/min，灌注15min。去離子水的用量100ml以內。

4)核酸酶應用液：dnase1液濃度為20-30ug/ml，用去離子水稀釋，即每1ml去離子水中加入dnase120-30ug，控制灌注溫度25℃，灌注流速為1-2ml/min，灌注0.5-1h，dnase1總用量約0.6-3.6mg。去離子水的用量約30-120ml。

5)去離子水：室溫，流速為5ml/min，灌注15min。去離子水的用量100ml以內。

6)含抗生素的pbs：青霉素g500u/ml，鏈霉素500ug/ml，兩性霉素b25ug/ml，即每1mlpbs中加入青霉素g500u，鏈霉素500ug和兩性霉素b25ug。室溫，流速為5ml/min，灌注2h。pbs用量約600ml，為了更好的沖洗細胞碎片，此步灌注時間可延長至3h，pbs用量可增加至1000ml。

sles是一種陰離子去垢劑，用來破壞細胞膜(裂解細胞)以釋放細胞內的可溶性物質。sles含有乙氧基(c2h5o-)，使得化學特性溫和。此外，sles易溶于水，具有優良的去污能力、生物降解性和低溫性能。肺臟結構疏松，溫和的sles用于肺的脫細胞能最大程度的保留肺臟的三維結構。目前，sles應用于肺的脫細胞國內外還沒有報道。本發明研究人員進過實驗發現，灌注0.1％濃度的sles是使sd大鼠肺接近透明化的最小濃度，同時三維結構保持完整。

為了進一步去除細胞，本發明聯合灌注dnaseⅰ溶液。dnaseⅰ即deoxyribonucleasei，中文名，脫氧核糖核酸酶i，是一種可以消化單鏈或雙鏈dna的核酸內切酶，在25℃時酶的活性最大。這里，dnaseⅰ用來去除殘留的dna，把免疫排斥的可能性降到最低。前期研究人員已通過dna定量實驗證明，灌注sles后，對比不灌注dnaseⅰ，聯合灌注dnaseⅰ可以使dna含量降至50ng/mg以內，達到組織工程學要求。

本發明提供脫細胞肺支架的制備方法，該方法采用先經0.1-1％sles的處理2-3小時；然后再在25℃下將20-30ug/mldnaseⅰ溶液以流速為1-2ml/min處理0.5-1h。

所述sles的用量為0.6-9ml，dnaseⅰ溶液的總用量約0.6-3.6mg。

具體地說，本發明的脫細胞肺支架的制備方法，包括如下方法：

1)先將離體處理后的肺支架進行肝素化的pbs溶液灌洗；

2)然后采用0.1-1％sles進行灌洗，并再用去離子水進行灌洗；

3)隨后采用20-30ug/ml的dnaseⅰ溶液進行灌洗處理，并用去離子水進行灌洗；

4)最后用含抗生素的pbs溶液灌洗。

進一步，本發明的脫細胞肺支架的制備方法，采用依次灌注以下溶液處理：

1)肝素化的pbs：肝素10u/ml，室溫，流速為5ml/min，灌注15min。

2)0.1-1％sles：用去離子水稀釋，室溫，流速為5ml/min，灌注2-3h，sles總用量約0.6-9ml。

3)去離子水：室溫，流速為5ml/min，灌注15min。

4)核酸酶應用液：dnase1液20-30ug/ml，用去離子水稀釋，25℃，流速為1-2ml/min，灌注0.5-1h，總用量約0.6-3.6mg。

5)去離子水：室溫，流速為5ml/min，灌注15min。

6)含抗生素的pbs：青霉素g500u/ml，鏈霉素500ug/ml，兩性霉素b25ug/ml，室溫，流速為5ml/min，灌注2h。

langendorff灌注系統可以控制灌注壓力、流速和溫度，保證最佳的灌注效果，有利于量化生產。研究人員將此方案應用于sd大鼠，所制備的脫細胞肺支架能有效地去除細胞，同時完美的保留了肺臟三維形態結構，構建人工肺的細胞外基質蛋白也能完整的保存。肺支架體內移植后能與受體很好的融合，細胞化和血管化良好。

本發明采用了一種新型去垢劑十二烷基醚硫酸鈉(sles)，聯合核酸酶(dnase1)，解決人工肺三維結構破壞嚴重，細胞外基質蛋白丟失過多的問題。利用langendorff灌注系統，制備出來的脫細胞肺支架細胞去除干凈，三維結構和細胞外基質蛋白保留完整，同種異體皮下移植6周后融合性、細胞化和血管化良好。本發明的制備方法統一、效率高，步驟簡單，可以進行量化生產，在組織工程肺及疏松器官領域有良好的應用前景甚至可以應用于豬和獼猴等大型動物的脫細胞肺制備，為組織工程人工肺早日應用于臨床提供了理論依據和技術支持。

附圖說明

圖1為不同灌注方式的大鼠肺部狀態圖；包含制備脫細胞肺支架不同時間點的狀態圖。

圖2為正常大鼠肺組織與本發明制備的肺支架的he染色對比圖；

圖3為不同灌注狀態下的大鼠肺的dna含量對照表；正常大鼠肺、僅灌注sles得到的脫細胞肺支架，和本發明聯合灌注制備的脫細胞肺支架之間的dna含量差異。

圖4為正常大鼠肺組織與本發明制備的肺支架的表面和內部掃描電鏡對比圖；

圖5為正常大鼠肺與脫細胞肺支架針對5種主要細胞外基質蛋白的免疫熒光對照圖；

圖6為采用本發明制備的脫細胞肺支架進行體內移植處理的效果圖。

具體實施方式

下面說明本發明的實施例。在本發明的一種實施方式中描述的元素和特征可以與一個或更多個其他實施方式中示出的元素和特征相結合。應當注意，為了清楚的目的，省略了與本發明無關的、本領域普通技術人員已知的部件或處理的表示和描述。

下面對本發明做進一步描述。

實施例1

一、大鼠取肺

選取健康雄性清潔級sd大鼠，體重250-350g，8-12周齡，術前12h禁食，4h禁飲水。腹腔內注射肝素，1000u/kg，15min后腹腔內注射3％戊巴比妥溶液，用量按150mg/kg麻醉。麻醉成功后將大鼠取仰臥位，四肢圖釘固定于手術臺上。胸部、腹部手術區備皮，常規消毒，胸腹部聯合正中切口，長約5-8cm，剪開膈肌和肋骨，扒開胸腺，暴露心肺。棉簽扒開腹部臟器，腹主動脈及腹主靜脈切斷放血。經右室注入生理鹽水20-50ml，每1ml生理鹽水含普通肝素50u防止心肺內血凝塊形成，肺部稍微變白后，心肺支氣管分離及整體切除，獲得的新鮮正常肺直接儲存在-80℃冰箱中備用。

二、langendorff灌注法制備脫細胞肺支架

之前儲存的正常大鼠心肺從-80℃冰箱中取出，37℃水浴中融化。經主支氣管注入20ml的pbs溶液，內含普通肝素100u，使雙肺稍微膨脹。沿氣管及升主動脈找到肺靜脈和主肺動脈并分離，經主肺動脈根部離斷心臟及升主動脈，并由主肺動脈插入16g灌注頭，肝素化pbs溶液灌洗出肺臟殘留血液。將灌注針頭懸吊至langendorff操作臺，調整與保溫小室達到合適的距離，經肺動脈行離體肺臟灌流。在第1、2、3、5、6步中保持灌流壓力為20cmh2o，室溫，流速5ml/min。在第4步中保持灌注壓力為20cmh2o，溫度為25℃，流速為1-2ml/min。

依次灌注以下溶液：

1.肝素化的pbs：肝素10u/ml，室溫，流速為5ml/min，灌注15min。

2.0.1％sles：用去離子水稀釋，室溫，流速為5ml/min，灌注2h，sles總用量約0.6ml。

3.去離子水：室溫，流速為5ml/min，灌注15min。

4.核酸酶應用液：dnase1液30ug/ml，用去離子水稀釋，25℃，流速為2ml/min，灌注1h，總用量約3.6mg。

而現有的方法大多是浸泡于30ug/ml的dnase1液中0.5-1h。本發明采用的dnase1灌注法可以更加有效的去除dna。但是如果dnase1用量過大會導致三維結構破壞嚴重，本發明優選采用流速為1-2ml/min。

5.去離子水：室溫，流速為5ml/min，灌注15min。

6.含抗生素的pbs：青霉素g500u/ml，鏈霉素500ug/ml，兩性霉素b25ug/ml，室溫，流速為5ml/min，灌注2h。此步驟的目的是為了沖洗殘留的細胞碎片和去垢劑。此步驟目前沒有統一的灌注時間，本發明采用灌注2小時，體內移植后也沒有出現排斥反應，細胞化和血管化良好。

實驗例1

采用不同灌注方式觀察大鼠肺部狀態，如圖1所示，a是從冰箱取出的正常大鼠肺與心臟分離后經主肺動脈插入16g灌注頭，并懸吊至langendorff操作臺上等待灌注。b是灌注0.1％sles溶液，流速5ml/min，2小時后肺基本透明，為了達到基本透明的效果，可以延長灌注時間至3小時。c是灌注濃度為30ug/ml的dnaseⅰ溶液1小時后，流速2ml/min，使肺更加晶瑩剔透。d是灌注最終完成后，得到本發明制備的脫細胞肺支架。e研究人員采用本發明方法制備的支架灌注亞甲藍染液后，可以看到藍色的染液分布均勻，毛細血管床保留完整。通過圖1可以得出結論，本發明能制備的脫細胞肺支架能完整的保留三維結構和微循環結構。

實驗例2

圖2為正常大鼠肺組織與本發明制備的肺支架的he染色對比圖；隨機取正常肺葉和脫細胞肺支架肺葉按照he染色常規步驟，即固定、脫水、包埋、制備切片后常規he染色。如圖2所示，a為正常大鼠肺組織he染色，組織內布滿細胞；b為本發明制備的肺支架he染色，組織無明顯細胞分布，放大100倍，比例尺100um。通過圖2可以得出結論，本發明方法能完全的去除正常肺內細胞。

實驗例3

圖3為不同灌注狀態下的大鼠肺的dna含量對照表為了評估聯合應用dnaseⅰ的有效性。我們把18只大鼠隨機分為3組，正常肺組6只，dnaseⅰ-組6只，dnaseⅰ+組6只。正常肺組為從冰箱取出的肺，不進行任何灌注。dnaseⅰ-組僅灌注sles，不灌注dnaseⅰ。dnaseⅰ+組采用本發明的聯合灌注sles和dnaseⅰ方法。三組方法得到的肺組織，按照qiaampdnaminikit試劑盒說明書進行dna含量測定。數據采用spss軟件進行單因素方差分析。結果如如圖3所示，。正常肺組：1113.7±56.9(均值±標準差)；dnaseⅰ-組：63.9±7.9；dnaseⅰ+組:33.9±3.1。單位：ng/mg(干重)。相對于正常肺組織，經過脫細胞，dna含量均明顯下降(p<0.05)，雖然dnaseⅰ-組和dnaseⅰ+組之間沒有統計學差異(p>0.05)，但是dnaseⅰ+組的dna含量均在50ng/mg以內，即每1mg脫細胞支架組織內的dna含量不超過50ng。通過圖3可以得出結論，本發明能去除正常肺內97％的dna含量，達到組織工程學要求。

實驗例4

圖4為正常大鼠肺組織與本發明制備的肺支架的表面和內部掃描電鏡對比圖；掃描電鏡的制作按照常規操作流程，結果如圖4所示，采用掃描電鏡：a正常大鼠肺表面超微結構。b是脫細胞肺支架表面超微結構，和正常肺基本相似，光滑完整。c是正常大鼠肺內部超微結構，布滿細胞。d是脫細胞肺支架內部超微結構，未見細胞殘留，三維結構基本接近正常肺。a、b擴大放大2000倍，比例尺50um。c、d擴大放大1000倍，比例尺100um。通過圖4可以得出結論，本發明制備的脫細胞肺支架的超微結構也保留完整，接近正常肺組織。

實驗例5

圖5為正常大鼠肺與脫細胞支架針對5種細胞外基質蛋白的免疫熒光對照圖；正常肺組織和本發明制備的脫細胞肺支架組織，按照常規免疫熒光流程，即組織制備成石蠟切片，經過抗原修復，山羊血清封閉，一抗孵育、加入相對應的熒光二抗，在熒光顯微鏡下觀察。結果如圖5所示，本發明所述的脫細胞肺支架能基本完好的保留了5種主要的細胞外基質蛋白：ⅳ型膠原蛋白、ⅰ型膠原蛋白、成纖維蛋白、層粘連蛋白、彈力蛋白，熒光表達量基本接近正常肺。放大200倍，比例尺75um。通過圖5可以得出結論，構成細胞外基質的5種關鍵蛋白都能很好的保留，這為體內移植細胞化、血管化提供了很好的宿主環境。

實驗例6

圖6為采用本發明脫細胞支架進行體內移植處理的效果圖；我們制備的脫細胞肺支架，取右肺上葉，大小約2cm×1.5cm。受體sd大鼠經過麻醉、消毒，切開腹部皮膚，把脫細胞肺支架右肺上葉移植到受體大鼠腹部皮下，縫合消毒，整個過程注意無菌操作，術后常規飼養。6周后取出植入的組織進行改良masson染色。結果如圖6所示，a為脫細胞肺支架移植到另一sd大鼠皮下6周，可見支架與周圍組織融合良好，沒有出現壞死、脫落等排斥反應。b為改良masson三色染色，顯示有新生血管形成(箭頭所指)，周圍有細胞浸潤(紅色)。通過圖6可以得出結論，本發明制備的脫細胞肺支架有很好的組織相容性，細胞化、血管化效果良好。這為最終的器官原位移植并長期存活提供了實驗基礎。

雖然已經詳細說明了本發明及其優點，但是應當理解在不超出由所附的權利要求所限定的本發明的精神和范圍的情況下可以進行各種改變、替代和變換。而且，本申請的范圍不僅限于說明書所描述的過程、設備、手段、方法和步驟的具體實施例。本領域內的普通技術人員從本發明的公開內容將容易理解，根據本發明可以使用執行與在此所述的相應實施例基本相同的功能或者獲得與其基本相同的結果的、現有和將來要被開發的過程、設備、手段、方法或者步驟。因此，所附的權利要求旨在在它們的范圍內包括這樣的過程、設備、手段、方法或者步驟。