核酸適配體修飾核殼型復合材料及其制備方法和應用與流程

本發明涉及納米技術與生物醫藥領域，特別是涉及核酸適配體修飾核殼型復合材料及其制備方法和應用。

背景技術：

納米材料具有獨特的物理-化學性質，近年來，基于納米材料的疾病診斷和治療開始受到人們的關注。納米材料常用的癌癥治療方式為光熱治療和化學治療，熱療和化療的協同應用可以有效增強治療效果。為了達到精準治療，一般將診斷和治療相結合。表面增強拉曼光譜(sers)具有靈敏度高、抗光漂白性好等優點，已成功應用于細胞成像、癌癥診斷等方面。金納米顆粒生物相容性好，具有較高的sers活性和光熱性質，在sers成像和光熱治療方面具有潛在的應用前景。然而，金納米顆粒容易發生團聚，sers效應受環境影響較大；而且比表面積小，無法高效負載藥物。

技術實現要素：

基于此，本發明的目的在于，提供一種核酸適配體修飾核殼型復合材料及其制備方法和應用，所述復合材料同時具有sers成像、光熱治療、藥物治療三重功效，可有效實現診斷和治療的協同功能。

一種核酸適配體修飾核殼型復合材料，包括金納米顆粒核、金屬-有機骨架外殼和核酸適配體，所述金納米顆粒包覆于金屬-有機骨架外殼內，所述核酸適配體接枝于金屬-有機骨架外殼表面。

本發明的核酸適配體修飾核殼型復合材料，引入4-巰基苯甲酸，4-巰基苯甲酸以去質子的形式通過巰基端與金納米顆粒結合；4-巰基苯甲酸分子上的苯環通過金納米顆粒的增強作用可以產生良好的sers信號，具有拉曼標記功能；4-巰基苯甲酸分子上的羧基可與金屬-有機骨架的前驅體cu²⁺絡合，具有橋連作用；因而，4-巰基苯甲酸的引入既提供了拉曼信號源，又提供了后續金屬-有機骨架修飾的結合位點，因此該合成方法具有集合成與修飾為一體的優點，避免了合成材料后再修飾拉曼標記分子的繁瑣。通過4-巰基苯甲酸的橋連作用將金屬-有機骨架包覆于金納米顆粒的表面，避免了裸金納米顆粒團聚引起拉曼信號重現性差的問題，提高復合材料的穩定性，保證sers成像；并且，金屬離子及有機配體的作用位點能夠與特定的化合物分子等客體作用，有效負載藥物等，此外，金屬-有機骨架外殼具有多孔性，有效提高了復合材料的載藥率。金屬-有機骨架表面殘留的羧基與核酸適配體上的氨基通過羧基-氨基縮合反應，使核酸適配體通過化學鍵固定接枝于金屬-有機骨架，從而使所述復合材料能作用于蛋白質、小分子化合物、細胞膜表面受體等靶標，使復合材料具有優異的生物相容性及靶向識別性能。此外，該復合材料在近紅外存在吸收，可以將吸收的近紅外光能轉化為熱量，從而可以對腫瘤細胞進行光熱治療。

進一步地，所述核酸適配體修飾核殼型復合材料的粒徑為40-55nm。所述復合材料為納米級尺寸，能有效進入細胞成像，且納米尺寸的比表面積大，對藥物的吸附量更大。

進一步地，所述金納米顆粒的尺寸為40-50nm；所述金屬-有機骨架是銅和均苯三甲酸配位組裝的金屬-有機骨架；所述核酸適配體為抗肺癌細胞a549適配體，其堿基序列為5'-nh2-(ch2)6-ggttgcatgccgtggggaggggggtgggttttatagcgtactcag-3'。

進一步地，所述金屬-有機骨架外殼的厚度為2-3nm。

一種核酸適配體修飾核殼型復合材料的制備方法，包括以下步驟：

s1：采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備金納米顆粒；

s2：向步驟s1制得的金納米顆粒的溶液中加入巰基化試劑，攪拌反應后，離心分離得到巰基修飾的金納米顆粒；

s3：將步驟s2制備得到的巰基修飾的金納米顆粒分散于醇類溶劑中，加入乙酸銅，超聲后離心分離取沉淀物再分散于醇類溶劑中，加入均苯三甲酸，超聲進行配位反應，離心分離得到核殼型復合材料；

s4：將步驟s3制得的核殼型復合材料分散于tris-hcl緩沖液中，加入交聯劑，攪拌反應后，離心分離得到沉淀物，將沉淀物加入含有核酸適配體的pbs溶液中，低溫反應后，離心分離得到核酸適配體修飾的核殼型復合材料。

進一步地，步驟s2中，所述巰基化試劑為4-巰基苯甲酸。

進一步地，步驟s4中，所述交聯劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺。

進一步地，步驟s2中，所述金納米顆粒在水中的分散濃度為50mg/l；所述金納米顆粒與巰基化試劑的質量比為0.6:1。

進一步地，步驟s3中，所述巰基修飾的金納米顆粒在醇類溶劑中的分散濃度為300mg/l；所述巰基修飾的金納米顆粒、乙酸銅、均苯三甲酸的質量比為0.03:1:1。

進一步地，步驟s4中，所述核殼型復合材料、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、n-羥基琥珀酰亞胺的質量比為0.24:2:1。

本發明還公開了一種核酸適配體修飾核殼型復合材料在癌細胞靶向成像中的應用，所述癌細胞為a549細胞。

本發明還公開了一種核酸適配體修飾核殼型復合材料在光熱治療中的應用。

本發明還公開了一種核酸適配體修飾核殼型復合材料在抗腫瘤藥物負載及緩釋中的應用，所述的抗腫瘤藥物為阿霉素、紫杉酮、喜樹堿、酞菁、表柔比星、柔紅霉素、甲氨蝶呤中的一種物質或多種的混合物。所述復合材料中的金屬-有機骨架，具有多孔性，且比表面積大，當特定的客體分子的空間立體尺寸與金屬-有機骨架的尺寸相匹配時，且金屬-有機骨架中的金屬離子和有機配體與所述客體分子之間通過配位作用或π-π作用，使所述復合材料可有效負載大量的特定藥物。并且，所述金屬-有機骨架暴露的羧基等作用位點還可進一步修飾其他適配體或抗體等識別元素，進一步為所述復合材料提供靶向性能。

本發明的核酸適配體修飾核殼型復合材料，引入4-巰基苯甲酸，4-巰基苯甲酸以去質子的形式通過巰基端與金納米顆粒結合；4-巰基苯甲酸分子上的苯環通過金納米顆粒的增強作用可以產生良好的sers信號，具有拉曼標記功能；4-巰基苯甲酸分子上的羧基可與金屬-有機骨架的前驅體cu²⁺絡合，具有橋連作用。4-巰基苯甲酸的引入既提供了拉曼信號源，又提供了后續mofs修飾的結合位點，因此該合成方法集合成與修飾為一體的優點，避免了合成材料后再修飾拉曼標記分子的繁瑣。所述核酸適配體修飾核殼復合材料的具有光熱治療的功效。

所述復合材料表面修飾核酸適配體，能與多種目標物質高特異性、高選擇性地結合；所述金屬-有機框架的金屬位點能夠有效與藥物中的氨基或羧基基團進行配位，從而對特定藥物的負載，實現藥物治療；并且采用均苯三甲酸作為有機配體，增加比表面積，提高吸附性能，能夠提高藥物負載率。因而，所述核酸適配體修飾核殼型復合材料可通過sers進行診斷，并能夠負載藥物進行治療，實現診斷和治療的協同功能，為疾病的早期診斷和治療等領域提供技術基礎。

并且，所述金屬-有機框架包覆于金納米顆粒的表面，避免了金納米顆粒的自發團聚，提高了金納米顆粒的穩定性。

為了更好地理解和實施，下面結合附圖詳細說明本發明。

附圖說明

圖1為本發明的核酸適配體修飾核殼型復合材料的合成示意圖；

圖2為本發明的核酸適配體修飾核殼型復合材料的透射電鏡掃描圖；

圖3為本發明的核酸適配體修飾核殼型復合材料在不同濃度的nacl溶液中的拉曼光譜圖；

圖4為本發明的不同濃度的核酸適配體修飾核殼型復合材料在激光照射下的升溫速率圖；

圖5為本發明的核酸適配體修飾核殼型復合材料的藥物體外釋放曲線圖；

圖6為本發明的核酸適配體修飾核殼型復合材料對a549細胞和beas-2b細胞的sers成像圖；

圖7為向a549細胞的培養液中加入不同組樣品培養后所得的細胞存活率圖。

具體實施方式

本發明公開了一種核酸適配體修飾核殼型復合材料，包括金納米顆粒核、金屬-有機骨架外殼和核酸適配體，所述金納米顆粒包覆于金屬-有機骨架外殼內，所述核酸適配體接枝于金屬-有機骨架外殼表面。所述核酸適配體修飾核殼型復合材料的粒徑為40-55nm。所述金屬-有機骨架外殼的厚度為2-3nm。

本發明所述的核酸適配體修飾核殼型復合材料的制備方法，包括以下步驟：

s1：采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備金納米顆粒；

s2：向步驟s1制得的金納米顆粒的溶液中加入巰基化試劑，攪拌反應后，離心分離得到巰基修飾的金納米顆粒；

s3：將步驟s2制備得到的巰基修飾的金納米顆粒分散于醇類溶劑中，加入乙酸銅，超聲后離心分離取沉淀物再分散于醇類溶劑中，加入均苯三甲酸，超聲進行配位反應，離心分離得到核殼型復合材料；

s4：將步驟s3制得的核殼型復合材料分散于tris-hcl緩沖液中，加入交聯劑，攪拌反應后，離心分離得到沉淀物，將沉淀物加入含有核酸適配體的pbs溶液中，低溫反應后，離心分離得到核酸適配體修飾的核殼型復合材料。

具體的，所述巰基化試劑為4-巰基苯甲酸。所述交聯劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺。

步驟s2中，所述金納米顆粒在水中的分散濃度為50mg/l；所述金納米顆粒與巰基化試劑的質量比為0.6:1。步驟s3中，所述巰基修飾的金納米顆粒在醇類溶劑中的分散濃度為300mg/l；所述巰基修飾的金納米顆粒、乙酸銅、均苯三甲酸的質量比為0.03:1:1。步驟s4中，所述核殼型復合材料、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、n-羥基琥珀酰亞胺的質量比為0.24:2:1。

本發明還公開了一種核酸適配體修飾核殼型復合材料在癌細胞靶向成像中的應用，所述癌細胞為a549細胞。

本發明還公開了一種核酸適配體修飾核殼型復合材料在光熱治療中的應用。

本發明還公開了一種核酸適配體修飾核殼型復合材料在負載藥物及藥物緩釋中的應用，所述的負載藥物為阿霉素、紫杉酮、喜樹堿、酞菁、表柔比星、柔紅霉素、甲氨蝶呤中的一種物質或多種的混合物。

實施例1

核酸適配體修飾核殼型復合材料及其制備方法和應用

本發明的核酸適配體修飾核殼型復合材料包括金納米顆粒核、金屬-有機骨架外殼和核酸適配體，所述金納米顆粒包覆于金屬-有機骨架外殼內，所述核酸適配體接枝于金屬-有機骨架外殼表面。

請參閱圖1，其是本發明的核酸適配體修飾核殼型復合材料的合成示意圖，所述核酸適配體修飾核殼型復合材料的制備方法，包括以下步驟：

步驟s1：采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備金納米顆粒；具體的，取200ml的質量分數為0.01％氯金酸溶液加到500ml三口燒瓶中，加熱至145℃，加熱過程中保持磁力攪拌和冷凝回流，加熱至劇烈沸騰狀態后，迅速加入1.46ml質量分數為1％的檸檬酸鈉溶液，繼續加熱攪拌回流40min后，攪拌冷卻至室溫，得到分散于水溶液中的金納米顆粒。

步驟s2：取12ml步驟s1中制備得到的金納米顆粒的分散液，邊攪拌邊向其中加入120μl濃度為0.05mol/l的4-巰基苯甲酸的乙醇溶液，持續攪拌2h后，在轉速為8000rpm的條件下離心8min，用乙醇清洗一次，離心棄去上清液，將離心得到的沉淀物分散在2ml的乙醇中，得到分散于乙醇中的巰基修飾的金納米顆粒。

步驟s3：取2ml的步驟s2中得到的分散于乙醇中的巰基修飾的金納米顆粒，向其中加入10ml濃度為10mmol/l的乙酸銅的乙醇溶液，超聲10min，在轉速為8000rpm的條件下離心8min，再用乙醇清洗一次，離心棄去上清液，將離心得到的沉淀物分散在2ml的乙醇中，加入10ml濃度為10mmol/l的均苯三甲酸的乙醇溶液，超聲10min，于75℃下反應20min；在轉速為8000rpm的條件下離心6min，用移液槍棄去上層清液，再用乙醇清洗一次，離心棄去上層清液，離心得到的沉淀物分散于tris-hcl緩沖液中，得到核殼型復合材料。

步驟s4：向步驟s3得到的分散于tris-hcl緩沖液中的核殼型復合材料中加入5mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和2.5mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，攪拌反應12h；反應結束后，在轉速為8000rpm的條件下離心6min，用移液槍棄去上層清液，再用去離子水清洗一次，棄去上清液，將沉淀物加入含有核酸適配體的pbs溶液中，于4℃下反應12h；反應結束后，在轉速為8000rpm的條件下離心6min，用移液槍棄去上層清液，將沉淀用pbs清洗一次后，得到核酸適配體修飾的核殼型復合材料。

將上述得到的核酸適配體修飾的核殼型復合材料分散在2ml的pbs溶液中，進行超聲處理0.5h，然后滴在銅網上，晾干后進行透射電鏡掃描。請參閱圖2，其是所述核酸適配體修飾的核殼型復合材料的透射電鏡掃描圖。從圖中可以看出，所述復合材料為核殼結構，粒徑大小約50nm，金屬-有機骨架外殼的厚度為2-3nm，復合材料殼體的尺寸均一，分散性好。

實施例2

(1)核酸適配體修飾核殼型復合材料的表面拉曼光譜的穩定性

用ph為7.4的pbs溶液配制濃度為5mg/l的核酸適配體修飾的核殼型復合材料的pbs溶液，將復合材料的pbs溶液與不同濃度的nacl溶液按照體積比為8:2混合，所述nacl的濃度依次為為0.01、0.05、0.1、0.5mol/l。混合后，均于37℃下攪拌2h，然后采集拉曼光譜。請參閱圖3，其是所述核酸適配體修飾核殼型復合材料在不同濃度的nacl溶液中的拉曼光譜圖。從圖中可知，隨著nacl濃度的增加，所述核酸適配體修飾的核殼型復合材料的拉曼光譜未發生明顯變化，說明所述復合材料在鹽溶液中具有較好的sers穩定性。

(2)核酸適配體修飾核殼型復合材料的光熱性能

配制濃度分別為1mg/l、5mg/l、10mg/l的復合材料的pbs溶液，然后分別取1ml加入樣品管中，用808nm波長的激光照射(功率為0.5w/cm²)，每隔一段時間記錄溫度變化。請參閱圖4，其是不同濃度的核酸適配體修飾核殼型復合材料在激光照射下的升溫速率圖。從圖中可以看出，各個濃度的溶液隨著照射時間的增加逐漸升溫，并且，10mg/l的核酸適配體修飾核殼型復合材料溶液在光照60min后溫度升溫了22.8℃，說明其光熱轉化效果較好。

(3)核酸適配體修飾核殼型復合材料的負載藥物-藥物緩釋功能

將100μl的1mg/ml的阿霉素(dox)加入5ml的濃度為50mg/l的核酸適配體修飾核殼型復合材料的pbs溶液中，于25℃暗處下攪拌反應24h，然后離心分離，收集上清液，根據dox吸光值的標準曲線和dox負載前后在480nm處的吸光值，計算dox的負載率，得dox的負載率為57.0％。

然后將負載有dox的核酸適配體修飾核殼型復合材料分散于pbs溶液中，pbs溶液的ph分別為7.4和5.5，每隔一定時間，離心取上清液測定紫外，通過480nm處的紫外吸收值計算dox隨時間的釋放量。請參閱圖5，其是所述核酸適配體修飾核殼型復合材料的藥物體外釋放曲線圖。從圖中可以看出，相較于ph＝7.4的中性環境，ph＝5.5的酸性環境中dox的釋放量更大，ph＝5.5的條件下，10h時dox的釋放量為48％，而ph＝7.4的條件下，10h時dox的釋放量僅為9.7％，說明酸性條件更有利于dox的釋放。

實施例3

(1)核酸適配體修飾核殼型復合材料在sers成像中的應用

將5mg/l的核酸適配體修飾核殼型復合材料分別加入肺癌細胞a549和正常肺細胞beas2b培養液中，孵育30min，在激光533nm下進行拉曼成像測試。請參閱圖6，其是本發明的核酸適配體修飾核殼型復合材料對a549細胞和beas-2b細胞的sers成像圖。從圖中可以看出，所述復合材料與a549細胞孵育后，可以觀察到明顯的sers信號，而將復合材料與beas2b細胞孵育后，sers信號很弱，說明所述核酸適配體修飾核殼型復合材料對肺癌細胞a549具有靶向成像功能。

(2)核酸適配體修飾核殼型復合材料在熱療-化療復合治療中的應用

取6組相同濃度(20mg/l)的不同樣品的pbs溶液分別加入細胞a549的培養液中培養1h，所述樣品及處理方式分別如下表：

請參閱圖7，其是向a549細胞的培養液中加入不同組樣品培養后所得的細胞存活率圖。第1組樣品為僅進行光照，細胞存活率沒有發生明顯變化，說明僅進行光照對細胞的存活率無明顯影響。比較第2組和第4組，激光照射后，核酸適配體修飾核殼型復合材料升溫會導致細胞死亡。比較第3組和第5組，負載dox的核酸適配體修飾核殼型復合材料比dox會引起更多的細胞死亡，這主要是因為，負載dox的核酸適配體修飾核殼型復合材料是以主動內吞的方式進入細胞，而dox是以被動擴散的方式進入細胞，而主動內吞比被動擴散的吸收更好。比較第3組、第4組和第6組，第6組的藥物治療結合光熱治療的效果比第3組僅進行藥物治療或第4組僅進行光熱治療的效果好，這是因為dox藥物治療和核酸適配體修飾核殼型復合材料的光熱治療產生了協同作用使細胞存活率降低，而且核酸適配體修飾核殼型復合材料在細胞內局部濃度更高，協同作用更明顯，因此第6組的細胞存活率最低，進一步說明了本發明的核酸適配體修飾核殼型復合材料能夠用于光熱治療和負載藥物及藥物緩釋中。

以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。